CN114588056A - 茶氨酸负载虫草素复合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提出茶氨酸负载虫草素复合物及其制备方法和应用，属于护肤品技术领域。所述制备方法包括如下步骤：S1：将聚乙二醇‑1000热水浴加热溶化后，加入无酶无菌水，采用滤膜过滤，得过滤的聚乙二醇‑1000溶液；S2：将茶氨酸、虫草素加入至上述过滤的聚乙二醇‑1000溶液中，搅拌同时超声，均质混合，得茶氨酸负载虫草素复合物。将茶氨酸负载虫草素复合物用于化妆品的制备，可有效缓解由R‑Loop介导的紫外炎性损伤。
Description
技术领域
本发明属于护肤品技术领域，具体涉及茶氨酸负载虫草素复合物及其制备方法和应用。
背景技术
随着当今社会对美的不断追求，防晒抗老防衰的理念已经深入人心，同时，研究表明，紫外线辐射是引起皮肤炎症反应的主要原因之一。人体皮肤的主要组成细胞——人上皮细胞(Human Keratinocytes，HKC)可接受各种外界刺激，激活胞内复杂的信号传递机制。阳光紫外辐射(UVR)可诱导HCK表达包括IL-1在内的多种炎性因子，但其诱导的皮肤炎症机理，特别是炎症信号涉及的受体分子及信号传导途径，尚缺少明确的实验依据。
发明内容
本发明提供了茶氨酸负载虫草素复合物及其制备方法和应用，所述茶氨酸负载虫草素复合物可抑制R-Loop生成，缓解紫外诱导的皮肤炎性损伤。
本发明提出一种茶氨酸负载虫草素复合物的制备方法，包括如下步骤：
S1：将聚乙二醇-1000热水浴加热溶化后，加入无酶无菌水，采用滤膜过滤，得过滤的聚乙二醇-1000溶液；
S2：将茶氨酸、虫草素加入至上述过滤的聚乙二醇-1000溶液中，搅拌同时超声，均质混合，得茶氨酸负载虫草素复合物。
进一步地，步骤S1中：所述热水浴的温度为40～50℃。
进一步地，步骤S1中：聚乙二醇-1000与无酶无菌水的质量比为1：1。
进一步地，步骤S2中：茶氨酸、虫草素与过滤的聚乙二醇-1000溶液的质量比为1～10:10:10。
进一步地，步骤S2中：茶氨酸、虫草素与过滤的聚乙二醇-1000溶液的质量比为2:10:10。
进一步地，步骤S2中：所述超声具体为每搅拌4小时超声5-15分钟。
本发明还提出上述任一所述的制备方法制备得到的茶氨酸负载虫草素复合物。
本发明还提出上述任一茶氨酸负载虫草素复合物在化妆品中的应用。
进一步地，所述化妆品具有修复皮肤由R-Loop介导的紫外炎性损伤功效。
进一步地，所述化妆品为洗面奶、卸妆水、清洁霜、花露水、爽身粉、沐浴液、洗发液、护肤霜、乳液、精华、化妆水、面膜、唇膏、唇油、护发素、粉饼、胭脂、眼影、眼线笔、眉笔、香水、粉底、隔离霜或粉饼。
本发明具有以下优势：
本发明提出的茶氨酸负载虫草素复合物及其制备方法和应用，通过调整茶氨酸、虫草素以及聚乙二醇-1000的配比以及具体制备步骤等，使虫草素自身游离的醇基掺入受损细胞的DNA中发挥作用，同时，茶氨酸也具有相应缓解炎症的功效，并且茶氨酸可以为虫草素提供合适的酸性环境，保证虫草素释放更加高效稳定。将茶氨酸负载虫草素复合物用于化妆品的制备，可有效缓解由R-Loop介导的紫外炎性损伤。
附图说明
构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
在附图中：
图1为紫外损伤模型构建；
图2为紫外损伤导致R-Loop结构病理性增加效果图；
图3为茶氨酸负载虫草素复合物降低紫外诱导炎性损伤的效果图；
图4为茶氨酸负载虫草素复合物的毒性检测效果图；
图5为茶氨酸负载虫草素复合物减少R-Loop结构效果图；
图6为茶氨酸虫草素复合物与单体茶氨酸、虫草素单体治疗紫外损伤的效果对比图；
图7为免疫组化半定量标准分析效果图；
图8为各实验组对皮肤损伤综合评判效果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
虫草素，嘌呤类生物碱，具有修复细胞保护生命体遗传密码的特殊功效，本发明提出虫草素可以通过游离自由基来缓解紫外造成的炎性损伤。虫草素的分子结构式如下：
茶氨酸，谷氨酰胺类氨基酸类似物，可调节抗肿瘤药物的活性。茶氨酸的分子结构式如下：
本发明一实施例提出一种茶氨酸负载虫草素复合物的制备方法，包括如下步骤：
S1：将聚乙二醇-1000热水浴加热溶化后，加入无酶无菌水，采用滤膜过滤，得过滤的聚乙二醇-1000溶液；
S2：将茶氨酸、虫草素加入至上述过滤的聚乙二醇-1000溶液中，搅拌同时超声，均质混合，得茶氨酸负载虫草素复合物。
本发明一实施例中，步骤S1中：所述热水浴的温度为40～50℃。优选的，步骤S1中：所述热水浴的温度为45℃。
本发明一实施例中，步骤S1中：滤膜的孔径为0.22微米。
本发明一实施例中，步骤S1中：聚乙二醇-1000与无酶无菌水的质量比为1：1。
本发明一实施例中，步骤S2中：茶氨酸、虫草素与过滤的聚乙二醇-1000溶液的质量比为1～10:10:10。
本发明一优选实施例中，步骤S2中：茶氨酸、虫草素与过滤的聚乙二醇-1000溶液的质量比为2:10:10。
本发明一实施例中，步骤S2中：搅拌的温度为室温。搅拌的时间为24h。
本发明一实施例中，步骤S2中：超声具体为每搅拌4小时超声5-15分钟。优选的，步骤S2中：超声具体为每搅拌4小时超声10分钟。
本发明一实施例还提出上述任一制备方法制备得到的茶氨酸负载虫草素复合物。本发明所述的茶氨酸负载虫草素复合物，可以保证虫草素自身游离的醇基掺入受损细胞的DNA中发挥作用，同时，茶氨酸也具有相应缓解炎症的功效，并且茶氨酸可以为虫草素提供合适的酸性环境，保证虫草素释放更加高效稳定。
本发明一实施例还提出茶氨酸负载虫草素复合物在化妆品中的应用。
本发明一实施例中，所述化妆品具有修复皮肤由R-Loop介导的紫外炎性损伤功效。
本申请发明人发现，紫外照射会导致一种特殊的由DNA和RNA稳定结合形成的DNA-RNA双链产生，即R-Loop的产生，这种稳定的环状结构的出现可直接导致皮肤的炎性损伤。
因此，本申请发明人提出，使用与核酸结构类似的虫草素抑制R-Loop形成，从而缓解由紫外诱导的皮肤炎性损伤。并且，本申请发明人提出，使用茶氨酸负载虫草素复合物可进一步保护虫草素的游离醇基，使游离的醇基可以掺入受损细胞的DNA中，发生作用，保证虫草素的活性稳定，此复合物在缓解炎症过程中可起到高效的作用。
具体地，茶氨酸负载虫草素复合物通过与COIL蛋白竞争性结合，抑制R-Loop的产生，从而缓解由R-Loop介导的紫外炎性损伤。
本发明实施例中，通过对R-Loop结构的研究以及缓解R-Loop所需结构的分析，通过大量分子生物学实验筛选出虫草素，虫草素可以作为核酸类似物，与蛋白COIL竞争性结合，从而有效缓解R-Loop结构的产生，同时茶氨酸可以为虫草素提供完全合适的酸性环境，保证虫草素游离的醇基高效发挥作用。
具体而言，术语“化妆品”指以涂抹、洒、喷或其它类似方式，施于人体表面任何部位，以达到清洁、芳香、改变外观、修正人体气味、保养、保持良好状态目的的产品。
化妆品按主要功能不同可以分为清洁类化妆品、护理类化妆品和美容/修饰类化妆品。
所述清洁类化妆品包括：洗面奶、卸妆水(乳)、清洁霜(蜜)、花露水、爽身粉、沐浴液、洗发液(水)等。
所述护理类化妆品包括：护肤霜(膏)、乳液、精华、化妆水、面膜、唇膏、唇油、护发素等。
所述美容/修饰类化妆品包括：粉饼、胭脂、眼影、眼线笔(液)、眉笔、香水、粉底、隔离霜、粉饼等。
优选的，本发明一实施例中，所述化妆品为洗面奶、卸妆水、清洁霜、花露水、爽身粉、沐浴液、洗发液、护肤霜、乳液、精华、化妆水、面膜、唇膏、唇油、护发素、粉饼、胭脂、眼影、眼线笔、眉笔、香水、粉底、隔离霜、粉饼等。
所述茶氨酸负载虫草素复合物为所述抗炎、缓解紫外导致的皮肤损伤、或护肤的唯一活性成分，或该复合物与其他物质一起制备所述抗炎、缓解紫外导致的皮肤损伤或护肤的制剂。例如，制备护肤霜时，除了含有有效活性成分茶氨酸负载虫草素复合物，还可以含有护肤霜常用的组分，如乳木果油、荷荷巴油、乳化剂、甘油以及纯净水等。
具体而言，所述化妆品以含水洗液、油包水或水包油乳液、油或油醇洗液、阴离子或非离子两亲脂质的囊状分散体、含水凝胶、水醇凝胶、醇凝胶或油醇凝胶、固体棒或气溶胶的形式存在。
下面将结合实施例详细阐述本发明技术方案。
本发明使用的试验材料及其来源包括：
(1)主要实验药物与试剂
虫草素、茶氨酸(ChemicalBook公司)
cck8检测试剂盒(Solarbio，北京索莱宝科技有限公司)
H-E染液试剂盒(Solarbio，北京索莱宝科技有限公司)
QPCR试剂盒(Solarbio，北京索莱宝科技有限公司)
IL-6、IL-1β、TNF-α引物(擎科生物有限公司)
S9.6抗体、不同原性免疫荧光二抗(Solarbio，北京索莱宝科技有限公司)
(2)细胞及实验动物
小鼠成纤维细胞系(NIH-3T3)；KeyGen Biotech(南京凯基生物科技发展有限公司)
人上皮细胞系(HaCat)；KeyGen Biotech(南京凯基生物科技发展有限公司)
5周龄的雌性昆明小鼠：由中国人民解放军军事医学科学院试验动物中心和北京维通利华实验动物技术有限公司提供。
实施例1紫外损伤导致R-Loop异常增加
1.1紫外损伤模型构建
本部分实验选用人源皮肤细胞(HaCat)和鼠源成纤维细胞(NIH-3T3)两种工具细胞开展实验。将HaCat和3T3以50％的密度接种于6孔板内，37℃，5％CO2培养箱过夜培养。吸出培养基后用PBS清洗1-2次，在孔板内保留2ml PBS，同时加入1μL双氧水(30％)诱导紫外损伤放入37℃，5％CO2培养箱中，15min后吸出含有双氧水的PBS，重新加入预热37℃的培养基，至此紫外损伤模型构建成功。收取细胞进行QPCR相关实验，紫外损伤相关的炎症因子：TNF-α、IL-1β、IL-6的表达如图1所示。
如图1所示，通过细胞实验，对构建的紫外损伤模型进行QPCR实验，发现在实验组中和紫外损伤因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表达相较于对照组显著上升，结果证明紫外诱导损炎性伤模型构建成功。
1.2紫外损伤导致R-Loop结构病理性增加
本部分实验选用人源皮肤细胞(HaCat)和鼠源成纤维细胞(NIH-3T3)两种工具细胞开展实验。将细胞镊子夹取48孔板爬片置于孔板内，接种细胞，放入37℃，5％CO2培养箱中培养过夜，根据1.1所述方法构建紫外损伤模型。设置对照组和uv实验组。
根据抗体说明书及预实验结果，滴加抗体形成凸液面，放于湿盒中室温孵育12h。一抗孵育完成后，用PBS溶液洗涤三次，每次5min，根据抗体说明书及预实验结果，将异源荧光二抗按比例滴加抗体放于湿盒中室温避光孵育2h。
激光共聚焦显微镜在对应的荧光通道进行图像采集。如图2所示。
如图2所示，通过细胞实验，构建紫外损伤模型，并对实验组和对照组进行R-Loop结构染色，通过激光共聚焦显微镜在对应的荧光通道进行图像采集结果所示紫外损伤会导致R-Loop结构病理性增加。R-Loop结构的异常增加会导致下游基因的表达，导致上皮细胞中炎症的产生。
实施例2茶氨酸虫草素复合物抑制R-Loop介导的紫外损伤
2.1茶氨酸虫草素复合物抑制炎症因子表达
本部分实验选用人源皮肤细胞(HaCat)和鼠源成纤维细胞(NIH-3T3)两种工具细胞开展实验，将人源皮肤细胞和鼠源成纤维细胞接种与六孔板内，待细胞贴壁，向培养基中加入虫草素、茶氨酸、茶氨酸负载虫草素复合物保护细胞24h，而后吸出带有药物的培养基并保留与4mL EP管中，同时加入1μL双氧水(30％)和2mL PBS诱导紫外损伤。将培养皿放入37℃，5％CO2培养箱中，15min后加入前一步保留的带有对应药物的培养基，再次共培养24h后收取各组细胞，使用QPCR试剂盒来测定TNF-α、IL-1β、IL-6的含量。如图3所示。
如图3所示，实施例1中对R-Loop结构以及R-Loop下游通路的分析进行了药物筛选。实施例2中，通过设置空白对照组、UV损伤组、虫草素组、茶氨酸组、茶氨酸负载虫草素组，进行紫外损伤诱导后收取细胞进行QPCR实验，发现加药后紫外损伤因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表达显著降低；同时在药物浓度相同的情况下，茶氨酸负载虫草素复合物的效果最为显著。其结果所示，茶氨酸负载虫草素复合物的药物效果更加高效。
2.2茶氨酸虫草素复合物对细胞毒性研究
本部分实验选用人源皮肤细胞(HaCat)和鼠源成纤维细胞(NIH-3T3)两种工具细胞开展实验，将人源皮肤细胞和鼠源成纤维细胞接种与96孔板内，待细胞贴壁，向培养基中加入虫草素、茶氨酸、茶氨酸负载虫草素复合物保护细胞24h，而后吸出带有药物的培养基并保留，同时加入0.1μL双氧水(30％)诱导紫外损伤15min，待紫外损伤模型诱导成功后，加入前一步保留的带有对应药物的培养基，放入培养箱中，再次共培养24h，后收取各组细胞，按照CCK8试剂盒说明，向每孔加入100ul的培养液和10ul CCK-8溶液混匀后，37℃孵育2h，测定细胞活力。用酶标仪(MultiskanTMFC，Thermo Scientific，USA)，测定450nm下的光密度。如图4所示。
如图4所示，通过CCK8实验来验证所选药物对细胞的毒性。其结果所示，茶氨酸负载虫草在与只添加虫草素，并且两组虫草素含量相同的情况下，对细胞的损伤最小。根据显微镜下形态观察，茶氨酸负载虫草素复合物对细胞形态影响最小。
实施例3茶氨酸虫草素复合物动物模型上抑制R-Loop介导的紫外损伤本部分实验使用上述昆明鼠来开展实验，实验组每组两只小鼠。采用背部皮肤紫外照射处理：首先使用脱毛膏将小鼠背部毛脱掉，提前24h在各实验组小鼠背部涂抹对应药物，24h后进行紫外照射(UV辐射的量为500mJ/cm2)20min进行紫外损伤模型构建。动物的紫外照射时间以及给药时间实验持续进行4周后模型构建好后将小鼠处死，进行损伤皮肤组织包埋，切片，进行免疫组织荧光染色。通过激光共聚焦显微镜在对应的荧光通道进行图像采集结果，如图5所示。
如图5所示，根据动物实验，通过激光共聚焦显微镜在对应的荧光通道进行图像采集结果所示紫外损伤会导致R-Loop结构病理性增加，同时茶氨酸负载虫草素复合物可以很好的降低这种R-Loop结构病理性增加，从而治疗紫外诱导的炎性损伤。
实施例4茶氨酸虫草素复合物与单体茶氨酸、虫草素单体治疗紫外损伤的效果对比
本部分实验使用昆明鼠来开展。实验小鼠分5组，每组三只，分别为实验对照组、紫外诱导后不使用药物组、紫外诱导后使用茶氨酸负载虫草素复合物组、紫外诱导后使用茶氨酸组、紫外诱导后使用虫草素组。
按照实施例3实验方法，对实验动物进行紫外损伤模型构建。在紫外损伤模型构建成功的第0天、1天、2天、4天、6天、7天进行分组药物涂抹。在第七天后处死小鼠后取其背部皮肤，福尔马林浸泡48h后，流动水冲洗12h，随后对所取皮肤进行蜡块包埋、切片，随后进行免疫组织化学染色，结果如图6所示。
如图6所示，相比于单独使用茶氨酸和单独使用虫草素，使用茶氨酸虫草素复合物的实验组R-Loop含量明显更低，这表示使用茶氨酸虫草素复合物的治疗效果显著高于单独使用茶氨酸和单独使用虫草素，进一步验证本发明复合物的显著效果。
实施例5不同茶氨酸和虫草素添加量的复合物对紫外诱导的炎症损伤
本部分实验使用昆明鼠来开展实验,实验每组三只小鼠。首先取40gPEG-1000水浴45℃加热至融化，加入40ml(等于40g)无酶无菌水，过0.22微米筛,得过滤的聚乙二醇-1000溶液。准备四只15ml离心管，每只离心管中加入10ml(等于10g)PEG-1000混合物(即过滤的聚乙二醇-1000溶液)，置于37℃备用；称取1g、2g、5g、10g茶氨酸分别加入四只离心管中超声10min，后加入10g虫草素,室温搅拌24h，每搅拌4h超声10min。为清楚起见，添加比例可参加表1。
由此制备的四组样品进行效果测试,将样品涂抹在以实施例3构建的紫外损伤模型小鼠皮肤上，同一只小鼠保留部分紫外损伤后未进行药物治疗区域,进行自身对照。其余实验部分连续7天涂抹等剂量组合物试验品。7天后将小鼠处死后，取皮肤进行包埋、切片、进行免疫组化实验分析。结果如图7所示。
表1茶氨酸负载虫草素复合物配比
| 添加物 | 实验组1 | 实验组2 | 实验组3 | 实验组4 |
| PEG-1000 | 10g | 10g | 10g | 10g |
| 茶氨酸 | 1g | 2g | 5g | 10g |
| 虫草素 | 10g | 10g | 10g | 10g |
| 无酶无菌水 | 10ml | 10ml | 10ml | 10ml |
由图7可得，由于组合物配比不同导致治疗紫外诱导的皮肤炎症效果大为不同。根据动物实验证明本发明选定各组分配比为:茶氨酸、虫草素与过滤聚乙二醇-1000溶液的质量比为1:5:5，实验组2配比，为最适配比，对紫外诱导的炎性损伤治疗效果最强，并且对皮肤损伤最小。
实施例6不同复合物配比对皮肤损伤影响
将实施例5中的四组实验药物，按照表2的成分比例加入，制成护肤霜1、护肤霜2、护肤霜3、护肤霜4。
表2护肤霜中成分配比
| 配方 | 含量 |
| 乳木果油 | 5g |
| 荷荷巴油 | 10ml |
| 乳化剂 | 2ml |
| 甘油 | 5ml |
| 茶氨酸负载虫草素复合物 | 2ml |
| 纯净水 | 76ml |
本部分实验采用昆明鼠来开展,每组三只,将实施例5所得紫外损伤引发炎症的动物模型分组,背部损伤部位涂抹护肤霜1、护肤霜2、护肤霜3、护肤霜4。分别在第0天、1天、2天、4天、6天、7天使用皮肤检测仪检测小鼠背部皮肤状态。检测指标包含经表皮水流失、弹性两项指标综合评分。结果如图8所示。
由图8可得，紫外损伤造成炎症后，小鼠涂抹实验组1、2的皮肤损伤最小，结合实施例5的治疗效果评价，实验组2的治疗效果及皮肤保护效果综合效果最佳。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种茶氨酸负载虫草素复合物的制备方法，包括如下步骤：
S1：将聚乙二醇-1000热水浴加热溶化后，加入无酶无菌水，采用滤膜过滤，得过滤的聚乙二醇-1000溶液；
S2：将茶氨酸、虫草素加入至上述过滤的聚乙二醇-1000溶液中，搅拌同时超声，均质混合，得茶氨酸负载虫草素复合物。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，
步骤S1中：所述热水浴的温度为40～50℃。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，
步骤S1中：聚乙二醇-1000与无酶无菌水的质量比为1：1。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，
步骤S2中：茶氨酸、虫草素与过滤的聚乙二醇-1000溶液的质量比为1～10:10:10。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，
步骤S2中：茶氨酸、虫草素与过滤的聚乙二醇-1000溶液的质量比为2:10:10。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，
步骤S2中：所述超声具体为每搅拌4小时超声5-15分钟。
7.权利要求1～6任一项所述的制备方法制备得到的茶氨酸负载虫草素复合物。
8.权利要求7所述的茶氨酸负载虫草素复合物在化妆品中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，
所述化妆品具有修复皮肤由R-Loop介导的紫外炎性损伤功效。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，
所述化妆品为洗面奶、卸妆水、清洁霜、花露水、爽身粉、沐浴液、洗发液、护肤霜、乳液、精华、化妆水、面膜、唇膏、唇油、护发素、粉饼、胭脂、眼影、眼线笔、眉笔、香水、粉底、隔离霜或粉饼。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20220607 |