CN105001433A - 一种壳聚糖纳米粒悬浮液的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种壳聚糖纳米粒悬浮液的制备方法及其应用，所述壳聚糖纳米粒悬浮液的制备方法包括如下步骤：(1)将壳聚糖溶于冰醋酸水溶液中，制备壳聚糖醋酸水溶液；(2)搅拌条件下，逐滴滴加三聚磷酸钠水溶液，得到壳聚糖纳米粗悬浮液；(3)将壳聚糖纳米粗悬浮液过滤后经高压匀质处理，得到粒径分布均匀的纳米壳聚糖悬浮液。本发明制备操作简便、规模化制备重现性好，生产成本低，适合于工业化生产，制成的纳米粒形态均匀，具有较小的粒径和较好的稳定性，可应用于抗菌、止血、促进组织修复等产品的制备。

Description

一种壳聚糖纳米粒悬浮液的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及高分子多糖领域，具体涉及一种壳聚糖纳米粒悬浮液的制备方法及其应用。

背景技术

壳聚糖作为天然带正电荷的多糖，具有生物相容性好、黏膜吸附性好、体内可降解的特点。长期以来，壳聚糖在医药领域的主要应用是作为药物载体材料。壳聚糖载药微球能够对药物进行控制释放，实现缓释、控释和靶向释放药物的功能。提高药物的稳定性，降低药物的毒性。

近年来大量研究已经证明，壳聚糖具有止血、抗菌、促进组织修复、抗肿瘤、降血脂、免疫调节、抗衰老、抗氧化、保湿、润肤、护肤、护发等生物学活性，在医药产品、医药材料、组织工程等领域中已崭露头角。壳聚糖在生物工程领域作为生物可降解的生物材料，既能为机体提供屏障或支架，又能在作用完成后降解成人体可吸收的物质，减少了排异反应、炎症及其它不良影响，对组织、骨骼、器官的修复重建具有重要意义。以壳聚糖为基础的抗菌敷料、喷剂、膜剂、凝胶剂等已经开发上市，用于止血、创伤和各类疾病。以壳聚糖为基础的生物支架，如体外细胞培养支架，天然材料-壳聚糖复合支架，如壳聚糖-羟基磷灰石成骨细胞修复重建支架和人工合成材料壳聚糖复合支架，如聚乳酸-羟基乙酸复合壳聚糖血管生长支架。温敏性壳聚糖水凝胶。

壳聚糖具有显著的抗菌作用，可以有效地抑制体内致病菌的生长。壳聚糖具有促进止血的作用，壳聚糖带有一定量的正电荷，能激活凝血系统，在静电吸引力的作用下将带阴离子的红细胞聚集在一起，促进血小板黏附与聚集，迅速形成血凝块，将血液凝固。另外，壳聚糖本身独特的分子结构，可以结合一些主要血浆蛋白与重要的凝血因子，从而进一步牢固血凝块。壳聚糖具有促进组织修复和创面愈合作用，主要包括血小板的聚集、血液的凝固、纤维蛋白的形成、炎性反应的发生、基质的变化、细胞的增殖和再生以及受损组织的修复和重塑等过程。壳聚糖通过对上皮细胞的再生的促进作用，介导细胞的增殖来促进伤口的愈合，通过较为温和的急性炎性反应可以吸引多形核细胞以及巨噬细胞，从而清除组织中的碎片及血凝块。另外，壳聚糖对纤维细胞的迁移有选择性地促进促进作用，趋化、迁移、激活基质细胞，加速细胞的增殖和组织的重塑过程，促进皮肤组织的修复再生。许多研究表明壳聚糖能增加新骨质形成，诱导骨组织再生。壳聚糖具有良好的可生物降解性，在体内会被分解，主要为苷键在多种酶的作用下易发生断裂，导致壳聚糖的降解。生成的氨基葡萄糖为无毒小分子化合物，不仅能够被人体组织吸收利用，而且能呈现良好的组织作用。

由于壳聚糖具有良好的生物安全性和生物学功能，在食品加工业上可用作为保鲜剂、增稠剂、抗氧化剂、果汁澄清剂、脱色剂、抗菌剂、食品防腐剂等广泛应用于食品工业中。

壳聚糖具有良好的保湿、护发、润肤、护肤、抗静电、抗衰老、防皱,可增加皮肤弹性等功效,广泛用于制备洁肤和护肤液、护肤霜、乳液、护发香波、面膜等。

但壳聚糖在中性水溶液中的难溶性问题是壳聚糖在医药产品应用中的主要障碍之一。采用纳米化技术，可以极大地增加壳聚糖的比表面积，提高壳聚糖在中性溶液中的溶解性，从而显著提高壳聚糖的生物活性，弥补难溶性问题所带来的缺陷。将壳聚糖纳米化后不仅可以改善它的溶解性，还有助于增强生物活性。壳聚糖纳米颗粒更容易吸附到黏膜表面，完整的壳聚糖纳米颗粒能够被人体细胞吞噬，从而显著提高生物利用率。

目前常规技术通常采取离子凝胶、共价交联和沉淀凝聚等方法制备各种壳聚糖纳米粒。离子凝胶法是将三聚磷酸钠加入到壳聚糖溶液中，利用壳聚糖分子上的游离氨基与三聚磷酸钠的阴离子发生分子间或分子内交联反应制得纳米粒。共价交联法是指在一定条件下，利用壳聚糖分子链上的氨基或羟基，与化学交联剂发生反应，制备出纳米药物载体。常用方法是利用戊二醛为交联剂与壳聚糖的游离氨基进行交联。沉淀法是在壳聚糖的醋酸溶液中加入聚山梨酯80(Tween-80)作为分散剂，在搅拌和超声下逐渐滴加硫酸钠溶液，借助硫酸钠的去溶剂化作用沉淀出纳米粒子。上述制备方法分别具有以下缺点：制备的纳米粒粒径较大，长时间放置易发生沉降聚集，纳米粒稳定性差；操作步骤较复杂，实验室小试到大批量生产重现性较差，制备过程中使用的有机溶剂、交联剂、表面活性剂会残留于所制得的壳聚糖颗粒中等。

发明内容

本发明的目的是提供一种稳定性较好的壳聚糖纳米粒悬浮液的制备方法及其应用。

为了实现上述技术问题，本发明提供的技术方案为：本发明提供了一种壳聚糖纳米粒悬浮液的制备方法，包括如下步骤：

(1)将壳聚糖溶于冰醋酸水溶液,制备壳聚糖醋酸水溶液；

(2)在搅拌条件下，滴加三聚磷酸钠水溶液，搅拌制备壳聚糖纳米粗悬浮液；

(3)将壳聚糖纳米粗悬浮液经高压匀质处理，得到壳聚糖纳米粒悬浮液。

进一步地，在步骤(1)中，将壳聚糖溶于重量百分含量为0.1％～2.0％的冰醋酸水溶液中,制备壳聚糖醋酸水溶液；

在步骤(2)中，搅拌条件下，滴加重量百分含量为0.1～1％的三聚磷酸钠水溶液，三聚磷酸钠与壳聚糖的重量比为1：2～8，滴加速度为1～2ml/min，继续搅拌40～100min，得到壳聚糖纳米粗悬浮液；

在步骤(3)中，将壳聚糖纳米粗悬浮液过滤，进行高压匀质处理，压力为500～800Mpa，循环匀质次数为5～15次，得到壳聚糖纳米粒悬浮液。

进一步地，在步骤(1)中，将壳聚糖溶于重量百分含量为0.1％～2.0％的冰醋酸水溶液中,制备壳聚糖醋酸溶液；

在步骤(2)中，滴加重量百分含量为0.1～1％的三聚磷酸钠水溶液，三聚磷酸钠与壳聚糖的重量比为1：4～6，滴加速度为1～2ml/min，继续搅拌60～80min，得到壳聚糖纳米粗悬浮液；

在步骤(3)中，将壳聚糖纳米粗悬浮液过滤，进行高压匀质处理，高压匀质的压力为500～800Mpa，循环次数为10次,得到重量百分含量为0.1-5％的壳聚糖纳米粒悬浮液。

更进一步地，在步骤(1)中，将壳聚糖溶于重量百分含量为0.1％～2.0％的冰醋酸水溶液中,制备壳聚糖醋酸溶液；

在步骤(2)中，滴加重量百分含量为0.1～1％的三聚磷酸钠水溶液，三聚磷酸钠与壳聚糖的重量比为1：5，滴加速度为1～2ml/min，继续搅拌60～80min，得到壳聚糖纳米粗悬浮液；

在步骤(3)中，将壳聚糖纳米粗悬浮液过滤，进行高压匀质处理，高压匀质的压力为500～800Mpa，循环次数为10次，得到壳聚糖纳米粒悬浮液。

进一步地，在步骤(3)中，加入高分子辅料，所述高分子辅料为羟丙甲纤维素HPMC、聚乙二醇PEG、聚维酮PVP、泊洛沙姆Poloxamer、卡波姆Carbopol、环糊精CDs中的一种或几种的组合，制备壳聚糖纳米粒悬浮液。

进一步地，在步骤(3)中，加入高分子辅料，所述高分子辅料的重量百分含量为0.05％～2.0％，制备壳聚糖纳米粒悬浮液。

更进一步地，在步骤(1)中，所述壳聚糖的平均分子量为10000～1500000，脱乙酰度大于50％；所述壳聚糖为壳聚糖或壳聚糖衍生物中的一种或几种的组合；

在步骤(3)中，所述的环糊精为β环糊精、羟丙基β环糊精、磺丁基β环糊精、甲基β环糊精中的一种或多种的组合；

所述羟丙甲纤维素HPMC为粘度在30～200000毫帕·秒范围内的一种或多种的组合；

所述聚乙二醇PEG为平均分子量在400～20000范围内的一种或多种的组合；

所述聚维酮PVP为平均分子量在10000～630000范围内的一种或多种的组合；

所述泊洛沙姆Poloxamer为平均分子量在1000～50000范围内的一种或多种的组合；

卡波姆Carbomer为类型在910、934、934P、940、941或1342范围内的一种或几种的组合。

本发明所述壳聚糖纳米粒悬浮液在制备具有治疗和保健作用的膜剂、海绵剂、凝胶剂、喷雾剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、注射剂、软膏剂、栓剂、生物医用支架材料、细胞培养支架材料或医用敷料材料中的应用。

本发明所述壳聚糖纳米粒悬浮液在抗菌、止血、促进组织修复、抗肿瘤、降血脂、免疫调节、抗衰老、抗氧化、保湿、润肤、护肤、护发作用的医药健康产品以及食品保鲜剂、防腐剂、增稠剂、澄清脱色剂或金属离子螯合剂中的应用。

有益效果：本发明外观形状均匀一致，粒径可控、稳定性较好、生物相容性好、亲水性好、制备操作简便、规模化放大重现性好，适合于工业化生产。具有较好的稳定性和生物活性，对于人体组织具有更好的生物相容性，生物安全性好，可应用于各类医药健康产品，可应用于制备生物医用材料和医疗器械如生物支架、医用敷料等。

相对于现有技术，本发明具有如下优点：

(1)本发明通过采用离子凝胶处理、高压匀质处理的组合技术，提出的技术方案的效果显著优于常规技术。此外，本发明采用高分子辅料与本技术方案结合，进一步显著改善了壳聚糖纳米粒的性能，优化了制备参数和原辅料配比，实现了最佳效果。

(2)解决了壳聚糖在纳米化和稳定性的技术难题，并保证最终产品质量。粒径小、稳定性好、适合于工业化生产制备、生物安全好，环保绿色、便于医药、食品、化妆、健康产品的处方的制备。

附图说明

为了易于说明，本发明由下述的具体实施例及附图作以详细描述；

图1为壳聚糖的结构式；

图2为离子凝胶法IGT法制备的壳聚糖纳米粒(×2.0k)的电子显微镜图；

图3为为本发明方案制备的壳聚糖纳米粒(×4.0k)的电子显微镜图。

具体实施方式

以下通过实施例进一步说明本发明。应该理解的是，这些实施例是本发明的阐释和举例，并不以任何形式限制本发明的范围。

本发明提供了一种壳聚糖纳米粒悬浮液的制备方法，包括如下步骤：

(1)将壳聚糖溶于重量百分含量为0.1％～2.0％的冰醋酸水溶液中,制备壳聚糖醋酸溶液；所述壳聚糖的平均分子量为10000～1500000，脱乙酰度大于50％；所述壳聚糖为羧甲基壳聚糖或改性壳聚糖中的一种或两种的组合；

(2)搅拌条件下，滴加重量百分含量为0.1～1％的三聚磷酸钠水溶液，三聚磷酸钠与壳聚糖的重量比为1：2～8，滴加速度为1～2ml/min，继续搅拌40～100min，得到壳聚糖纳米粗悬浮液；

(3)将壳聚糖纳米粗悬浮液过滤，进行高压匀质处理，压力为500～800Mpa，循环匀质次数为5～15次，得到壳聚糖纳米粒悬浮液。

加入高分子辅料，所述高分子辅料为羟丙甲纤维素HPMC、聚乙二醇PEG、聚维酮PVP、泊洛沙姆Poloxamer、卡波姆Carbopol、环糊精CDs中的一种或几种的组合，制备壳聚糖纳米粒悬浮液。

加入高分子辅料，所述高分子辅料的重量百分含量为0.05％～2.0％，制备壳聚糖纳米粒悬浮液。

所述壳聚糖的平均分子量为10000～1500000，脱乙酰度大于50％；所述壳聚糖为壳聚糖或壳聚糖衍生物中的一种或几种的组合,如羧甲基壳聚糖、改性壳聚糖。

所述的环糊精为β环糊精、羟丙基β环糊精、磺丁基β环糊精、甲基β环糊精中的一种或多种的组合。规格可以为药用级环糊精、医用级环糊精或食品级环糊精。

所述羟丙甲纤维素HPMC为粘度在30～200000毫帕·秒范围内的一种或多种的组合；规格可以为药用级羟丙甲纤维素、医用级羟丙甲纤维素或食品级羟丙甲纤维素；

所述聚乙二醇PEG为平均分子量在400～20000范围内的一种或多种的组合；规格可以为药用级聚乙二醇、医用级聚乙二醇、食品级聚乙二醇；

所述聚维酮PVP为聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone)，平均分子量在10000～630000范围内的一种或多种的组合；规格可以为药用级聚维酮PVP、医用级聚维酮PVP、食品级聚维酮PVP，型号可以为K-15、K-30或K-90。

所述泊洛沙姆Poloxamer为平均分子量在1000～50000范围内的一种或多种的组合；所述泊洛沙姆Poloxamer的型号为108，124,182，188,215，235，237,333,334，338,407，F108，F128，F127，F107，P103，P104，F87，P85，P75，F68，L62，L92，F38。规格可以为药用级泊洛沙姆、医用级泊洛沙姆或食品级泊洛沙姆；

卡波姆Carbomer为类型在910、934、934P、940、941或1342范围内的一种或几种的组合。规格可以为药用级卡波姆、医用级卡波姆或食品级卡波姆。

本发明所述壳聚糖纳米粒悬浮液在制备具有治疗和保健作用的膜剂、海绵剂、凝胶剂、喷雾剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、注射剂、软膏剂、栓剂、生物医用支架材料、细胞培养支架材料或医用敷料材料中的应用。

本发明所述壳聚糖纳米粒悬浮液在抗菌、止血、促进组织修复、抗肿瘤、降血脂、免疫调节、抗衰老、抗氧化、保湿、润肤、护肤、护发作用的医药健康产品以及食品保鲜剂、防腐剂、增稠剂、澄清脱色剂或金属离子螯合剂中的应用。

实施例1

称取适量壳聚糖粉末，溶于重量百分含量为1％的冰醋酸溶液，制备壳聚糖醋酸溶液。在搅拌下，将重量百分含量为0.2％的三聚磷酸钠溶液缓慢滴加到壳聚糖醋酸溶液中，滴加速度为1～2ml/min，三聚磷酸钠与壳聚糖的重量比为1:5。继续搅拌60min，得到壳聚糖纳米粗悬浮液。取壳聚糖纳米粗悬浮液，置入高压匀质机中，压力为500Mpa，反复匀质10次，收集得到重量百分含量为0.5％的壳聚糖纳米粒悬浮液。

与本发明有关的壳聚糖纳米粒的电子显微镜图见附图。离子凝胶法IGT法制备的壳聚糖纳米粒(×2.0k)如图2所示，外观形态各异，粒径较大；图3为本发明方案制备的壳聚糖纳米粒(×4.0k)，外观形态均匀一致，粒径明显变小。

实施例2

称取适量壳聚糖粉末，溶于重量百分含量为0.1％的冰醋酸溶液，制备壳聚糖醋酸溶液。在搅拌下，将重量百分含量为1％三聚磷酸钠溶液缓慢滴加到壳聚糖醋酸溶液中，滴加速度为1～2ml/min，三聚磷酸钠与壳聚糖的重量比为1:8。继续搅拌40min，得到壳聚糖纳米粗悬浮液。取壳聚糖纳米粗悬浮液，置入高压匀质机中，压力为500Mpa匀质5次，压力为800Mpa匀质5次，收集得到重量百分含量为1％的壳聚糖纳米粒悬浮液。

实施例3

称取适量壳聚糖粉末，溶于重量百分含量为0.5％的冰醋酸溶液，制备壳聚糖醋酸溶液。在搅拌下，将重量百分含量为0.5％的三聚磷酸钠溶液缓慢滴加到壳聚糖醋酸溶液中，滴加速度为1～2ml/min，三聚磷酸钠与壳聚糖的重量比为1:2。继续搅拌100min，得到壳聚糖纳米粗悬浮液。取壳聚糖纳米粗悬浮液，置入高压匀质机中，压力为800Mpa，反复匀质10次，收集得到重量百分含量为0.1％的壳聚糖纳米粒悬浮液。

实施例4

称取适量壳聚糖粉末，溶于重量百分含量为2％的冰醋酸溶液，制备壳聚糖醋酸溶液。在搅拌下，将重量百分含量为0.8％的三聚磷酸钠溶液缓慢滴加到壳聚糖醋酸溶液中，滴加速度为1～2ml/min，三聚磷酸钠与壳聚糖的重量比为1:6。继续搅拌60min，得到壳聚糖纳米粗悬浮液。取壳聚糖纳米粗悬浮液，置入高压匀质机中，压力为800Mpa匀质5次，收集得到重量百分含量为5％的壳聚糖纳米粒悬浮液。

实施例5

称取适量壳聚糖粉末，溶于重量百分含量为1％的冰醋酸溶液，制备壳聚糖醋酸溶液。在搅拌下，将重量百分含量为0.4％的三聚磷酸钠溶液缓慢滴加到壳聚糖醋酸溶液中，滴加速度为1～2ml/min，三聚磷酸钠与壳聚糖的重量比为1:5。继续搅拌80min，得到壳聚糖纳米粗悬浮液。取壳聚糖纳米粗悬浮液，置入高压匀质机中，压力为500Mpa，反复匀质15次，收集得到重量百分含量为8％的壳聚糖纳米粒悬浮液。

实施例6

称取适量壳聚糖粉末，溶于重量百分含量为1％的冰醋酸溶液，制备壳聚糖醋酸溶液。在室温搅拌下，将重量百分含量为0.5％的三聚磷酸钠溶液缓慢滴加到壳聚糖醋酸溶液中，滴加速度为1～2ml/min，三聚磷酸钠与壳聚糖的重量比为1:6。继续搅拌60min，得到壳聚糖纳米粗悬浮液。取壳聚糖纳米粗悬浮液，加入泊洛沙姆-188后使浓度达到0.05％，混合均匀，置入高压匀质机中，压力为600Mpa，反复匀质10次，收集得到重量百分含量为0.8％的壳聚糖纳米粒悬浮液。

实施例7

称取适量壳聚糖粉末，溶于重量百分含量为1％的冰醋酸溶液，制备壳聚糖醋酸溶液。在搅拌下，将重量百分含量为0.3％的三聚磷酸钠溶液缓慢滴加到壳聚糖醋酸溶液中，滴加速度为1～2ml/min，三聚磷酸钠与壳聚糖的重量比为1:4。继续搅拌60min，得到壳聚糖纳米粗悬浮液。取壳聚糖纳米粗悬浮液，置入高压匀质机中，压力为500Mpa，反复匀质15次，加入泊洛沙姆-407使浓度达到0.2％，混合均匀，收集得到重量百分含量为1％的壳聚糖纳米粒悬浮液。

实施例8

称取适量壳聚糖粉末，溶于重量百分含量为0.6％的冰醋酸溶液，制备壳聚糖醋酸溶液。在搅拌下，将重量百分含量为1％的三聚磷酸钠溶液缓慢滴加到壳聚糖醋酸溶液中，滴加速度为1～2ml/min，三聚磷酸钠与壳聚糖的重量比为1:5。继续搅拌100min，得到壳聚糖纳米粗悬浮液。取壳聚糖纳米粗悬浮液，加入PEG-1500后使浓度达到1％，混合均匀，置入高压匀质机中，压力为800Mpa，反复匀质10次，收集得到重量百分含量为2％的壳聚糖纳米粒悬浮液。

实施例9

称取适量壳聚糖粉末，溶于重量百分含量为1.5％的冰醋酸溶液，制备壳聚糖醋酸溶液。在搅拌下，将重量百分含量为0.9％的三聚磷酸钠溶液缓慢滴加到壳聚糖醋酸溶液中，滴加速度为1～2ml/min，三聚磷酸钠与壳聚糖的重量比为1:8。继续搅拌80min，得到壳聚糖纳米粒粗悬浮液。取壳聚糖纳米粗悬浮液，置入高压匀质机中，压力为800Mpa，反复匀质8次，加入PVP后使浓度达到2％，混合均匀，收集得到8％壳聚糖纳米粒悬浮液。

实施例10

称取适量壳聚糖粉末，溶于重量百分含量为1％的冰醋酸溶液，制备壳聚糖醋酸溶液。在搅拌下，将重量百分含量为1％的三聚磷酸钠溶液缓慢滴加到壳聚糖醋酸溶液中，滴加速度为1～2ml/min，三聚磷酸钠与壳聚糖的重量比为1:3。继续搅拌90min，得到壳聚糖纳米粒粗悬浮液。取壳聚糖纳米粗悬浮液，加入HP-β-CD后使浓度达到0.2％，混合均匀，置入高压匀质机中，压力为700Mpa，反复匀质12次，收集得到重量百分含量为0.7％的壳聚糖纳米粒悬浮液。

实施例11

称取适量壳聚糖粉末，溶于重量百分含量为1％的冰醋酸溶液，制备壳聚糖醋酸溶液。在搅拌下，将重量百分含量为0.8％的三聚磷酸钠溶液缓慢滴加到壳聚糖醋酸溶液中，滴加速度为1～2ml/min，三聚磷酸钠与壳聚糖的重量比为1:4。室温下继续搅拌60min，得到壳聚糖纳米粗悬浮液。取壳聚糖纳米粗悬浮液，加入PVP K-30、β-CD、PEG400后使浓度达到1.2％，置入高压匀质机中，压力为500Mpa匀质6次，压力为800Mpa匀质4次，收集得到重量百分含量为2％的壳聚糖纳米粒悬浮液。

实施例12

称取适量壳聚糖粉末，溶于重量百分含量为1％的冰醋酸溶液，制备壳聚糖醋酸溶液。在搅拌下，将重量百分含量为0.5％的三聚磷酸钠溶液缓慢滴加到壳聚糖醋酸溶液中，滴加速度为1～2ml/min，三聚磷酸钠与壳聚糖的重量比为1:6。继续搅拌60min，得到壳聚糖纳米粗悬浮液。取壳聚糖纳米粗悬浮液，置入高压匀质机中，压力为500Mpa匀质3次，压力为800Mpa匀质2次，，加入HPMC、HP-β-CD及泊洛沙姆-188后使浓度达到1.4％，收集得到重量百分含量为1.2％的壳聚糖纳米粒悬浮液。

实施例13

称取适量壳聚糖粉末，溶于重量百分含量为1％的冰醋酸溶液，制备壳聚糖醋酸溶液。在搅拌下，将重量百分含量0.8％的三聚磷酸钠溶液缓慢滴加到壳聚糖醋酸溶液中，滴加速度为1～2ml/min，三聚磷酸钠与壳聚糖的重量比为1:5。继续搅拌60min，得到壳聚糖纳米粗悬浮液。取壳聚糖纳米粗悬浮液，置入高压匀质机中，压力为500Mpa匀质10次，加入甲基β环糊精后使浓度达到0.3％，收集得到重量百分含量为8％的壳聚糖纳米粒悬浮液。

实施例14

称取适量壳聚糖粉末，溶于重量百分含量为1％的冰醋酸溶液，制备壳聚糖醋酸溶液。在搅拌下，将重量百分含量为0.8％的三聚磷酸钠溶液缓慢滴加到壳聚糖醋酸溶液中，滴加速度为1～2ml/min，三聚磷酸钠与壳聚糖的重量比为1:5。继续搅拌60min，得到壳聚糖纳米粗悬浮液。取壳聚糖纳米粗悬浮液，加入卡波姆Carbomer后使浓度达到0.8％，置入高压匀质机中，压力为500Mpa匀质10次，收集得到重量百分含量为3％的壳聚糖纳米粒悬浮液。

实施例15

称取适量壳聚糖粉末，溶于重量百分含量为1％的冰醋酸溶液，制备壳聚糖醋酸溶液。在搅拌下，将重量百分含量为0.8％的三聚磷酸钠溶液缓慢滴加到壳聚糖醋酸溶液中，滴加速度为1～2ml/min，三聚磷酸钠与壳聚糖的重量比为1:5。继续搅拌60min，得到壳聚糖纳米粗悬浮液。取壳聚糖纳米粗悬浮液，加入PEG4000后使浓度达到0.8％，置入高压匀质机中，压力为500Mpa匀质10次，收集得到重量百分含量为1％的壳聚糖纳米粒悬浮液。

实施例16

实施例16与实施例1基本相同，但采用所得到的壳聚糖纳米粒悬浮液制备膜剂，其余同实施例1。

实施例17

实施例17与实施例2基本相同，但采用所得到的壳聚糖纳米粒悬浮液制备海绵剂，其余同实施例2。

实施例18

实施例18与实施例6基本相同，但采用所得到的壳聚糖纳米粒悬浮液制备软膏剂，其余同实施例6。

实施例19

实施例19与实施例7基本相同，但采用所得到的壳聚糖纳米粒悬浮液制备凝胶剂，其余同实施例7。

实施例20

实施例20与实施例8基本相同，但采用所得到的壳聚糖纳米粒悬浮液制备喷雾剂，其余同实施例8。

实施例21

实施例21与实施例9基本相同，但采用所得到的壳聚糖纳米粒悬浮液制备溶液剂，其余同实施例9。

实施例22

实施例22与实施例9基本相同，但采用所得到的壳聚糖纳米粒悬浮液制备混悬剂，其余同实施例9。

实施例23

实施例23与实施例10基本相同，但采用所得到的壳聚糖纳米粒悬浮液制备乳剂，其余同实施例10。

实施例24

实施例24与实施例6基本相同，但采用所得到的壳聚糖纳米粒悬浮液制备注射剂，其余同实施例6。

实施例25

实施例25与实施例11基本相同，但采用所得到的壳聚糖纳米粒悬浮液制备壳聚糖明胶复合口腔止血敷料，其余同实施例11。

实施例26

实施例26与实施例11基本相同，但采用所得到的壳聚糖纳米粒悬浮液制备聚乳酸-羟基乙酸壳聚糖复合支架，作为血管生长载体，其余同实施例11。

实施例27

实施例27与实施例11基本相同，但采用所得到的壳聚糖纳米粒悬浮液制备壳聚糖-羟基磷灰石复合支架，作为软骨修复和重建载体，其余同实施例11。

实施例28

实施例28与实施例6基本相同，但采用所得到的壳聚糖纳米粒悬浮液制备抗菌剂，其余同实施例6。

实施例29

实施例29与实施例6基本相同，但采用所得到的壳聚糖纳米粒悬浮液制备抗肿瘤温敏凝胶剂，其余同实施例6。

实施例30

实施例30与实施例6基本相同，但采用所得到的壳聚糖纳米粒悬浮液制备降血脂溶剂剂，其余同实施例6。

实施例31

实施例31与实施例6基本相同，但采用所得到的壳聚糖纳米粒悬浮液制备抗衰老润肤护肤乳，其余同实施例6。

实施例32

实施例32与实施例6基本相同，但采用所得到的壳聚糖纳米粒悬浮液制备保湿护发液，其余同实施例6。

实施例33

实施例33与实施例6基本相同，但采用所得到的壳聚糖纳米粒悬浮液制备食品保鲜剂，其余同实施例6。

实施例34

实施例34与实施例6基本相同，但采用所得到的壳聚糖纳米粒悬浮液制备防腐添加剂，其余同实施例6。

实施例35

实施例35与实施例6基本相同，但采用所得到的壳聚糖纳米粒悬浮液制备化妆品增稠剂，其余同实施例6。

实施例36

实施例36与实施例6基本相同，但采用所得到的壳聚糖纳米粒悬浮液制备澄清脱色剂，其余同实施例6。

实施例37

实施例37与实施例6基本相同，但采用所得到的壳聚糖纳米粒悬浮液制备金属离子螯合剂，其余同实施例6。

实施例38

实施例38与实施例6基本相同，但采用改性壳聚糖制备壳聚糖纳米粒悬浮液，其余同实施例6。

实施例39

实施例39与实施例12基本相同，但加入PEG400和PEG6000制备壳聚糖纳米粒悬浮液，其余同实施例12。

实施例40

实施例40与实施例10基本相同，但加入HP-β-CD和β-CD制备壳聚糖纳米粒悬浮液，其余同实施例10。

实施例41

实施例41与实施例2基本相同，但采用改性壳聚糖和羧甲基壳聚糖制备壳聚糖纳米粒悬浮液，其余同实施例2。

试验1 不同制备方法样品的比较

实验用试剂、药品等由合法渠道提供。

(1)样品制备方法：

样品1

称取适量壳聚糖粉末，溶于重量百分含量为1％的冰醋酸溶液，制备壳聚糖醋酸溶液。在搅拌条件下，将重量百分含量为0.2％的三聚磷酸钠溶液滴加到壳聚糖醋酸溶液中，滴加速度为1～2ml/min，三聚磷酸钠与壳聚糖的重量比为1:5。继续搅拌60min，得到重量百分含量为1％的壳聚糖纳米粒悬浮液，制得样品1。

样品2

称取适量壳聚糖粉末，制备壳聚糖混悬液。取壳聚糖混悬液，置入高压匀质机中，压力为500Mpa，反复匀质20次，收集得到重量百分含量为1％的壳聚糖纳米粒悬浮液，制得样品2。

样品3

称取适量壳聚糖粉末，溶于重量百分含量为1％的冰醋酸溶液，制备壳聚糖醋酸溶液。在搅拌下，将重量百分含量为0.2％的三聚磷酸钠溶液滴加到壳聚糖醋酸溶液中，滴加速度为1～2ml/min，三聚磷酸钠与壳聚糖的重量比为1:5。继续搅拌60min，得到壳聚糖纳米粒粗悬浮液。取壳聚糖纳米粗悬浮液，置入高压匀质机中，压力为500Mpa，反复匀质10次，收集得到重量百分含量为1％的壳聚糖纳米粒悬浮液，制得样品3。

(2)样品稳定性考察

分别取样品各10mL，装入20mL西林瓶中，瓶口密封，在25℃下放置6个月。在规定时间测定纳米粒的粒径和电位，比较各样品的外观变化。

(3)琼脂扩散法抑菌测定试验

将100μL白色念珠菌悬液接种于马铃薯葡萄糖琼脂板(PDA)，在培养基上等距离地用牛津杯打直径为8mm、高度为3mm的孔。平板干燥后，每孔加入100μL不同样品。将平板于4℃下放置2h后，于37℃孵化24h。测量抑菌圈的直径，采用无菌蒸馏水为阴性对照，采用硝酸咪康唑(100μg/mL)为阳性对照，评价样品的抑菌作用。

(4)实验结果

具体结果如下：

表1为不同制备方法制备壳聚糖纳米粒的粒径以及电位

表1

注：与样品1或样品2相比，﹡P<0.01；#P<0.05。

表2为不同壳聚糖纳米粒25℃下放置6个月粒径和电位的变化(x±S.D.，n＝3)。

表2

注：与样品1或样品2相比，﹡P<0.05

表3为不同样品抑菌圈比较(x±S.D.，n＝3)

表3

注：与阴性对照组相比，﹡P<0.01；与样品1或样品2相比，▲P<0.05。

从表1至表3可知，样品3使用的是本发明的技术方案，其方法显著优于离子凝胶或高压均质处理单独使用的效果，优化方案产生意想不到的效果。

本发明所述的“离子凝胶处理与高压均质处理组合”的优化方案显著改善了壳聚糖纳米粒的外观形状、平均粒径、电位和稳定性，产生意想不到的效果。本发明方案优于任一技术单独使用或其它组合的效果。

本发明技术方案的组合物进行了系统的理化表征、稳定性考察和药理活性评价。在表征研究中，建立了电镜分析和粒径电位作为技术指标。在药理活性研究中，设计了抗菌药效实验。在稳定性考察中，考察了25℃条件下6个月的稳定性。结果表明本发明技术方案所制备的壳聚糖纳米粒的平均粒径为50～300nm纳米，其表面电位为25～35mv。

更重要的是，与单独采用离子凝胶法处理或高压均质处理的壳聚糖纳米粒相比，本发明组合物具有显著优势。本发明方案中处理方法的优化、制备参数的优化和原辅料比例的优化均能产生意想不到的效果，特别是这三个优化方案联合应用可以具有更显著的优势。

试验2 不同制备参数样品的比较

实验用试剂、药品等由合法渠道提供。

(1)样品制备方法：

样品4

称取适量壳聚糖粉末，溶于重量百分含量为1％的冰醋酸溶液，制备壳聚糖醋酸溶液。在搅拌下，将重量百分含量为0.2％的三聚磷酸钠溶液滴加到壳聚糖醋酸溶液中，滴加速度为1～2ml/min，三聚磷酸钠与壳聚糖的重量比为1:10。继续搅拌60min，得到壳聚糖纳米粗悬浮液。取壳聚糖纳米粗悬浮液，置入高压匀质机中，压力为500Mpa，反复匀质10次，收集得到重量百分含量为1％的壳聚糖纳米粒悬浮液，制得样品4。

样品5

称取适量壳聚糖粉末，溶于重量百分含量1％的冰醋酸溶液，制备壳聚糖醋酸溶液。在搅拌下，将重量百分含量的0.2％三聚磷酸钠溶液滴加到壳聚糖醋酸溶液中，滴加速度为1～2ml/min，三聚磷酸钠与壳聚糖的重量比为1:5。继续搅拌60min，得到壳聚糖纳米粗悬浮液。取壳聚糖纳米粗悬浮液，置入高压匀质机中，压力为300Mpa，反复匀质3次，收集得到重量百分含量为1％的壳聚糖纳米粒悬浮液，制得样品5。

样品6

称取适量壳聚糖粉末，溶于重量百分含量为1％的冰醋酸溶液，制备壳聚糖醋酸溶液。在搅拌下，将重量百分含量为0.2％的三聚磷酸钠溶液滴加到壳聚糖醋酸溶液中，滴加速度为1～2ml/min，三聚磷酸钠与壳聚糖的重量比为1:5。继续搅拌60min，得到壳聚糖纳米粗悬浮液。取壳聚糖纳米粗悬浮液，置入高压匀质机中，压力为500Mpa，反复匀质10次，收集得到重量百分含量为1％的壳聚糖纳米粒悬浮液，制得样品6。

(2)样品稳定性考察：同试验1

(3)琼脂扩散法抑菌测定试验：同试验1

(4)实验结果：

表4为不同制备方法制备壳聚糖纳米粒的粒径以及电位(x±S.D.，n＝3)。表5为不同壳聚糖纳米粒25℃下放置6个月粒径和电位的变化(x±S.D.，n＝3)。表6为不同样品抑菌圈比较(x±S.D.，n＝3)。

表4

注：与样品4或样品5相比，﹡P<0.05

表5

注：与样品4或样品5相比，﹡P<0.05

表6

注：与阴性对照组相比，﹡P<0.01；与样品4或样品5相比，▲P<0.05。

从表4至表6可知，本发明方案的制备方法和参数均有同样效果。本发明方案中制备技术参数的优化显著改善壳聚糖纳米粒的粒径和电位，从而确保药理效果和有利于药物剂型制备。

试验3 不同高分子辅料配比参数样品的比较

实验用试剂、药品等由合法渠道提供。

(1)样品制备

样品7

称取适量壳聚糖粉末，溶于重量百分含量为1％的冰醋酸溶液，制备壳聚糖醋酸溶液。在搅拌下，将重量百分含量为0.2％的三聚磷酸钠溶液滴加到壳聚糖醋酸溶液中，滴加速度为1～2ml/min，三聚磷酸钠与壳聚糖的重量比为1:5。继续搅拌60min，得到壳聚糖纳米粗悬浮液。取壳聚糖纳米粗悬浮液，加入重量百分含量为0.2％泊洛沙姆后混合均匀，置入高压匀质机中，压力为500Mpa，反复匀质10次，收集得到重量百分含量为1％壳聚糖纳米粒悬浮液，制得样品7。

样品8

称取适量壳聚糖粉末，溶于重量百分含量为1％的冰醋酸溶液，制备壳聚糖醋酸溶液。在搅拌下，将重量百分含量为0.2％的三聚磷酸钠溶液滴加到壳聚糖醋酸溶液中，滴加速度为1～2ml/min，三聚磷酸钠与壳聚糖的重量比为1:5。继续搅拌60min，得到壳聚糖纳米粗悬浮液。取壳聚糖纳米粗悬浮液，加入重量百分含量为0.2％的PEG1500混合均匀，置入高压匀质机中，压力为500Mpa，反复匀质10次，收集得到重量百分含量为1％的壳聚糖纳米粒悬浮液，制得样品8。

样品9

称取适量壳聚糖粉末，溶于重量百分含量为1％的冰醋酸溶液，制备壳聚糖醋酸溶液。在搅拌下，将重量百分含量为0.2％的三聚磷酸钠溶液滴加到壳聚糖醋酸溶液中，滴加速度为1～2ml/min，三聚磷酸钠与壳聚糖的重量比为1:5。继续搅拌60min，得到壳聚糖纳米粗悬浮液。取壳聚糖纳米粗悬浮液，加入8％泊洛沙姆188后混合均匀，置入高压匀质机中，压力为500Mpa，反复匀质10次，收集得到重量百分含量为1％的壳聚糖纳米粒悬浮液，制得样品9。

样品10

称取适量壳聚糖粉末，溶于重量百分含量为1％的冰醋酸溶液，制备壳聚糖醋酸溶液。在搅拌下，将为重量百分含量0.2％的三聚磷酸钠溶液滴加到壳聚糖醋酸溶液中，滴加速度为1～2ml/min，三聚磷酸钠与壳聚糖的重量比为1:5。继续搅拌60min，得到壳聚糖纳米粒粗悬浮液。取壳聚糖纳米粗悬浮液，置入高压匀质机中，压力为500Mpa，反复匀质10次，收集得到重量百分含量为1％的壳聚糖纳米粒悬浮液，制得样品10。

(2)样品稳定性考察：同试验1

(3)琼脂扩散法抑菌测定试验：同试验1

(4)实验结果：

表7为不同高分子辅料配比参数制备壳聚糖纳米粒的粒径以及电位(x±S.D.，n＝3)；

表7

注：与样品9或样品10相比，﹡P<0.05

表8为不同壳聚糖纳米粒25℃下放置6个月粒径和电位的变化(x±S.D.，n＝3)。

表8

注：与样品9或样品10相比，*P<0.01

表9为不同样品抑菌圈比较(x±S.D.，n＝3)。

表9

注：与阴性对照相比，﹡P<0.01；与样品9或样品10相比，▲P<0.05。

从表7至表9可知，高分子辅料的优化将会产生意想不到的效果。本发明采用特定高分子辅料与本发明技术方案组合处理，进一步显著改善了壳聚糖纳米粒的粒径、稳定性和药理效果，有助于保证壳聚糖纳米粒的质量。高分子辅料的含量变化将显著影响将显著影响壳聚糖纳米粒的粒径、电位、稳定性和药理效果。通过优化高分子辅料种类和比例，本发明技术制备的壳聚糖纳米粒具有更理想的粒径、电位和稳定性，具有更加可靠的药理活性。本发明提出高分子辅料种类及含量变化可以使本发明壳聚糖纳米粒的粒径、稳定性和药理效果有意想不到的变化。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。

Claims (9)

1.一种壳聚糖纳米粒悬浮液的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)将壳聚糖溶于冰醋酸水溶液,制备壳聚糖醋酸水溶液；

(2)在搅拌条件下，滴加三聚磷酸钠水溶液，搅拌制备壳聚糖纳米粗悬浮液；

(3)将壳聚糖纳米粗悬浮液经高压匀质处理，得到壳聚糖纳米粒悬浮液。

2.根据权利要求1所述壳聚糖纳米粒悬浮液的制备方法，其特征在于：

在步骤(1)中，将壳聚糖溶于重量百分含量为0.1％～2.0％的冰醋酸水溶液中,制备壳聚糖醋酸水溶液；

在步骤(2)中，搅拌条件下，滴加重量百分含量为0.1～1％的三聚磷酸钠水溶液，三聚磷酸钠与壳聚糖的重量比为1：2～8，滴加速度为1～2ml/min，继续搅拌40～100min，得到壳聚糖纳米粗悬浮液；

在步骤(3)中，将壳聚糖纳米粗悬浮液过滤，进行高压匀质处理，压力为500～800Mpa，循环匀质次数为5～15次，得到壳聚糖纳米粒悬浮液。

3.根据权利要求1或2所述壳聚糖纳米粒悬浮液的制备方法，其特征在于：

在步骤(1)中，将壳聚糖溶于重量百分含量为0.1％～2.0％的冰醋酸水溶液中,制备壳聚糖醋酸溶液；

在步骤(2)中，滴加重量百分含量为0.1～1％的三聚磷酸钠水溶液，三聚磷酸钠与壳聚糖的重量比为1：4～6，滴加速度为1～2ml/min，继续搅拌60～80min，得到壳聚糖纳米粗悬浮液；

在步骤(3)中，将壳聚糖纳米粗悬浮液过滤，进行高压匀质处理，高压匀质的压力为500～800Mpa，循环次数为10次,得到重量百分含量为0.1-5％的壳聚糖纳米粒悬浮液。

4.根据权利要求3所述壳聚糖纳米粒悬浮液的制备方法，其特征在于：

在步骤(1)中，将壳聚糖溶于重量百分含量为0.1％～2.0％的冰醋酸水溶液中,制备壳聚糖醋酸溶液；

在步骤(2)中，滴加重量百分含量为0.1～1％的三聚磷酸钠水溶液，三聚磷酸钠与壳聚糖的重量比为1：5，滴加速度为1～2ml/min，继续搅拌60～80min，得到壳聚糖纳米粗悬浮液；

在步骤(3)中，将壳聚糖纳米粗悬浮液过滤，进行高压匀质处理，高压匀质的压力为500～800Mpa，循环次数为10次，得到壳聚糖纳米粒悬浮液。

5.根据权利要求2所述壳聚糖纳米粒悬浮液的制备方法，其特征在于：在步骤(3)中，加入高分子辅料，所述高分子辅料为羟丙甲纤维素HPMC、聚乙二醇PEG、聚维酮PVP、泊洛沙姆Poloxamer、卡波姆Carbopol、环糊精CDs中的一种或多种的组合，制备壳聚糖纳米粒悬浮液。

6.根据权利要求5所述壳聚糖纳米粒悬浮液的制备方法，其特征在于：在步骤(3)中，加入高分子辅料，所述高分子辅料的重量百分含量为0.05％～2.0％，制备壳聚糖纳米粒悬浮液。

7.根据权利要求5所述壳聚糖纳米粒悬浮液的制备方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述壳聚糖的平均分子量为10000～1500000，脱乙酰度大于50％；所述壳聚糖为壳聚糖或壳聚糖衍生物中的一种或多种的组合；

在步骤(3)中，所述的环糊精为β环糊精、羟丙基β环糊精、磺丁基β环糊精、甲基β环糊精中的一种或多种的组合；

所述羟丙甲纤维素HPMC为粘度在30～200000毫帕·秒范围内的一种或多种的组合；

所述聚乙二醇PEG为平均分子量在400～20000范围内的一种或多种的组合；

所述聚维酮PVP为平均分子量在10000～630000范围内的一种或多种的组合；

所述泊洛沙姆Poloxamer为平均分子量在1000～50000范围内的一种或多种的组合；

卡波姆Carbomer为类型在910、934、934P、940、941或1342范围内的一种或多种的组合。

8.权利要求1至7任一项所述壳聚糖纳米粒悬浮液在制备具有治疗和保健作用的膜剂、海绵剂、凝胶剂、喷雾剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、注射剂、软膏剂、栓剂、生物医用支架材料、细胞培养支架材料或医用敷料材料中的应用。

9.权利要求1至7任一项所述壳聚糖纳米粒悬浮液在抗菌、止血、促进组织修复、抗肿瘤、降血脂、免疫调节、抗衰老、抗氧化、保湿、润肤、护肤、护发作用的医药健康产品以及食品保鲜剂、防腐剂、增稠剂、澄清脱色剂或金属离子螯合剂中的应用。