CN114028606A - 一种壳聚糖、鱼精蛋白抗菌止血微球及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于新型止血材料技术领域，具体包括一种壳聚糖、鱼精蛋白抗菌止血微球及其制备方法，通过静电LbL制备一层组装物和组装物，并通过用BCA试剂盒方法测定未组装进微球中的鱼精蛋白含量，可根据鱼精蛋白的标准曲线计算其包封率，最终可以确定不同组装条件下的鱼精蛋白的组装情况，进行微球的优化制备。通过抑菌实验和凝血实验鉴定二层组装微球的性能，确定其对革兰氏阴性菌大肠杆菌和革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌两类细菌均具有优异的抑菌性能，确定二层组装微球较组装材料鱼精蛋白和HACC具有显著的凝血性能。

Description

一种壳聚糖、鱼精蛋白抗菌止血微球及其制备方法
技术领域
本发明属于新型止血材料技术领域，具体涉及一种壳聚糖、鱼精蛋白抗菌止血微球及其制备方法。
背景技术
意外事故、手术和自然灾害等导致的创伤处大量失血是现代人类死亡的主要原因之一。救治后期的感染是最主要的并发症。然而，目前国内外主要的止血方式除了利用传统止血器械和传统止血药物止血外，还有研究人员开发了新型止血材料。前者可能会造成组织坏死或引发血栓等问题，后者也可能有使机体细胞组织受损等不良反应。
鱼精蛋白作为一种碱性阳离子多肽，主要存在于鱼类等的成熟精巢组织中。它的分子量较小，在四千至一万道尔顿之间，形状似球形，一般由30个左右氨基酸组成，等电点在10-12之间，可溶于水和稀酸。鱼精蛋白具有抑菌活性，通过自身碱性氨基酸或肽链的特殊结构而与细菌细胞壁上的肽聚糖结合，从而阻止了细胞壁的合成，作用于细菌细胞膜，通过改变膜上质子动力而影响了某些氨基酸的吸收，并且通过本身含有的磷脂负电荷结合膜上某些活性分子去阻断生物合成的信号，最终扰乱细菌生命活动而致其死亡。因此，它常被作为抑菌材料广泛使用。鱼精蛋白还具有凝血活性，可激活纤维原蛋白受体和α颗粒的释放而直接介导血小板的聚集而增强凝血效果，可以与肝素特异性结合而起到特殊凝血作用。除此之外，鱼精蛋白还具有优异的生物相容性且无毒性，被广泛用于医药领域。
羧甲基淀粉钠(CMS)是以淀粉这一天然植物多糖为原料制备的，可以于冷水中溶解，形成阴离子型的高分子聚电解质醚。它的制备方法主要有干法和水媒法等，化学性质稳定；在医药、食品、纺织等众多工业中都重要地位。在医药工业中，它因良好生物相容性和可生物降解性而常被制成水凝胶或纳米颗粒而用于药物递送等。
甲壳素是广泛存在于壳动物类和节肢动物类的外壳中的一类天然高分子化合物，脱去葡萄糖上的N－乙酰基则成为现在被人们使用最多的一类重要衍生物壳聚糖。但是，壳聚糖难溶于水的这一缺陷使其应用受限；而羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖(HACC)是采用不同方法在壳聚糖上引入羟丙基三甲基氯化铵的一类壳聚糖季铵盐，因引入了亲水性很强的基团，期较前者易溶于水，具有更广泛的应用。
层层自组装技术(LbL)利用溶液中高分子化物基团间的相互作用力而在基体上自发缔合形成结构完整，性质稳定，具有特定功能的分子聚集体的一门技术；其具有组装条件温和以及组装分子等材料的选择范围广等特点；用于LbL的材料种类繁多，因此其应用领域广泛，近年来在医药方向尤为突出。在医药领域方面，其制备的微囊可控制周围分子的扩散而实现药物控释。
发明内容
发明目的
本发明的目的在于利用静电LbL制备鱼精蛋白/CMS/HACC抑菌凝血微球，以期得到具有多功能作用的凝血材料，弥补市场不足。
技术方案
(1)鱼精蛋白和组装载体材料的理化性质的研究
测定鱼精蛋白在不同pH下的zeta－电位和平均粒径以及测定CMS、HACC组装材料和一层组装微球在不同pH和浓度下的zeta－电位，确定较适合的组装条件范围；
(2)组装微球的制备及结构性能的研究
准确称取一定量的CMS或HACC，使其分别溶解在具有一定pH的溶液中，按上述已确定的组装条件范围，以一定质量比分别组装一层组装微球和二层组装微球，在不同温度中反应不同时间。反应完成后，在一定转速下离心的沉淀物，将其冷冻干燥12h以上，所得白色或黄色粉末即为一层组装微球和二层组装微球。收集的上清液和洗涤液用BCA试剂盒方法测定未组装进微球中的鱼精蛋白含量，可根据鱼精蛋白的标准曲线计算其包封率，最终可以确定不同组装条件下的鱼精蛋白的组装情况，进行微球的优化制备。上述所得组装微球利用光学显微镜去观察其微观构造、表面形貌并利用紫外分光光度计进行190-800cm-1扫描全谱，确定鱼精蛋白的成功组装。
制备微球过程中回收的上清液和洗涤液，用BCA试剂盒方法测定其吸光度，通过上述标准曲线计算得出未组装在内的鱼精蛋白含量，进而通过以下公式计算得出鱼精蛋白的包封率，其质量单位为mg。因此，可以确定不同组装条件下的鱼精蛋白的组装情况，从而优化微球制备方案。
Figure BDA0003321360610000031
(3)抗菌凝血性能的研究
分别取一定质量的鱼精蛋白、HACC和二层组装微球与一定浓度的菌液于Eppendorf管中混合均匀作为实验组，以未含组装材料的菌液作为对照组，以未含菌液的LB液体培养基作为空白组，于摇床上培养一定时间，吸取一定量的溶液，进行涂平板操作，并设置三组平行抑菌实验，统计菌落个数，计算抑菌率。
分别称取一定质量的鱼精蛋白、HACC和二层组装物与一定体积的肝素抗凝牛血于37℃水浴中温育一定时间，作为实验组，加入一定体积灭菌蒸馏水，测定上清液吸光度以计算凝血指数。
有益效果
与现有技术相比，本发明的一种壳聚糖、鱼精蛋白抗菌止血微球及其制备方法，具备以下有益效果：
(1)通过测定一层组装材料鱼精蛋白和CMS在不同pH和浓度条件下的电位和粒径，确定一层组装物制备的最适pH条件为3.0，最适CMS浓度为3mg/mL；通过调控组装材料质量比、反应时间和温度三类组装条件以及测定组装物的zeta－电位，得到了最优一层组装微球，其包封率为100％，说明鱼精蛋白被成功包封；
(2)通过测定最优一层组装物和组装材料HACC在不同pH和浓度条件下的电位和粒径，确定二层组装物制备的最适pH条件为4.0。通过调控两者质量比和HACC浓度的组装条件以及测定组装物的zeta－电位，得到最优二层组装物微球，其包封率为78.16％；
(3)通过抑菌实验和凝血实验鉴定二层组装微球的性能，确定其对革兰氏阴性菌大肠杆菌和革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌两类细菌均具有优异的抑菌性能，其抑菌率均大于99％；确定二层组装微球较组装材料鱼精蛋白和HACC具有显著的凝血性能，其凝血指数为0％；
附图说明
图1为pH对鱼精蛋白zeta－电位的影响分析图；
图2为pH对鱼精蛋白平均粒径的影响分析图；
图3为pH对CMS zeta－电位的影响分析图；
图4为CMS浓度对其zeta－电位的影响分析图；
图5为鱼精蛋白/CMS质量比对鱼精蛋白包封率的影响分析图；
图6为鱼精蛋白/CMS质量比对其zeta－电位的影响分析图；
图7为组装时间对鱼精蛋白包封率的影响分析图；
图8为组装温度对鱼精蛋白包封率的影响分析图；
图9为pH对一层组装物zeta－电位的影响分析图；
图10为pH对一层组装物平均粒径的影响分析图；
图11为pH对HACCzeta－电位的影响分析图；
图12为HACC浓度对其zeta－电位的影响分析图；
图13为HACC浓度对鱼精蛋白包封率的影响分析图；
图14为一层组装物/HACC质量比对鱼精蛋白包封率的影响分析图；
图15为一层组装物/HACC质量比对其zeta－电位的影响分析图；
图16为一层组装物/HACC质量比对二层组装物平均粒径的影响分析图；
图17为鱼精蛋白、HACC和二层组装物对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的抑菌性能分析图；
图18为鱼精蛋白、HACC、鱼精蛋白+HACC和二层组装物的凝血指数分析图。
具体实施方式
一种壳聚糖、鱼精蛋白抗菌止血微球及其制备工艺，包括一层组装微球的制备，具体工艺如下：
准确称取一定质量的组装材料鱼精蛋白和CMS，分别加入pH＝3.0的溶液中溶解，按质量比分别为1/1、1/2、1/3、1/4和1/6的比例将鱼精蛋白溶液缓慢滴加到CMS溶液中，分别在温度为25℃、35℃、45℃和55℃水浴中反应0.5、1、2、3和4h。组装完成后，取组装液于8000rpm的转速下离心10min，取1mL上清液备用；沉淀物用蒸馏水洗涤2次，得到的重悬液于8000rpm的转速下离心5min，取1mL上清液备用；无水乙醇洗涤1次，操作同步。取定量上清液和洗涤液，用BCA试剂盒法检测未组装的鱼精蛋白浓度以计算损失量，组装物冷冻干燥12h以上，所得白色粉末即为一层组装物。
实施例1
一层组装物结果分析，包括zeta－电位和平均粒径分析和不同组装条件对鱼精蛋白包封率的影响；其中，zeta－电位和平均粒径分析包括：
(1)鱼精蛋白的zeta－电位和平均粒径分析
图1和图2分别是不同pH条件下鱼精蛋白的带电量和平均粒径情况。结果如下，鱼精蛋白在pH＝11左右时，它的带电量最小，所以该pH值应该非常接近它的等电点，此时鱼精蛋白分子链之间容易发生聚集现象而导致其平均粒径最大。当pH值小于鱼精蛋白等电点时，其分子中的碱性基团及氨基基团会结合氢离子而使其带正电荷，并且带电荷量会随pH值的减小而增加，而其粒子平均粒径则会相对减小。这主要是因为在此条件下鱼精蛋白分子呈现出的同种电荷会使自身分子链之间相互排斥，进而减少了蛋白质间的聚集，而且排斥力越大，其在溶液中的稳定性越高。当pH值大于鱼精蛋白等电点时，其分子中的羟基基团电离而使其呈现相反电荷性质。因此可知，pH小于5的条件下，鱼精蛋白分子带电量较高，平均粒径较小，分子分散较均匀且稳定，可成为通过静电作用而层层自组装的pH条件。
(2)羧甲基淀粉钠的zeta－电位分析
图3是不同pH条件下CMS的带电量情况。结果显示，CMS在pH小于6的条件下，其分子均带有负电荷；而且在pH大于3的条件下，分子所带电荷量较高，则其可溶液中较稳定存在。结合组装基体鱼精蛋白和组装材料CMS在不同pH条件下的zeta－电位情况可知，在pH值为3-5的范围内，鱼精蛋白和CMS分别带有正负相反电荷且带电量较大。但是，鱼精蛋白在此范围内带电量较均匀，而CMS在pH＝3时带电量最大，因此选择pH＝3为后续制备一层组装物的pH条件。
图4是不同CMS浓度的带电量情况。由图可知，pH＝3时，CMS带电荷量随着其浓度增加而呈增大趋势，浓度在3mg/mL以上均带有较高电荷量，都可成为后续制备一层组装物的CMS浓度条件。但是，在组装溶液中，其浓度越大，超声分散均匀后的CMS沉降会加快。因此，选取3mg/mL为制备组装物的CMS浓度条件。
不同组装条件对鱼精蛋白包封率的影响包括：不同鱼精蛋白/羧甲基淀粉钠质量比对鱼精蛋白包封率的影响、不同组装时间对鱼精蛋白包封率的影响、不同组装温度对鱼精蛋白包封率的影响，具体分析结果如下：
(1)不同鱼精蛋白/羧甲基淀粉钠质量比对鱼精蛋白包封率的影响
根据图5可以得到，鱼精蛋白/CMS质量比对鱼精蛋白包封率的影响趋势是逐渐增加直至达到100％，在质量比小于等于1/4之后的一层组装物都具有最大包封率。
图6是不同鱼精蛋白/CMS质量比的一层组装物带电量情况。由图可知，质量比大于1/4的一层组装物带有很低的正电荷，可能是由于鱼精蛋白所带正电荷较高，掩盖了CMS带的负电荷；而质量比小于等于1/4的则带有较高的负电荷，并根据图5可知其包封率均达100％，因此均可作为一层组装物的质量比条件。但是其包封率达100％后，随着质量比的减小，其载药量必然减少。因此，可以选择鱼精蛋白/CMS质量比1/4作为制备一层组装物的最佳质量比条件。
(2)不同组装时间对鱼精蛋白包封率的影响
从图7可以得到，组装时间从0.5h增加至2h时，鱼精蛋白的包封率明显提高；但再随着组装时间的增加，其包封率的增加趋势变缓，这主要是因为组装时间的延长增加了鱼精蛋白和CMS分子的碰撞机率。理论上，只要时间足够，反应就可达到饱和，鱼精蛋白就能被完全包封在内；但是，为了提高效率，节约时间，可以选择组装时间2h为制备一层组装物的最佳时间。
(3)不同组装温度对鱼精蛋白包封率的影响
图8是组装温度对鱼精蛋白包封率的影响，由图可以得到，随着组装温度从常温25℃上升至55℃时，包封率逐渐减小。温度升至35℃时，鱼精蛋白包封率几乎没有变化；但温度再升至55℃时，出现明显下降趋势，这主要是因为组装温度较高，从而加快了两者分子运动速率，因而不利于分子结合，致使包封率降低。因此，选择组装温度25℃为制备一层组装物的最佳温度。
实施例2
二层组装物结果分析，包括zeta－电位和平均粒径分析和不同组装条件对鱼精蛋白包封率的影响；其中，zeta－电位和平均粒径分析包括：
(1)一层组装物的zeta－电位和平均粒径分析
图9和图10分别是不同pH条件下一层组装物的带电量和平均粒径情况。由图可知，pH大于3小于6的范围内，一层组装物均带负电荷，而且其带电荷量和粒径随着pH的增大而增加。pH在3-4范围内，鱼精蛋白和CMS分别带有较高的相反电荷，且鱼精蛋白粒径较小，具有较强相互作用而使之结构较紧密，一层组装物粒径较小。pH在5-6范围内，一层组装物粒径增加；pH＝5条件下，两者所带电荷均有所减小，且鱼精蛋白粒径增加，一层组装物结构可能有些松散而使之粒径增加；然而，pH大于5条件下，一层组装物因溶液环境改变，可能出现不稳定而溶胀松散的情况，发生重新聚集组装而使其粒径剧增的情况。
(2)季铵盐壳聚糖的zeta－电位分析
图11是不同pH条件下HACC的带电量情况。结果显示，在pH＝3-6的范围内，HACC均带有较高正电荷，且其电荷量随着pH值的增大呈现先增再减趋势，在pH＝4时具有最大值。pH值大于4时，其所带电荷量逐渐减少主要是因为氨基基团脱去了氢离子而减少了溶液中的NH3+。结合图9和10中一层组装物zeta－电位和粒径情况可知，在pH＝4时，HACC和一层组装物分别带有正负相反电荷且电荷量较大，并且一层组装物粒径较小，可能较稳定，可成为制备二层组装物的pH条件。
图12是不同HACC浓度的带电量情况。由图可知，HACC带电荷量自其浓度从0.5mg/mL升至1mg/mL时有明显的增加趋势，之后就稳定于50mV附近，所以浓度在1mg/mL以上均可成为后续制备二层组装物的HACC浓度条件。但是，HACC浓度越大，溶液黏性越强，这不仅导致溶液难以搅拌，而且对回收量有明显影响。因此，选取接近1mg/mL为制备二层组装物的HACC浓度条件。
不同组装条件对鱼精蛋白包封率的影响分析包括：
(1)季铵盐壳聚糖钠浓度对鱼精蛋白包封率的影响
从图13可以得到，大于1mg/mL的HACC浓度对包封率的影响较小，其包封率在76％左右，但是呈微减小的趋势。HACC浓度大于4mg/mL的溶液黏度较高，影响搅拌，因此并未测定其对包封率的影响。综上所述，可以选取1mg/mL为制备二层组装物的HACC浓度条件。
(2)不同一层组装物/季铵盐壳聚糖钠质量比对鱼精蛋白包封率的影响
根据图14可以得到，一层组装物/HACC质量比对鱼精蛋白包封率的影响趋势是先增再趋于平稳，但基本在75％左右浮动。
图15和16是不同一层组装物/HACC质量比的二层组装物带电量和平均粒径情况。从图中可以得知，二层组装物都带有较高的正电荷，且于质量比小于1/2时，其电位均高于25mV，均可成为制备二层组装物的条件；质量比小于1/6时可能因团聚而粒径突增，而质量比大于1/4时粒径较小，组装物结合较紧密，可成为制备二层组装物的条件。再根据图14不同质量比对鱼精蛋白包封率的影响可知，质量比小于1/2的包封率基本为75％，但质量比越小，鱼精蛋白载药量则越少。因此，选择质量比1/2作为制备二层组装物的最佳条件。
实施例3
组装微球效能的研究，包括：
(1)抗菌性能
材料的抑菌结果如图17所示，鱼精蛋白、HACC和二层组装物均具有抑菌性能。鱼精蛋白对革兰氏阴性菌大肠杆菌和革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌均具有明显的抑菌性能，其抑菌率均在85％以上。HACC虽然对枯草芽孢杆菌具有明显的抑菌性能，抑菌率为77.88％；但是，对于大肠杆菌它则有较弱的抑菌效果，其抑菌率只有43.51％。二层组装物由鱼精蛋白、CMS和HACC组成，因此对两种菌类均具有优异的抑菌性能，其抑菌率几乎为100％，为用于伤口治疗提供基本保障。
(2)凝血性能
材料的凝血结果如图18所示，可知鱼精蛋白、HACC以及二层组装物均具有凝血作用。鱼精蛋白凝血指数大于90％，凝血作用很弱，可能在此只是发挥了拮抗肝素抗凝血作用的作用。HACC的凝血指数为49.97％，凝血效果较鱼精蛋白好，可能是通过吸收血液中的水分子而增加了血细胞的浓度，进而发挥了凝血作用。鱼精蛋白+HACC组的凝血指数为24.02％，可能是两者凝血作用简单相加关系的体现。二层组装物的凝血指数为0％，明显小于鱼精蛋白+HACC组的凝血指数，凝血性能十分优异，这可能是材料制备成微球后，其表面孔隙更密集而增加了水分的吸收，同时其内在的鱼精蛋白也发挥作用，两者共同作用使其效果更显著。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优先实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。需要说明的是，在本文中，术语“包括”、“包含”或者其他任何其他变体意在涵盖非排他性地包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者还是包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施条例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.一种壳聚糖、鱼精蛋白抗菌止血微球，其特征在于：通过静电LbL制备一层组装物，包括鱼精蛋白与CMS，质量比为1:4，微球组装时间为2h，微球组装温度为常温25℃。
2.根据权利要求1所述的壳聚糖、鱼精蛋白抗菌止血微球，其特征在于：一层组装物制备的最适pH条件为3.0。
3.根据权利要求1所述的壳聚糖、鱼精蛋白抗菌止血微球，其特征在于：一层组装物制备的最适CMS浓度为3mg/mL。
4.根据权利要求1所述的壳聚糖、鱼精蛋白抗菌止血微球，其特征在于：通过静电LbL制备二层组装物，包括所述一层组装物和组装材料HACC，其中一层组装物与HACC质量比为1:2，二层微球组装时间为2h，二层微球组装温度为常温。
5.根据权利要求1所述的壳聚糖、鱼精蛋白抗菌止血微球，其特征在于：二层组装物制备的最适pH条件为4.0。
6.根据权利要求1所述的壳聚糖、鱼精蛋白抗菌止血微球，其特征在于：二层组装物制备的最适HACC浓度为1mg/mL。
7.一种权利要求1-3的壳聚糖、鱼精蛋白抗菌止血微球的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)准确称取一定质量的组装材料鱼精蛋白和CMS，分别加入pH＝3.0的溶液中溶解；
(2)将鱼精蛋白溶液缓慢滴加到CMS溶液中，在温度为25℃水浴中反应2h；
(3)组装完成后，取组装液于8000rpm的转速下离心10min；
(4)沉淀物用蒸馏水洗涤2次，得到的重悬液于8000rpm的转速下离心5min；无水乙醇洗涤1次，操作同上。
(5)组装物冷冻干燥12h以上，所得白色粉末即为一层组装物。
8.根据权利要求4所述的壳聚糖、鱼精蛋白抗菌止血微球的制备方法，其特征在于：在步骤(3)和(4)中分别取1mL上清液和洗涤液备用，取定量上清液和洗涤液，用BCA试剂盒法检测未组装的鱼精蛋白浓度以计算损失量。
9.根据权利要求4-6所述的壳聚糖、鱼精蛋白抗菌止血微球的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)准确称取一定质量的组装材料HACC和一层组装物，分别加入pH＝4.0的溶液中溶解；
(2)按不同质量比将一层组装物溶液缓慢滴加到HACC溶液中，在常温水浴中反应不同时间；
(3)反应完成后，取组装液于6000rpm的转速下离心5min；
(4)沉淀物用蒸馏水洗涤2次，得到的重悬液于6000rpm的转速下离心3min，丙酮洗涤1次，操作同上；
(5)组装物冷冻干燥12h以上，所得黄色粉末即为二层组装微球。
10.根据权利要求9所述的壳聚糖、鱼精蛋白抗菌止血微球的制备方法，其特征在于：在步骤(3)和(4)中分别取1mL上清液和洗涤液备用，取定量上清液和洗涤液，用BCA试剂盒法检测未组装的鱼精蛋白浓度以计算损失量。
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