CN112773929A - 基于多聚阴离子型纤维素的可吸收止血复合材料及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基于多聚阴离子型纤维素的可吸收止血复合材料及其制备方法。该材料通过以多聚阴离子型纤维素为基材搭建网络结构，再与壳聚糖或者壳聚糖衍生物进行静电吸附自组装或者再与壳聚糖或其衍生物静电自组装负载蛋白多肽得到；或者通过以多聚阴离子型纤维素为基材搭建网络结构，并将壳聚糖微球或者壳聚糖微球和蛋白多肽原位成球，负载在纤维素的表面和网络中得到。该材料具有急性止血、广谱抗菌、促进愈合、体内吸收的特性。

Description

基于多聚阴离子型纤维素的可吸收止血复合材料及其制备 方法
技术领域
本发明属于生物医用复合材料及其制备领域，特别涉及一种基于多聚阴离子型纤维素的可吸收止血复合材料及其制备方法。
背景技术
不可控制的大量失血与渗血是外科手术中经常遇到的难题。战争中，50％的死亡是由于伤口大量出血所致，这其中80％是由于伤口位于不可按压止血的部位。因此实现出血伤口的快速止血成为亟需解决的问题。止血材料主要通过形成屏障来阻止血液流动，加速血液凝结要依靠纤维蛋白的产生。可吸收止血材料是指可以被身体吸收的医疗产品，一般在手术过程中，传统止血技术无效，可以使用该类产品通过加速伤口的局部血液凝结过程来达到止血效果。
目前可吸收止血材料主要有胶原类(含微纤维蛋白胶)、明胶、海藻酸盐、壳聚糖、氧化纤维素(氧化再生纤维素)、氰基丙稀酸类组织胶以及很有前景的短肽等，这些材料来源各不相同，止血机理也各异。
纤维素作为世界上储量最丰富的天然高分子材料，具有原料来源广泛、可再生性、生物可降解性、生物相容性等特点，被认为是可持续材料的一种重要资源。但随着科学技术的进步和人类生活品质的提高，纤维素自身的特性远不能满足人类的需求。临床上广泛使用的美国强生公司生产的再生氧化纤维素纱布(商品名：速即纱，SurgicelTM)是一种经植物提取、氧化再生制成的可以体内完全吸收的新型止血材料，广泛用于外科手术止血。以葡聚糖苷酸作为其有效的功能单元，依赖自身产生的物理屏障，48小时内变成一个凝胶状的物质。而不依赖人体自身的止血机制，以促进凝血，对毛细血管、小动脉、静脉出血都可以显示出止血效果。国内也有几家公司生产出类似纱布产品，但是材料性能远不如速即纱，所以临床上仍主要采用该昂贵的进口材料。
虽然氧化再生纤维素有很多优异的性能，但是也有很多弊端，例如比表面积小，止血作用机理单一和止血效率不高，不适用于大量出血；抗菌性能弱，不能有效防止伤口感染；其羧基基团造成的酸性环境会导致一定的细胞毒性；组织相容性低，不能快速促进伤口愈合。
人们一直致力于氧化再生纤维素的改性研究，目前，在一些公开或授权的发明专利中，已经使用天然/合成高分子材料，如凝血因子(CN110339391A)、壳聚糖(CN106178066A)、胶原蛋白(CN105079886A)等进行复合来改善氧化再生纤维素的止血性能。为了改进市售氧化再生纤维素比表面积小的问题，有人对氧化再生纤维进行纳米化处理。如中国专利(CN102912622A)中在氧化再生纤维素纱布表面利用静电纺技术喷涂一层纳米级氧化再生纤维素钠和纳米胶原粒子显著改善了其止血性能(止血时间缩短了56％)，但其抗菌性能仍旧有限。在中国专利(CN105178009A)中制备得到氧化再生纤维素/纳米晶纤维素(权利要求1步骤3)止血材料，相比氧化再生纤维素纱布，其止血性能有所提高，但由于改性方法单一，且用的是纳米晶纤维素而不是纳米纤维素纤维，比表面积相对不够大，因此效果不够显著，止血时间仅缩短了5-20％。随着各国医学界对止血材料止血性能要求的提高，开发止血效果更佳的材料势在必行。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种基于多聚阴离子型纤维素的可吸收止血复合材料及其制备方法，以克服现有技术中氧化再生纤维素改性材料比表面积小、止血作用机理单一、止血效率低，抗菌性能弱，生物相容性低的缺陷。
本发明提供一种基于多聚阴离子型纤维素的可吸收止血复合材料，通过以多聚阴离子型纤维素为基材搭建网络结构，再与壳聚糖或者壳聚糖衍生物进行静电吸附自组装或者再与壳聚糖或其衍生物静电自组装负载蛋白多肽得到；
或者通过以多聚阴离子型纤维素为基材搭建网络结构，并将壳聚糖微球或者壳聚糖微球和蛋白多肽原位成球，负载在纤维素的表面和网络中得到。
优选地，上述复合材料中，所述聚阴离子型纤维素为植物源氧化纤维素纳米纤维、氧化细菌纳米纤维素、羧甲基纤维素、双羧基纤维素纳米纤维中的一种或几种。
优选地，上述复合材料中，所述壳聚糖衍生物为羧甲基壳聚糖、季铵盐壳聚糖中的一种或两种。
优选地，上述复合材料中，所述蛋白多肽为胶原蛋白、明胶、丝素蛋白中的一种或几种。
本发明还提供一种基于多聚阴离子型纤维素的可吸收止血复合材料的制备方法，包括：
将壳聚糖/稀醋酸水溶液或壳聚糖衍生物水溶液缓慢滴入多聚阴离子型纤维素悬液中进行静电吸附自组装反应，然后调节pH值为2-8并离心漂洗，重新分散均匀，装配模具，冷冻干燥得到可吸收止血复合材料；
或者将蛋白多肽加入到多聚阴离子型纤维素悬液中浸渍吸附搅拌，然后缓慢滴加壳聚糖/稀醋酸水溶液或壳聚糖衍生物水溶液，然后调节pH值为2-8并离心漂洗，重新分散均匀，装配模具，冷冻干燥得到可吸收止血复合材料；
或者将壳聚糖/稀醋酸水溶液与质子化的多聚阴离子型纤维素悬液混匀，然后与硫酸盐水溶液或磷酸盐水溶液混合，形成的沉淀经离心漂洗，重新分散均匀，装配模具，冷冻干燥得到负载壳聚糖微球的可吸收止血复合材料；
或者将蛋白多肽加入到质子化的多聚阴离子型纤维素悬液中浸渍吸附搅拌，再加入壳聚糖/稀醋酸水溶液，然后与硫酸盐水溶液或磷酸盐水溶液混合，形成的沉淀经离心漂洗，重新分散均匀，装配模具，冷冻干燥得到负载壳聚糖微球和蛋白多肽的可吸收止血复合材料。
优选地，上述方法中，所述多聚阴离子型纤维素悬液为：0.5-5％w/v的植物源氧化纤维素纳米纤维水溶液、0.5-5％w/v的氧化细菌纳米纤维素水溶液或者0.3％-3％w/v的羧甲基纤维素水溶液。
优选地，上述方法中，所述壳聚糖/稀醋酸水溶液是将分子量为3000-300000的壳聚糖溶解于0.1-5％的稀醋酸水溶液中，形成终浓度为0.3-5％(w/v)的壳聚糖/稀醋酸水溶液。
优选地，上述方法中，所述壳聚糖/稀醋酸水溶液和壳聚糖衍生物水溶液浓度为0.3-5％w/v。
优选地，上述方法中，所述壳聚糖与多聚阴离子型纤维素的质量比为4:1-1:4。
优选地，上述方法中，所述壳聚糖衍生物与多聚阴离子型纤维素的质量比为4:1-1:4。
优选地，上述方法中，所述壳聚糖与质子化的多聚阴离子型纤维素的质量比为5:1-1:5。
优选地，上述方法中，所述质子化的多聚阴离子型纤维素悬液pH值为2-3，pH值是采用无机酸、有机酸中的一种或多种调节；无机酸为盐酸、硫酸、磷酸等，有机酸为醋酸、柠檬酸、乳酸等。
优选地，上述方法中，所述蛋白多肽与多聚阴离子型纤维素的质量比为0.5:1-5:1。
优选地，上述方法中，所述蛋白多肽与质子化的多聚阴离子型纤维素的质量比为0.2:1-4:1。
优选地，上述方法中，所述蛋白多肽是以蛋白多肽水溶液或者固体粉末加入聚阴离子型纤维素悬液中浸渍吸附搅拌。
优选地，上述方法中，所述蛋白多肽水溶液的浓度为0.1-10mg/mL。
优选地，上述方法中，所述质子化的多聚阴离子型纤维素悬液或加入蛋白多肽的质子化聚阴离子型纤维素悬液与壳聚糖/稀醋酸水溶液混合后纤维素浓度<5％w/v时，所述与硫酸盐水溶液或磷酸盐水溶液混合是向已加入壳聚糖/稀醋酸水溶液的质子化纤维素悬液或已加入壳聚糖/稀醋酸水溶液和蛋白多肽的质子化纤维素悬液中逐滴滴加硫酸盐水溶液或磷酸盐水溶液；
或者将加入壳聚糖/稀醋酸水溶液的质子化纤维素悬液或加入壳聚糖/稀醋酸水溶液和蛋白多肽的质子化纤维素悬液逐滴滴加到硫酸盐水溶液或磷酸盐水溶液中，由于硫酸盐和磷酸盐水溶液的pH分别接近中性和碱性，少量酸性纤维素悬液进入该体系会被迅速中和并去质子化(即质子化的多聚阴离子型纤维素会电离为阴离子，带正电荷的壳聚糖会同时与多聚阴离子型纤维素静电吸附又会自身成球)，因此可将加入壳聚糖/稀醋酸水溶液的纤维素悬液或加入壳聚糖/稀醋酸水溶液和蛋白多肽的纤维素悬液逐滴滴加到硫酸盐水溶液或磷酸盐水溶液中。
优选地，上述方法中，所述质子化的多聚阴离子型纤维素悬液或加入蛋白多肽的质子化聚阴离子型纤维素悬液与壳聚糖/稀醋酸水溶液混合后纤维素浓度>5％w/v或者是混合后得到有型纤维素材料(譬如膜状)，所述与硫酸盐水溶液或磷酸盐水溶液混合是将吸附壳聚糖溶液或加入壳聚糖溶液和蛋白多肽的质子化纤维素悬液/有型纤维素材料加到或浸入硫酸盐水溶液或磷酸盐水溶液，以使吸附的壳聚糖原位成球。
优选地，上述方法中，所述浸渍吸附搅拌时间为0.5-5小时。
优选地，上述方法中，所述静电吸附自组装反应时间为5-60分钟。
优选地，上述方法中，所述重新分散均匀的固含量浓度为0.2％-5％。
优选地，上述方法中，所述硫酸盐为硫酸钠、硫酸镁、硫酸铁中的一种或几种。
优选地，上述方法中，所述磷酸盐为磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠中一种或几种。
优选地，上述方法中，所述硫酸盐和磷酸盐水溶液浓度为0.1-20％w/v，pH值为3-7。
本发明还提供一种基于多聚阴离子型纤维素的可吸收止血复合材料在制备止血材料或抗菌材料中的应用。
本发明通过利用多聚阴离子型纤维素的高比表面和体内可吸收性，以多聚阴离子型纤维素为基材搭建网络结构，市售的植物源氧化纤维素纳米纤维以及氧化细菌纳米纤维素能够自发搭建高比表面积纳米网络结构，加快凝血过程，其原料便宜易得适合工业化大规模生产。羧甲基纤维素是常规改性纤维素。利用这些带负电荷的多聚阴离子型纤维素与带正电荷的壳聚糖或者其衍生物进行静电吸附自组装反应，或者将壳聚糖以微球形式负载于纤维素表面和网络中，还可以通过物理绑定在其中引入具有止血促愈作用的蛋白多肽，制备得到同时具有急性止血、广谱抗菌、促进愈合的可吸收止血复合材料。
有益效果
(1)本发明以植物源氧化纤维素纳米纤维或细菌纳米纤维素为基材构建网状结构，相比氧化再生纤维素具有更高的比表面积，加快凝血过程，止血效果更好。
(2)本发明利用多聚阴离子型纤维素带负电荷与带正电荷的壳聚糖或者壳聚糖衍生物进行静电吸附自组装反应，或者将壳聚糖微球原位成球并负载于纤维素表面和网络中，无需引入其它有毒交联剂；而且壳聚糖或壳聚糖衍生物的加入提高了材料的止血性能和抗菌特性。
(3)本发明通过利用多聚阴离子型纤维素充分吸附蛋白多肽分子，并通过引入壳聚糖发生静电自组装反应或者引入壳聚糖微球对蛋白多肽进行物理绑定从而实现多重止血的目的，得到的材料同时具有急性止血(止血时间相比Surgicel缩短了61％)、广谱抗菌、促进愈合、体内吸收的特性。
(4)本发明使用的聚阴离子型纤维素价格便宜，且复合止血材料制备方法简单绿色高效，适合工业化大规模生产，是一种具有良好市场应用前景的功能性复合材料。
附图说明
图1为本发明制备流程示意图。
图2为实施例1、2、3、5、6、9、10和11制备的可吸收止血复合材料产品图。其中a-h分别是TCNF、TCNF/CS、TCNF/COL/CS、CSMS-OBC、CSMS-OBC/SF、CMC、CMC/CS和CMC/COL/CS。
图3是实施例1、2、3、5、6、9和10中产品的扫描电镜图。
图4是实施例1-3中材料的红外图谱，其中a、b、c、d、e分别代表胶原蛋白、壳聚糖、TCNF、TCNF/CS和TCNF/COL/CS。
图5为实施例1-3中材料的孔隙率(A)和水吸收能力图(B)。
图6为实施例1-3中材料的压缩强度(A)和压缩模量图(B)。
图7为实施例1-3中材料在相同稀释倍数下对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果图(A，B)。
图8为实施例1-3中材料的细胞毒性测试结果，其中A是钙黄绿素荧光染色的结果，B是通过CCK-8试剂对细胞增殖的定量评估，C是扫描电镜下观察细胞在材料上的生长形态。
图9为实施例1-3中材料的溶血率和体外止血测试结果，其中A是溶血率实验结果，B为不同样品浓缩血液的能力，其中a、b、c、d和e分别为明胶海绵、Surgicel、TCNF、TCNF/CS和TCNF/COL/CS，C是体外动态全血凝固评价，D是血小板和红细胞在样品上粘附的扫描电镜图。
图10为实施例1-8中材料通过SD大鼠肝脏创伤模型的体内止血测试结果，其中A为止血时间，B为血流失量。
图11为实施例1-3中材料的体内降解性和组织相容性评估结果。
图12为实施例17中1％CS成球的CSMS-DAOBC产品的扫描电镜微观结构图。
图13为实施例17中CSMS-DAOBC产品的抗菌测试(抑菌圈法)结果。左边为大肠杆菌抗菌，右边为金黄色葡萄球菌。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
(1)将市场(中山纳纤丝新材料有限公司)购买的植物源氧化纤维素纳米纤维悬液(型号NFC1904H，氧化体系为TEMPO/NaClO/NaBr共氧化体系，英文为TEMPO-oxidizedCellulose Nano-fiber，简称TCNF)用去离子水稀释到固含量为1％(w/v)，并且充分搅拌得到均匀的悬浊液，pH值为6。
(2)将步骤(1)得到的悬浊液分装模具，并且于-80摄氏度冰箱预冻12h，预冻后放入冷冻干燥机中处理48h得到植物源氧化纤维素纳米纤维止血材料(TCNF)。
实施例2
(1)将市场(中山纳纤丝新材料有限公司)购买的植物源氧化纤维素纳米纤维悬液(型号NFC1904H，氧化体系为TEMPO/NaClO/NaBr共氧化体系)用去离子水稀释到固含量为1％(w/v)，并且充分搅拌得到均匀的悬浊液，pH值为6。
(2)称取1g分子量为5万的壳聚糖(Chitosan,CS)充分溶解于100mL的0.1M冰醋酸水溶液中，形成终浓度为1％的壳聚糖稀酸溶液。
(3)取10mL步骤(1)中制得的悬浊液放入小烧杯中，按照质量比为植物源氧化纤维素纳米纤维/壳聚糖＝1/1的配比再取10mL的步骤(2)制得的壳聚糖稀酸溶液逐滴缓慢滴入烧杯中，边滴加边搅拌，反应30min。
(4)将步骤(3)得到的凝胶悬液的pH值调节为6并且反复离心漂洗，最后收集凝胶沉淀按照固含量为1％加去离子水重新分散并搅拌均匀得到20mL的凝胶悬液。
(5)将步骤(4)得到的凝胶悬液分装模具，并且于-80摄氏度冰箱预冻12h，预冻后放入冷冻干燥机中处理48h得到植物源氧化纤维素纳米纤维/壳聚糖复合止血材料(TCNF/CS)。
实施例3
(1)将市场(中山纳纤丝新材料有限公司)购买的植物源氧化纤维素纳米纤维悬液(型号NFC1904H，氧化体系为TEMPO/NaClO/NaBr共氧化体系)用去离子水稀释到固含量为1％(w/v)，并且充分搅拌得到均匀的悬浊液，pH值为6。
(2)取10mL步骤(1)得到的悬浊液放入小烧杯中，按照质量比为植物源氧化纤维素纳米纤维/胶原蛋白(Collagen,COL)＝1/0.9的比例加入0.09g胶原蛋白粉末到小烧杯中，充分搅拌吸附30min得到吸附有胶原蛋白的植物源氧化纤维素纳米纤维悬浊液。胶原蛋白可以来自于水生动物，譬如鱼，也可以陆生动物，譬如牛和猪。
(3)称取1g分子量为5万的壳聚糖充分溶解于100mL的0.1M冰醋酸水溶液中，形成终浓度为1％的壳聚糖稀酸溶液。
(4)按照质量比为植物源纤维素纳米纤维/壳聚糖＝1/1的配比取10mL步骤(3)制得的壳聚糖稀酸溶液逐滴滴入步骤(2)的10mL吸附有胶原蛋白的植物源氧化纤维素纳米纤维悬浊液的烧杯中，边滴加边搅拌，反应30min。
(5)将步骤(4)得到的凝胶悬液的pH值调节为6并且反复离心漂洗，最后收集凝胶沉淀按照固含量为1％加去离子水重新分散并搅拌均匀得到20mL的凝胶悬液。
(6)将步骤(5)得到的凝胶悬液分装模具，并且于-80摄氏度冰箱预冻12h，预冻后放入冷冻干燥机中处理48h得到植物源氧化纤维素纳米纤维/胶原蛋白/壳聚糖复合止血材料(TCNF/COL/CS)。
实施例1-3中TCNF,TCNF/CS和TCNF/COL/CS海绵的比表面积、Zeta电位以及密度如表1所示。
表1
Figure BDA0002879317780000071
由表1可得到样本的基本表征，可以看出氧化纤维素纳米纤维相比较Surgicel(氧化再生纤维素)有较大的比表面积。相比较TCNF的Zeta电位，复合壳聚糖后的样本电位增加带有正电荷。而制备的样本密度都很小，轻质的性质有利于携带。
实施例4
(1)以木醋杆菌ATCC23770为菌种，经液体培养基恒温静置培养10天后，取出细菌纤维素膜置于0.1-1％(w/v)氢氧化钠溶液中，在80℃下处理3h后取出，用去离子水漂洗至中性后获得细菌纤维素膜。
(2)将步骤(1)得到的细菌纤维素膜剪碎后置于高速匀浆机中打散，然后分散于去离子水中得到浓度为2％(w/v)的细菌纤维素悬液。
(3)往步骤(2)中得到的细菌纤维素悬液中加入催化量的TEMPO和NaBr，TEMPO用量为0.1mmol/g(对绝干细菌纤维素)，NaBr用量为1mmol/g(对绝干细菌纤维素)，分散均匀后将反应体系的pH值调节为10。滴加10％的NaClO开始反应，并用0.1mol·L-1NaOH控制体系pH为10±0.1，反应至最终的pH值几乎不变时，加入量取好的乙醇终止反应，继续搅拌5min后，用抽滤法获得水不溶组分，并用去离子水反复洗涤最终重悬得到浓度为1％(w/v)的氧化细菌纳米纤维素悬液(Oxidized Bacterial Cellulose,OBC)。
(4)将所得的OBC悬液与1％(w/v)的海藻酸钠(Sodium Alginate,SA)水溶液混匀得到OBC/SA混合悬液。
(5)取10mL步骤(4)得到的混合悬浊液放入小烧杯中，按照质量比为混合悬液固含量/丝素蛋白＝1/0.9的比例加入0.09g丝素蛋白(Silk Fibroin,SF)粉末到小烧杯中，充分搅拌吸附30min得到吸附有丝素蛋白的OBC/SA悬浊液。
(6)称取1g羧甲基壳聚糖粉末充分溶解于100mL的去离子水中，搅拌均匀，形成终浓度为1％的羧甲基壳聚糖水溶液(Carboxymethyl Chitosan,CCS)。
(7)按照质量比为氧化细菌纳米纤维/羧甲基壳聚糖＝1/1的配比取10mL步骤(6)制得的羧甲基壳聚糖水溶液逐滴滴入步骤(5)的10mL吸附有丝素蛋白的OBC/SA悬浊液的烧杯中，边滴加边搅拌，反应30min。
(8)将步骤(7)得到的凝胶悬液分装模具，并且于-80摄氏度冰箱预冻12h，预冻后放入冷冻干燥机中处理48h得到氧化细菌纳米纤维/海藻酸钠/丝素蛋白/羧甲基壳聚糖复合止血材料(OBC/SA/SF/CCS)。
实施例5
(1)以木醋杆菌ATCC23767为菌种，经液体培养基恒温静置培养10天后，取出细菌纤维素膜置于0.1-1％(w/v)氢氧化钠溶液中，在80℃下处理3h后取出，用去离子水漂洗至中性后获得细菌纤维素膜。
(2)将步骤(1)得到的细菌纤维素膜剪碎后置于高速匀浆机中打散，然后分散于去离子水中得到浓度为2％(w/v)的细菌纤维素悬液。
(3)往步骤(2)中得到的细菌纤维素悬液中加入催化量的TEMPO和NaBr，TEMPO用量为0.1mmol/g(对绝干细菌纤维素)，NaBr用量为1mmol/g(对绝干细菌纤维素)，分散均匀后将反应体系的pH值调节为10。滴加10％的NaClO开始反应，并用0.1mol·L-1NaOH控制体系pH为10±0.1，反应至最终的pH值几乎不变时，加入量取好的乙醇终止反应，继续搅拌5min后，用抽滤法获得水不溶组分，并用去离子水反复洗涤最终用0.1M的冰醋酸水溶液重悬得到浓度为1％(w/v)的质子化氧化细菌纳米纤维素悬液，pH值为2。
(4)称取1g分子量为3000的壳聚糖充分溶解于100mL的0.1M冰醋酸水溶液中，形成终浓度为1％的壳聚糖稀酸溶液。
(5)取10mL步骤(3)中的质子化氧化细菌纳米纤维素悬浊液，往其中加入10mL的步骤(4)中的壳聚糖稀酸溶液，搅拌均匀得到混合液。
(6)将10mL的1％(w/v)硫酸钠水溶液(pH＝6.5)逐滴缓慢地滴入步骤(5)中的混合液中，搅拌均匀，静置5分钟。
(7)将步骤(6)所得悬液，经去离子水反复离心漂洗，收集沉淀，最后经去离子水重悬得到20mL固含量为1％的悬液。
(8)将步骤(7)得到的凝胶悬液分装模具，并且于-80摄氏度冰箱预冻12h，预冻后放入冷冻干燥机中处理48h得到负载壳聚糖微球(Chitosan Micro-sphere,CSMS)的氧化细菌纤维素纳米纤维止血材料(CSMS-OBC)。抗菌测试结果见表2。
实施例6
(1)以木醋杆菌ATCC23770为菌种，经液体培养基恒温静置培养10天后，取出细菌纤维素膜置于氢氧化钠溶液中，在80℃下处理3h后取出，用去离子水漂洗至中性后获得细菌纤维素膜。
(2)将步骤(1)得到的细菌纤维素膜剪碎后置于高速匀浆机中打散，然后分散于去离子水中得到浓度为2％(w/v)的细菌纤维素悬液。
(3)往步骤(2)中得到的细菌纤维素悬液中加入催化量的TEMPO和NaBr，TEMPO用量为0.1mmol/g(对绝干细菌纤维素)，NaBr用量为1mmol/g(对绝干细菌纤维素)，分散均匀后将反应体系的pH值调节为10。滴加10％的NaClO开始反应，并用0.1mol·L-1NaOH控制体系pH为10±0.1，反应至最终的pH值几乎不变时，加入量取好的乙醇终止反应，继续搅拌5min后，用抽滤法获得水不溶组分，并用去离子水反复洗涤最终用0.1M的冰醋酸水溶液重悬得到浓度为1％(w/v)的质子化氧化细菌纳米纤维素悬液，pH值为2。
(4)取10mL步骤(3)得到的悬浊液放入小烧杯中，按照质量比为质子化氧化细菌纳米纤维素/丝素蛋白＝1/0.9的比例加入0.09g丝素蛋白(SF)粉末到小烧杯中，充分搅拌吸附30min得到吸附有丝素蛋白的质子化细菌纳米纤维素悬浊液。
(5)称取1g分子量为3000的壳聚糖充分溶解于100mL的0.1M冰醋酸水溶液中，形成终浓度为1％的壳聚糖稀酸溶液。
(6)取10mL步骤(4)中吸附有丝素蛋白的质子化细菌纳米纤维素悬浊液，往其中加入10mL的步骤(5)中的壳聚糖稀酸溶液，搅拌均匀得到混合液。
(7)将10mL的1％(w/v)磷酸二氢钾水溶液(pH＝6.5)逐滴缓慢地滴入步骤(6)中的混合液中，搅拌均匀，静置5分钟。
(8)将步骤(7)所得悬液，经去离子水反复离心漂洗，收集沉淀，最后经去离子水重悬得到20mL固含量为1％的悬液。
(9)将步骤(8)得到的凝胶悬液分装模具，并且于-80摄氏度冰箱预冻12h，预冻后放入冷冻干燥机中处理48h得到负载壳聚糖微球和丝素蛋白的氧化细菌纳米纤维素复合止血材料(CSMS-OBC/SF)。
实施例7
(1)将市场(中山纳纤丝新材料有限公司)购买的植物源氧化纤维素纳米纤维悬液(型号NFC1904H，氧化体系为TEMPO/NaClO/NaBr共氧化体系)用0.1M冰醋酸水溶液稀释到固含量为1％(w/v)，并且充分搅拌得到质子化的氧化纤维素纳米纤维悬浊液，pH值为2。这里，冰醋酸可以用无机酸，譬如盐酸和硫酸，也可以用其他有机酸，譬如柠檬酸和乳酸替代，质子化效果类似。
(2)取10mL步骤(1)得到的悬浊液放入小烧杯中，按照质量比为质子化的植物源氧化纤维素纳米纤维/明胶＝1/0.9的比例加入0.09g明胶(Gelatin,GEL)粉末到小烧杯中，充分搅拌吸附30min得到吸附有明胶的质子化植物源氧化纤维素纳米纤维悬浊液。
(3)称取1g分子量为3000的壳聚糖充分溶解于100mL的0.1M冰醋酸水溶液中，形成终浓度为1％的壳聚糖稀酸溶液。
(4)取10mL步骤(2)中吸附有明胶的质子化氧化纤维素纳米纤维悬浊液，往其中加入10mL的步骤(3)中的壳聚糖稀酸溶液，搅拌均匀得到混合液。
(5)将10mL的1％(w/v)磷酸二氢钠水溶液(pH＝6.5)逐滴缓慢地滴入步骤(4)中的混合液中，搅拌均匀，静置5分钟。
(6)将步骤(5)所得悬液，经去离子水反复离心漂洗，收集沉淀，最后经去离子水重悬得到20mL固含量为1％的悬液。
(7)将步骤(6)得到的凝胶悬液分装模具，并且于-80摄氏度冰箱预冻12h，预冻后放入冷冻干燥机中处理48h得到负载壳聚糖微球和明胶的植物源氧化纤维素纳米纤维复合止血材料(CSMS-TCNF/GEL)。
实施例8
(1)在烧杯中加入全漂硫酸盐针叶木浆(金东纸业股份有限公司)3g、高碘酸钠1.98g、氯化钠11.7g以及200mL去离子水。用锡箔纸包住烧杯避免副反应，在室温下缓慢搅拌反应2h。然后将所得物用去离子水反复过滤清洗得到二醛纤维素浆。最后用去离子水重悬得到浓度为1％(w/v)的二醛纤维素(Dialdehyde cellulose,DAC)悬液。
(2)取10mL步骤(1)得到的悬浊液放入小烧杯中，按照质量比为二醛纤维素/胶原蛋白＝1/0.9的比例加入0.09g胶原蛋白(COL)粉末到小烧杯中，充分搅拌吸附30min得到吸附有胶原蛋白的二醛纤维素悬浊液。
(3)称取1g分子量为3000的壳聚糖充分溶解于100mL的0.1M冰醋酸水溶液中，形成终浓度为1％的壳聚糖稀酸溶液。
(4)取10mL步骤(2)中吸附有胶原蛋白的二醛纤维素悬浊液，往其中加入10mL的步骤(3)中的壳聚糖稀酸溶液，搅拌均匀得到混合液。
(5)将10mL的1％(w/v)磷酸二氢钠水溶液(pH＝6.5)逐滴缓慢地滴入步骤(4)中的混合液中，搅拌均匀，静置5分钟。
(6)将步骤(5)所得悬液，经去离子水反复离心漂洗，收集沉淀，最后经去离子水重悬得到20mL固含量为1％的悬液。
(7)将步骤(6)得到的凝胶悬液分装模具，并且于-80摄氏度冰箱预冻12h，预冻后放入冷冻干燥机中处理48h得到负载壳聚糖微球和胶原蛋白的二醛纤维素复合止血材料(CSMS-DAC/COL)。
实施例9
(1)在50℃水浴锅中将羧甲基纤维素(Carboxymethyl Cellulose，CMC)粉末缓慢加入装有去离子水的烧杯中，并且一边加一边搅拌均匀，得到固含量为1％(W/V)的羧甲基纤维素悬液。
(2)将步骤(1)得到的悬浊液分装模具，并且于-80摄氏度冰箱预冻12h，预冻后放入冷冻干燥机中处理48h得到羧甲基纤维素止血材料(CMC)。
实施例10
(1)在50℃水浴锅中将羧甲基纤维素粉末缓慢加入装有去离子水的烧杯中，并且一边加一边搅拌均匀，得到固含量为1％(W/V)的羧甲基纤维素悬液。
(2)称取1g分子量为5万的壳聚糖充分溶解于100mL的0.1M冰醋酸溶液中，形成终浓度为1％的壳聚糖稀酸溶液
(3)取10mL步骤(1)中制得的悬浊液放入小烧杯中，按照质量比为羧甲基纤维素/壳聚糖＝1/1的配比再取10mL的步骤(2)制得的壳聚糖稀酸溶液逐滴滴入烧杯中，边滴加边搅拌，反应30min。
(4)将步骤(3)得到的凝胶产物的pH值调节为6并且反复离心漂洗，最后收集凝胶沉淀按照固含量为1％加去离子水重新分散并搅拌均匀得到20mL的凝胶悬液。
(5)将步骤(4)得到的凝胶悬液分装模具，并且于-80摄氏度冰箱预冻12h，预冻后放入冷冻干燥机中处理48h得到羧甲基纤维素/壳聚糖复合止血材料(CMC/CS)。
实施例11
(1)在50℃水浴锅中将羧甲基纤维素粉末缓慢加入装有去离子水的烧杯中，并且一边加一边搅拌均匀，得到固含量为1％(W/V)的羧甲基纤维素悬液。
(2)取10mL步骤(1)得到的悬浊液放入小烧杯中，按照质量比为羧甲基纤维素/胶原蛋白＝1/0.9的比例加入0.09g胶原蛋白粉末到小烧杯中，充分搅拌吸附30min得到吸附有胶原蛋白的羧甲基纤维素悬浊液。
(3)称取1g分子量为5万的壳聚糖充分溶解于100mL的0.1M冰醋酸水溶液中，形成终浓度为1％的壳聚糖稀酸溶液。
(4)按照质量比为羧甲基纤维素/壳聚糖＝1/1的配比取10mL步骤(3)制得的壳聚糖稀酸溶液逐滴滴入步骤(2)的10mL吸附有胶原蛋白的羧甲基纤维素悬浊液的烧杯中，边滴加边搅拌，反应30min。
(5)将步骤(4)得到的凝胶产物的pH值调节为6并反复离心漂洗，最后收集凝胶沉淀按照固含量为1％加去离子水重新分散并拌均匀得到20mL的凝胶悬液。
(6)将步骤(5)得到的凝胶悬液分装模具，并且于-80摄氏度冰箱预冻12h，预冻后放入冷冻干燥机中处理48h得到羧甲基纤维素/胶原蛋白/壳聚糖复合止血材料(CMC/COL/CS)。
将实施例1-3和实施例5中止血材料以及实施例9-11中止血材料对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌进行抗菌测试，测试方法依据ISO-20743—2007，将海绵样品(直径：10mm；厚度：5mm)放进24孔板里，接种100μL调整好浓度的菌液(稀释至1×105至3×105cfu/mL浓度范围，对照组和样品组菌液浓度相同)到海绵样品的表面，并在37℃培养箱中孵育6h。然后将样品取出放入15mL的离心管中，往离心管中加入10mL无菌PBS溶液，拧紧瓶盖，在涡旋震荡仪上震荡3-4次，每次15s，将菌落从样品上洗涤下来。后来经过梯度稀释，涂布平板对细菌计数进行定量。使用无菌棉纱布作为对照，每个样品三个平行。细菌减少百分比(R)按如下公式计算：
R＝(Ct-Tt)/Ct×100％
其中，Ct和Tt分别为菌液在对照和测试样品上孵育6h后的菌体数量。测试结果如表2所示。
表2
Figure BDA0002879317780000121
注：无菌纱布为对照组。
由表2可知，TCNF有一定的抗菌性，而复合壳聚糖后的材料(TCNF/CS，TCNF/COL/CS)抗菌性明显提高，实施例5中CSMS-OBC也表现出极好的广谱抗菌性，优异的抗菌性使得这些材料具有应用于临床的潜力。
实施例12
(1)以TEMPO/NaClO2/NaClO共氧化体系对全漂硫酸盐针叶木浆(金东纸业股份有限公司)进行氧化，将3g全漂硫酸盐针叶木浆添加到含有90mL磷酸盐缓冲溶液的烧杯中(0.05M，pH6.86)并搅拌均匀，然后往均匀悬液中添加TEMPO(0.01mmol/g干全漂硫酸盐针叶木浆)和NaClO2(17mmol/g干全漂硫酸盐针叶木浆)，将0.6mL的NaClO加到30mL的磷酸缓冲液中进行稀释然后加入到均匀悬液中，这个悬液被密封并且在50℃下搅拌48h进行氧化反应。将所得产物反复过滤清洗去除杂质得到氧化纤维素，通过均质器将氧化纤维素打散纳米化，最终稀释得到固含量为1％(w/v)的氧化纤维素纳米纤维悬液(TEMPO OxidizedCellulose Nanofibers，TOCN)。
(2)取10mL步骤(1)得到的悬浊液放入小烧杯中，按照质量比为氧化纤维素纳米纤维/胶原蛋白＝1/0.9的比例加入0.09g胶原蛋白粉末到小烧杯中，充分搅拌吸附30min得到吸附有胶原蛋白的氧化纤维素纳米纤维悬浊液。
(3)称取1g分子量为5万的壳聚糖充分溶解于100mL的0.1M冰醋酸溶液中，形成终浓度为1％的壳聚糖稀酸溶液。
(4)按照质量比为氧化纤维素纳米纤维/壳聚糖＝1/1的配比取10mL步骤(3)制得的壳聚糖稀酸溶液逐滴滴入步骤(2)的10mL吸附有胶原蛋白的氧化纤维素纳米纤维悬浊液的烧杯中，边滴加边搅拌，反应30min。
(5)将步骤(4)得到的凝胶产物的pH值调节为6并反复离心漂洗，最后收集凝胶沉淀按照固含量为1％加去离子水重新分散并拌均匀得到20mL的凝胶悬液。
(6)将步骤(5)得到的凝胶悬液分装模具，并且于-80摄氏度冰箱预冻12h，预冻后放入冷冻干燥机中处理48h得到氧化纤维素纳米纤维/胶原蛋白/壳聚糖复合止血材料(TOCN/COL/CS)。
实施例13
(1)以TEMPO/漆酶/O2氧化体系对全漂硫酸盐针叶木浆(金东纸业股份有限公司)进行氧化。在烧杯中配置100mL包含一定量的漆酶(4U/mL)和TEMPO(50mM)的醋酸钠缓冲溶液(0.1M，pH4.5)。将1g全漂硫酸盐针叶木浆重悬于该缓冲液体系中。用塑料袋覆盖烧杯口，塑料袋通过氧气罐充满氧气，室温下在磁力搅拌器上以500rpm的转速反应24h。氧化后将该混合液倒入冰水中反应30min，将所得产物反复过滤清洗去除杂质得到氧化纤维素，通过均质器将氧化纤维素打散纳米化，最终稀释得到固含量为1％(w/v)的氧化纤维素纳米纤维悬液(Laccase-TEMPO-oxidized Cellulose Nanofibers,LCNF)。
(2)取10mL步骤(1)得到的悬浊液放入小烧杯中，按照质量比为氧化纤维素纳米纤维/胶原蛋白＝1/0.9的比例加入0.09g胶原蛋白粉末到小烧杯中，充分搅拌吸附30min得到吸附有胶原蛋白的氧化纤维素纳米纤维悬浊液。
(3)称取1g分子量为5万的壳聚糖充分溶解于100mL的0.1M冰醋酸溶液中，形成终浓度为1％的壳聚糖稀酸溶液。
(4)按照质量比为氧化纤维素纳米纤维/壳聚糖＝1/1的配比取10mL步骤(3)制得的壳聚糖稀酸溶液逐滴滴入步骤(2)的10mL吸附有胶原蛋白的氧化纤维素纳米纤维悬浊液的烧杯中，边滴加边搅拌，反应30min。
(5)将步骤(4)得到的凝胶产物的pH值调节为6并反复离心漂洗，最后收集凝胶沉淀按照固含量为1％加去离子水重新分散并拌均匀得到20mL的凝胶悬液。
(6)将步骤(5)得到的凝胶悬液分装模具，并且于-80摄氏度冰箱预冻12h，预冻后放入冷冻干燥机中处理48h得到氧化纤维素纳米纤维/胶原蛋白/壳聚糖复合止血材料(LCNF/COL/CS)。
实施例14
(1)在烧杯中加入全漂硫酸盐针叶木浆(金东纸业股份有限公司)3g、高碘酸钠1.98g、氯化钠11.7g以及200mL去离子水。用锡箔纸包住烧杯避免副反应，在室温下缓慢搅拌反应2h。然后将所得物用去离子水反复过滤清洗得到二醛纤维素浆。进一步取二醛纤维素浆3.5g、次氯酸钠(纯度：80％)2.76g、双氧水(30wt％)2.76g加入到150mL去离子水中在室温下反应20h，期间通过滴加氢氧化钠溶液保持反应体系pH为5，将所得物反复过滤清洗得到羧基化纤维素。然后通过均质器将羧基化纤维素打散纳米化，最终稀释得到固含量为1％(w/v)的双羧基纤维素纳米纤维(Di-Carboxylic Cellulose-nanofibers,DCC)悬液
(2)取10mL步骤(1)得到的悬浊液放入小烧杯中，按照质量比为双羧基纤维素纳米纤维/胶原蛋白＝1/0.9的比例加入0.09g胶原蛋白粉末到小烧杯中，充分搅拌吸附30min得到吸附有胶原蛋白的双羧基纤维素纳米纤维悬浊液。
(3)称取1g分子量为5万的壳聚糖充分溶解于100mL的0.1M冰醋酸溶液中，形成终浓度为1％的壳聚糖稀酸溶液。
(4)按照质量比为双羧基纤维素纳米纤维/壳聚糖＝1/1的配比取10mL步骤(3)制得的壳聚糖稀酸溶液逐滴滴入步骤(2)的10mL吸附有胶原蛋白的双羧基纤维素纳米纤维悬浊液的烧杯中，边滴加边搅拌，反应30min。
(5)将步骤(4)得到的凝胶产物的pH值调节为6并反复离心漂洗，最后收集凝胶沉淀按照固含量为1％加去离子水重新分散并拌均匀得到20mL的凝胶悬液。
(6)将步骤(5)得到的凝胶悬液分装模具，并且于-80摄氏度冰箱预冻12h，预冻后放入冷冻干燥机中处理48h得到双羧基纤维素纳米纤维/胶原蛋白/壳聚糖复合止血材料(DCC/COL/CS)。
实施例15
(1)以20wt％NO2的CCl4溶液为氧化剂，添加全漂硫酸盐针叶木浆(金东纸业股份有限公司)到烧杯中，按照木浆:氧化剂为1:30(g/mL)加入氧化剂常温反应40h对其进行氧化。然后用50％乙醇溶液洗涤氧化木浆3次，紧接着用无水乙醇洗涤五次得到氧化纤维素。通过均质器将氧化纤维素打散纳米化，最终稀释得到固含量为1％(w/v)的氧化纤维素纳米纤维悬液(Oxidized Cellulose Nano Fiber,OCNF)。
(2)取10mL步骤(1)得到的悬浊液放入小烧杯中，按照质量比为氧化纤维素纳米纤维/明胶蛋白＝1/0.9的比例加入0.09g明胶蛋白粉末到小烧杯中，充分搅拌吸附30min得到吸附有明胶蛋白的氧化纤维素纳米纤维悬浊液。
(3)称取1g分子量为5万的壳聚糖充分溶解于100mL的0.1M冰醋酸溶液中，形成终浓度为1％的壳聚糖稀酸溶液。
(4)按照质量比为氧化纤维素纳米纤维/壳聚糖＝1/1的配比取10mL步骤(3)制得的壳聚糖稀酸溶液逐滴滴入步骤(2)的10mL吸附有明胶蛋白的氧化纤维素纳米纤维悬浊液的烧杯中，边滴加边搅拌，反应30min。
(5)将步骤(4)得到的凝胶产物的pH值调节为6并反复离心漂洗，最后收集凝胶沉淀按照固含量为1％加去离子水重新分散并拌均匀得到20mL的凝胶悬液。
(6)将步骤(5)得到的凝胶悬液分装模具，并且于-80摄氏度冰箱预冻12h，预冻后放入冷冻干燥机中处理48h得到氧化纤维素纳米纤维/明胶蛋白/壳聚糖复合止血材料(OCNF/GEL/CS)。
实施例16
(1)以HNO3/H3PO4-NaNO2氧化体系对全漂硫酸盐针叶木浆(金东纸业股份有限公司)进行氧化。室温下，将69.7％的HNO3和85％的H3PO4(2∶1,V/V)的混合液30mL与1.1g的NaNO2混合，在烧杯中加入2.5g全漂硫酸盐针叶木浆，并加入上述混合液30mL，用锡箔纸将烧杯包住室温下避光反应48h，水洗样品并抽滤直到滤液pH为3～4得到氧化纤维素，通过均质器将氧化纤维素打散纳米化，最终稀释得到固含量为1％(w/v)的氧化纤维素纳米纤维悬液(Nitric acid-oxidized Cellulose Nano Fiber,NCNF)。
(2)取10mL步骤(1)得到的悬浊液放入小烧杯中，按照质量比为氧化纤维素纳米纤维/丝素蛋白(或者聚赖氨酸、聚谷氨酸)＝1/0.9的比例加入0.09g丝素蛋白(或者聚赖氨酸、聚谷氨酸)粉末到小烧杯中，充分搅拌吸附30min得到吸附有丝素蛋白(或者聚赖氨酸、聚谷氨酸)的氧化纤维素纳米纤维悬浊液。
(3)称取1g季铵盐壳聚糖充分溶解于100mL的去离子水中，形成终浓度为1％的季铵盐壳聚糖水溶液。
(4)按照质量比为氧化纤维素纳米纤维/季铵盐壳聚糖(Quaternary AmmoniumChitosan，QCS)＝1/1的配比取10mL步骤(3)制得的季铵盐壳聚糖水溶液逐滴滴入步骤(2)的10mL吸附有丝素蛋白的氧化纤维素纳米纤维悬浊液的烧杯中，边滴加边搅拌，反应30min。
(5)将步骤(4)得到的凝胶产物的pH值调节为6并反复离心漂洗，最后收集凝胶沉淀按照固含量为1％加去离子水重新分散并拌均匀得到20mL的凝胶悬液。
(6)将步骤(5)得到的凝胶悬液分装模具，并且于-80摄氏度冰箱预冻12h，预冻后放入冷冻干燥机中处理48h得到氧化纤维素纳米纤维/胶原蛋白/季铵盐壳聚糖复合止血材料(NCNF/SF/QCS)。
为增强产品的止血和抗菌效果，可以将丝素蛋白替换为聚赖氨酸或者聚谷氨酸。
实施例17
(1)将市售细菌纤维素膜(海南椰国食品有限公司)置于1w/v％氢氧化钠水溶液中，在80℃下处理4h后取出水洗，这样反复4次碱处理后，用去离子水漂洗至中性后获得细菌纤维素膜。(2)在烧杯中加入细菌纤维素膜3g(按干重计)、高碘酸钠1.98g、氯化钠11.7g以及200mL去离子水。用锡箔纸包住烧杯(或者暗室避光)避免副反应，在室温下缓慢搅拌反应2h。然后将所得物用去离子水反复过滤清洗得到二醛氧化细菌纤维素(DialdehydeOxidized Bacterial Cellulose,DAOBC)。
(3)称取分子量为3000的壳聚糖充分溶解于100mL的0.1M冰醋酸水溶液中，形成终浓度为0.25％、0.5％、1.0％和2.0％的壳聚糖稀酸溶液。
(4)取10g步骤(2)中的二醛氧化细菌纳米纤维素湿膜，往其中加入10mL的步骤(3)中的壳聚糖稀酸溶液，振荡过夜，吸附均匀。
(5)将步骤(4)中的吸附壳聚糖的湿膜放入10mL的1％(w/v)硫酸钠水溶液(pH＝6.5)中，振荡1min，然后静置5min。
(6)将步骤(5)所得产品经去离子水反复漂洗后收集，于-80摄氏度冰箱预冻12h，预冻后放入冷冻干燥机中处理48h得到负载壳聚糖微球的二醛氧化细菌纤维素纳米纤维止血材料(CSMS-DAOBC)。1％CS成球的CSMS-DAOBC产品的微观结构见图12，抗菌测试结果见图13。
由图3可知本发明制备的海绵样品都具有均匀分布的大孔结构，TCNF由纳米纤维搭建而成。与TCNF相比，TCNF/CS和TCNF/COL/CS的孔径小而多，整体结构松散。CMC与TCNF相比，结构更加严实，表面更加光滑，在放大20K倍下看不到纳米纤维搭建的网络。也可以看到CSMS-OBC和CSMS-OBC/SF被成功制备，壳聚糖微球存在于氧化细菌纳米纤维素的纤维表面和内部，并且将邻近的纳米纤维包裹在一起。
图4可以证明TCNF/CS通过静电自组装成功合成，TCNF/COL/CS也成功的通过静电自组装将胶原蛋白物理绑定与其中。
由图5可知本发明制备的TCNF、TCNF/CS和TCNF/COL/CS都有超过90％的孔隙率，并且有很强的水吸收能力，其中TCNF/COL/CS的水吸收能力最强。
图6为样品的机械力学性能，将海绵样品制备成直径为10mm，高度为10mm的圆柱体。使用万能材料测试机以3mm/min的速度压缩海绵样品。通过传感器得到相关压缩力学数据，在各种目标应变下计算压缩强度，由应力-应变曲线的线性区域的斜率计算出杨氏模量。每个样品至少重复6次。可知本发明制备的TCNF、TCNF/CS和TCNF/COL/CS有一定的力学性质能够满足适当的压缩符合止血材料的要求，相比较TCNF，复合壳聚糖后的力学性质下降，可能是因为壳聚糖的复合破换了TCNF之间强烈结合的氢键。
图7为细菌与不同样品接触后洗脱并定殖在平板上的生长情况。测试方法依据ISO-20743—2007，具体测试过程见实施例11。显而易见，相比纱布对照组，TCNF、TCNF/CS、和TCNF/COL/CS这三组样品上存活的细菌数量显著减少，可知本发明制备的TCNF、TCNF/CS和TCNF/COL/CS抗菌性能优秀，与表二结果一致，其中无菌纱布为对照组。
图8为细胞毒性结果，图8A是钙黄绿素荧光染色的结果，图8B是通过CCK-8试剂对细胞增殖的定量评估，图8C是扫描电镜下观察细胞在材料上的生长形态。可以得出结论，相比于Surgicel，本发明制备的TCNF、TCNF/CS和TCNF/COL/CS有优秀的细胞相容性。
图9是溶血率和体外止血试验结果，图9A证明了我们制备的TCNF、TCNF/CS和TCNF/COL/CS溶血率都低于2％,具有良好的血液相容性。图9B中a、b、c、d和e分别是商用明胶海绵、Surgicel、TCNF、TCNF/CS和TCNF/COL/CS。可以看出相比商用明胶海绵和Surgicel，本发明制备的海绵样品有很好的血液浓缩能力。图9C是全血凝固实验，能够反映材料的促凝血能力，本发明能够看到TCNF、TCNF/CS以及TCNF/COL/CS相比对照组都有较好的促凝血能力，其中TCNF/COL/CS有最大的促凝血能力。图9D是血小板和红细胞粘附实验，可以看出在TCNF/CS和TCNF/COL/CS上粘附了最多的红细胞和血小板。
图10是体内止血试验，通过SD大鼠肝脏创伤模型得到止血时间(图10A)和血流失量(图10B)两组数据。可以看出相比单一的TCNF和CMC，其它复合组的止血时间都要短并且血流失量也较少，尤其是复合蛋白多肽以后，止血时间最短且血流失量最小，TCNF/COL/CS、OBC/SA/SF/CCS、CSMS-OBC/SF、CSMS-TCNF/GEL、CSMS-DAC/COL、CMC/COL/CS、TOCN/COL/CS、LCNF/COL/CS、DCC/COL/CS、OCNF/GEL/CS、NCNF/SF/QCS的止血时间分别是41s、41s、40s、42s、46s、60s、42s、40s、50s、45s和46s，血流失量分别是37mg、39mg、40mg、41mg、45mg、50mg、41mg、38mg、45mg、41mg和47mg。这可能是因为相比单一材料的止血，复合材料能够发挥多重协同机制从而迅速止血。相比如羧甲基纤维素基的止血材料，纤维素纳米纤维和细菌纳米纤维素基的止血效果较好。这可能是因为纳米级别的纤维具有较高的比表面积能够加快凝血过程。
图11是SD大鼠皮下包埋材料的HE染色，可以看出，一周后TCNF，TCNF/CS，TCNF/COL/CS以及对照组都有明显的炎症反应，初期的炎症反应有利于组织的愈合，但是四周后炎症反应已经消失，并且材料大部分降解，组织细胞取代了材料或者与材料融为一体，而其中TCNF/COL/CS的组织愈合的最好，结缔组织已经长满在了材料的空隙之间，这是因为胶原蛋白能够促进成纤维细胞的生长，有利于组织的愈合。
图12是CS浓度为1％时，二醛氧化细菌纤维素网络中原位形成的壳聚糖微球，不仅尺寸均匀而且分布均匀，微球均匀镶嵌在网络中。
图13是CSMS-DAOBC产品的抗菌测试结果(左边为大肠杆菌抗菌，右边为金黄色葡萄球菌)，通过琼脂扩散法来测定，将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌从斜面种子接种到种子培养基中，37℃恒温培养24h得到种子液。吸取0.1mL种子液至固体平板培养基上，涂布均匀。将样品平铺在平板中心，37℃恒温环境培养24h。观查样品周围是否出现抑菌圈。实验结果表明壳聚糖浓度为0.25％时，对革兰氏阴性和阳性细菌，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果不明显，而在0.5-2.0％浓度时抑菌带明显，说明有很好的抑菌效果。
上述实施例的结果表明，本发明在不破坏原有结构的情况下将这三种材料巧妙的结合在一起，得到的复合材料具有广谱抗菌性，优秀的细胞相容性、血液相容性以及组织促愈性，优异的止血性能以及体内可吸收性。具有极大的潜力作为止血材料应用于临床。

Claims (9)

1.一种基于多聚阴离子型纤维素的可吸收止血复合材料，其特征在于，通过以多聚阴离子型纤维素为基材搭建网络结构，再与壳聚糖或者壳聚糖衍生物进行静电吸附自组装或者再与壳聚糖或其衍生物静电自组装负载蛋白多肽得到；
或者通过以多聚阴离子型纤维素为基材搭建网络结构，并将壳聚糖微球或者壳聚糖微球和蛋白多肽原位成球，负载在纤维素的表面和网络中得到。
2.根据权利要求1所述复合材料，其特征在于，所述聚阴离子型纤维素为植物源氧化纤维素纳米纤维、氧化细菌纳米纤维素、羧甲基纤维素、双羧基纤维素纳米纤维中的一种或几种；壳聚糖衍生物为羧甲基壳聚糖、季铵盐壳聚糖中的一种或两种；蛋白多肽为胶原蛋白、明胶、丝素蛋白中的一种或几种。
3.一种基于多聚阴离子型纤维素的可吸收止血复合材料的制备方法，包括：
将壳聚糖/稀醋酸水溶液或壳聚糖衍生物水溶液缓慢滴入多聚阴离子型纤维素悬液中进行静电吸附自组装反应，然后调节pH值为2-8并离心漂洗，重新分散均匀，装配模具，冷冻干燥得到可吸收止血复合材料；
或者将蛋白多肽加入到多聚阴离子型纤维素悬液中浸渍吸附搅拌，然后缓慢滴加壳聚糖/稀醋酸水溶液或壳聚糖衍生物水溶液，然后调节pH值为2-8并离心漂洗，重新分散均匀，装配模具，冷冻干燥得到可吸收止血复合材料；
或者将壳聚糖/稀醋酸水溶液与质子化的多聚阴离子型纤维素悬液混匀，然后与硫酸盐水溶液或磷酸盐水溶液混合，形成的沉淀经离心漂洗，重新分散均匀，装配模具，冷冻干燥得到可吸收止血复合材料；
或者将蛋白多肽加入到质子化的多聚阴离子型纤维素悬液中浸渍吸附搅拌，再加入壳聚糖/稀醋酸水溶液，然后与硫酸盐水溶液或磷酸盐水溶液混合，形成的沉淀经离心漂洗，重新分散均匀，装配模具，冷冻干燥得到可吸收止血复合材料。
4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述多聚阴离子型纤维素悬液为：0.5-5％w/v的植物源氧化纤维素纳米纤维水溶液、0.5-5％w/v的氧化细菌纳米纤维素水溶液或者0.3％-3％w/v的羧甲基纤维素水溶液。
5.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述壳聚糖/稀醋酸水溶液和壳聚糖衍生物水溶液浓度为0.3-5％w/v；壳聚糖与多聚阴离子型纤维素的质量比为4:1-1:4；壳聚糖衍生物与多聚阴离子型纤维素的质量比为4:1-1:4；壳聚糖与质子化的多聚阴离子型纤维素的质量比为5:1-1:5。
6.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述质子化的多聚阴离子型纤维素悬液pH值为2-3；蛋白多肽与多聚阴离子型纤维素的质量比为0.5:1-5:1；蛋白多肽与质子化的多聚阴离子型纤维素的质量比为0.2:1-4:1。
7.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述浸渍吸附搅拌时间为0.5-5小时；静电吸附自组装反应时间为5-60分钟；重新分散均匀的固含量浓度为0.2％-5％。
8.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述硫酸盐为硫酸钠、硫酸镁、硫酸铁中的一种或几种；磷酸盐为磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠中一种或几种；硫酸盐和磷酸盐水溶液浓度为0.1-20％w/v，pH值为3-7。
9.一种如权利要求1所述复合材料在制备止血材料或抗菌材料中的应用。
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