CN115850733B - 一种可注射用纳米粘土水凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种可注射用纳米粘土水凝胶及其制备方法和应用，具体涉及医药材料领域。所述水凝胶的制备方法包括将金属离子与多酚还原氧化埃洛石纳米管鳌合进行原位制备多酚改性埃洛石纳米管‑金属离子复合纳米管；进而将多酚改性埃洛石纳米管‑金属离子复合纳米管掺杂到明胶‑多糖混合溶液中制备得可注射用纳米粘土水凝胶。本发明制备的可注射纳米粘土水凝胶，不仅保留了水凝胶可快速成胶的可注射性，还增强了水凝胶的粘附性能；负载抗菌金属离子的复合纳米管的加入，不仅显著的增强了水凝胶的止血能力，同时赋予了水凝胶体系高效的抗菌性能和促愈性能。

Description

一种可注射用纳米粘土水凝胶及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及医药材料技术领域，具体涉及一种可注射用纳米粘土水凝胶及其制备方法和应用。

背景技术

皮肤伤口愈合包括止血、抗炎、增殖和再上皮化的几个重叠过程。止血停止后伤口开始愈合，因此，缩短止血时间可以促进伤口提前进入愈合阶段。然而，一旦整个表皮严重受损，皮肤将失去最基本的保护作用，尤其是伤口部位的微生物感染将严重延长愈合过程。如果不能及时有效治疗，慢性伤口很容易被大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌等病原体定植，最终导致非功能性瘢痕。因此，出血和感染仍然是临床治疗中最棘手的问题，也是亟待解决的难题。然而，止血材料的设计主要集中在止血性能的提高，而忽略了抗菌抗感染性能。因此有必要开发一种新的策略，实现快速止血的同时避免细菌感染或快速杀死各种细菌并消除用于伤口止血。

近年来，水凝胶由于其三维聚合网络类似于细胞外基质的结构，在生物医学应用中得到了越来越多的关注，特别是组织修复和再生。其中，具有原位凝胶形成能力的原位水凝胶能够与不规则伤口紧密结合，有效防止微生物渗透。尽管原位水凝胶具有许多明显的优点，但大多数水凝胶缺乏组织粘附性，凝胶时间相对较长，不能根据需要去除。因此，寻找合适的基质并赋予其快速止血和抗菌性能，对于多功能水凝胶的设计具有重要意义。

发明内容

为此，本发明提供一种具有超强止血和抗菌性能的可注射纳米粘土水凝胶，其适用于伤口形态复杂的感染伤口术后修复，且具有良好的组织粘附性，止血特性、强效抗菌性和良好的促愈性，可以改善传统敷料均存在着各种方面的不足，或功能单一性，或粘附力差，或形状固定不能适应复杂形状创面，或在促进细胞生长创口愈合方面存在的不足。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

根据本发明第一方面提供的一种可注射用纳米粘土水凝胶的制备方法，包括：

步骤一，负载金属离子的多酚类改性埃洛石纳米管的制备

在碱性条件下，利用空气中的氧气氧化多酚类物质，在多酚类物质聚合过程中包覆纳米粘土埃洛石纳米管，再经过真空泵吸抗菌性金属盐溶液中的金属离子，制备出负载金属离子的多酚改性埃洛石纳米管；

步骤二，混合溶液的制备

将明胶溶液与壳聚糖溶液均匀混合后得明胶-壳聚糖混合溶液；

溶解多巴胺修饰的氧化葡聚糖，得多巴胺接枝的氧化葡聚糖溶液，将负载金属离子的多酚改性埃洛石纳米管分散于多巴胺接枝的氧化葡聚糖溶液中，得到纳米管-多糖混合溶液；

步骤三，可注射纳米粘土水凝胶的制备

将纳米管-多糖混合溶液加入到明胶-壳聚糖混合溶液中，搅拌混合均匀，即得可注射纳米粘土水凝胶。

进一步的，所述步骤一中，所述多酚类物质为没食子酸，单宁酸中的一种或几种；

和/或，所述抗菌性金属盐溶液为银离子盐溶液、锌离子盐溶液或铜离子盐溶液，所述抗菌性金属盐溶液优选锌离子盐溶液，具体为乙酸锌、硝酸锌或氯化锌。

进一步的，所述步骤一中，负载金属离子的多酚改性埃洛石纳米管的制备还包括负载金属离子的多酚改性埃洛石纳米管需要在60℃烘干研磨成粉末后干燥保存。

进一步的，所述步骤二中，多巴胺修饰的氧化葡聚糖是通过氧化葡聚糖冻干粉溶解在去离子水中，加入多巴胺，在37℃下反应24h后，透析并冻干后获得多巴胺接枝的氧化葡聚糖DA-OD，即为多巴胺修饰的氧化葡聚糖。

进一步的，所述氧化葡聚糖冻干粉是葡聚糖通过高碘酸钠的氧化作用生成氧化葡聚糖溶液，经过透析冻干后获得氧化葡聚糖冻干粉。

进一步的，所述多巴胺修饰的氧化葡聚糖在-20℃保存。

作为示例：

一种具有超强止血和抗菌性能的可注射纳米粘土水凝胶的制备方法，包括如下步骤：

步骤1：在室温下，将一定量的埃洛石纳米管均匀分散在去离子水中，向该混合物中加入一定量的没食子酸(GA)，随后，添加一定量的tris-hcl溶液使得混合物pH＝8～10之间，在35℃下避光反应搅拌24小时，最后通过将混合物离心获得聚没食子酸改性埃洛石纳米管(PHTs)，随后60℃烘干研磨成粉末后干燥保存；

步骤2：将步骤1得到一定量的PHTs均匀分散在锌离子盐溶液中搅拌并真空泵吸，最后通过将混合物离心获得聚没食子酸改性埃洛石纳米管-锌离子复合纳米管(PHTs@Zn)，随后60℃烘干研磨成粉末后干燥保存；

步骤3：将一定量的葡聚糖通过高碘酸钠的氧化作用生成氧化葡聚糖溶液，经过透析冻干后获得氧化葡聚糖(OD)，再次将氧化葡聚糖溶解在去离子水中，加入定量的多巴胺，在37℃下反应24h后，透析并冻干后获得多巴胺接枝的氧化葡聚糖DA-OD，然后，置于-20℃保存；

步骤4：将一定量的明胶和极少量的壳聚糖在60℃条件下溶解在1％乙酸或乙酸盐溶液中得到均一的明胶-壳聚糖混合溶液(Gel-CS)；

溶解定量的多巴胺接枝的氧化葡聚糖，在多巴胺接枝的氧化葡聚糖溶液中均匀分散定量的聚没食子酸改性埃洛石纳米管-锌离子复合纳米管得到纳米管混合溶液(DA-OD/PHTs@Zn)；

将混合溶液(Gel-CS)和纳米管混合溶液(DA-OD/PHTs@Zn)等体积混合后得到可注射纳米粘土水凝胶(PHTs@Zn/GCD)。

进一步的，步骤1和2中均匀分散是通过搅拌-超声-搅拌进行分散，处理时间为10min-5min-10min。

进一步的，步骤2中所述的锌离子盐溶液为乙酸锌、硝酸锌或氯化锌。

根据本发明第二方面提供的一种可注射用纳米粘土水凝胶，是由如上任一方法制备而成。

本发明植被的具有超强止血和抗菌性能的可注射纳米粘土水凝胶(PHTs@Zn/GCD)；命名为负载锌离子-聚没食子酸改性埃洛石纳米管明胶多糖水凝胶。

进一步的，所述水凝胶是负载金属离子-多酚改性埃洛石纳米管明胶多糖水凝胶。

根据本发明第三方面提供的一种可注射用纳米粘土水凝胶在制备如下任一产品中的应用；

a)具有超强止血功能的产品；

b)具有超强抗菌性能的产品；

c)具有良好促愈性能的产品；

d)作为感染创面愈合用创面敷料的产品。

本发明的水凝胶具有良好的组织粘附性，止血特性、强效抗菌性和良好的促愈性。

本发明具有如下优点：

(1)本发明所使用的原位法制备负载金属离子-多酚改性埃洛石纳米管的方法，可通过将金属离子吸附在多酚还原的氧化埃洛石纳米管原位来制备PHTs@金属，经过PGA的修饰，使其能均匀分散在水凝胶网络上；多酚可以进一步增加HNTs的比表面积和赋予HNTs多酚结构，以高效负载金属离子并达到缓释效应；多酚结构赋予了埃洛石纳米管优异的抗炎能力，使得纳米复合物既可以均匀分散又可以高效负载缓释金属离子同时兼顾抗炎能力。

(2)本发明制备的负载金属离子-多酚改性埃洛石纳米管明胶基水凝胶，不仅保留了水凝胶可快速成胶的可注射性，还增强了水凝胶的粘附性能，加强了水凝胶的注射密封性；埃洛石纳米管的止血效果一直是研究的热点，多酚的改性并没有改变埃洛石纳米管的结构，水凝胶中增加的纳米管，显著的增强了水凝胶的止血能力；通过高效负载抗菌的金属离子，进一步加强了其止血效应，同时赋予了体系高效的抗菌性能。

(3)本发明制备得到的负载金属离子-多酚改性埃洛石纳米管明胶基水凝胶，多酚改性埃洛石纳米管上的聚没食子酸因其独特的多酚结构具有组织亲和性；多糖成分可缩短水凝胶的成胶时间，赋予了水凝胶的可注射性；结合明胶基水凝胶的促愈合能力，可实现伤口形态复杂的感染伤口术后组织修复，为其后续在医药材料方面的应用奠定了基础。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。

本说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。

图1为本发明实施例2提供的不同改性方法得到的纳米管的TEM图；

其中，比例尺分别为HNTs-500nm，50nm；PHTs-500nm，50nm；

PHTs@Zn-500nm，50nm；

图2为本发明实施例2提供的不同改性方法得到的纳米管的Zeta电位图；

图3为本发明实施例1提供的纳米管在去离子水中的分散时间对比实物图；

其中，A-HNTs；B-PHTs@Zn；

图4为本发明实施例2提供的一种可注射纳米粘土水凝胶不同尺寸的SEM图；

其中，比例尺分别为A-500μm；B-200μm；C-50μm；

图5为本发明实验例2提供的粘附力统计图；

其中，A-GCD；B-2PHTs@Zn/GCD；C-4PHTs@Zn/GCD；D-8PHTs@Zn/GCD；

图6为本发明实验例2提供的细胞相容性统计图；

其中，control：空白组；A-GCD；B-4PHTs/GCD；C-2PHTs@Zn/GCD；D-4PHTs@Zn/GCD；E-8PHTs@Zn/GCD；

图7为本发明实验例2提供的血液相容性实物图和统计图；

其中，Ⅰ-实物图；Ⅱ-统计图；A-GCD；B-4PHTs/GCD；C-2PHTs@Zn/GCD；D-4PHTs@Zn/GCD；E-8PHTs@Zn/GCD；

图8为本发明实验例3提供的抗菌性能图；

其中，A-GCD；B-4PHTs/GCD；C-2PHTs@Zn/GCD；D-4PHTs@Zn/GCD；E-8PHTs@Zn/GCD；

图9为本发明实验例4提供的体内止血实实物图；

其中，A-肝缺损止血实验对照组；B-肝缺损止血实验实验组：PHTs@Zn/GCD；

图10为本发明实验例1提供的体内愈合实实物图；

其中，A-空白对照组；B-PHTs@Zn/GCD；C-4PHTs/GCD；D-4PHTs@Zn/GCD。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实验所需材料来源除了聚没食子酸改性埃洛石纳米管-锌离子复合纳米管和多巴胺接枝的氧化葡聚糖是实验室(西南交通大学教育部材料科学与工程重点实验室)自己制备存留的，其余均来自实验室购置的sigma化学试剂。

HNTs-埃洛石纳米管

Gel-明胶

CS-壳聚糖

PHTs-聚没食子酸改性埃洛石纳米管

PHTs@Zn--负载锌离子的聚没食子酸改性埃洛石纳米管

GA-没食子酸

PGA-聚没食子酸

DA-OD-多巴胺接枝的氧化葡聚糖

GCD-可注射明胶多糖水凝胶--为明胶/壳聚糖溶液+多巴胺接枝的氧化葡聚糖溶液混合搅拌而成。

4PHTs/GCD-可注射纳米粘土水凝胶--聚没食子酸改性埃洛石纳米管明胶多糖水凝胶；其中：PHTs含量为4％

PHTs@Zn/GCD-可注射纳米粘土复合水凝胶--负载锌离子-聚没食子酸改性埃洛石纳米管明胶多糖水凝胶；其中：2PHTs@Zn/GCD；4PHTs@Zn/GCD；8PHTs@Zn/GCD；分别代表PHTs@Zn含量为2％、4％、8％。

实施例1

本实施例提供一种适用于伤口形态复杂的感染伤口术后修复的水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

步骤一，聚没食子酸改性埃洛石纳米管-锌离子复合纳米管(PHTs@Zn)的制备：

在室温下，将1g埃洛石纳米管充分分散在去离子水中，高速搅拌10min后超声处理5min，再充分搅拌10min，之后，向该混合物中加入0.5g没食子酸(GA)，同时添加一定量的pH＝8～10的tris-hcl溶液调节混合物溶液pH＝8～10之间，在35℃水浴下避光反应搅拌24小时，最后通过将混合物离心获得聚没食子酸改性埃洛石纳米管(PHTs)，并用去离子水洗涤2-3次，随后60℃烘干研磨成粉末；

称量1g干燥的PHTs纳米管粉末，均匀分散在浓度为100g/L乙酸锌盐溶液中，经过搅拌并真空泵吸后，通过将混合物离心获得聚没食子酸改性埃洛石纳米管-锌离子复合纳米管(PHTs@Zn)，随后60℃烘干研磨成粉末后干燥保存；

步骤二，多巴胺接枝的氧化葡聚糖DA-OD的制备：

将5g的葡聚糖通过高碘酸钠摩尔量1：1的氧化作用生成氧化葡聚糖溶液，经过透析冻干后获得氧化葡聚糖(OD)，再次将1g氧化葡聚糖溶解在去离子水中，加入质量比为10：1的多巴胺，在37℃下反应24h后，透析并冻干后获得多巴胺接枝的氧化葡聚糖DA-OD，然后，置于-20℃保存。

步骤三，可注射纳米粘土水凝胶(PHTs@Zn/GCD)的制备：

将1.25g明胶和0.04g壳聚糖在60℃条件下溶解在5ml 1％乙酸溶液中得到均一的明胶-壳聚糖混合溶液(Gel-CS)；

在5ml去离子水中溶解0.2g多巴胺接枝的氧化葡聚糖，在多巴胺接枝的氧化葡聚糖溶液中均匀分散2％的聚没食子酸改性埃洛石纳米管-锌离子复合纳米管得到纳米管-多糖混合溶液(DA-OD/PHTs@Zn)，

其中PHTs@Zn质量分数为：2％，

将明胶-壳聚糖混合溶液(Gel-CS)和混合溶液(DA-OD/2PHTs@Zn)等体积混合后得到可注射纳米粘土水凝胶(2PHTs@Zn/GCD)。

实施例2

本实施例提供一种适用于伤口形态复杂的感染伤口术后修复的水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

步骤一，聚没食子酸改性埃洛石纳米管-锌离子复合纳米管(PHTs@Zn)的制备：

在室温下，将1g埃洛石纳米管充分分散在去离子水中，高速搅拌10min后超声处理5min，再充分搅拌10min，之后，向该混合物中加入0.5g没食子酸(GA)，同时，添加pH＝8～10的tris-hcl溶液调节混合物溶液pH＝8～10之间，在35℃水浴下避光反应搅拌24小时，最后通过将混合物离心获得聚没食子酸改性埃洛石纳米管(PHTs)，并用去离子水洗涤2-3次，随后60℃烘干研磨成粉末。

称量1g干燥的PHTs纳米管粉末，均匀分散在浓度为100g/L的乙酸锌盐溶液中搅拌并真空泵吸，最后通过将混合物离心获得聚没食子酸改性埃洛石纳米管-锌离子复合纳米管(PHTs@Zn)，随后60℃烘干研磨成粉末后干燥保存；

步骤二，多巴胺接枝的氧化葡聚糖DA-OD的制备：

将5g的葡聚糖通过高碘酸钠摩尔量1：1的氧化作用生成氧化葡聚糖溶液，经过透析冻干后获得氧化葡聚糖(OD)，再次将1g氧化葡聚糖溶解在去离子水中，加入质量比为10：1的多巴胺，在37℃下反应24h后，透析并冻干后获得多巴胺接枝的氧化葡聚糖DA-OD，然后，置于-20℃保存。

步骤三，可注射纳米粘土水凝胶(PHTs@Zn/GCD)的制备：

将1.5g明胶和0.04g壳聚糖在60℃条件下溶解在5ml 1％乙酸溶液中得到均一的明胶-壳聚糖混合溶液(Gel-CS)；

在5ml去离子水中溶解0.2g多巴胺接枝的氧化葡聚糖，在多巴胺接枝的氧化葡聚糖溶液中均匀分散4％的聚没食子酸改性埃洛石纳米管-锌离子复合纳米管得到纳米管混合溶液(DA-OD/PHTs@Zn)；

其中PHTs@Zn质量分数为：4％，

将明胶-壳聚糖混合溶液(Gel-CS)和纳米管混合溶液(DA-OD/4PHTs@Zn)等体积混合后得到可注射纳米粘土水凝胶(4PHTs@Zn/GCD)。

实施例3

本实施例提供一种适用于伤口形态复杂的感染伤口术后修复的水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

步骤一，聚没食子酸改性埃洛石纳米管-锌离子复合纳米管(PHTs@Zn)的制备：

在室温下，将1g埃洛石纳米管充分分散在去离子水中，高速搅拌10min后超声处理5min，再充分搅拌10min，之后，向该混合物中加入0.5g没食子酸(GA)，同时，添加pH＝8～10的tris-hcl溶液调节混合物溶液pH＝8～10之间，在35℃水浴下避光反应搅拌24小时，最后通过将混合物离心获得聚没食子酸改性埃洛石纳米管(PHTs)，并用去离子水洗涤2-3次，随后60℃烘干研磨成粉末。

称量1g干燥的PHTs纳米管粉末，均匀分散在浓度为100g/L的乙酸锌盐溶液中搅拌并真空泵吸，最后通过将混合物离心获得聚没食子酸改性埃洛石纳米管-锌离子复合纳米管(PHTs@Zn)，随后60℃烘干研磨成粉末后干燥保存；

步骤二，多巴胺接枝的氧化葡聚糖DA-OD的制备：

将5g的葡聚糖通过高碘酸钠摩尔量1：1的氧化作用生成氧化葡聚糖溶液，经过透析冻干后获得氧化葡聚糖(OD)，再次将1g氧化葡聚糖溶解在去离子水中，加入质量比为10：1的多巴胺，在37℃下反应24h后，透析并冻干后获得多巴胺接枝的氧化葡聚糖DA-OD，然后，置于-20℃保存。

步骤三，可注射纳米粘土水凝胶(PHTs@Zn/GCD)的制备：

将1.5g明胶和0.04g壳聚糖在60℃条件下溶解在5ml 1％乙酸溶液中得到均一的明胶-壳聚糖混合溶液(Gel-CS)；

在5ml去离子水中溶解0.2g多巴胺接枝的氧化葡聚糖，在多巴胺接枝的氧化葡聚糖溶液中均匀分散8％的聚没食子酸改性埃洛石纳米管-锌离子复合纳米管得到纳米管-多糖混合溶液(DA-OD/PHTs@Zn)；

其中PHTs@Zn质量分数为：8％，

将明胶-壳聚糖混合溶液(Gel-CS)和纳米管-多糖混合溶液(DA-OD/8PHTs@Zn)等体积混合后得到可注射纳米粘土水凝胶(8PHTs@Zn/GCD)。

实施例4

本实施例提供一种适用于伤口形态复杂的感染伤口术后修复的水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

步骤一，聚没食子酸改性埃洛石纳米管-锌离子复合纳米管(PHTs@Zn)的制备：

在室温下，将1g埃洛石纳米管充分分散在去离子水中，高速搅拌10min后超声处理5min，再充分搅拌10min，之后，向该混合物中加入0.5g没食子酸(GA)，同时，添加pH＝8～10的tris-hcl溶液调节混合物溶液pH＝8～10之间，在35℃水浴下避光反应搅拌24小时，最后通过将混合物离心获得聚没食子酸改性埃洛石纳米管(PHTs)，并用去离子水洗涤2-3次，随后60℃烘干研磨成粉末。

称量1g干燥的PHTs纳米管粉末，均匀分散在浓度为100g/L的硝酸锌盐溶液中搅拌并真空泵吸，最后通过将混合物离心获得聚没食子酸改性埃洛石纳米管-锌离子复合纳米管(PHTs@Zn)，随后60℃烘干研磨成粉末后干燥保存；

步骤二，多巴胺接枝的氧化葡聚糖DA-OD的制备：

将5g的葡聚糖通过高碘酸钠摩尔量1：1的氧化作用生成氧化葡聚糖溶液，经过透析冻干后获得氧化葡聚糖(OD)，再次将1g氧化葡聚糖溶解在去离子水中，加入质量比为10：1的多巴胺，在37℃下反应24h后，透析并冻干后获得多巴胺接枝的氧化葡聚糖DA-OD，然后，置于-20℃保存。

步骤三，可注射纳米粘土水凝胶(PHTs@Zn/GCD)的制备：

将1.5g明胶和0.04g壳聚糖在60℃条件下溶解在5ml 1％乙酸盐溶液中得到均一的明胶-壳聚糖混合溶液(Gel-CS)；

在5ml去离子水中溶解0.2g多巴胺接枝的氧化葡聚糖，在多巴胺接枝的氧化葡聚糖溶液中均匀分散4％聚没食子酸改性埃洛石纳米管-锌离子复合纳米管得到纳米管混合溶液(DA-OD/PHTs@Zn)，

其中PHTs@Zn质量分数为：4％，

将明胶-壳聚糖混合溶液(Gel-CS)和纳米管混合溶液(DA-OD/4PHTs@Zn)等体积混合后得到可注射纳米粘土水凝胶(4PHTs@Zn/GCD)。

实施例5

本实施例提供一种适用于伤口形态复杂的感染伤口术后修复的水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

步骤一，聚没食子酸改性埃洛石纳米管-锌离子复合纳米管(PHTs@Zn)的制备：

在室温下，将1g埃洛石纳米管充分分散在去离子水中，高速搅拌10min后超声处理5min，再充分搅拌10min，之后，向该混合物中加入0.5g没食子酸(GA)，同时，添加pH＝8～10的tris-hcl溶液调节混合物溶液PH＝8～10之间，在35℃水浴下避光反应搅拌24小时，最后通过将混合物离心获得聚没食子酸改性埃洛石纳米管(PHTs)，并用去离子水洗涤2-3次，随后60℃烘干研磨成粉末。

称量1g干燥的PHTs纳米管粉末，均匀分散在浓度为100g/L的氯化锌盐溶液中搅拌并真空泵吸，最后通过将混合物离心获得聚没食子酸改性埃洛石纳米管-锌离子复合纳米管(PHTs@Zn)，随后60℃烘干研磨成粉末后干燥保存；

步骤二，多巴胺接枝的氧化葡聚糖DA-OD的制备：

将5g的葡聚糖通过高碘酸钠摩尔量1：1的氧化作用生成氧化葡聚糖溶液，经过透析冻干后获得氧化葡聚糖(OD)，再次将1g氧化葡聚糖溶解在去离子水中，加入质量比为10：1的多巴胺，在37℃下反应24h后，透析并冻干后获得多巴胺接枝的氧化葡聚糖DA-OD，然后，置于-20℃保存。

步骤三，可注射纳米粘土水凝胶(PHTs@Zn/GCD)的制备：

将1.5g明胶和0.04g壳聚糖在60℃条件下溶解在5ml 1％乙酸盐溶液中得到均一的明胶-壳聚糖混合溶液(Gel-CS)；

在5ml去离子水中溶解0.2g多巴胺接枝的氧化葡聚糖，在多巴胺接枝的氧化葡聚糖溶液中均匀分散4％聚没食子酸改性埃洛石纳米管-锌离子复合纳米管得到纳米管混合溶液(DA-OD/PHTs@Zn)，

其中PHTs@Zn质量分数为：4％

将明胶-壳聚糖混合溶液(Gel-CS)和纳米管混合溶液(DA-OD/4PHTs@Zn)等体积混合后得到可注射纳米粘土水凝胶(4PHTs@Zn/GCD)。

实验例1

本实施例是实施例2得到的水凝胶各组分及中间组分的检测：

1.TEM图

实施例2得到的复合纳米管，其不同改性方法得到的纳米管的TEM图如图1所示；由图1可见，不同改性方法得到的埃洛石纳米管并没有改变其原本的物理结构，从而保留了其原本的生物性能。

2.Zeta电位图

实施例2得到的不同方法改性得到的复合纳米管，其不同方法改性得到的纳米管的Zeta电位图，如图2所示：不同改性方法的纳米管使埃洛石纳米管表面的电位发生改变，从而证明了纳米管的表面改性成功。

3.纳米管分散图

本试验例提供一种改性纳米管分散性能对比实验。将实施例2的聚没食子酸改性埃洛石纳米管-锌离子复合纳米管分散于去离子水中，

实验组:实施例2制得的PHTs@Zn，

空白组:HNTs；

在室温下，通过分别将定量的PHTs@Zn和HNTs分散到PBS中后静置，如图3所示，在额定时间观察纳米管的沉淀，通过对比可见本发明的实验组很好的分散性。

4.SEM图

实施例2可注射纳米粘土水凝胶不同尺寸的SEM图。如图4所示，由图4中可以看出，水凝胶内部具有均匀的多孔结构，结构平滑，内部交联分布良好；负载锌离子-聚没食子酸改性埃洛石纳米管水凝胶孔隙变小。

5.粘附力

实验方法：选用新鲜猪皮作为测试基底材料。

将500μL水凝胶预混液注射在一对同样基地材料(2.5cm*2.5cm)中间等30分钟稳定成胶，然后通过万能力学试验机(Instron 5567,USA)进行测试，加载力为10N，拉伸速率为2mm/min。当水凝胶样品从任一面基地材料脱落，则试验结束。粘附(As)强度计算公式：As＝F/A(F是粘附最大载荷，A是样品表面积)，

其中，A-GCD；B-2PHTs@Zn/GCD；C-4PHTs@Zn/GCD；D-8PHTs@Zn/GCD；

图5为实施例2中粘附力的统计图。实验结果表明：改性纳米管的加入显著增强了水凝胶的粘附能力。

6.生物相容性测试

其中，control-空白组；A-GCD；B-4PHTs/GCD；C-2PHTs@Zn/GCD；D-4PHTs@Zn/GCD；E-8PHTs@Zn/GCD；

6.1将培养的NIH-3T3成纤维细胞以5000个/孔的密度接种于96孔板中，培养过夜后吸去原培养基，加入不同浓度的水凝胶浸出液，培养24h后用MTT法检测细胞活性。图6为实施例2复合水凝胶浸出液的OD值统计图。从图6中可以看出，复合水凝胶对NIH-3T3成纤维细胞的存活率均高于空白对照组，表明本发明复合水凝胶具有良好的生物相容性。

6.2血液相容性实验

将含有柠檬酸钠溶液(3.8％)新鲜大鼠全血离心分离得到浓缩红细胞(RBC),将浓缩红细胞用生理盐水稀释成10％的稀红细胞溶液，在0.05g相应组分的水凝胶中加入500ul稀释的RBC,每组三个平行样。此外，100ul0.1％Triton-X和100ul生理盐水分别用作阳性和阴性对照。测量溶血率，图7为实施例2和实施例2的各组水凝胶溶血率统计图和实物图。从图7中可以看出，各组水凝胶的溶血率均远低于0.5％，表明本发明各组水凝胶具有良好的血液相容性。

实验例3

本试验例提供一种实施例2制备的可注射纳米粘土水凝胶抗菌性能实验：

实验分组：

其中，A-GCD；B-4PHTs/GCD；C-2PHTs@Zn/GCD；D-4PHTs@Zn/GCD；E-8PHTs@Zn/GCD；

实验方法：先往已灭菌的平板中倾注20mL左右平板培养基，水平静置凝固，接种0.05mL 108CFU/mL大肠杆菌菌液，涂布均匀后放置直径为1cm，厚度0.3cm的圆形水凝胶。12h/24h后观察并测量抑菌圈大小。

由图8可见，水凝胶有明显的抑菌圈出现，说明水凝胶可以杀死周围的细菌，负载锌的纳米管含量越大，杀菌效果越好。

实验例4

本试验例提供一种体内止血实验：

实验方法1：将小鼠麻醉并安装在手术软板上。通过腹部切口暴露每只小鼠的肝脏，并小心处理周围的血液。将一张预先称重的滤纸放在肝脏下方的封口膜上。将大鼠固定板倾斜约30°，用手术刀划出深度约为0.5厘米、长度约为1厘米的出血口，并立即使用注射器将水凝胶溶液应用于出血部位。3分钟后，称取含有吸收血液的滤纸重量，并与对照组(出血后未处理)进行比较。

实验方法2：将小鼠麻醉并安装在手术软板上。剪断大鼠尾部近端1/3处，并立即使用注射器将水凝胶溶液应用于出血部位。3分钟后，称取含有吸收血液的滤纸重量，并与对照组(出血后未处理)进行比较。

实验分组：A-对照组；B-4PHTs@Zn/GCD；

如图9可见，本发明实施例制备的水凝胶(4PHTs@Zn/GCD)有优异的止血性能。

实验例5

本试验例提供一种感染伤口愈合实验：

实验方法：3％的戊巴比妥钠(0.3ml/100g大鼠体重)腹腔注射行麻醉处理。用10％聚维酮碘对大鼠背部进行消毒处理后调整皮肤打孔器的孔径为1.5cm，后在大鼠背部脊柱两侧行皮肤打孔处理(一侧两孔，且保证感染灶不相互影响)，过程中保证无菌，打孔深度达到破坏肌肉层为止。用无菌纱布或者棉签擦拭伤口部位，对伤口进行初步止血处理后向伤口处滴加菌液100μl(大肠杆菌10⁸(CFU)/ml)。接触感染48h后揭去敷料，肉眼可见脓液及分泌物，创缘皮肤轻微肿胀。感染灶形成后生理盐水初步清创处理，实验组创面清洁消毒后创面注射200ul相应水凝胶，实验组一共有4组样品，分别为A-空白对照组；B-GCD；C-4PHTs/GCD；D-4PHTs@Zn/GCD水凝胶组，空白对照组创面清洁消毒后注射无菌生理盐水200ul。在特定时间点处死动物，拍摄创面愈合状态。实验分组：A-空白对照组；B-GCD；C-4PHTs/GCD；D-4PHTs@Zn/GCD；如图10可见，本发明实施例制备的水凝胶(4PHTs@Zn/GCD)有优异的促进愈合性能。

本发明首先制备了一种复合纳米管，将锌离子与聚没食子酸还原氧化埃洛石纳米管鳌合进行原位制备聚没食子酸改性埃洛石纳米管-锌离子复合纳米管；进而将聚没食子酸改性埃洛石纳米管-锌离子复合纳米管掺杂到可注射水凝胶中制备得适用于伤口形态复杂的感染伤口术后修复的水凝胶；由于埃洛石纳米管固有的止血特性，聚没食子酸的修饰没有改变其物理性能，反而进一步增强了水凝胶的抗炎性能，可用于止血的同时抗炎；与此同时，锌离子高效负载在聚没食子酸酸改性的埃洛石纳米管上，实现了水凝胶缓慢释放金属离子从而赋予水凝胶优异的抗菌能力和增强止血能力，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌都显示出较强的广谱抗菌活性；实现了本发明所述水凝胶适用于伤口形态复杂的感染伤口术后止血、抗炎、抗菌修复的目的。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (1)

1.一种可注射用纳米粘土水凝胶的制备方法，其特征在于，包括：

步骤一，聚没食子酸改性埃洛石纳米管-锌离子复合纳米管（PHTs@Zn）的制备：

在室温下，将 1g 埃洛石纳米管充分分散在去离子水中，高速搅拌 10min 后超声处理5min，再充分搅拌 10min，之后，向该混合物中加入 0.5g 没食子酸(GA)，同时，添加 pH=8~10 的 tris-hcl 溶液调节混合物溶液 pH=8~10 之间，在 35℃水浴下避光反应搅拌 24小时，最后通过将混合物离心获得聚没食子酸改性埃洛石纳米管（PHTs），并用去离子水洗涤 2-3 次，随后 60℃烘干研磨成粉末；

称量 1g 干燥的 PHTs 纳米管粉末，均匀分散在浓度为 100g/L 的乙酸锌盐溶液中搅拌并真空泵吸，最后通过将混合物离心获得聚没食子酸改性埃洛石纳米管-锌离子复合纳米管（PHTs@Zn），随后 60℃烘干研磨成粉末后干燥保存；

步骤二，多巴胺接枝的氧化葡聚糖 DA-OD 的制备：

将5g的葡聚糖通过高碘酸钠摩尔量1：1的氧化作用生成氧化葡聚糖溶液， 经过透析冻干后获得氧化葡聚糖(OD)，再次将 1g 氧化葡聚糖溶解在去离子水中，加入质量比为 10：1的多巴胺，在 37℃下反应 24h 后，透析并冻干后获得多巴胺接枝的氧化葡聚糖 DA-OD，然后，置于-20℃保存；

步骤三，可注射纳米粘土水凝胶（PHTs@Zn/GCD）的制备：

将 1.5g 明胶和 0.04g 壳聚糖在 60℃条件下溶解在 5ml 1%乙酸溶液中得到均一的明胶-壳聚糖混合溶液（Gel-CS）；

在 5ml 去离子水中溶解 0.2g 多巴胺接枝的氧化葡聚糖，在多巴胺接枝的氧化葡聚糖溶液中均匀分散 4%的聚没食子酸改性埃洛石纳米管-锌离子复合纳米管得到纳米管混合溶液（DA-OD/PHTs@Zn）；

其中 PHTs@Zn 质量分数为：4%，

将明胶-壳聚糖混合溶液（Gel-CS）和纳米管混合溶液（DA-OD/4PHTs@Zn）等体积混合后得到可注射纳米粘土水凝胶（4PHTs@Zn/GCD）。