CN109907072A - 载菌纳米壳聚糖畜舍消毒剂及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种载菌纳米壳聚糖畜舍消毒剂，该消毒剂由壳聚糖和枯草芽孢杆菌按照2～4:1的质量比混合而成。本发明还同时提供了上述载菌纳米壳聚糖畜舍消毒剂的制备方法，包括如下步骤：将枯草芽孢杆菌水浴加热后加入黄原胶混匀，所得的枯草芽孢杆菌复合体缓慢加入至壳聚糖纳米粒悬浮液中，加入完毕后继续搅拌，所得的载枯草芽孢杆菌的纳米壳聚糖悬浮液干燥至水分含量为5％～10％，得载菌纳米壳聚糖畜舍消毒剂。载菌纳米壳聚糖畜舍消毒剂稀释后喷洒畜舍，能达到持续而稳定的抑菌效果，从而改善畜舍空气质量，提高畜禽生产性能。

Description

载菌纳米壳聚糖畜舍消毒剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于畜舍消毒剂技术领域，具体涉及一种载枯草芽孢杆菌的纳米壳聚糖畜舍消毒剂及其制备方法。

背景技术

消毒是养殖场重要且必需的环节，做好日常消毒工作是预防养殖场疫病感染和控制疫病暴发的重要措施之一，是养殖场高效发展的重要保证。养殖业常见的消毒剂主要分有机和无机消毒剂两大类，存在易挥发、易分解、稳定性差、作用时间短，且可能分解产生有害物质，腐蚀性强，释放刺激性气体等弊端，对畜禽健康产生不利影响，开发新型健康有效的畜舍消毒剂至关重要。

壳聚糖是甲壳素脱乙酰基的产物，是地球上仅次于纤维素的第二大多糖类，资源十分丰富。壳聚糖具有很好的生物相容性和生物活性，且无毒，易于生物降解，现广泛应用于生物医学、化学化工、食品工业等领域。壳聚糖可降低胆固醇，抑制细菌活性，吸附和排泄重金属，提高免疫力。作为抗菌剂，壳聚糖及其衍生物有较好的抗菌活性，能抑制一些真菌、细菌和病毒的生长繁殖，是一种很有实用价值的卫生抗菌材料，有着广阔的应用前景。通过离子交联法后制成的壳聚糖纳米粒子，相较于壳聚糖具备更优异的特性和功能。

枯草芽孢杆菌是一类好氧或兼性厌氧菌，具有抗逆性强、抑菌谱广、代谢产物丰富、绿色无污染等特点，应用在畜牧养殖业，可改善畜禽肠道微生态，促进营养物质消化吸收，提高动物生产性能。其发挥作用的主要机理如下：第一，枯草芽孢杆菌菌体生长过程中会产生枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质，这些活性物质对致病菌或内源性感染的条件致病菌有明显的抑制作用。第二，枯草芽孢杆菌能迅速消耗肠道中的游离氧，造成肠道低氧，促进有益厌氧菌生长，间接抑制其它致病菌生长。第三，枯草芽孢杆菌菌体自身合成α～淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等酶类，在消化道中与动物体内的消化酶类一同发挥作用。

目前，壳聚糖和枯草芽孢杆菌在养殖业中一般用作饲料添加剂，通过消化道进入畜禽体内发挥作用，但将壳聚糖纳米粒子与枯草芽孢杆菌的复合物作为畜舍消毒剂的研究还未见报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种载枯草芽孢杆菌的纳米壳聚糖畜舍消毒剂及其制备方法和应用。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种载菌纳米壳聚糖畜舍消毒剂(载枯草芽孢杆菌的纳米壳聚糖畜舍消毒剂)：所述消毒剂由壳聚糖和枯草芽孢杆菌按照2～4:1的质量比混合而成。

本发明还同时提供了上述载菌纳米壳聚糖畜舍消毒剂的制备方法，包括如下步骤：

1)、将枯草芽孢杆菌水浴加热至(60±5)℃，加入黄原胶混匀(使黄原胶包覆在枯草芽孢杆菌表面)，形成枯草芽孢杆菌复合体；

黄原胶与枯草芽孢杆菌的用量比为1～2:1；

2)、于搅拌条件下，将步骤1)得到的枯草芽孢杆菌复合体缓慢加入至(加入时间为5～10分钟)壳聚糖纳米粒悬浮液中，加入完毕后继续搅拌70～90min，得到载枯草芽孢杆菌的纳米壳聚糖悬浮液；

所述壳聚糖纳米粒悬浮液的质量浓度为2％～8％，壳聚糖和枯草芽孢杆菌的质量比为2～4:1，搅拌速度为700～1000r/min；

3)、将步骤2)所得的载枯草芽孢杆菌的纳米壳聚糖悬浮液干燥至水分含量为5％～10％(质量％)，得载菌纳米壳聚糖畜舍消毒剂(即，载枯草芽孢杆菌的纳米壳聚糖复合粉，载枯草芽孢杆菌的纳米壳聚糖畜舍消毒剂)。

作为本发明的制备方法的改进：所述步骤3)的干燥于通氧气(氧气含量为45～55％)、50～60℃的辅助低温下进行。

作为本发明的制备方法的进一步改进：所述枯草芽孢杆菌的菌体总量为≥1.03×10¹⁰cfu/mL。

本发明还同时提供了上述载菌纳米壳聚糖畜舍消毒剂的应用：载菌纳米壳聚糖畜舍消毒剂按1:100～200的质量比与水混合均匀，所得的稀释后消毒剂按照每平方米5～10mL的喷施量喷洒畜舍。

在本发明中，壳聚糖纳米粒悬浮液按照专利号201510417163.4的发明《一种壳聚糖纳米粒悬浮液的制备方法及其应用》制备而得，即，由壳聚糖溶液与三聚磷酸钠水溶液搅拌均匀，制成质量浓度为2％～8％的纳米壳聚糖悬浮液。

所述的黄原胶是由糖类经黄单胞杆菌发酵，产生的胞外微生物多糖，化学式为C₃₅H₄₉O₂₉，具有胶体特性，可作为乳化剂、稳定剂、凝胶增稠剂、浸润剂、膜成型剂等。可通过常规的市购形式获得。

枯草芽孢杆菌为购自中国普通微生物菌种保藏管理中心的CGMCC 1.8715(原始编号SB3295)枯草芽孢杆菌。

本发明的纳米壳聚糖畜舍消毒剂，能用于畜舍消毒，该畜舍消毒剂无毒绿色，对畜禽无有害影响，作用效果持续而稳定，可有效抑制病原微生物繁殖与传播，改善畜舍环境质量。

本发明采用纳米壳聚糖负载枯草芽孢杆菌，制备所得的载枯草芽孢杆菌的纳米壳聚糖具有壳聚糖和枯草芽孢杆菌二者的优良特性，一方面结合了纳米壳聚糖与枯草芽孢杆菌对有害微生物的抑制作用，纳米壳聚糖优化了壳聚糖原本的抗菌抑菌效果，提高了吸附能力；另一方面，壳聚糖纳米离子包覆在枯草芽孢杆菌表面，可控制其释放速度，延长枯草芽孢杆菌的作用时间，达到持续而稳定的抑菌效果，从而改善畜舍空气质量，提高畜禽生产性能。

具体实施方式

以下案例中，枯草芽孢杆菌可购自中国普通微生物菌种保藏管理中心的CGMCC1.8715(原始编号SB3295)枯草芽孢杆菌。经常规的培养方式(例如可参照公开发表于《一株枯草芽孢杆菌培养基及培养条件的优化》的优化后的方法进行培养)，菌体总量达到1.03×10¹⁰cfu/mL。

实施例1、一种载枯草芽孢杆菌的纳米壳聚糖畜舍消毒剂(载菌纳米壳聚糖畜舍消毒剂)的制备方法，依次进行以下步骤：

1)、制备质量浓度为2％的纳米壳聚糖悬浮液：

按照专利号201510417163.4的发明《一种壳聚糖纳米粒悬浮液的制备方法及其应用》的实施例8进行制备而得。

2)、将枯草芽孢杆菌水浴加热至60℃，迅速加入黄原胶，混合均匀，使黄原胶包覆在枯草芽孢杆菌表面，形成枯草芽孢杆菌复合体；

黄原胶与枯草芽孢杆菌的用量比为1:1；

3)、使用数字显示转速电动搅拌机搅拌条件下，将步骤2)得到的枯草芽孢杆菌复合体缓慢加入(加入时间为5分钟)至步骤1)所得的壳聚糖纳米粒悬浮液中，壳聚糖和枯草芽孢杆菌的质量比为2:1(即，纳米壳聚糖悬浮液中的壳聚糖：枯草芽孢杆菌复合体中的枯草芽孢杆菌＝2:1的质量比)，搅拌速度设置为700r/min，加入完毕后继续搅拌70min，得到载枯草芽孢杆菌的纳米壳聚糖悬浮液。

4)、采用通氧气辅助低温的干燥技术(50℃、氧气含量为50％)，将步骤3)所得的载枯草芽孢杆菌的纳米壳聚糖悬浮液干燥至水分含量为总重量的5％，得载枯草芽孢杆菌的纳米壳聚糖复合粉，作为载枯草芽孢杆菌的纳米壳聚糖畜舍消毒剂，备用。

5)、取步骤4)所得的载枯草芽孢杆菌纳米壳聚糖畜舍消毒剂，按质量比1:100的比例与水混合均匀后作为稀释后消毒剂，随机选取5间断奶仔猪舍，按照每平方米5mL的喷施量喷洒稀释后消毒剂。

消毒前先在舍内不同位置(四个角落及中间位置)分别放置不同的5个平皿，10分钟后盖好，取出，然后对舍内喷施稀释后消毒剂，待12小时后再以同样方式放入不同平皿，10分钟后取出；上述平皿均放入37℃恒温培养箱培养24小时，分别计数消毒前与消毒后菌数。计算抑菌率，结果如下：

胸膜肺炎放线杆菌58％、猪链球菌63％、猪大肠杆菌67％、猪副嗜血杆菌65％、猪多杀性巴杆菌71％。

抑菌率的计算方式为消毒前后菌数差除以消毒前菌数，取上述平皿的平均值。

实施例2、一种载枯草芽孢杆菌的纳米壳聚糖畜舍消毒剂的制备方法，依次进行以下步骤：

1)、制备质量浓度为8％的纳米壳聚糖悬浮液：

按照专利号201510417163.4的发明《一种壳聚糖纳米粒悬浮液的制备方法及其应用》的实施例5进行制备而得。

2)、将枯草芽孢杆菌水浴加热至60℃，迅速加入黄原胶，混合均匀，使黄原胶包覆在枯草芽孢杆菌表面，形成枯草芽孢杆菌复合体；

黄原胶与枯草芽孢杆菌的用量比为2:1；

3)、使用数字显示转速电动搅拌机搅拌条件下，将步骤2)得到的枯草芽孢杆菌复合体缓慢加入(加入时间为10分钟)至壳聚糖纳米粒悬浮液中，壳聚糖和枯草芽孢杆菌的质量比为4:1，搅拌速度设置为1000r/min，加入完毕后继续搅拌90min，得到载枯草芽孢杆菌的纳米壳聚糖悬浮液。

4)、采用通氧气辅助低温的干燥技术(60℃、氧气含量为50％)，将步骤3)所得的载枯草芽孢杆菌的纳米壳聚糖悬浮液干燥至水分含量为总重量的10％，得载枯草芽孢杆菌的纳米壳聚糖复合粉，作为载枯草芽孢杆菌的纳米壳聚糖畜舍消毒剂，备用。

5)、稀释后消毒剂由载枯草芽孢杆菌纳米壳聚糖畜舍消毒剂：水＝1:200质量比均匀混合而得，随机选取8间鸡舍，按照每平方米10mL的喷施量喷洒稀释后消毒剂。其余实验方法同实施例1的步骤5)。

所得的抑菌率如下：

鸡金黄色葡萄球菌54％、鸡大肠杆菌63％、鸡白痢沙门氏菌58％、禽多杀性巴氏杆菌65％。

实施例3、一种载枯草芽孢杆菌的纳米壳聚糖畜舍消毒剂的制备方法，依次进行以下步骤：

1)、制备质量浓度为5％的纳米壳聚糖悬浮液：

按照专利号201510417163.4的发明《一种壳聚糖纳米粒悬浮液的制备方法及其应用》的实施例4进行制备而得。

2)、将枯草芽孢杆菌水浴加热至60℃，迅速加入黄原胶，混合均匀，使黄原胶包覆在枯草芽孢杆菌表面，形成枯草芽孢杆菌复合体；

黄原胶与枯草芽孢杆菌的用量比为1.5:1；

3)、使用数字显示转速电动搅拌机搅拌条件下，将步骤2)得到的枯草芽孢杆菌复合体缓慢加入(加入时间为8分钟)至壳聚糖纳米粒悬浮液中，壳聚糖和枯草芽孢杆菌的质量比为3:1，搅拌速度设置为850r/min，加入完毕后继续搅拌80min，得到载枯草芽孢杆菌的纳米壳聚糖悬浮液。

4)、采用通氧气辅助低温的干燥技术(55℃、氧气含量为50％)，将步骤3)所得的载枯草芽孢杆菌的纳米壳聚糖悬浮液干燥至水分含量为总重量的8％，得载枯草芽孢杆菌的纳米壳聚糖复合粉，作为载枯草芽孢杆菌的纳米壳聚糖畜舍消毒剂，备用。

5)、稀释后消毒剂由载枯草芽孢杆菌纳米壳聚糖畜舍消毒剂：水＝1:150质量比均匀混合而得，随机选取6间断奶仔猪舍，按照每平方米8mL的喷施量喷洒稀释后消毒剂。其余实验方法同实施例1的步骤5)。

所得的抑菌率如下：

胸膜肺炎放线杆菌58％、猪链球菌57％、猪大肠杆菌69％、猪副嗜血杆菌61％、猪多杀性巴杆菌65％。

实施例4、一种载枯草芽孢杆菌的纳米壳聚糖畜舍消毒剂的制备方法，依次进行以下步骤：

1)、制备质量浓度为2％的纳米壳聚糖悬浮液：

按照专利号201510417163.4的发明《一种壳聚糖纳米粒悬浮液的制备方法及其应用》的实施例8进行制备而得。

2)、将枯草芽孢杆菌水浴加热至60℃，迅速加入黄原胶，混合均匀，使黄原胶包覆在枯草芽孢杆菌表面，形成枯草芽孢杆菌复合体；

黄原胶与枯草芽孢杆菌的用量比为2:1；

3)、使用数字显示转速电动搅拌机搅拌条件下，将步骤2)得到的枯草芽孢杆菌复合体缓慢加入(加入时间为6分钟)至壳聚糖纳米粒悬浮液中，壳聚糖和枯草芽孢杆菌的质量比为4:1，搅拌速度设置为700r/min，加入完毕后继续搅拌90min，得到载枯草芽孢杆菌的纳米壳聚糖悬浮液。

4)、采用通氧气辅助低温的干燥技术(60℃、氧气含量为50％)，将步骤3)所得的载枯草芽孢杆菌的纳米壳聚糖悬浮液干燥至水分含量为总重量的5％，得载枯草芽孢杆菌的纳米壳聚糖复合粉，作为载枯草芽孢杆菌的纳米壳聚糖畜舍消毒剂，备用。

5)、稀释后消毒剂由载枯草芽孢杆菌纳米壳聚糖畜舍消毒剂：水＝1:100质量比均匀混合而得，随机选取6间鸡舍，按照每平方米5mL的喷施量喷洒稀释后消毒剂。其余实验方法同实施例1的步骤5)。

所得的抑菌率如下：

鸡金黄色葡萄球菌58％、鸡大肠杆菌55％、鸡白痢沙门氏菌65％、禽多杀性巴氏杆菌62％。

对比例1、实施例1步骤1)中纳米壳聚糖悬浮液的质量浓度由2％改成12％，其余等同于实施例1；所得的抑菌率如下：

胸膜肺炎放线杆菌50％、猪链球菌53％、猪大肠杆菌61％、猪副嗜血杆菌56％、猪多杀性巴杆菌58％。

对比例2-1、实施例1步骤3)中壳聚糖和枯草芽孢杆菌的质量比由2:1改成8:1，其余等同于实施例1；所得的抑菌率如下：

胸膜肺炎放线杆菌41％、猪链球菌47％、猪大肠杆菌51％、猪副嗜血杆菌45％、猪多杀性巴杆菌43％。

对比例2-2、实施例1步骤3)中壳聚糖和枯草芽孢杆菌的质量比由2:1改成1:1，其余等同于实施例1；所得的抑菌率如下：

胸膜肺炎放线杆菌50％、猪链球菌51％、猪大肠杆菌56％、猪副嗜血杆菌55％、猪多杀性巴杆菌60％。

对比例3、取消实施例1步骤1)的喷雾，即，取消黄原胶的使用；在步骤2)中，以枯草芽孢杆菌替代枯草芽孢杆菌复合体，其余等同于实施例1；所得的抑菌率如下：

胸膜肺炎放线杆菌46％、猪链球菌52％、猪大肠杆菌53％、猪副嗜血杆菌47％、猪多杀性巴杆菌49％。

对比例4、取消实施例1步骤4)的“通氧气辅助低温(50℃)干燥”改成常规的“50℃的通风干燥”，其余等同于实施例1；所得的抑菌率如下：

胸膜肺炎放线杆菌43％、猪链球菌42％、猪大肠杆菌45％、猪副嗜血杆菌50％、猪多杀性巴杆菌49％。

对比例5、实施例2步骤3)中的搅拌速度由1000r/min改成300r/min，加入完毕后继续搅拌的时间由90min改成50min；其余等同于实施例2；所得的抑菌率如下：

鸡金黄色葡萄球菌37％、鸡大肠杆菌46％、鸡白痢沙门氏菌45％、禽多杀性巴氏杆菌50％。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (5)

1.载菌纳米壳聚糖畜舍消毒剂，其特征在于：所述消毒剂由壳聚糖和枯草芽孢杆菌按照2～4:1的质量比混合而成。

2.如权利要求1所述的载菌纳米壳聚糖畜舍消毒剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

1)、将枯草芽孢杆菌水浴加热至(60±5)℃，加入黄原胶混匀，形成枯草芽孢杆菌复合体；

黄原胶与枯草芽孢杆菌的用量比为1～2:1；

2)、于搅拌条件下，将步骤1)得到的枯草芽孢杆菌复合体缓慢加入至壳聚糖纳米粒悬浮液中，加入完毕后继续搅拌70～90min，得到载枯草芽孢杆菌的纳米壳聚糖悬浮液；

所述壳聚糖纳米粒悬浮液的质量浓度为2％～8％，壳聚糖和枯草芽孢杆菌的质量比为2～4:1，搅拌速度为700～1000r/min；

3)、将步骤2)所得的载枯草芽孢杆菌的纳米壳聚糖悬浮液干燥至水分含量为5％～10％，得载菌纳米壳聚糖畜舍消毒剂。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤3)的干燥于通氧气、50～60℃的辅助低温下进行。

4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌的菌体总量为≥1.03×10¹⁰cfu/mL。

5.如权利要求1所述的载菌纳米壳聚糖畜舍消毒剂的应用，其特征在于：载菌纳米壳聚糖畜舍消毒剂按1:100～200的质量比与水混合均匀，所得的稀释后消毒剂按照每平方米5～10mL的喷施量喷洒畜舍。