CN102559816A

CN102559816A - 一种抗菌脂肽的制备方法及其在兽医药中的应用

Info

Publication number: CN102559816A
Application number: CN2011103616524A
Authority: CN
Inventors: 韩健宝
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2011-10-13
Filing date: 2011-11-16
Publication date: 2012-07-11

Abstract

本发明涉及一种抗菌脂肽的制备方法及其在兽医药中的应用，通过抗菌脂肽制备工艺的优化，使抗菌脂肽产量较高，达到了6.8g/L。该制备方法获得的抗菌脂肽具有广谱抗菌作用，尤其对革兰氏阳性菌(葡萄球菌和链球菌)效果更佳。将其应用到兽医临床试验中，发现其对猪病原菌(副嗜血杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、链球菌、多杀性巴氏杆菌、肺炎双球菌等)和鸡病原菌(沙门氏菌、大肠杆菌、巴氏杆菌等)均有良好的抗菌效果，具有无毒副作用，无耐药性和抗菌谱广的优点，更无化学药物类抗菌素残留等食品安全问题，可成为新型抗生素替代品，具有良好的应用前景。

Description

一种抗菌脂肽的制备方法及其在兽医药中的应用

技术领域

本发明涉及一种抗菌脂肽的制备方法及其在兽医药中的应用，属于生物医药技术领域。

背景技术

近年来，研究人员发现某些细菌分泌的产物也具有抗菌活性，目前研究较多的主要有两种(阳离子抗菌肽和脂肽)。脂肽主要来源于一些由细菌、酵母菌、真菌分泌的代谢产物，结构上含亲水的肽键和亲油的脂肪烃链两部分。其中肽链上的氨基酸能以内酯或酰胺键形式与脂肪烃链的羧基、羟基或氨基结合形成环状结构。脂肽分子中脂肪链部分的碳原子数一般在12～19之间，肽链部分的氨基酸残基数在6～13之间。枯草芽孢杆菌在自然生长和发酵培养后期产生的脂肽类抗生素是其最重要的抗菌物质。脂肽类抗生素包括伊枯草菌素(iturins)、泛革素(fengycins)和表面活性素(surfactin)，其中伊枯草菌素和泛革素具有很强的抗真菌活性，而表面活性素对病毒、肿瘤、支原体都有很高的抑制活性。

抗菌脂肽属于抗菌肽家族中的一种，具有抗菌活性高、抗菌谱广、结构稳定，对人、兽、畜无害等特性。其抗菌机理和一般抗生素有所不同，它是在微生物的细胞膜上形成孔洞而使细胞内容物流出从而导致细菌死亡或螯合一、二价阳离子从而抑制了细菌代谢过程中多种酶类活性，不易产生耐药性。此外，由于是肽类物质在自然界中容易分解，极具潜力开发为一种新型、环境友好的生物药物。

迄今已有近千种天然抗菌肽被分离出来，但是天然抗菌肽的分离纯化过程烦琐且费用较高，另外多数抗菌肽的活性较弱难以达到应用的水平，有些抗菌肽还具有副作用。当前制备抗菌脂肽的方法主要有生物材料提取法，化学合成法和基因工程表达等方法。天然抗菌脂肽在生物材料中含量低，分离也较烦琐，采用这种方法获得的样品难以满足应用需求。化学合成虽可以完成，但成本较高。因此，研发新型、广谱、易于大量制备与纯化而又有较高活性的抗菌脂肽将有利于降低成本，并为开发代替抗生素的抗菌药物提供更大的发挥空间。

本发明提供了一种抗菌脂肽的生物制备方法，产量高，生产成本低。所得抗菌脂肽对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有较好的抗菌活性，应用于兽医药临床实践中，取得了良好的效果。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种抗菌脂肽的制备方法。

本发明的另外一种目的是提供一种抗菌脂肽的纯化方法。

本发明方法制备的抗菌脂肽应用于兽医药领域取得了良好的效果，提供了一种抗菌脂肽的新用途。

本发明所述的抗菌脂肽制备方法为：种子菌的培养、发酵培养、抗菌脂肽的粗提、抗菌脂肽的纯化、抗菌脂肽的鉴定与制备结果评价。

上述种子菌培养中的种子菌包括枯草芽孢杆菌(B.subtilis A1株，购于中国普通微生物菌种保藏中心)。

其中，种子菌的制备方法为：B.subtilisA1株菌种转接至LB平板上，37℃培养24h；

用接种环取活化菌种，接种于含有100ml LB液体培养基的锥形瓶中，培养过夜作为种子菌。

上述的发酵培养中的培养基包括NS-L-I培养基(葡萄糖20.0g，L-谷氨酸钠5.0g，MgSO40.5g，KCl 0.5g，KH2PO4 1g，FeSO4 0.15mg，MnSO4 5.0mg，CuSO4 0.16mg，蒸馏水1000ml，pH 7.0。)。

其中，NS-L-I培养基可用其中葡萄糖含量调整，乳糖，L-谷氨酸钠，微量元素等及培养基pH值进行调整后的培养基取代。

其中，发酵条件为：种子菌接种量(1％～15％)，发酵温度(20℃～37℃)，发酵时间(24～72h)，发酵转速(50～300r/min)，发酵初始pH为pH 5.0～9.0。

上述抗菌脂肽的粗提过程为：取制备的发酵菌液在pH2.0～5.0条件下经7000rpm离心10min，去除菌体，取上清用6mol/L HCL分别调节所需pH，再以7000rpm 离心10min，收集沉淀。将沉淀在70℃的烘箱中下燥20h，即得抗菌脂肽粗提物。

上述抗菌脂肽的纯化过程采用酸-醇法，具体步骤为：取未烘干的抗菌脂肽粗提物，加入醇类物质后用NaOH调节pH至5.0～8.0，再用醇类物质抽提2次并将其抽提液合并，然后将其过Sephadex LH-20层析柱，最后用离心浓缩仪浓缩至完全干燥，即得抗菌脂肽的纯化物。

上述抗菌脂肽的鉴定过程为：取抗菌脂肽纯化物溶解在少量醇类中，再取一定量的该抗菌脂肽溶液分多次点样于硅胶板上，待点样点风干后，放入盛有展开剂的层析缸中饱和30min，展开剂的组成为氯仿∶甲醇∶水＝65∶25∶4(体积比)，然后，待展开剂到达距硅胶板上层边缘2cm左右时取出，待有机溶剂充分挥发后，再采用含有0.5％茚三酮的丙酮溶液喷雾显色。

上述抗菌脂肽的的制备结果评价方法为：70℃的烘箱中干燥所得纯化的抗菌脂肽，产量需大于6.8g/L。

上述提纯的抗菌脂肽的抗菌效果评价方法如下：

选用如下表的10种动物病原菌，将其培养至对数期后，分别制备成菌悬液，活菌数大于10⁶CFU/ml，备用。将素琼脂固体培养基融化后倒入培养皿，待冷却凝固后，等距平稳地将3个已经灭菌的牛津杯放在固体培养基平面上，再将分别培养细菌的LB半固体培养基融化，冷却至40℃～50℃，移取1ml菌悬液到培养基中，混匀，然后用移液管移取8ml含菌培养基至素琼脂平板上。待凝固后，拔出牛津杯，用移液枪取30μl不同浓度的纯抗菌脂肽加入牛津孔内，以生理盐水作对照。每个处理重复3次，最后细菌放置于37℃培养箱培养24h。培养完成后，取出培养皿测量抑菌圈的直径大小。

纯抗菌脂肽的抗菌谱

注：判断标准：抑菌圈直径大于20mm为高敏，小于20mm大于14mm为中敏，小于14mm为不敏感。

具体实施方式

实施例1抗菌脂肽的制备方法

取枯草芽孢杆菌(B.subtilis A1株)进行制备，种子菌的制备方法为：B.subtilis A1株菌种转接至LB平板上，37℃培养24h；用接种环取活化菌种，接种于含有100ml LB液体培养基的锥形瓶中，培养过夜作为种子菌。

取种子菌进行发酵培养，培养基包括NS-L-I培养基(葡萄糖20.0g，L-谷氨酸钠5.0g，MgSO40.5g，KCl 0.5g，KH2PO4 1g，FeSO4 0.15mg，MnSO4 5.0mg，CuSO4 0.16mg，蒸馏水1 000ml，pH 7.0。)。发酵条件为：种子菌接种量8％，发酵温度29℃，发酵时间48小时，发酵转速150r/min，发酵初始pH为pH 7.0。

上述抗菌脂肽的粗提过程为：取制备的发酵菌液在pH2.0～5.0条件下经7000rpm离心10min，去除菌体，取上清用6mol/L HCL分别调节所需pH，再以7000rpm离心10min，收集沉淀。将沉淀在70℃的烘箱中干燥20h，即得抗菌脂肽粗提物。

将抗菌脂肽粗提物采用酸醇法进行纯化，具体步骤为：取未烘干的抗菌脂肽粗提物，加入醇类物质后用NaOH调节pH至5.0～8.0，再用醇类物质抽提2次并将其抽提液合并，然后将其过Sephadex LH-20层析柱，最后用离心浓缩仪浓缩至完全干燥，即得抗菌脂肽的纯化物。

将纯化后的抗菌脂肽进行鉴定：取抗菌脂肽纯化物溶解在少量醇类中，再取一定量的该抗菌脂肽溶液分多次点样于硅胶板上，待点样点风干后，放入盛有展开剂的层析缸中饱和30min，展开剂的组成为氯仿∶甲醇∶水＝65∶25∶4(体积比)，然后，待展开剂到达距硅胶板上层边缘2cm左右时取出，待有机溶剂充分挥发后，再采用含有0.5％茚三酮的丙酮溶液喷雾显色。

抗菌脂肽的制备结果评价：70℃的烘箱中干燥所得纯化的抗菌脂肽，产量需大于6.8克/升。

上述提纯的抗菌脂肽的抗菌效果评价方法如下：

纯抗菌脂肽的抗菌谱

实施例2抗菌脂肽对断奶仔猪5种细菌病的治疗作用

试验猪为28日龄健康断奶仔猪，共198头，体重7.52±0.65kg。试验分为6大组，其中5大组为感染组，分别接种复制5种细菌病，每组设立药物组合组和阳性对照组，另一大组为阴性对照组，共11个小组，18头/小组，各小组公母各半，各组按常规隔离饲养。

复制猪细菌病的菌种为本中心保存菌种，通过本动物接种恢复其毒力后制备成一定浓度的菌悬液，这5种细菌分别是：猪副嗜血杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、猪链球菌、猪多杀性巴氏杆菌和猪大肠杆菌，通过相应的接种途径和细菌总数，分别对各个感染组接种这5种细菌而复制出5种细菌性猪病，阴性对照组仔猪不接种细菌，只供给洁净饮水。每日观察记录对断奶仔猪的活动情况和病死情况。

接种感染2天后对药物组合组开始投药，投药方式和剂量：每400-500g纯抗菌脂肽均匀拌入1吨基础日粮中，自由采食，连续饲喂5天，饮水中不添加任何抗菌类物质。其它试验期间内饲喂不含任何抗菌类物质的基础日粮和饮水。10天后，每小组随机抽取9头猪，采用PCR法分别对其接种菌进行分离和检测。结果见下表。

B.subtilis A1株所分泌抗菌脂肽抗猪致病菌临床试验

实施例3抗菌脂肽对白羽肉鸡3种细菌病的治疗作用

试验鸡为15日龄健康白羽肉鸡，共700羽。试验分为4个大组，其中3大组为感染组，分别接种复制3种细菌性鸡病，每组设立药物组合组和阳性对照组，另一组为不感染不用药的阴性对照组，共7个小组，100羽/组，各组鸡公母各半，各组按常规隔离饲养。

复制鸡细菌病的菌种为本中心保存菌种，通过本动物接种本动物恢复其毒力后制备成一定浓度的菌悬液，这3种细菌分别是：沙门氏菌、大肠杆菌和巴氏杆菌，通过相应的接种途径和细菌总数，分别对各个感染组接种这3种细菌而复制出3个细菌性鸡病，阴性对照组鸡只供给洁净饮水。

鸡接种感染后，每日观察记录各组鸡的活动情况和病死情况。感染2天后，对感染的药物组合组开始投药，投药方式和剂量：将纯化抗菌脂肽按照50g/100kg的剂量兑水混匀，采取自由饮水方式，连续饮水7天，基础日粮中不含任何抗菌类物质，其它试验期间内饲喂不含任何抗菌类物质的饮水和基础日粮。10天后，每小组随机抽取20只鸡，采用PCR法分别对其接种菌进行分离和检测。结果见下表。

B.subtilis A1株所分泌抗菌脂肽抗肉鸡致病菌临床试验

Claims

1.一种抗菌脂肽的制备方法，其特征在于：该方法包括种子菌的培养、发酵培养、抗菌脂肽的粗提、抗菌脂肽的纯化、抗菌脂肽的鉴定与制备结果评价。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：上述种子菌培养中的种子菌包括枯草芽孢杆菌(B.subtilis A1株，购于中国普通微生物菌种保藏中心)。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：种子菌的制备方法为：B.subtilis A1株菌种转接至LB平板上，37℃培养24h；用接种环取活化菌种，接种于含有100ml LB液体培养基的锥形瓶中，培养过夜作为种子菌。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：上述的发酵培养中的培养基包括NS-L-I培养基(葡萄糖20.0g，L-谷氨酸钠5.0g，MgSO40.5g，KCl 0.5g，KH2PO4 1g，FeSO4 0.15mg，MnSO4 5.0mg，CuSO4 0.16mg，蒸馏水1000ml，pH 7.0。)。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：NS-L-I培养基可用葡萄糖含量调整，乳糖，L-谷氨酸钠，微量元素及培养基pH值进行调整后的培养基取代。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：种子菌接种量是1％～15％，发酵温度是20℃～37℃，发酵时间为24～72小时，发酵转速为50～300转/分钟，发酵初始pH为pH 5.0～9.0。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：抗菌脂肽粗提物的制备过程是发酵菌液在pH2.0～5.0条件下经7000rpm离心10分钟，去除菌体，取上清用6mol/L HCL分别调节所需pH，再以7000rpm离心10分钟，收集沉淀，将沉淀在70℃的烘箱中干燥20小时，即得。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：抗菌脂肽的纯化过程采用酸-醇法，具体步骤是取未烘干的抗菌脂肽粗提物，加入醇类物质后用NaOH调节pH至5.0～8.0，再用醇类物质抽提2次并将其抽提液合并，然后将其过Sephadex LH-20层析柱，最后用离心浓缩仪浓缩至完全干燥，即得抗菌脂肽的纯化物。

9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：抗菌脂肽的鉴定方法为抗菌脂肽纯化物溶解在少量醇类中，再取一定量的该抗菌脂肽溶液分多次点于硅胶板上，待点样点风干后，放入盛有展开剂的层析缸中饱和30分钟，展剂的组成为氯仿∶甲醇∶水＝65∶25∶4(体积比)，然后，待展开剂到达距硅板上层边缘2厘米时取出，待有机溶剂充分挥发后，再采用含有0.5％茚三酮丙酮溶液喷雾显色。

10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所得纯化的抗菌脂肽，量大于6.8克/升。

11.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：该制备方法获得的抗菌肽可用于抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。

12.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：该制备方法获得的抗菌肽可用于对断奶仔猪和白羽肉鸡细菌病的治疗作用。