CN104740672A - 一种壳聚糖纳米金粒子复合物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种壳聚糖纳米金粒子复合物及其制备方法和用途。上述壳聚糖纳米金粒子复合物的制备方法包括步骤：将含壳聚糖或其衍生物的溶液和氯金酸水溶液在40-70℃下混合、反应得到壳聚糖纳米金粒子复合物；所述壳聚糖或其衍生物与氯金酸水溶液的重量体积比为1：30-60。

Description

一种壳聚糖纳米金粒子复合物及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于生物材料技术领域，涉及一种壳聚糖或其衍生物的纳米金粒子复合材料的制备方法及用途。

背景技术

壳聚糖作为一种天然生物材料，由于其优良的生物相容性、无毒性、促细胞生长活性和可生物降解等特性，被广泛应用于在食品、医药、化妆品等领域。研究表明，壳聚糖有抗菌活性，其基本原理是通过在细菌体内吸附带阳离子的细胞质，干扰菌体代谢，阻断细菌对营养物质的吸收，从而实现其抗菌作用。然而，壳聚糖的抗菌性受分子量和pH值影响，寡聚糖和低分子量的壳聚糖的抑菌效果较好。同时，由于壳聚糖难溶于一般的有机溶剂和水中，其抗菌活性只在酸性溶液体系内显示出来，因而也限制了它的应用范围。而通过将壳聚糖分子进一步的化学改性，如将它羧甲基化、季铵化等，则可使其成为水溶性，而又不失其抗菌活性，应用范围大大增加。

据研究报道，壳聚糖或其衍生物对金属离子具有较强的鳌合作用，由于其分子中含有的大量-NH2、-OH、-COOH等，可以借氢键或离子键形成具有类似网状结构的笼形分子,从而对金属离子具有稳定的配位作用。

利用金、银、铜、锌等金属粒子具有一定的抗菌能力，可以通过物理吸附离子交换等方法，将银、铜、锌等金属粒子（或离子）固定在生物材料中而制成抗菌剂，或者将其加入到相应的制品中得到具有抗菌能力的材料。

纳米级胶体金粒子可以通过在氯金酸中加入柠檬酸钠、鞣酸、抗坏血酸、白磷、硼氢化钠等还原剂进行制备，被还原的单个金原子在一定条件下聚合形成一种纳米级的金粒子，再与其它高分子材料复合组成各种复合材料。杨秀荣等通过循环多次地将壳聚糖、纳米金粒子胶体一层层吸附沉积，制备了层层组装的壳聚糖-纳米金粒子复合材料。

由于纳米金粒子具有极好的稳定生物分子的能力,且能够保持被固定的生物分子的生物催化活性和电化学特性，被广泛应用于精密微量检测和生物传感器的研究应用。壳聚糖具有易成膜、pH敏感等特性,通过电沉积或表面修饰的方法制备的纳米金颗粒-壳聚糖复合膜,表现出特别的电化学特性，被用于精密生物和湿度传感器的制造。Aroca等将氯金酸与壳聚糖的乙酸溶液混合制备得到金纳米颗粒与壳聚糖的复合膜，用于罗丹明6G的痕量分析；陈强等在铂电极上沉积形成聚丙烯酸、纳米金粒子、壳聚糖的多层复合膜，制备了葡萄糖生物传感器。

多羟基和多氨基化合物可以作为弱还原剂制备金属纳米粒子，壳聚糖含有大量自由氨基和羟基，也可以用于还原氯金酸制备纳米金粒子。Zhu等把一定浓度下氯金酸和壳聚糖的稀乙酸溶液混合后于125℃油浴加热反应，得到金纳米颗粒组成的链状结构产物。Wei等加热氯金酸与壳聚糖的稀乙酸混合溶液制备了金纳米片。

目前，应用于医疗、化妆品领域的壳聚糖纳米金粒子复合物尚未见报道。

发明内容

本发明旨在提供一种壳聚糖纳米金粒子复合物。

本发明的另一个目的是提供上述壳聚糖纳米金粒子复合物的制备方法。

本发明的再一个目的是提供上述壳聚糖纳米金粒子复合物的用途。

在本发明的第一方面，提供了一种壳聚糖纳米金粒子复合物的制备方法，所述方法包括步骤：将含壳聚糖或其衍生物的溶液和氯金酸水溶液在40-70℃下混合、反应得到壳聚糖纳米金粒子复合物；

所述壳聚糖或其衍生物与氯金酸水溶液的重量体积比为1：30-60。

在另一优选例中，所述含壳聚糖或其衍生物的溶液包括将壳聚糖或其衍生物和稀乙酸溶液混合而得到的质量分数为1%-10%的溶液，和将壳聚糖衍生物和水混合而得到的质量分数为1%-10%的水溶液。

在另一优选例中，所述壳聚糖或其衍生物和稀乙酸溶液混合而得到的质量分数为1%-10%的溶液的pH大于等于5；更优选pH5-8。

在另一优选例中，所述壳聚糖包括如式Ⅰ所示的甲壳素、甲壳素脱乙酰基（脱乙酰度为75%-98%）而得到的如式Ⅱ所示的壳聚糖；所述壳聚糖衍生物包括羧甲基壳聚糖、羟丙基壳聚糖、三甲基壳聚糖、环糊精接枝壳聚糖、医用几丁糖；

其中n=70－7000的整数。

在另一优选例中，以所述氯金酸水溶液的总体积计，其中氯金酸的浓度为0.2－2m mol/L。

在另一优选例中，所述反应时间为3-6小时。

在另一优选例中，上述本发明提供的制备方法包括步骤：

（1）将含壳聚糖或其衍生物的溶液和氯金酸水溶液在40-70℃下混合、反应得到壳聚糖纳米金粒子复合物溶液；

（2）将壳聚糖纳米金粒子复合物溶液与甲醇和乙醇的混合液混合，过滤得到壳聚糖纳米金粒子复合物固体；

所述甲醇和乙醇的混合液与壳聚糖或其衍生物的体积重量比为40-400:1。

在本发明的第二方面，提供了一种如上所述的本发明提供的制备方法制备得到的壳聚糖纳米金粒子复合物。

在本发明的第三方面，提供了一种如上所述的本发明提供的壳聚糖纳米金粒子复合物的用途，用于制备医用辅料或化妆品。

在本发明的第四方面，提供了一种医用敷料或化妆品，以所述医用敷料或化妆品的总重量计，其中含有0.001-1%如上所述的本发明提供的壳聚糖纳米金粒子复合物。

据此，本发明提供了一种应用于医疗、化妆品领域的壳聚糖纳米金粒子复合物。

附图说明

图1显示了壳聚糖及其部分衍生物结构。

图2显示了壳聚糖纳米金粒子复合物复溶后透射电子显微镜检测时的照片，显示金粒子为纳米级（通常纳米级是指直径100纳米以下的颗粒）。

具体实施方式

发明人经过广泛而深入的研究，发现了一种制备壳聚糖纳米金粒子复合物的方法，并因此得到了一种抗菌活性优异的壳聚糖纳米金粒子复合物。在此基础上，完成了本发明。

如本文所用，“壳聚糖（chitosan）”是一种医学上称的多糖体的化合物，是一种无毒、无刺激、无免疫原及抗原性、生物相容性良好的生物材料。

本发明涉及的几种物质的结构式如下表所列：

其中，n=70-7000的整数，优选为700-5000，更优选为1000-2000。

如本文所用，“本发明提供的壳聚糖纳米金粒子复合物”、“本发明的壳聚糖纳米金粒子复合物”或“壳聚糖纳米金粒子复合物”可以互换使用，都是指一种具有还原性的壳聚糖及其衍生物还原出金粒子后又大量吸附在金粒子上形成纳米级颗粒，经有机溶剂纯化后制成的成份均一的粉末状复合物，可以复溶。

如本文所用，“医用敷料”是指临床上用以覆盖疮、伤口或其他损伤的医用材料。

本发明提供的壳聚糖纳米金粒子复合物通过下述方法制备得到：

第一步，将含壳聚糖或其衍生物的溶液和氯金酸水溶液在40-70℃下混合、反应得到壳聚糖纳米金粒子复合物反应溶液；

第二步，将壳聚糖纳米金粒子复合物反应溶液与甲醇和乙醇的混合液混合，过滤得到纯化的壳聚糖纳米金粒子复合物固体。

上述制备方法中，所述壳聚糖包括如式Ⅰ所示的甲壳素、甲壳素脱乙酰基（脱乙酰度为75%-98%）而得到的如式Ⅱ所示的壳聚糖；所述壳聚糖衍生物包括羧甲基壳聚糖、羟丙基壳聚糖、三甲基壳聚糖、环糊精接枝壳聚糖、医用几丁糖；

其中，n=70-7000的整数，优选为700-5000，更优选为1000-2000。

上述第一步中涉及的含壳聚糖或其衍生物的溶液中的壳聚糖或其衍生物不溶于水时，所述含壳聚糖或其衍生物的溶液需调节pH为5-8，优选为5-7，更优选为5-6，可以是：将壳聚糖或其衍生物和稀乙酸溶液混合而得到的质量分数为1%-10%的溶液，优选为1.5%-6%，更优选为2%-4%；其中以所述稀乙酸溶液的总体积计，乙酸浓度为0.5-2%，优选为0.8-1.5%，更优选为1%；

上述第一步中涉及的含壳聚糖或其衍生物的溶液中的壳聚糖或其衍生物溶于水时，无需调节pH值，可以是：将壳聚糖衍生物和水混合而得到的质量分数为1%-10%的水溶液，优选为1.5%-6%，更优选为2%-4%。

上述第一步中，以所述氯金酸水溶液的总体积计，氯金酸的浓度为0.2-2mmol/L，优选为0.3-1.5m mol/L，更优选为1m mol/L。

上述第一步中，所述壳聚糖或其衍生物与氯金酸水溶液的重量体积比为1:10-100，优选为1:20-80，更优选为1:30-50。（注：w/v=壳聚糖（g）：1m mol/L的氯金酸溶液（ml）之比）。

上述第一步中，所述优选在40-60℃下进行混合、反应，更优选在45-50℃下。所述反应进行3-6小时，更优选2-6小时。

上述第一步中的混合需缓慢，并搅拌。

上述方法中所述甲醇和乙醇的混合液与壳聚糖或其衍生物的体积重量比为40-400:1，优选为60-360:1，更优选为80-320:1。所述甲醇和乙醇的混合液中乙醇的体积占比为20%-90%，优选为40-70%，更优选为50%。

上述第二步中所述的过滤可依本领域的常规方法进行，例如但不限于，抽滤、真空干燥、喷雾干燥等，优选通过减压抽滤得到壳聚糖纳米金粒子复合物沉淀。

在本发明的一个优选实施例中，上述第二步中通过减压抽滤得到壳聚糖纳米金粒子复合物沉淀，用95%乙醇反复洗涤和减压抽滤三次，真空干燥得到本发明的壳聚糖纳米金粒子复合物。

本发明提供的壳聚糖纳米金粒子复合物可用于制备医用敷料和/或化妆品，发挥其抗菌、抑菌、促进细胞生长、和/或预防重度创伤患者休克等作用。

本发明将壳聚糖及其衍生物优异的生物相容性、促细胞生长活性和抗菌活性，与纳米金粒子的保持生物分子活性和抗菌活性有机结合，制备出适用于医疗和美容的壳聚糖金粒子复合物，在医疗和化妆品应用领域提供一种性能优异的新原料。

本发明还提供一种组合物，其中包括本发明提供的壳聚糖纳米金粒子复合物和医用原料或化妆品原料；以所述组合物的总重量计，其中的壳聚糖纳米金粒子复合物的重量百分比为0.001%-1%，优选为0.005%-0.5%，更优选为0.01%-0.05%。

该组合物可以通过下述方法制备得到：

将复溶的壳聚糖纳米金粒子复合物在室温条件下（10℃-25℃）缓慢加入液态或半固态流体医用敷料基质或化妆品基质里，搅拌均匀即可。所述化妆品基质可以是本领域常规使用的，例如但不限于化妆品膏霜、凝胶、乳液、啫喱等。

本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。

本发明的主要优点在于：

1、本发明提供的壳聚糖纳米金粒子复合物综合了壳聚糖和纳米金粒子的抗菌活性，其抗菌活性优于二者的叠加作用，表现出二者的协同抗菌效应。

2、采用少量本发明提供的壳聚糖纳米金粒子复合物可以作为医疗敷料和高端化妆品的添加剂替代其它药物或抗菌剂使用，发挥其优异的抗菌力强、抗菌谱广、安全性高及一定的医疗作用等优秀性能。

3、采用本发明提供的壳聚糖纳米金粒子复合物一方面降低致敏性，另一方面利用金本身的中医学功效，在重度创伤治疗中起到减轻患者休克发生等作用，具有广阔的应用潜力。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例、或份数按重量计。

本发明中的重量体积百分比中的单位是本领域技术人员所熟知的，例如是指在100毫升的溶液中溶质的重量。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1

1、称取脱乙酰度为90%的壳聚糖2.5克溶解于w＝1%的稀乙酸溶液250ml中，用0.1N NaOH溶液调整pH值至5或大于5。

2、将氯金酸溶解配制成1m mol/L的氯金酸水溶液100ml。

3、将上述1和2的溶液缓慢混合并搅拌，45℃水浴反应6小时。

4、将反应后溶液加入到800ml甲醇和乙醇混合液（1:1）中，减压抽滤后获取沉淀。

5、用95%乙醇洗涤沉淀和减压抽滤三次，真空干燥粉碎后密封保存。即得壳聚糖纳米金粒子复合物。

得到的壳聚糖纳米金粒子复合物参见附图2。

实施例2

1、称取羧甲基壳聚糖5克溶解于溶于250ml蒸馏水中。2、将氯金酸溶解配制成1mmol/L的氯金酸水溶液150ml。

3、将上述1和2的溶液缓慢混合并搅拌，50℃水浴反应5小时。

4、将反应后溶液加入到800ml甲醇和乙醇混合液（1:1）中，减压抽滤后获取沉淀。

5、用95%乙醇洗涤沉淀和减压抽滤三次，真空干燥粉碎后密封保存。即得羧甲基壳聚糖纳米金粒子复合物。

实施例3

1、称取医用几丁糖10克溶解于溶于250ml蒸馏水中。2、将氯金酸溶解配制成1mmol/L的氯金酸水溶液350ml。

3、将上述1和2的溶液缓慢混合并搅拌，45℃水浴反应3小时。

4、将反应后溶液加入到800ml甲醇和乙醇混合液（1:1）中，减压抽滤后获取沉淀。

5、用95%乙醇洗涤沉淀和减压抽滤三次，真空干燥粉碎后密封保存。即得几丁糖纳米金粒子复合物。

实施例4

称取按本发明方法获得的壳聚糖纳米金粒子复合物0.2克复溶后，加入美白保湿乳液200ml中缓慢搅拌溶解混匀，即得含壳聚糖/纳米金粒子复合物0.1%的化妆品。

实施例5

人表皮细胞、HSF细胞用含10%小牛血清，100U/ml青霉素和链霉素的DMEM培养基，置于37℃、5%CO₂的孵育箱内培养，每3天换培养基，实验用细胞选用对数期生长细胞。

将消化好的细胞用分别含有壳聚糖纳米金粒子复合物0.002%、0.004%、0.008%、0.016%、0.032%、0.064%（质量分数）的培养基稀释后移入96孔板，每孔200ul，并使每孔细胞数为1X10⁴个，37℃、5%CO₂的孵育箱内培养48小时后，在无菌吸水纸上拍净细胞板内培养基，加入MTT染色液（含MTT5%）各50ul，继续培养5个小时后取出，甩干孔内培养基后加10%SDS溶解液200μl/孔，在测定570nm吸光度值，观察复合物对细胞的影响。结果见表1。

表1壳聚糖纳米金粒子复合物对HSF细胞的影响

	壳聚糖纳米金粒子复合物浓度（%）	OD570nm
					0.064	0.811
	0.032	0.802
					0.016	0.765
	0.008	0.724
					0.004	0.689
	0.002	0.689
					0(对照)	0.677

表1数据显示了壳聚糖纳米金粒子复合物在一定浓度范围内对HSF细胞增殖的促进作用。

实施例6

称取壳聚糖及其衍生物各1克，分别溶解在50ml1%醋酸（HAc）溶液中，制成浓度为2%的溶液。用琼脂培养基配成不同浓度的平板（pH为6.0），使其浓度分别为1.00%、0.500%、0.250%、0.100%、0.005%和0.0250%、0.010%，然后涂布接种0.2ml微生物种子液（D₆₃₀为0.68）。将平板置于恒37℃温箱中培养，观察菌的生长情况，每个质量浓度做3组平行试验，以培养72h时完全没有微生物生长为完全抑制。同时做溶剂空白对照。

抑制微生物活性试验观察：上述已接种菌的平板分别在12、24、36、48、60、72ｈ时观察记录微生物的生长情况，以平板上长出微生物所需时间长短判断抑菌活性的强弱，见表2。“-”表示无抑制微生物活性（在12ｈ时长出细菌和酵母，在24ｈ时长出霉菌），“+-”表示弱抑制微生物活性（12h后长出细菌和酵母，或者24h后长出霉菌），“+”表示完全抑制微生物活性（在72ｈ时未长出任何微生物）。

表2不同样品间体外抑菌实验结果对比

结果表明，壳聚糖络合了纳米金粒子后，大大强化了其抗菌性能，极低的浓度下即可达到良好的抗菌效果。

与常用抗菌素类药物相比，这种复合物很难使细菌生成耐药性，同时该复合物显示了其优异的保湿、促细胞生长、增进组织修复等效用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。

Claims (10)

1.一种壳聚糖纳米金粒子复合物的制备方法，其特征在于，所述方法包括步骤：将含壳聚糖或其衍生物的溶液和氯金酸水溶液在40-70℃下混合、反应得到壳聚糖纳米金粒子复合物；

所述壳聚糖或其衍生物与氯金酸水溶液的重量体积比为1：30-60。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述含壳聚糖或其衍生物的溶液包括将壳聚糖或其衍生物和稀乙酸溶液混合而得到的质量分数为1%-10%的溶液，和将壳聚糖衍生物和水混合而得到的质量分数为1%-10%的水溶液。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述壳聚糖或其衍生物和稀乙酸溶液混合而得到的质量分数为1%-10%的溶液的pH大于等于5；优选pH5-8。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述壳聚糖包括如式Ⅰ所示的甲壳素、甲壳素脱乙酰基（脱乙酰度为75%-98%）而得到的如式Ⅱ所示的壳聚糖；所述壳聚糖衍生物包括羧甲基壳聚糖、羟丙基壳聚糖、三甲基壳聚糖、环糊精接枝壳聚糖、医用几丁糖；

其中n=70－7000的整数。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，以所述氯金酸水溶液的总体积计，其中氯金酸的浓度为0.2－2m mol/L。

6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述反应时间为3-6小时。

7.如权利要求1-6任一项所述的制备方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

（1）将含壳聚糖或其衍生物的溶液和氯金酸水溶液在40-70℃下混合、反应得到壳聚糖纳米金粒子复合物溶液；

（2）将壳聚糖纳米金粒子复合物溶液与甲醇和乙醇的混合液混合，过滤得到壳聚糖纳米金粒子复合物固体；

所述甲醇和乙醇的混合液与壳聚糖或其衍生物的体积重量比为40-400:1。

8.一种如权利要求1-7任一项所述的制备方法制备得到的壳聚糖纳米金粒子复合物。

9.一种如权利要求8所述的壳聚糖纳米金粒子复合物的用途，其特征在于，用于制备医用辅料或化妆品。

10.一种医用敷料或化妆品，以所述医用敷料或化妆品的总重量计，其中含有0.001-1%如权利要求8所述的壳聚糖纳米金粒子复合物。