CN103060221A - 一种连续增菌培养鸡毒支原体培养基及制备方法 - Google Patents

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Abstract

发明涉及连续增菌培养鸡毒支原体培养基及制备方法，属于兽医生物学技术领域。包括PPLO、酵母浸出粉、葡萄糖等组成，使用前加入健康猪血清。该培养基能够既保证半成品生长滴度高而且稳定，用本发明方法制备的半成品菌液高达1012CCU/ml；同时该培养基采用连续增菌培养工艺培养鸡毒支原体，使得鸡毒支原体繁殖菌体延长生长稳定期时段，最大限度地利用消耗培养基中的有效成分，从而使得鸡毒支原体有效抗原大大增值增量，最终菌液可直接或稀释后制备灭活疫苗，菌液无需浓缩，不仅简化了生产工艺，而且降低了生产成本。

Description

一种连续增菌培养鸡毒支原体培养基及制备方法
技术领域
本发明属于生物制品技术领域，涉及一种改良的增菌培养鸡毒支原体培养基，尤其涉及一种鸡毒支原体增菌培养工艺。
背景技术
鸡毒支原体（Mycoplasma galliseptium,MG）是鸡慢性呼吸道病(chronic respiratory disease，CRD)的病原，且感染率很高。CRD可通过水平和垂直方式传播并在鸡群中长期存在和蔓延。鸡场感染MG后，雏鸡的弱雏率升高，蛋鸡的产蛋率、肉鸡的体重及饲料转化率均下降，对养鸡业的发展造成严重危害。目前各鸡场对鸡毒支原体的治疗主要是使用抗生素，而鸡毒支原体易产生耐药性，效果也不理想。免疫疫苗是控制鸡毒支原体病的最好措施，但优质疫苗的前提需要有一种好的培养基来支撑。
目前生产鸡毒支原体疫苗，主要应用改良Frey氏培养基或其他支原体培养基培养鸡毒支原体。其制苗用菌液培养工艺为：将合格的鸡毒支原体生产用种子液按1︰10的比例接种于培养基，逐步扩大培养，一直到所需的量；每代均置37℃培养24-48h，待培养基的pH下降到6.4左右收获；按此传统工艺培养所获得的鸡毒支原体制苗用菌液（半成品）的浓度最高只能达到1×109CCU/ml。
上述传统培养基及培养工艺所培养的鸡毒支原体培养滴度低（培养菌液浓度低），制苗用菌液（半成品）生产灭活疫苗时不能直接使用，需对半成品进行一定浓缩后方可制备成品疫苗，而半成品的浓缩操作繁琐、浓缩过程损失较大，最终影响成品疫苗的保护效力，并且使疫苗生产成本提高。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种连续增菌培养鸡毒支原体培养基及其制备方法，该方法能够提高鸡毒支原体菌液浓度及培养滴度。
本发明提供的一种连续增菌培养鸡毒支原体培养基及其制备方法，包括如下步骤：
1、连续增菌培养鸡毒支原体培养基
Figure BDA0000208310401
培养时，再加150-200ml猪血清和1000单位/ml青霉素，20%NaOH调pH7.6-7.8。
2、上述连续增菌培养鸡毒支原体培养基制备按如下步骤进行：
（1）将鸡毒支原体生产用种子按1︰10的比例接种于所述的鸡毒支原体培养基中，在36-37℃培养18-24h收获；以同样方法将收获的培养液按1︰10的比例再接种传代1次；
(2) 将上述传代后的菌液按1︰10的比例接种于本发明的连续增菌培养基中，37℃培养，待pH下降至6.5左右，添加连续增菌培养鸡毒支原体培养基为原培养体积的30%，用20%NaOH调pH7.6-7.8，如此进行两次增菌培养，待第二次增菌培养pH下降到6.4时，加甲醛灭活，连续增菌培养结束。
本发明的连续增菌培养鸡毒支原体培养基对不同碳源、氮源、无机盐、蛋白质和胆固醇等诸多营养组分进行了筛选，在培养过程中对鸡毒支原体的生长特性进行了全面的了解掌握，在培养过程中适时地添加培养基，使得鸡毒支原体繁殖菌体延长生长稳定期时段，最大限度地利用消耗培养基中的有效成分，从而鸡毒支原体有效抗原大大增值增量，最终菌液可直接或稀释后制备灭活疫苗，菌液无需浓缩，不仅简化了生产工艺，而且降低了生产成本。
具体实施方式
实施例1本发明培养基的制备
1、连续增菌培养鸡毒支原体培养基
培养时，再加200ml猪血清和1000单位/ml青霉素，20%NaOH调pH7.6-7.8
2、上述连续增菌培养鸡毒支原体培养基制备按如下步骤进行：
（1）将鸡毒支原体生产用种子按1︰10的比例接种于所述的鸡毒支原体培养基中，在36-37℃培养18-24h收获；以同样方法将收获的培养液按1︰10的比例再接种传代1次；
（2）将上述传代后的菌液按1︰10的比例接种于本发明的连续增菌培养基中，37℃培养，待pH下降至6.5左右，添加连续增菌培养鸡毒支原体培养基为原培养体积的30%，用20%NaOH调pH7.6-7.8，如此进行两次增菌培养，待第二次增菌培养pH下降到6.4时，加甲醛灭活，连续增菌培养结束。
实施例2本发明培养基的制备
1、连续增菌培养鸡毒支原体培养基
培养时，再加180ml猪血清和1000单位/ml青霉素，20%NaOH调pH7.6-7.8。
2、上述连续增菌培养鸡毒支原体培养基制备按如下步骤进行：
（1）将鸡毒支原体生产用种子按1︰10的比例接种于所述的鸡毒支原体培养基中，在36-37℃培养18-24h收获；以同样方法将收获的培养液按1︰10的比例再接种传代1次；
（2）将上述传代后的菌液按1︰10的比例接种于本发明的连续增菌培养基中，37℃培养，待PH下降至6.5左右，添加连续增菌培养鸡毒支原体培养基为原培养体积的30%，用20%NaOH调pH7.6-7.8，如此进行两次增菌培养，待第二次增菌培养pH下降到6.4时，加甲醛灭活，连续增菌培养结束。
实施例3本发明培养基的制备
1、连续增菌培养鸡毒支原体培养基
培养时，再加1800ml猪血清和1000单位/ml青霉素，20%NaOH调pH7.6-7.8。
2、上述连续增菌培养鸡毒支原体培养基制备按如下步骤进行：
（1）将鸡毒支原体生产用种子按1︰10的比例接种于所述的鸡毒支原体培养基中，在36-37℃培养18-24h收获；以同样方法将收获的培养液按1︰10的比例再接种传代1次；
（2）将上述传代后的菌液按1︰10的比例接种于本发明的连续增菌培养基中，37℃培养，待pH下降至6.5左右，添加连续增菌培养鸡毒支原体培养基为原培养体积的30%，用20%NaOH调pH7.6-7.8，如此进行两次增菌培养，待第二次增菌培养pH下降到6.4时，加甲醛灭活，连续增菌培养结束。

Claims (3)

1.一种连续增菌培养鸡毒支原体培养基及制备方法，所述疫苗经鸡毒支原体培养基配制、种子制备、制苗菌液连续增菌培养及灭活疫苗制备工序制成，其特征在于，所述鸡毒支原体培养基按如下工艺配制：
PPLO肉汤                20.0-25.5g
酵母浸出粉                3-7g
葡萄糖                    7-9g
质量浓度为0.4%的酚红溶液  2ml
加去离子水                700—800ml
121℃高压灭菌15分钟  4℃保存；
培养时，再加150-200ml猪血清和1000单位/ml青霉素，20%NaOH调pH7.6-7.8。
2.根据权利要求1所述的连续增菌培养鸡毒支原体培养基的制备方法，其特征在于，所述培养制苗用培养基的制备按如下步骤进行：
（1）将鸡毒支原体生产用种子按1︰10的比例接种于所述的鸡毒支原体培养基中，在36-37℃培养18-24h收获；以同样方法将收获的培养液按1︰10的比例再接种传代1次；
（2）将上述传代后的菌液按1︰10的比例接种于本发明的连续增菌培养基中，37℃培养，待pH下降至6.5左右，添加连续增菌培养鸡毒支原体培养基为原培养体积的30%，用20%NaOH调pH7.6-7.8，如此进行两次增菌培养，待第二次增菌培养pH下降到6.4时，加甲醛灭活，连续增菌培养结束。
3.根据权利要求1和2所述的连续增菌培养鸡毒支原体培养基的制备方法，包括鸡毒支原体所有灭活疫苗抗原的制备。
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