CN112807483B

CN112807483B - 一种抗炎、抗菌、止血的双网络水凝胶及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN112807483B
Application number: CN202110147451.8A
Authority: CN
Inventors: 钟文英; 孙露; 徐克明
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2021-02-03
Filing date: 2021-02-03
Publication date: 2022-10-21
Anticipated expiration: 2041-02-03
Also published as: CN112807483A

Abstract

本发明公开了一种抗炎、抗菌、止血的“双网络”水凝胶及其制备方法和应用。所述“双网络”水凝胶是由多肽纳米纤维和壳聚糖分子组成的具有双重网络微观结构的水凝胶。其中，多肽通过非共价作用自组装成纳米纤维，进而相互交织形成第一网络，而京尼平与壳聚糖分子化学交联形成第二网络。本发明制备的“双网络”水凝胶具有优异的机械强度，克服了多肽水凝胶机械强度弱、易被外力破坏的缺点，且无毒无刺激，具有良好的生物相容性。“双网络”水凝胶用作伤口敷料时，除了快速止血作用外，还具有良好的抗炎和抗菌效果，可以防止伤口感染，并提供良好的伤口愈合微环境，在伤口敷料领域具有良好的应用前景。

Description

一种抗炎、抗菌、止血的双网络水凝胶及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及伤口敷料领域，具体为一种抗炎、抗菌、止血的“双网络”水凝胶及其制备方法和应用。

背景技术

不受控制的出血仍然是创伤和手术死亡的主要原因，利用伤口敷料作为止血剂，迅速有效地控制出血，对伤口治疗具有重要意义。同时，为了防止伤口感染，并提供良好的伤口愈合微环境，伤口敷料除了快速止血作用外，还应该具有良好的抗炎和抗菌功效。传统伤口敷料(如纱布、棉垫、绷带等)在实际应用中有很多缺点和局限，如无法保持创面湿润，肉芽组织易长入纱布的网眼中，敷料渗透时易导致外源性感染、不适用于不可按压伤口的止血等。目前已报道的新型伤口敷料主要包括泡沫、薄膜、海绵、水凝胶等，其中，水凝胶因特有的性质，如保持创面环境湿润，吸收多余渗出液，允许氧气渗透，冷却伤口表面，缓解患者疼痛等而被广泛关注。特别的是，自组装多肽水凝胶因具有较好的生物相容性和生物降解性、形成的纳米纤维网络与天然细胞外基质(ECM)类似，分子结构允许特定的相互作用等优势，在伤口敷料领域具有广阔的应用前景。

但多肽水凝胶由于自组装过程中主要依靠氢键、π-π堆积等非共价作用，机械强度较弱，缺乏长期稳定性，用作伤口敷料时，易被外力破坏，失去原本的作用。为了提高其机械强度，可在多肽水凝胶中引入化学交联作用，通过非共价作用和化学交联相结合的方式，构建由两种相互渗透的聚合物网络组成的“双网络”水凝胶。此外，“双网络”水凝胶中的不同组分将带来额外的功能，可用于制备具有多功能(如抗炎、抗菌、促进伤口愈合等)的伤口敷料。

因此，有必要开发一种既具有较高机械强度又同时具有抗炎、抗菌、止血功效的“双网络”水凝胶，以便进一步推进多肽水凝胶在伤口敷料领域的应用。

发明内容

为解决现有技术中多肽水凝胶机械强度较弱、无法同时具有抗炎、抗菌、止血功效的技术问题，本发明的目的在于提供一种抗炎、抗菌、止血的“双网络”水凝胶的制备方法和应用。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

本发明的第一个目的是提供一种抗炎、抗菌、止血的水凝胶，所述水凝胶包括多肽、壳聚糖和京尼平，所述水凝胶为双网络结构，所述水凝胶是由多肽纳米纤维和壳聚糖分子组成的具有双重网络微观结构的“双网络”水凝胶。所述双网络结构包括第一网络和第二网络，所述第一网络为多肽通过非共价作用自组装成纳米纤维，进而相互交织形成第一网络，所述第二网络为京尼平与壳聚糖分子化学交联形成；

优选的，所述多肽为共价键合吲哚美辛的八肽序列，所述壳聚糖为羧甲基壳聚糖；

优选的，所述多肽和壳聚糖的体积比为(0.5～4)：1，所述京尼平与多肽和壳聚糖总量的体积比为1：(5～20)；

进一步优选的，所述多肽为吲哚美辛-甘氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-酪氨酸-甘氨酸-精氨酸- 甘氨酸-天冬氨酸，简写为IDM-GFFYGRGD或者IDM-1；

进一步优选的，所述多肽和壳聚糖的体积比为(0.5～3)：1，进一步优选为所述多肽和壳聚糖的体积比为(1～3)：1，所述京尼平与多肽和壳聚糖总量的体积比为1：(10～20)。

本发明的第二个目的是提供前述一种抗炎、抗菌、止血的水凝胶的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

1)将多肽溶解在PBS缓冲液中，加入1M NaOH至多肽溶解，再加入1M HCl调节pH为

7.0～8.0，得到多肽水凝胶；

2)将壳聚糖溶解在PBS缓冲液中，调节pH为7.0～8.0得到壳聚糖溶液；

3)将京尼平溶解在PBS缓冲液中，得到京尼平溶液；

4)将步骤1)得到的多肽水凝胶加入步骤2)得到的壳聚糖溶液中膨胀，得到混合溶液A；

5)在步骤4)得到的混合溶液A中加入京尼平溶液，反应后得到所述双网络水凝胶。

进一步的，步骤1)中所述多肽为共价键合吲哚美辛的八肽序列；优选的，所述多肽为吲哚美辛-甘氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-酪氨酸-甘氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸，简写为 IDM-GFFYGRGD或者IDM-1。

进一步的，步骤1)中所述多肽水凝胶的浓度为1.5～2.5wt％，优选为1.8～2.2wt％；更优选为2.0wt％；

所述多肽水凝胶的pH为7.2～7.5。

进一步的，步骤2)中所述壳聚糖为羧甲基壳聚糖。

进一步的，步骤2)中所述壳聚糖溶液的浓度与步骤1)中所述多肽水凝胶的浓度相同或不同，优选的，步骤2)中所述壳聚糖溶液的浓度与步骤1)中所述多肽水凝胶的浓度相同；所述壳聚糖溶液的浓度为1.5～2.5wt％，优选为1.8～2.2wt％；更优选为2.0wt％；

所述壳聚糖在转子搅拌状态下溶解，转子转速为500～1500rpm/min，优选为800～1200 rpm/min，更优选为1000rpm/min；

所述壳聚糖溶液的pH为7.2～7.5。

进一步的，步骤3)中所述京尼平溶液的浓度为0.5～1.5mM，优选为0.9～1.1mM，更优选为1mM。

进一步的，步骤4)中多肽水凝胶与壳聚糖溶液的体积比为(0.5～4)：1，优选为(0.5～3)： 1，进一步优选为(1～3)：1；

步骤4)中膨胀温度为25～40℃，优选为35～40℃；

步骤4)中膨胀时间为0.5～3h，优选为0.5～1h。

进一步的，步骤5)中混合溶液A与京尼平溶液的体积比为(5～20)：1，优选的，(10～20)： 1；

步骤5)中反应温度为25～40℃，优选为35～40℃；

步骤5)中反应时间为2～24h，优选为4～12h。

本发明的第三个目的是提供前述的一种抗炎、抗菌、止血的水凝胶在医用材料中的应用；

优选的，所述医用材料为能够抗炎、抗菌、止血的伤口敷料材料；

进一步优选的，所述抗菌为抗革兰氏阳性菌和/或革兰氏阴性菌；

更进一步优选的，所述抗菌为抗金黄色葡萄球菌和/或大肠杆菌。

本发明的有益效果在于：

1、本发明采用多肽、壳聚糖和京尼平制备“双网络”水凝胶，其中，多肽由氨基酸组成，其降解产物无毒无刺激，壳聚糖是天然多糖甲壳素的脱乙酰基产物，生物相容性好，京尼平是一种细胞毒性较低的天然交联剂，使得“双网络”水凝胶具有良好的生物相容性。同时，壳聚糖和京尼平的交联作用能提高多肽水凝胶中纤维网络的交联度，流变学测试显示：与多肽水凝胶储能模量仅有71Pa相比，“双网络”水凝胶的储能模量为425Pa，是多肽水凝胶的6倍，表明“双网络”水凝胶具有优异的机械强度，克服了多肽水凝胶机械强度弱、易被外力破坏的缺点。

2、吲哚美辛是常用的非甾体抗炎药，本发明采用吲哚美辛作为多肽的头基，可以使多肽水凝胶在止血的同时发挥抗炎的功效。壳聚糖具有广谱抗菌活性，对革兰氏阳性菌和阴性菌均有明显的抑菌效果。因此，本发明制备的“双网络”水凝胶用作伤口敷料时，除了快速止血作用外，还具有良好的抗炎和抗菌效果，可以防止伤口感染，并提供良好的伤口愈合微环境，在伤口敷料领域具有良好的应用前景。

附图说明

图1:a为多肽水凝胶外观图；b为“双网络”水凝胶的外观图；

图2:a为多肽水凝胶的TEM图；b为“双网络”水凝胶的TEM图；

图3为多肽水凝胶和“双网络”水凝胶的CD图；

图4为壳聚糖、京尼平、多肽水凝胶和“双网络”水凝胶的UV图；

图5：a为多肽水凝胶的流变时间扫描图；b为“双网络”水凝胶的流变时间扫描图；

图6：a为壳聚糖、多肽水凝胶和“双网络”水凝胶的MTT图；b为壳聚糖、多肽水凝胶和“双网络”水凝胶的溶血率图；

图7：a为吲哚美辛、多肽水凝胶和“双网络”水凝胶的NO含量测定图；b为吲哚美辛、壳聚糖、多肽水凝胶和“双网络”水凝胶的足肿胀数据图；

图8为壳聚糖对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制效果图；

图9为壳聚糖、多肽水凝胶、“双网络”水凝胶和纤维蛋白胶(市售的止血凝胶)的肝脏出血量图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步的说明。

以下实施例中，单位M表示mol/L。

以下实施例中，所述多肽均为吲哚美辛-甘氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-酪氨酸-甘氨酸-精氨酸- 甘氨酸-天冬氨酸，简写为IDM-GFFYGRGD。

实施例1

一种抗炎、抗菌、止血的“双网络”水凝胶，其由多肽(IDM-GFFYGRGD)、羧甲基壳聚糖和京尼平组成。

一种抗炎、抗菌、止血的“双网络”水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

1)称取14mg的多肽粉末至小瓶中，加入500μL的PBS缓冲液，加入1M NaOH至多肽溶解，再加入1M HCl调节pH至7.4，用PBS缓冲液将多肽水凝胶的总体积补充至700μL，得到多肽水凝胶，多肽水凝胶的浓度为2wt％；

2)称取100mg的羧甲基壳聚糖至含转子的小瓶中，加入4mL的PBS缓冲液，在搅拌器上搅拌，转子转速为1000rpm/min，待溶解完全后，调节pH至7.4，用PBS缓冲液将溶液的总体积补充至5mL，得到羧甲基壳聚糖溶液，羧甲基壳聚糖溶液的浓度为2wt％；

3)称取2.3mg京尼平粉末至EP管中，加入1mL的PBS缓冲液，溶解完全后，取出100μL至新EP管中，在新EP管中再加入900μL的PBS缓冲液，混合均匀后得到京尼平溶液，京尼平溶液的浓度为1mM；

4)取出66μL羧甲基壳聚糖溶液至新小瓶中，再取出133μL多肽水凝胶至羧甲基壳聚糖溶液中，涡旋均匀后在37℃下膨胀0.5h，得到混合溶液A；

5)在混合溶液A中加入10μL京尼平溶液，涡旋均匀后在37℃下反应8h，得到“双网络”水凝胶。

实施例2

1)称取10.5mg的多肽粉末至小瓶中，加入500μL的PBS缓冲液，加入1M NaOH至多肽溶解，再加入1M HCl调节pH至7.2，用PBS缓冲液将多肽水凝胶的总体积补充至700μL，得到多肽水凝胶，多肽水凝胶的浓度为1.5wt％；

2)称取75mg的羧甲基壳聚糖至含转子的小瓶中，加入4mL的PBS缓冲液，在搅拌器上搅拌，转子转速为500rpm/min，待溶解完全后，调节pH至7.2，用PBS缓冲液将溶液的总体积补充至5mL，得到羧甲基壳聚糖溶液，羧甲基壳聚糖溶液的浓度为1.5wt％；

3)称取1.15mg京尼平粉末至EP管中，加入1mL的PBS缓冲液，溶解完全后，取出100μL 至新EP管中，在新EP管中再加入900μL的PBS缓冲液，混合均匀后得到京尼平溶液，京尼平溶液的浓度为0.5mM；

4)取出133μL羧甲基壳聚糖溶液至新小瓶中，再取出66μL多肽水凝胶至羧甲基壳聚糖溶液中，涡旋均匀后在25℃下膨胀1h，得到混合溶液A；

5)在混合溶液A中加入20μL京尼平溶液，涡旋均匀后在25℃下反应2h，得到“双网络”水凝胶。

实施例3

1)称取17.5mg的多肽粉末至小瓶中，加入500μL的PBS缓冲液，加入1M NaOH至多肽溶解，再加入1M HCl调节pH至7.5，用PBS缓冲液将多肽水凝胶的总体积补充至700μL，得到多肽水凝胶，多肽水凝胶的浓度为2.5wt％；

2)称取125mg的羧甲基壳聚糖至含转子的小瓶中，加入4mL的PBS缓冲液，在搅拌器上搅拌，转子转速为1500rpm/min，待溶解完全后，调节pH至7.5，用PBS缓冲液将溶液的总体积补充至5mL，得到羧甲基壳聚糖溶液，羧甲基壳聚糖溶液的浓度为2.5wt％；

3)称取3.45mg京尼平粉末至EP管中，加入1mL的PBS缓冲液，溶解完全后，取出100μL 至新EP管中，在新EP管中再加入900μL的PBS缓冲液，混合均匀后得到京尼平溶液，京尼平溶液的浓度为1.5mM；

4)取出50μL羧甲基壳聚糖溶液至新小瓶中，再取出150μL多肽水凝胶至羧甲基壳聚糖溶液中，涡旋均匀后在40℃下膨胀3h，得到混合溶液A；

5)在混合溶液A中加入40μL京尼平溶液，涡旋均匀后在40℃下反应24h，得到“双网络”水凝胶。

实施例4实施例1制备的抗炎、抗菌、止血的“双网络”水凝胶的应用及性能验证 1.“双网络”水凝胶的形态及形貌

将实施例1步骤1)制备得到的多肽水凝胶和步骤5)制备得到的“双网络”水凝胶进行宏观观察，结果见图1，同时将制备的多肽水凝胶和“双网络”水凝胶稀释后，于透射电镜(TEM) 下对其微观形貌进行观察比较，结果见图2。

由图1可知，多肽水凝胶略呈黄色(图1a)，本发明制备的“双网络”水凝胶呈现乳白微透明的特性(图1b)。

由图2可知，多肽水凝胶内部的纳米纤维网络较为稀疏(图2a)，而“双网络”水凝胶的纤维网络更为致密(图2b)，可以看出纤维之间的交联结点明显增加，说明京尼平交联形成的壳聚糖网络与多肽纳米纤维网络叠加，导致整个纤维网络更为致密。

2.圆二色谱(CD)测试

将实施例1步骤1)制备的多肽水凝胶和步骤5)制备得到的“双网络”水凝胶稀释后，置于0.5mm石英比色皿中，采用Jasco J-810圆二色谱仪分析扫描190-230nm范围内的圆二色谱。

由图3可知，多肽水凝胶和“双网络”水凝胶均在195nm处为正峰，在207nm处出现一个宽的负峰，表明多肽自组装成β-片层结构，并且“双网络”水凝胶的形成对多肽的结构没有影响。

3.紫外可见吸收光谱(UV)测试

将实施例1步骤1)、2)、3)制备的多肽水凝胶、壳聚糖溶液、京尼平溶液、和步骤5)制备得到的“双网络”水凝胶稀释后，在紫外可见分光光度计上分别扫描样品在500-700nm范围内的光谱图。

由图4可知，单独的壳聚糖、京尼平和多肽水凝胶在500-700nm范围内无特征吸收峰，而“双网络”水凝胶在585nm处出现了一个明显的吸收峰。据文献报道，京尼平与壳聚糖发生交联后在600nm附近会出现新峰。上述结果与文献报道一致，表明“双网络”水凝胶中京尼平与壳聚糖分子发生交联。

4.胶体的流变学测试

将实施例1步骤1)制备的多肽水凝胶和步骤5)制备得到的“双网络”水凝胶放置在DHR-1 流变仪上，设置温度为37℃，采用40mm的电加热平行板进行测量。设置频率为6.28rad/s，应变为0.2％，监测胶体240min内储能模量(G’)和损耗模量(G”)的动态变化。

由图5可知，动态时间扫描240min后，多肽水凝胶的储能模量仅有71Pa(图5a)，但“双网络”水凝胶的储能模量可达到425Pa(图5b)，是多肽水凝胶的6倍，表明“双网络”水凝胶的机械性能更强，与预期效果一致。

5.生物相容性试验

1)细胞毒性(MTT)试验

以DMEM培养基为溶剂，分别配制不同浓度(0、15.625、31.25、62.5、125、250μg/mL)的壳聚糖溶液、不同浓度(0、15.625、31.25、62.5、125、250μg/mL)的多肽(IDM-GFFYGRGD)水凝胶和不同多肽浓度(0、15.625、31.25、62.5、125、250μg/mL)的“双网络”水凝胶，将成纤维细胞(NIH-3T3)过夜培养后，分别加入不同浓度的壳聚糖溶液、多肽水凝胶和“双网络”水凝胶，培养48h后，加入MTT孵育4h后，吸出上清液，加入DMSO孵育10min，用酶标仪测定492nm处吸光度。

由图6a可知，壳聚糖溶液、多肽水凝胶和“双网络”水凝胶组的细胞存活率都在90％以上，表明“双网络”水凝胶具有良好的生物相容性。

2)溶血率试验

将柠檬酸钠与新鲜鼠血按比例混合制成抗凝血，再加入生理盐水稀释制备稀释血液。将实施例1制备的壳聚糖溶液、多肽水凝胶和“双网络”水凝胶与稀释血液混匀后，置于37℃反应 1h，采用紫外可见分光光度计测定545nm处样品上清液的吸光度。

由图6b可知，除双蒸水组外，壳聚糖、多肽水凝胶和“双网络”水凝胶组的溶血率均在5％以下，说明“双网络”水凝胶具有良好的生物相容性。

6.抗炎性能试验

1)体外抗炎试验：细胞抗炎实验

脂多糖可刺激巨噬细胞产生过量的NO，NO是一种促炎介质，在异常情况下诱导炎症。由于NO的生理半衰期极短，会迅速还原成亚硝酸盐，可通过Griess分析进行定量测定。NO 含量越低，说明实验组抗炎效果越好。

以DMEM培养基为溶剂，分别配制不同浓度(62.5、125、250μM)的吲哚美辛溶液、不同浓度(62.5、125、250μM)的多肽水凝胶和不同多肽浓度(62.5、125、250μM)的“双网络”水凝胶，将巨噬细胞(RAW 264.7)过夜培养后，加入不同浓度的吲哚美辛溶液、多肽水凝胶和“双网络”水凝胶预处理，再加入脂多糖刺激后，吸出上清液，加入Griess试剂孵育10min，用酶标仪测定492nm处吸光度，根据吸光度和标准曲线，计算出每组的NO浓度。

由图7a可知，吲哚美辛、多肽水凝胶和“双网络”水凝胶实验组的NO含量均低于脂多糖对照组，且呈浓度依赖的趋势，说明实验组均有一定的抗炎作用，“双网络”水凝胶也保持了多肽中吲哚美辛的抗炎效果，与预期效果一致。

2)体内抗炎试验：足肿胀模型

将小鼠分为实验组、对照组和λ-角叉胶组。实验组分别在小鼠的右后爪涂抹吲哚美辛溶液 (4.3mg/mL)、实施例1制备的壳聚糖溶液、多肽水凝胶和“双网络”水凝胶，对照组和λ-角叉胶组不操作，然后足底注射λ-角叉胶诱导小鼠爪子发生水肿(对照组不操作)，24h后分别测定每组小鼠右后爪的厚度，厚度越小，说明抑制水肿作用越明显，即抗炎效果越好。

由图7b可知，与对照组相比，λ-角叉胶组的鼠爪厚度明显增加，说明成功建立炎症模型 (足肿胀模型)。与λ-角叉胶组相比，吲哚美辛、多肽水凝胶和“双网络”水凝胶组的鼠爪厚度均有一定程度的下降，并且“双网络”水凝胶组的鼠爪厚度最小，表明“双网络”水凝胶能够有效抑制足肿胀，具有良好的抗炎效果。

7.抗菌性能试验

将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌分别接种在肉汤培养基中，过夜培养后，对菌液进行活化，并将菌液浓度分别稀释至10⁶cfu/mL，实验组加入稀释后的壳聚糖溶液(1mg/mL)，对照组不处理。待对照组菌液开始浑浊后，利用紫外分光光度计分别测定600nm处对照组和壳聚糖组菌液的吸光度。菌液吸光度值越小，说明细菌生长速度越慢，即抗菌效果越显著。

由图8可知，对照组大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的吸光度值分别为0.508和0.400，而壳聚糖组大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的吸光度值分别为0.411和0.166，均小于对照组，尤其是针对金黄色葡萄球菌，壳聚糖组吸光度值下降显著，说明壳聚糖对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有抑制作用，且对金黄色葡萄球菌抑制效果更显著。

8.肝脏止血试验

使用21G的针头刺入小鼠肝脏，造出3mm深度的伤口。将实施例1制备的壳聚糖溶液、多肽水凝胶、“双网络”水凝胶和纤维蛋白胶(市售的止血凝胶，上海莱士血液制品股份有限公司，2mL/套)分别覆盖在伤口上，对照组不做处理，5min内用滤纸吸取伤口处溢出的血，并记录每组的出血量。

由图9可知，对照组的出血量为310.0±29.4mg，壳聚糖组为216.7±30.6mg，多肽水凝胶组为173.3±15.3mg，纤维蛋白胶组为135.0±20.8mg，而“双网络”水凝胶组的出血量仅为 62.5±17.1mg，明显低于对照组和其他实验组，结果表明“双网络”水凝胶具有优异的止血作用。

对比例1

设置目的：为了探索“双网络”水凝胶的最佳制备条件，包括多肽浓度(表1)、京尼平用量 (表2)、以及多肽和壳聚糖的体积比(表3)。

表1操作步骤：以PBS为溶剂，分别配制0.5wt％、1wt％、1.5wt％、2wt％、2.5wt％的IDM-1溶液，采用倒置成胶法，分别考察上述IDM-1溶液的成胶情况、最佳成胶pH和成胶时间。

表2操作步骤：1)按照实施例1步骤1)2)3)分别制备IDM-1水凝胶(2wt％)、壳聚糖溶液(2wt％)和京尼平溶液(1mM)；2)保持IDM-1水凝胶和壳聚糖溶液的体积不变，改变京尼平溶液的用量，采用倒置成胶法，分别考察其成胶情况。

表3操作步骤：1)按照实施例1步骤1)2)3)分别制备IDM-1水凝胶(2wt％)、壳聚糖溶液(2wt％)和京尼平溶液(1mM)；2)保持京尼平溶液的体积不变，改变IDM-1水凝胶和壳聚糖溶液的体积比，采用倒置成胶法，分别考察其成胶情况。

实验结果如下：

表1 IDM-1的成胶性能

表2“双网络”水凝胶中各组分的用量和成胶情况

表3“双网络”水凝胶中各组分的用量和成胶情况

Claims

1.一种抗炎、抗菌、止血的水凝胶的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括如下步骤：

1）将多肽溶解在PBS缓冲液中，加入1M NaOH至多肽溶解，再加入1M HCl调节pH为7.0~8.0，得到多肽水凝胶，所述多肽为吲哚美辛-甘氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-酪氨酸-甘氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸，所述多肽水凝胶的浓度为1.5~2.5 wt%；

2）将壳聚糖溶解在PBS缓冲液中，调节pH为7.0~8.0，得到壳聚糖溶液，所述壳聚糖溶液的浓度为1.5~2.5 wt%；

3）将京尼平溶解在PBS缓冲液中，得到京尼平溶液，所述京尼平溶液的浓度为0.5~1.5mM；

4）将步骤1）得到的多肽水凝胶加入步骤2）得到的壳聚糖溶液中膨胀，得到混合溶液A；所述多肽水凝胶和壳聚糖溶液的体积比为（0.5~4）：1；

5）在步骤4）得到的混合溶液A中加入京尼平溶液，反应后得到双网络结构水凝胶，混合溶液A与京尼平溶液的体积比为（5~20）：1。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤1）中所述多肽水凝胶的浓度为1.8~2.2 wt%；

所述多肽水凝胶的pH为7.2~7.5。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤1）中所述多肽水凝胶的浓度为2.0 wt%。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤2）中所述壳聚糖替换为羧甲基壳聚糖。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤2）中所述壳聚糖溶液的浓度与步骤1）中所述多肽水凝胶的浓度相同或不同，所述壳聚糖溶液的浓度为1.8~2.2 wt%；

所述壳聚糖在转子搅拌状态下溶解，转子转速为500~1500 rpm/min；

所述壳聚糖溶液的pH为7.2~7.5。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤2）中所述壳聚糖溶液的浓度与步骤1）中所述多肽水凝胶的浓度相同。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤2）中所述壳聚糖溶液的浓度为2.0 wt%。

8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤2）中所述转子转速为800~1200rpm/min。

9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤3）中所述京尼平溶液的浓度为0.9~1.1 mM。

10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于：步骤3）中所述京尼平溶液的浓度为1mM。

11.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤4）中多肽水凝胶与壳聚糖溶液的体积比为（0.5~3）：1；

步骤4）中膨胀温度为25~40℃；

步骤4）中膨胀时间为0.5~3h。

12.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于：步骤4）中多肽水凝胶与壳聚糖溶液的体积比为（1~3）：1。

13.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于：步骤4）中膨胀温度为35~40℃。

14.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于：步骤4）中膨胀时间为0.5~1h。

15.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤5）中混合溶液A与京尼平溶液的体积比为（10~20）：1；

步骤5）中反应温度为25~40℃；

步骤5）中反应时间为2~24h。

16.根据权利要求15所述的制备方法，其特征在于：步骤5）中反应温度为35~40℃。

17.根据权利要求15所述的制备方法，其特征在于：步骤5）中反应时间为4~12h。

18.一种抗炎、抗菌、止血的水凝胶，其特征在于：所述水凝胶为采用权利要求1所述的制备方法制备得到，所述水凝胶包括多肽、壳聚糖和京尼平，所述水凝胶为双网络结构，所述双网络结构包括第一网络和第二网络，所述第一网络为多肽通过非共价作用自组装成纳米纤维，进而相互交织形成第一网络，所述第二网络为京尼平与壳聚糖分子化学交联形成。

19.权利要求18所述的一种抗炎、抗菌、止血的水凝胶在制备医用材料中的应用。

20.根据权利要求19所述的应用，其特征在于：所述医用材料为能够抗炎、抗菌、止血的伤口敷料材料。

21.权利要求19所述的应用，其特征在于：所述抗菌为抗革兰氏阳性菌和/或革兰氏阴性菌。

22.权利要求19所述的应用，其特征在于：所述抗菌为抗金黄色葡萄球菌和/或大肠杆菌。