CN116942883B

CN116942883B - 促进糖尿病伤口愈合的仿生纤维膜及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN116942883B
Application number: CN202311206811.2A
Authority: CN
Inventors: 丁传波; 刘兴龙; 赵婷; 王宁; 郑毅男; 刘文丛; 李敏
Original assignee: Jilin Agricultural Science and Technology College
Current assignee: Jilin Agricultural Science and Technology College
Priority date: 2023-09-19
Filing date: 2023-09-19
Publication date: 2023-12-15
Anticipated expiration: 2043-09-19
Also published as: CN116942883A

Abstract

本发明属于医药领域，涉及伤口敷料，具体涉及促进糖尿病伤口愈合的仿生纤维膜及其制备方法与应用，该仿生纤维膜以OHDA和GEL为基底，将活性物质COR加入其中，经静电纺丝处理后得到COR/OHDA/GEL纳米仿生纤维膜；其中，OHDA为透明质酸经氧化处理后，与多巴胺反应得到的产物；GEL为明胶；COR为虫草素。该纤维膜将多巴胺接枝到透明质酸上，利用静电纺丝方法将明胶和多巴胺接枝的透明质酸制备成纳米纤维，作为虫草素载体，其不仅可以解决透明质酸湿粘附性不足的问题，同时虫草素与多巴胺接枝的透明质酸协同作用，还可显著提高纤维膜的抗氧化活性、抗菌效果，促进细胞增殖，加速糖尿病伤口的愈合。

Description

促进糖尿病伤口愈合的仿生纤维膜及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于医药领域，涉及伤口敷料，具体涉及一种促进糖尿病伤口愈合的仿生纤维膜及其制备方法与应用。

背景技术

糖尿病伤口治疗在临床上仍面临着重大挑战，过度炎症，持续出血和伤口渗出液堆积是糖尿病伤口普遍遇到的问题，会妨碍细胞增殖和扰动组织重构；另外，糖尿病伤口微环境中持续的炎症环境产生大量活性氧(ROS)，高表达的 ROS会对正常细胞及组织造成损害，使得糖尿病伤口难以愈合。

近年来，中草药以其高效、低毒的特点吸引了众多研究人员的关注。尤其是其中的天然活性成分，具有潜在的生物活性，被广泛用于慢性伤口的治疗。虫草素（COR）是一种核苷类抗生素，具有多种生物活性。一些研究表明，虫草素对大肠杆菌、枯草杆菌和金黄色葡萄球菌有很好的抑制作用，这对控制伤口细菌感染非常重要。已经有人将虫草素与壳聚糖复合制备水凝胶，用于促进伤口愈合；然而，糖尿病伤口愈合与常规伤口愈合不同，导致其在糖尿病伤口愈合过程效果并不理想。

随着技术的发展，电纺丝技术引起了研究人员的关注。电纺丝技术是唯一能在微米或纳米尺度上形成连续纤维的技术。它具有与细胞外基质（ECM）形态相似、比表面积大、孔隙率高、渗透性好等优点。它可以将活性物质装入纤维，活性物质与载体一起作为支架，模拟 ECM，实现连续给药。

透明质酸（HA）是哺乳动物上皮和结缔组织中 ECM 的关键成分，在止血阶段可加速血小板迁移并促进纤维蛋白凝块的形成。在炎症期，它有助于扩张新鲜伤口周围的组织，促进间质细胞和炎症细胞的浸润，迫使吞噬细胞清除坏死组织，并通过 TLR4 途径抑制损伤处炎症因子的表达。在增殖期，它能促进伤口胶原沉积和细胞增殖。在重塑阶段，它能促进肌成纤维细胞分化，减少疤痕形成。因此，透明质酸在伤口愈合的各个时期都有积极作用。但是，透明质酸仍不能加速组织再生和伤口愈合，而且对组织的湿粘附性不足，无法满足制备纤维膜伤口敷料的要求。

发明内容

鉴于上述技术问题，本发明的目的在于提供一种促进糖尿病伤口愈合的仿生纤维膜，该纤维膜将多巴胺接枝到透明质酸上，利用静电纺丝方法将明胶和多巴胺接枝的透明质酸制备成纳米纤维，作为虫草素载体，其不仅可以解决透明质酸湿粘附性不足的问题，同时虫草素与多巴胺接枝的透明质酸协同作用，还可显著提高纤维膜的抗氧化活性、抗菌效果，促进细胞增殖，加速糖尿病伤口的愈合。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种促进糖尿病伤口愈合的仿生纤维膜，该仿生纤维膜以OHDA和GEL为基底，将活性物质COR加入其中，经静电纺丝处理后得到COR /OHDA/GEL 纳米仿生纤维膜；其中， OHDA为透明质酸经氧化处理后，与多巴胺反应得到的产物；GEL为明胶；COR为虫草素。

本发明还提供一种促进糖尿病伤口愈合的仿生纤维膜的制备方法，该方法包括以下步骤：

步骤1、氧化透明质酸的合成：采用高碘酸盐氧化法合成氧化透明质酸OHA；

步骤2、多巴胺接枝氧化透明质酸的合成：将 OHA溶于去离子水中，加入多巴胺DA溶解，避光反应，反应结束后，在去离子水中透析，然后在超纯水中透析得OHDA；

步骤3、COR/OHDA/GEL 纳米仿生纤维膜的制备：将GEL和OHDA溶于醋酸中；然后，将虫草素COR粉末与OHDA/GEL溶液混合，搅拌混匀，进行静电纺丝处理，得到COR /OHDA/GEL纳米仿生纤维膜。

作为本发明的优选，所述步骤1氧化透明质酸的合成方法为：将1g，2.5mmol的透明质酸HA溶于100mL去离子水中，在室温下搅拌过夜；之后称取0.5g NaIO₄，边搅拌边加入NaIO₄，在室温下暗处搅拌24小时，然后加入1mL乙二醇停止反应，得到的溶液在去离子水中透析3天后冻干；其中，透析时所用透析袋的截留分子量为3500Da。

作为本发明的优选，所述步骤2多巴胺接枝氧化透明质酸的合成方法为：将1 克OHA溶于 100 毫升pH 值为 5 的去离子水中，然后加入0.5 克DA 溶解，避光反应 12 小时；反应结束后，在 pH 值为 5 的去离子水中透析2 天，然后在超纯水中透析 1 天，之后OHDA 被冷冻干燥并储存在 -20°C 的冰箱中；其中，透析时所用透析袋的截留分子量为3500 Da。

作为本发明的优选，所述步骤3 COR/OHDA/GEL 纳米仿生纤维膜的制备方法为：将1.0g GEL和0.15g OHDA溶于40%的醋酸中，配制成OHDA/GEL溶液；然后，将虫草素COR粉末与OHDA/GEL溶液混合，在45℃下搅拌6小时；之后进行静电纺丝处理，喷嘴和收集器之间的距离以及转鼓的转速分别固定为15cm和220rpm；最后将制备好的COR/OHDA/GEL纳米仿生纤维膜放入真空干燥箱中干燥24小时；其中，OHDA/GEL溶液中GEL和OHDA与醋酸的质量体积百分比为23%，虫草素与OHDA/GEL溶液的质量体积百分比为10%。

本发明提供的促进糖尿病伤口愈合的仿生纤维膜可以在制备促进糖尿病伤口组织的胶原基质重塑和功能重建的药物中应用；还可以在制备抑制TLR4/NF-κB信号通路的药物中应用。

本发明的优点和有益效果：

（1）本发明用DA对HA进行改性，得到OHDA；然后以OHDA和GEL为基底，将活性物质COR加入其中，得到仿生ECM伤口敷料；该伤口敷料机械性能好，具有良好的热稳定性，且采用多巴胺改性后的HA能大大提高纤维膜的湿粘附性（1.32N），使纳米仿生纤维膜能够满足伤口敷料的要求，同时还可以使透明质酸在伤口愈合的各个时期都发挥作用。

（2）本发明提供的OHDA（也称多巴胺改性后的HA）具有较强的抗氧化效果，当浓度达到250mg/mL时，抗氧化活性达到68.05%，其与COR协同作用可显著提高COR/OHDA/GEL纤维膜的抗氧化活性，对于ABTS和DPPH，COR/OHDA/GEL纳米纤维膜都具有良好的抗氧化能力（对DPPH自由基的清除能力为82.75±2.62%，对ABTS自由基的清除能力为91.67±0.24%），有助于维持细胞内氧化还原平衡，避免细胞异常生长和免疫反应紊乱，加速糖尿病伤口愈合。

（3）本发明活性物COR的添加使纤维膜的亲水性增强，有利于促进细胞粘附和增殖；同时COR具有抗菌作用，COR与OHDA/GEL基底协同抗菌，抗菌效果好（对金黄色葡萄球菌的抑菌率95.60±0.99%），可为慢性伤口愈合提供抗菌消炎环境，有利于伤口部位的实际保护。

（4）本发明制备的纳米纤维膜是由均匀、光滑、随机取向的纤维组成的纤维状结构，与天然ECM高度相似，其具有较高的水蒸气渗透性和孔隙率，既能防止伤口水分过度蒸发，又能防止伤口积液，其在细胞生长和组织重建过程中，能促进营养运输和气体交换，还能阻挡外部致病菌，有利于营养供应和细胞生长，加速伤口愈合。

（5）本发明提供的仿生纤维膜所添加的COR量少，具有良好的生物安全性；利用COR/OHDA/GEL纳米纤维膜对糖尿病小鼠伤口进行处理后，21天糖尿病伤口便可完全愈合（愈合率为100%）。

（6）本发明通过H&E和Masson染色发现，COR/OHDA/GEL组的肉芽组织丰富，皮层结构致密有序，细胞器和毛囊开始生成，胶原蛋白含量增加明显，胶原纤维保存完好，呈波纹状，确定COR/OHDA/GEL纤维膜可以促进糖尿病伤口组织的胶原基质重塑和功能重建，加速糖尿病伤口的愈合，具有良好的愈合条件和较短的愈合时间。

（7）本发明通过免疫印迹发现，提供的COR/OHDA/GEL纳米纤维膜可通过抑制TLR4/NF-κB信号通路，减轻糖尿病小鼠皮肤伤口的炎症反应，促进伤口愈合。

附图说明

图1是本发明HA与OHDA对DPPH自由基的清除能力分析图；

图2是本发明制备的OHDA/GEL纳米纤维膜和COR/OHDA/GEL纳米纤维膜的表征；其中，（A.a）OHDA/GEL纳米纤维膜的扫描电镜照片（×4000，标尺5μm）；（A.b）OHDA/GEL纳米纤维膜的扫描电镜照片（×8000，标尺2μm）；（A.c）OHDA/GEL纳米纤维中纤维的尺寸分布，分别为归一化曲线；（B.a）COR/OHDA/GEL纳米纤维膜的扫描电镜照片（×4000，标尺5μm）；（B.b）COR/OHDA/GEL纳米纤维膜的扫描电镜照片（×8000，标尺2μm）；（B.c）COR/OHDA/GEL纳米纤维膜中纤维的尺寸分布及归一化曲线。

图3是本发明制备的COR、OHDA/GEL纳米纤维膜和COR/OHDA/GEL纳米纤维膜的特性分析；其中，（A）傅立叶变换红外光谱（FT-IR）；（B）热重分析（TGA）。

图4是本发明制备的OHDA/GEL纳米纤维膜和COR/OHDA/GEL纳米纤维膜的特性分析一；其中，（A）水接触角（WCA）；（B）水蒸气透过率（WVTR）；（C）孔隙率；柱形图代表平均值+SD，n=3。

图5是本发明制备的HA/GEL纳米纤维膜和OHDA/GEL纳米纤维膜的湿粘附性分析图；柱形图代表平均值+SD，n=3，*p<0.05，**p<0.01。

图6是本发明制备的OHDA/GEL纳米纤维膜和COR/OHDA/GEL纳米纤维膜的的特性分析二；其中，（A）抑制率；（B）细胞活力；柱形图代表平均值+SD，n=6，*p<0.05，**p<0.01。

图7是本发明体外抗菌活性照片（A）以及OHDA/GEL纳米纤维膜和COR/OHDA/GEL纳米纤维膜对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的相对抑菌作用（B）；条形图代表平均值+SD，n=3，*p<0.05，**p<0.01。

图8是纳米纤维膜对2型糖尿病（T2D）皮肤愈合的影响；其中，(A)实验流程图；(B)代表性伤口图像；(C)伤口痕迹；(D)相对伤口面积；(E)21天伤口愈合率；n=3,*p<0.05,**p<0.01。

图9是皮肤伤口的组织病理学染色；其中，(A)具有代表性的H&E染色图像（比例尺：200微米）；(B)具有代表性的Masson染色图像（比例尺：200微米）。

图10免疫印迹分析；其中，(A)TLR4、MyD88、IκBα、p-IκBα、NF-κB和TNF-α的代表性蛋白条带；(B)COR/OHDA/GEL纳米纤维膜通过TLR4/NF-κB通路加速糖尿病小鼠伤口愈合的机制示意图；(C)TLR4/β-actin定量分析；(D)MyD88/β-actin定量分析；(E)IκBα/p-IκBα定量分析；(F)NF-κB/β-actin定量分析；(G)TNF-α/β-actin定量分析；条形图代表平均值+SD，n=3，*p<0.05，**p<0.01。

图11是多巴胺接枝氧化透明质酸（OHDA）的合成路线图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例来进一步说明本发明，但本发明的实施方式不限于此。对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

一、试验材料

透明质酸（HA，分子量：200,000-400,000），高碘酸钠（NaIO₄，99.5%），盐酸多巴胺（DA，98%），虫草素（COR，98%），醋酸（99.5%），购自上海麦林生化有限公司（中国，上海）。明胶（GEL）购自西陇化学试剂有限公司（中国，汕头）。

动物：所有ICR雄性小鼠（18-22g）均购自长春市益思实验动物技术有限公司（中国长春），饲养在标准的实验室环境中（22±2°C，湿度：60±5%，12h光照/12h黑暗循环）。所有实验程序均由吉林农业大学动物保育与使用委员会批准（编号：2022-11-20-1），并严格遵守美国国立卫生研究院（NIH）的《实验动物保育与使用指南》。

细胞和菌：人永生化角质形成细胞（Hacat），购自上海富航生物技术有限公司；大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均购自上海雅吉生物科技有限公司。

二、纳米纤维膜的制备

（1）氧化透明质酸（OHA）的合成

采用高碘酸盐氧化法合成OHA。简言之，将HA（1g，2.5mmol）溶于100mL去离子水中，在室温下搅拌过夜。之后称取0.5g NaIO₄，边搅拌边加入NaIO₄，NaIO₄与HA的摩尔比为1:1（NaIO₄与HA重复糖单元的摩尔比）。在室温下暗处搅拌24小时，然后加入1mL乙二醇停止反应，得到的溶液在去离子水中透析（透析袋截留分子量3500Da）3天后冻干。

（2）多巴胺接枝氧化透明质酸（OHDA）的合成

将 OHA（1 克）溶于 100 毫升去离子水（pH=5，用 0.1 M HCl 和 0.1 M NaOH 调节）中，然后加入 DA（0.5 克）溶解，避光反应 12 小时。反应结束后，在 pH 值为 5 的去离子水中透析（透析袋截留分子量为 3500 Da）2 天，然后在超纯水中透析（透析袋截留分子量为 3500 Da）1 天，杂质被完全去除。OHDA 被冷冻干燥并储存在 -20°C 的冰箱中。

多巴胺接枝氧化透明质酸（OHDA）的合成路线如图11所示。

（3）制备虫草素/OHDA/GEL 纳米纤维膜

将GEL（1.0g）和OHDA（0.15g）溶于40%(v/v)的醋酸中，配制成OHDA/GEL溶液（23%，w/v）。然后，将虫草素（COR，10%，w/v）粉末与OHDA/GEL溶液混合，在45℃下搅拌6小时；进行静电纺丝处理，喷嘴和收集器之间的距离以及转鼓的转速分别固定为15cm和220rpm。将制备好的COR/OHDA/GEL纳米纤维膜放入真空干燥箱中干燥24小时，以去除残留的有机溶液。

本实施例参照上述方法还制备了OHDA/GEL、HA/GEL纳米纤维膜；且对OHDA的抗氧化活性进行检测，对上述制备的纳米纤维膜进行表征和测试，具体情况如下：

（1）多巴胺接枝氧化透明质酸（OHDA）的抗氧化活性

将透明质酸(HA)和多巴胺接枝氧化透明质酸（OHDA）配制为不同浓度的溶液。取500 μL溶液，加入到500 μL 0.1mM的DPPH乙醇溶液中，在室温避光条件下进行反应。使用酶标仪在517nm波长处测量溶液的吸光度。实验重复三次，以不含溶液的DPPH溶液为对照组，计算自由基清除率。

（2）表征

使用扫描电子显微镜（SEM）观察OHDA/GEL和COR/OHDA/GEL纳米纤维膜的形态。使用ImageJ进行图像分析，测量纳米纤维的平均直径。傅立叶变换红外光谱（FT-IR）用于表征纳米纤维膜的分子结构，扫描波长为400-4000cm^-1，分辨率为2cm^-1。热重分析法（TGA）测定了纳米纤维膜的热力学性质。使用接触角测角仪通过水接触角（WCA）分析了纳米纤维膜的表面润湿性。

（3）水蒸汽透过率（WVTR）

根据YYT0471.2-2004标准方法测定纳米纤维膜的水蒸气透过率。将纳米纤维膜安装在装有PBS（pH=7.4）的容器口上。液面与样品之间的距离为5±1mm。容器和水的重量记为W₁。将该装置转移到37°C的干燥器中，培养24小时后称重，记为W₂；根据下述公式计算水蒸汽透过率。

WVTR（g/m²/d）=（W₁-W₂）/S；其中，S 是杯口面积（m²），W₁为干燥前容器和水的重量，W₂为干燥后容器和水的重量。

（4）孔隙率

采用乙醇置换法评估纳米纤维膜的孔隙率。首先，在小瓶中注满乙醇并记录其重量（m₁）。称取一定量的纳米纤维膜（m_s），将其完全浸入乙醇中，使纳米纤维膜的孔隙完全被乙醇取代。然后，再次向小瓶中注满乙醇，记录此时的重量（m₂）。紧接着，迅速取出纳米纤维膜，称量剩余的溶液和杯子的重量（m₃）：根据下述公式计算水蒸汽透过率。

Porosity (%)=（m₂- m₃- m_s）/（m₁- m₃）×100%。

（5）纤维膜湿粘附性测试

采用万能材料试验机检测HA/GEL和ODHA/GEL纳米纤维膜粘附性能；实验步骤如下：首先，将用生理盐水润湿猪皮，将纳米纤维膜置于两猪皮之间。在测试之前，施加1 N的负载 5 min 使其接触充分；然后，用万能材料试验机的上下夹具将被粘附物钳夹固定，以100 mm/min 的速度测试，直至两个猪皮脱离，最后记录最大拉力，实验重复三次。

（6）体外抗氧化活性

研究纳米纤维膜的抗氧化活性。测定纳米纤维膜对DPPH和ABTS的清除能力。

DPPH：将20mg纳米纤维膜浸入3mL浓度为0.1mM的DPPH乙醇溶液中，在室温避光条件下进行反应。使用酶标仪在517nm波长处测量溶液的吸光度。实验重复三次，以不含纳米纤维膜的溶液为对照组，根据自由基清除率公式计算自由基清除率。

ABTS：将等量的ABTS（7.4mM）和过硫酸钾（2.6mM）混合，在室温避光条件下反应12h，用PBS稀释至734nm处的吸光度为0.70±0.02，即得ABTS工作液。在3mLABTS工作液中加入20mg纳米纤维膜。将膜在黑暗中培养6min。使用酶标仪在734nm波长处测量溶液的吸光度。实验重复三次，以不含纳米纤维膜的溶液为对照。根据自由基清除率公式计算自由基清除率。

Inhibition rate（%）=（Ac-As）/Ac×100%；其中，Ac是对照组的吸光度，As是添加了纤维膜的溶液的吸光度。

（7）细胞活力

纳米纤维膜的细胞活力用比色法3-（4,5二甲基-2-噻唑基）-2,5二苯基溴化四氮唑（MTT）测定。每组纳米纤维膜外部灭菌1小时（每侧0.5小时）。将灭菌后的纳米纤维膜铺入无菌96孔板中。以1×10⁴个细胞/孔的密度在无菌96孔板中培养Hacat细胞，然后在37°C的无菌培养箱中培养24小时。用100 µL的PBS冲洗细胞三次。然后，加入20 µL MTT（5 mg/mL）并培养4小时。移去含MTT的培养基，加入150 µL二甲基亚砜（DMSO）并振荡10分钟。使用酶标记物根据490nm波长处的吸光度计算细胞存活率。

Cell Viability（%）=（As-Ab）/（Ac-Ab）×100%；其中，As是样品的吸光度，Ab是空白组的吸光度，Ac是对照组的吸光度。

（8）体外抗菌活性

纳米纤维的抗菌活性是其作为伤口敷料的基本特性之一。纳米纤维伤口敷料的抑菌作用采用GB/T20944.2-2007方法测定。将纳米纤维薄膜切割成适当大小（重量为0.2g±0.05g）。紫外线灭菌1小时（每侧0.5小时）。将紫外线灭菌后的纳米纤维膜放入无菌小瓶中。分别加入100μL1×10⁸CFU/mL的菌液（注意不要粘在瓶壁上）。分别向培养瓶中加入10mLLB液体培养基，振荡洗菌（振荡5次，每次5秒）。稀释适当次数（2-3次），取100µL进行涂布。在37±2°C下倒置培养18-24小时，拍照并记录菌落数，计算纳米纤维膜的抑菌率。

Antibacterial rate（%）=（C-T）/C×100%;其中，C和T分别为空白对照组和样品组的CFU数。

（9）小鼠糖尿病伤口模型的伤口愈合评估

诱导小鼠患上2型糖尿病（T2D）。所有ICR雄性小鼠均适应环境并喂养一周。连续喂食高糖高脂食物（HSFD；基本食物49.5%、蔗糖25%、猪油15%、奶粉5%、蛋黄粉5%、胆酸钠0.5%）5周。随后，连续三天（第一天：80 mg/kg，第二天：70 mg/kg，第三天：60 mg/kg）禁食12小时后腹腔注射STZ枸橼酸缓冲液（0.1 M，pH=4.3）。小鼠空腹血糖（FBG）≥11.1 mM，且一周后出现典型的临床多尿、多食、多饮和体重减轻，则被视为T2D。

动物随机分为三组：对照组（0.9%生理盐水）、OHDA/GEL组（OHDA/GEL纳米纤维膜）和COR/OHDA/GEL组（COR/OHDA/GEL纳米纤维膜）。

向T2D小鼠注射水合氯醛（4%）10-12 mg/kg进行麻醉。去除小鼠背部的毛发。消毒后，用0.9%生理盐水擦拭皮肤。用剪刀在小鼠背部剪出一个1 cm长的皮肤伤口。对照组每天在伤口上涂抹0.9%生理盐水。治疗组分别使用OHDA/GEL和COR/OHDA/GEL纳米纤维敷料。所有敷料在使用前均经过紫外线消毒0.5小时。分别在第0、3、7、14和21天对伤口进行观察。伤口愈合率按下述公式计算：

Wound healing rate (%)=At/A0×100%；其中，A0为初始创伤面积，At为不同时间点的创伤面积。

（10） H&E和Masson染色

第21天采集样本，在4%PFA中固定24小时，嵌入石蜡并进行组织学评估。H&E和Masson三色染色用于评估伤口的病理状态和愈合情况。在显微镜下观察样本并收集和分析图片。

（11）免疫印迹分析（WB）

采用Western印迹法检测与TLR4信号通路相关的TLR4、MyD88、NF-κB和IκBα的表达水平。使用ImageJ软件通过密度计对各条带的密度进行量化。

（12）统计分析

数据收集使用Microsoft Excel 2019。Origin 2022用于材料特性分析。GraphPadPrism8.0版用于统计分析。IBM SPSS statistics 27用于数据分析。Adobe Photoshop2022用于图像组合。ImageJ用于图像分析。统计意义通过t-test a和单因素方差分析确定。

三、结果

（1）多巴胺接枝氧化透明质酸（OHDA）的抗氧化活性

本实施例通过DPPH的清除能力对HA与OHDA的抗氧化活性进行了评估。如图1所示，HA的抗氧化活性低，几乎无抗氧化活性。然而，OHDA具有较强的抗氧化效果，当浓度达到250mg/mL时，抗氧化活性达到68.05%，而HA仅有10.08%。研究表明接枝多巴胺后能够提高HA的抗氧化活性。

（2）表征

2.1 扫描电镜（SEM）

OHDA/GEL纳米纤维膜和COR/OHDA/GEL纳米纤维膜不同放大倍数的扫描电镜图像如图2所示。通过图2可以看出，所有纳米纤维膜都呈现出由均匀、光滑、随机取向的纤维组成的纤维状结构，与天然ECM高度相似，有利于营养交换和废物交换，同时还能阻挡外部致病菌。值得注意的是，OHDA/GEL纳米纤维膜的平均直径为227.27±81.94nm（图1.A.c），COR/OHDA/GEL纳米纤维膜的平均直径为225.55±71.03nm（图1.B.c）。OHDA/GEL和COR/OHDA/GEL纳米纤维膜的平均直径没有明显差异。这表明添加虫草素对纳米纤维膜的影响不大。

2.2傅立叶变换红外光谱（FT-IR）

COR、OHDA/GEL纳米纤维膜和COR/OHDA/GEL纳米纤维膜的傅立叶变换红外光谱分析结果如图3A所示。通过图3可以看出，OHDA/GEL纳米纤维膜和COR/OHDA/GEL纳米纤维膜在3200-3600cm^-1范围内出现一个宽峰，这是由于-OH基团和-NH2基团的伸缩振动所致。OHDA/GEL纳米纤维膜在1653cm^-1处出现C=O振动。COR/OHDA/GEL纳米纤维膜的C=O伸缩振动为1668cm^-1。与OHDA/GEL纳米纤维膜相比发生了红移。这是由于添加的COR与C=O之间存在氢键等弱相互作用。相比之下，OHDA/GEL纳米纤维膜和COR/OHDA/GEL纳米纤维膜在1548cm^-1处都有酰胺的N-H振动。值得注意的是，在COR/OHDA/GEL纳米纤维膜中没有出现COR的特征峰，这是因为COR的特征峰被OHDA和GEL的特征峰所掩盖。

2.3 热重分析（TGA）

不同的材料含有不同的成分，其热力学性质也大不相同。为了确定纳米纤维膜的热力学性质，本申请采用热重法研究了OHDA/GEL纳米纤维膜和COR/OHDA/GEL纳米纤维膜的热稳定性。如图3B所示， COR有三个热降解阶段，在温度范围的最初阶段具有良好的热稳定性，第一次降解开始于210°C，800°C时降解率为12%。然而，OHDA/GEL纳米纤维膜和COR/OHDA/GEL纳米纤维膜在一开始就开始下降，这是由于纳米纤维膜中的水分子受热气化，随后缓慢分解，直到560°C左右完全热分解。COR/OHDA/GEL纳米纤维膜和OHDA/GEL纳米纤维膜的结果相似，但在255-267°C时迅速下降，这是由于纳米纤维膜中的COR开始分解所致。上述结果表明，COR/OHDA/GEL纳米纤维膜和OHDA/GEL纳米纤维膜都具有良好的热稳定性。

2.4 水接触角(WCA)

润湿性是评价纳米纤维膜的一个重要标准，高润湿性可促进细胞粘附和增殖。图4A显示了在纳米纤维膜上添加COR前后的水静态接触角测试结果对比。OHDA/GEL纳米纤维膜和COR/OHDA/GEL纳米纤维膜的水接触角分别为45.48±2.47°和44.89±2.13°，与OHDA/GEL纳米纤维膜相比，COR/OHDA/GEL纳米纤维膜的亲水性增强，这是因为COR是水溶性药物。这有利于促进细胞粘附和增殖。

（3）水蒸汽透过率（WVTR）

纳米纤维膜既要吸收大量伤口渗出物，又要具有气体交换特性，以防止二氧化碳在伤口内积聚，导致伤口介质酸化，从而抑制伤口细胞增殖。裸伤口的水蒸气透过率为5109g/m²/d。如图4B所示，OHDA/GEL纳米纤维膜和COR/OHDA/GEL纳米纤维膜的水蒸气透过率分别为3239.13±113.44g/m²/d和3354.71±79.01g/m²/d。这表明，OHDA/GEL纳米纤维膜和COR/OHDA/GEL纳米纤维膜既能防止伤口水分过度蒸发，又能防止伤口积液，有利于伤口愈合。

（4）孔隙率

纳米纤维膜的孔隙率是细胞生长和组织重建过程中营养物质运输和交换的前提条件。OHDA/GEL纳米纤维膜和COR/OHDA/GEL纳米纤维膜的孔隙率没有显著差异。如图4C所示，OHDA/GEL纳米纤维膜的孔隙率为83.85±1.26%，COR/OHDA/GEL纳米纤维膜的孔隙率为88.98±4.34%，这有利于营养供应和细胞生长。

（5）湿粘附性测试

通过测试HA/GEL和ODHA/GEL纳米纤维膜粘附性能来初步评估各自的湿粘附性能。如图5所示，HA/GEL纳米纤维膜的湿粘附性差，仅有0.65 N，无法满足伤口敷料要求。然而，ODHA/GEL纳米纤维膜的湿粘附性能为1.32N，湿粘附性提高。结果表明，多巴胺改性后的HA能大大提高其湿粘附性，使制备的纳米纤维膜能够满足伤口敷料要求。

（6）体外抗氧化活性

研究表明，在慢性伤口中，持续的炎症反应会导致ROS大量积累，超过细胞的抗氧化能力，从而阻碍伤口从炎症阶段向增殖阶段过渡。这使伤口部位陷入长期炎症的恶性循环，最终导致难以愈合的慢性伤口。另一方面，具有抗氧化特性的伤口敷料可以减轻ROS的破坏，从而提高皮肤再生的治疗效果。纳米纤维膜的抗氧化性通过ABTS和DPPH的清除能力进行了评估。如图6A所示，OHDA/GEL纳米纤维膜和COR/OHDA/GEL纳米纤维膜都具有很强的抗氧化活性，对ABTS的清除能力分别为91.63±0.13%和91.67±0.24%，对DPPH的清除能力分别为51.65±0.67%和82.75±2.62%。对于ABTS和DPPH，COR/OHDA/GEL纳米纤维膜都具有良好的抗氧化能力。因此，COR/OHDA/GEL纳米纤维膜有助于维持细胞内氧化还原平衡，避免细胞异常生长和免疫反应紊乱，加速糖尿病伤口愈合。

（7）细胞活力

细胞毒性是纳米纤维膜敷料临床应用的一个重要指标。如图6B所示，当OHDA/GEL纳米纤维膜的浓度为4000μg/mL时，Hacat细胞的存活率大于100%，说明OHDA/GEL纳米纤维膜具有促进Hacat细胞增殖的作用，且无细胞毒性。然而，当COR/OHDA/GEL纳米纤维膜的浓度增加时，Hacat细胞的活力下降。这是由于在OHDA/GEL纳米纤维膜中添加了COR。COR/OHDA/GEL纳米纤维膜在浓度为0.4-4μg/mL时具有良好的生物安全性（根据GB/T16886.5-2003（ISO10993-5：1999），细胞存活率超过75%的样品通常被认为是无细胞毒性的）。当COR/OHDA/GEL纳米纤维膜的浓度≥40μg/mL时，Hacat细胞的存活率较低。结果表明，COR/OHDA/GEL纳米纤维膜在≥40μg/mL时具有细胞毒性。然而，在≤4μg/mL时，COR/OHDA/GEL纳米纤维膜具有良好的生物安全性。

（8）体外抗菌活性

由于糖尿病伤口极易受到细菌感染，因此抗菌活性对伤口敷料至关重要，本实验采用GB/T20944.2-2007方法评估纳米纤维膜对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌活性。如图7所示，OHDA/GEL纳米纤维膜和COR/OHDA/GEL纳米纤维膜对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都具有一定的抗菌活性。OHDA/GEL和COR/OHDA/GEL纳米纤维膜对大肠杆菌的抑菌率分别为54.18±3.14%和71.17±6.87%，对金黄色葡萄球菌的抑菌率分别为74.74±3.92%和95.60±0.99%。然而，COR/OHDA/GEL纳米纤维膜对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑制率似乎并不相同。这是由于金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的细胞壁不同，而COR对金黄色葡萄球菌的抑制活性更高。结果表明，COR/OHDA/GEL纳米纤维膜可为慢性伤口愈合提供抗菌消炎环境，有利于伤口部位的实际保护。

（9）小鼠糖尿病伤口模型的伤口愈合评估

如图8所示，在第一阶段，伤口面积增大，这是因为糖尿病伤口处于高糖环境中，细菌感染和炎症因子过度表达，导致伤口新陈代谢和溃疡。第7天，OHDA/GEL纳米纤维膜处理组和COR/OHDA/GEL纳米纤维膜处理组的伤口开始愈合，从炎症阶段过渡到重塑阶段。然而，对照组仍处于炎症期，伤口内有组织渗出，没有愈合。到第14天，对照组伤口开始愈合，但愈合不明显。值得注意的是，OHDA/GEL纳米纤维膜处理组和COR/OHDA/GEL纳米纤维膜处理组的伤口愈合良好。到第21天，对照组仍有大面积伤口未愈合，OHDA/GEL纳米纤维膜处理组愈合率为88.15%，而COR/OHDA/GEL纳米纤维膜处理组的伤口已完全愈合。结果表明，COR/OHDA/GEL纳米纤维膜可加速糖尿病伤口的愈合。

（10）H&E和Masson染色

通过H&E染色和Masson染色评估了伤口愈合的生物学机制。如图9所示，对照组糖尿病小鼠的伤口愈合不完全，再上皮化和肉芽组织形成缓慢，胶原蛋白含量低，皮肤结构稀疏。这是由于成纤维细胞功能和胶原沉积受损所致。然而，OHDA/GEL组和COR/OHDA/GEL组的伤口愈合状况良好，伤口基本愈合，胶原沉积明显增加，再上皮化和肉芽组织愈合状况良好。而COR/OHDA/GEL组的肉芽组织最为丰富，皮层结构致密有序，细胞器和毛囊开始生成，胶原蛋白含量增加最为明显，胶原纤维保存完好，呈波纹状。结果表明，COR/OHDA/GEL纳米纤维膜可促进糖尿病伤口组织的胶原基质重塑和功能重建，加速糖尿病伤口的愈合，具有良好的愈合条件和较短的愈合时间。

（11）免疫印迹（Western blot）

糖尿病伤口部位的高血糖环境、缺血缺氧和慢性炎症反应导致伤口愈合困难。炎症反应是延迟伤口愈合的主要因素。因此，为了进一步研究COR/OHDA/GEL纳米纤维膜对糖尿病小鼠皮肤愈合的作用机制。研究人员利用TLR4/NF-κB信号通路探讨了COR/OHDA/GEL纳米纤维膜的抗炎作用。如图10所示，对照组小鼠TLR4、MyD88、NF-κB、TNF-α的相对表达量显著增加。与对照组相比，OHDA/GEL组和COR/OHDA/GEL组的TLR4、MyD88、NF-κB、TNF-α的表达明显降低。各种炎症细胞因子的产生归因于TLR4信号通路的激活，而TLR4的激活依赖于MyD88通路诱导转录因子NF-κB的核转位，NF-κB反过来又调节炎症因子的表达。结果表明，COR/OHDA/GEL纳米纤维膜可通过抑制TLR4/NF-κB信号通路，减轻糖尿病小鼠皮肤伤口的炎症反应，促进伤口愈合。

以上所述为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种促进糖尿病伤口愈合的仿生纤维膜，其特征在于，该仿生纤维膜以OHDA和GEL为基底，将活性物质COR加入其中，经静电纺丝处理后得到COR/OHDA/GEL 纳米仿生纤维膜；其中，OHDA为透明质酸经氧化处理后，与多巴胺反应得到的产物；GEL为明胶；COR为虫草素；仿生纤维膜制备时，将1.0g GEL和0.15g OHDA溶于醋酸中，配制成OHDA/GEL溶液；然后，将虫草素COR粉末与OHDA/GEL溶液混合，搅拌混匀；之后进行静电纺丝处理。

2.一种促进糖尿病伤口愈合的仿生纤维膜的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤3、COR/OHDA/GEL 纳米仿生纤维膜的制备：将1.0g GEL和0.15g OHDA溶于醋酸中；然后，将虫草素COR粉末与OHDA/GEL溶液混合，搅拌混匀，进行静电纺丝处理，得到COR/OHDA/GEL纳米仿生纤维膜。

3.根据权利要求2所述的一种促进糖尿病伤口愈合的仿生纤维膜的制备方法，其特征在于，所述步骤1氧化透明质酸的合成方法为：将1g，2.5mmol的透明质酸HA溶于100mL去离子水中，在室温下搅拌过夜；之后称取0.5g NaIO4，边搅拌边加入NaIO4，在室温下暗处搅拌24小时，然后加入1mL乙二醇停止反应，得到的溶液在去离子水中透析3天后冻干；其中，透析时所用透析袋的截留分子量为3500Da。

4.根据权利要求2所述的一种促进糖尿病伤口愈合的仿生纤维膜的制备方法，所述步骤2多巴胺接枝氧化透明质酸的合成方法为：将1 克OHA溶于 100 毫升pH 值为 5 的去离子水中，然后加入0.5 克DA 溶解，避光反应 12 小时；反应结束后，在 pH 值为 5 的去离子水中透析2 天，然后在超纯水中透析 1 天，之后OHDA 被冷冻干燥并储存在 -20°C 的冰箱中；其中，透析时所用透析袋的截留分子量为 3500 Da。

5.根据权利要求2所述的一种促进糖尿病伤口愈合的仿生纤维膜的制备方法，所述步骤3 COR/OHDA/GEL 纳米仿生纤维膜的制备方法为：将1.0g GEL和0.15g OHDA溶于40%的醋酸中，配制成OHDA/GEL溶液；然后，将虫草素COR粉末与OHDA/GEL溶液混合，在45℃下搅拌6小时；之后进行静电纺丝处理，喷嘴和收集器之间的距离以及转鼓的转速分别固定为15cm和220rpm；最后将制备好的COR/OHDA/GEL纳米仿生纤维膜放入真空干燥箱中干燥24小时；其中，OHDA/GEL溶液中GEL和OHDA与醋酸的质量体积百分比为23%，虫草素COR与OHDA/GEL溶液的质量体积百分比为10%。

6.权利要求2或3或4或5所述方法制备的促进糖尿病伤口愈合的仿生纤维膜在制备促进糖尿病伤口组织的胶原基质重塑和功能重建的药物中应用。

7.权利要求2或3或4或5所述方法制备的促进糖尿病伤口愈合的仿生纤维膜在制备抑制TLR4/NF-κB信号通路的药物中应用。