CN107595878A - 一种壳聚糖‑植酸钠纳米颗粒及其制备方法和抑菌剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种壳聚糖‑植酸钠纳米颗粒及其制备方法和抑菌剂，属于纳米材料技术领域。本发明提供了一种壳聚糖‑植酸钠纳米颗粒的制备方法，将壳聚糖和植酸钠为原料，植酸钠结构中的六个磷酸基团与壳聚糖表面的游离氨基发生分子间或分子内静电作用交联而得到壳聚糖‑植酸钠纳米颗粒，对细胞无毒性。本发明提供的壳聚糖‑植酸钠纳米颗粒，粒径为50～150nm，所述纳米颗粒的尺寸小，与壳聚糖‑三聚磷酸钠纳米颗粒相比稳定性更高，同时纳米颗粒小有利于增加其对细菌的附着力，有效破坏细胞壁和细胞膜，使细菌的内容物释放，可用于制备抑菌效果较好的抑菌剂。

Description

一种壳聚糖-植酸钠纳米颗粒及其制备方法和抑菌剂

技术领域

本发明属于纳米材料技术领域，具体涉及一种壳聚糖-植酸钠纳米颗粒及其制备方法和抑菌剂。

背景技术

随着生活水平的提高，大众对食品的要求也渐渐提高，安全无毒可降解的材料的需求也越来越大。壳聚糖是一种安全、无毒，自然界唯一带正电的碱性多糖，其具有生物相容性、安全性、促进伤口愈合、血液相容性等的优点。同时，壳聚糖有很高的抗菌性，能减少细菌感染食品的可能性，使得壳聚糖具有保鲜效果。因此，壳聚糖已经普遍被应用于食品、生物医学、制药领域。例如，在工业中壳聚糖可以作为黏结剂、稳定剂、胶凝剂、防霉剂等，用于制作腌制品、焙烤制品、面包等；还用作保健品添加剂，起到调节血脂、提高免疫力、调节血糖及排除体内有害物质的作用；在化妆品领域，尤其是护发素、发胶、香水、晚露、口红等。由此可见，壳聚糖在工业生产中具有广泛的应用。

壳聚糖纳米颗粒可以作为药物、基因传递和控制载体，因为壳聚糖具有良好的生物粘附性、促进吸收和酶抑制载体等特性，作为一种新载体成为国内外研究的热点。然而目前大部分的壳聚糖纳米颗粒，都是壳聚糖与三聚磷酸钠通过离子交联法制备得到的，但是三聚磷酸钠是一种化学合成的无机物，会刺激皮肤和粘膜(Madsen,T.；Boyd,H.B.；Nylén,D.(1988).Environmental and health assessment of substances in householddetergents and cosmetic detergent products.Danish Environmental ProtectionAgency.)，不利于壳聚糖纳米颗粒的广泛应用。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种对人体无毒害的壳聚糖-植酸钠纳米颗粒及其制备方法和抑菌剂，制备得到的纳米颗粒生物相容性较好。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种壳聚糖-植酸钠纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：

1)将壳聚糖溶解于酸溶液中，得到壳聚糖溶液；酸溶液的pH值为2～5；

2)将植酸钠与纯水混合，得到植酸钠溶液；

3)将所述步骤2)得到的植酸钠溶液滴加到所述步骤1)得到的壳聚糖溶液中，在20～35℃条件下以200～400rpm的速度进行搅拌，得到壳聚糖-植酸钠纳米颗粒；所述植酸钠与壳聚糖的质量比为9:1～18:1；搅拌过程中壳聚糖溶液的pH值为3～5；

所述步骤1)和步骤2)没有时间顺序的限制。

优选的，所述步骤1)中壳聚糖溶液的质量浓度为1～5mg/mL。

优选的，所述步骤2)中植酸钠溶液的质量浓度为0.25～2mg/mL。

优选的，所述步骤3)中滴加的速度为1～3滴/s；所述每滴植酸钠溶液的体积为0.05～0.1mL。

优选的，所述步骤1)中酸溶液包括盐酸溶液、磷酸溶液或乙酸溶液。

优选的，所述步骤3)中搅拌的时间为6～12h。

优选的，所述步骤1)中壳聚糖脱乙酰度≥80％，壳聚糖的粘度≤400mPa.s。

本发明提供了所述方法制备的壳聚糖-植酸钠纳米颗粒，具有球形或椭球形结构，所述壳聚糖-植酸钠纳米颗粒的粒径为50～150nm。

本发明还提供了一种用于抑制细菌的抑菌剂，包括所述方法制备的壳聚糖-植酸钠纳米颗粒或所述的壳聚糖-植酸钠纳米颗粒和抑菌剂中可接受的辅料。

本发明提供了一种壳聚糖-植酸钠纳米颗粒的制备方法，以壳聚糖和植酸钠为原料，将植酸钠溶液滴加到壳聚糖溶液中，植酸钠结构中的六个磷酸基团与壳聚糖表面的游离氨基发生分子间或分子内静电作用交联而得到壳聚糖-植酸钠纳米颗粒。采用本发明所述方法制备得到的壳聚糖-植酸钠纳米颗粒对人体无毒害，生物相容性较好。植酸钠和壳聚糖-植酸钠纳米颗粒用于体外细胞实验，结果表明壳聚糖-植酸钠纳米颗粒与壳聚糖和植酸钠原料一样，均对细胞无毒性，实验处理后的细胞其活力均达到90％。而且本发明提供的制备方法，具有绿色、无污染的特点，并且制备方法简单，成本低。

本发明提供了一种壳聚糖-植酸钠纳米颗粒，粒径为50～150nm，所述纳米颗粒的尺寸小，与壳聚糖-三聚磷酸钠纳米颗粒相比稳定性更高，同时纳米颗粒小有利于增加其对细菌的附着力，有效破坏细胞壁和细胞膜，使细菌的内容物释放，提高其抗菌活性。而且壳聚糖和植酸钠均具有抑菌性，本发明提供的壳聚糖-植酸钠纳米颗粒在抑菌性能方面具有协同增效作用，可用于制备抑菌效果较好的抑菌剂。

附图说明

图1为实施例1制备的壳聚糖-植酸钠纳米颗粒的透射电镜图；

图2为实施例2制备的壳聚糖-植酸钠纳米颗粒的透射电镜图；

图3为实施例3制备的壳聚糖-植酸钠纳米颗粒的透射电镜图；

图4为实施例4制备的壳聚糖-植酸钠纳米颗粒的透射电镜图；

图5为实施例6中不同低粘度壳聚糖与植酸钠质量比制备的纳米颗粒的粒径变化；

图6为实施例6中不同中粘度壳聚糖与植酸钠质量比制备的纳米颗粒的粒径变化；

图7为实施例6中不同低粘度壳聚糖与植酸钠质量比制备的纳米颗粒的电位变化；

图8为实施例6中不同中粘度壳聚糖与植酸钠质量比制备的纳米颗粒的电位变化；

图9为实施例3制备的壳聚糖-植酸钠纳米颗粒随不同盐浓度变化的浊度分布图；

图10为实施例4制备的壳聚糖-植酸钠纳米颗粒随不同盐浓度变化的浊度分布图；

图11为实施例3制备的壳聚糖-植酸钠纳米颗粒随不同pH值变化的粒径大小图；

图12为实施例4制备的壳聚糖-植酸钠纳米颗粒随不同pH值变化的粒径大小图；

图13为实施例3制备的壳聚糖-植酸钠纳米颗粒随温度变化的粒径大小图；

图14为实施例4制备的壳聚糖-植酸钠纳米颗粒随温度变化的粒径大小图；

图15为实施例9中壳聚糖-植酸钠纳米颗粒对金黄色葡萄球菌的抑菌率；

图16为实施例9中壳聚糖-植酸钠纳米颗粒对大肠杆菌的抑菌率；

图17为实施例10低粘度壳聚糖、植酸钠和低粘度壳聚糖-植酸钠纳米颗粒的细胞活性；

图18为实施例10中粘度壳聚糖和中粘度壳聚糖-植酸钠纳米颗粒的细胞活性。

具体实施方式

本发明提供了一种壳聚糖-植酸钠纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：

1)将壳聚糖溶解于酸溶液中，得到壳聚糖溶液；酸溶液的pH值为2～5；

2)将植酸钠与纯水混合，得到植酸钠溶液；

3)将所述步骤2)得到的植酸钠溶液滴加到所述步骤1)得到的壳聚糖溶液中，在20～35℃条件下以200～400rpm的速度进行搅拌，得到壳聚糖-植酸钠纳米颗粒；所述植酸钠与壳聚糖的质量比为9:1～18:1；搅拌过程中壳聚糖溶液的pH值为3～5；

所述步骤1)和步骤2)没有时间顺序的限制。

本发明将壳聚糖溶解于酸溶液中，得到壳聚糖溶液；酸溶液的pH值为2～5。

本发明中，所述壳聚糖的脱乙酰度优选≥80％，更优选为≥90％。所述壳聚糖的粘度优选≤400mPa.s，更优选为200mPa.s。本发明对所述壳聚糖的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的壳聚糖即可。

本发明中，所述酸溶液的pH值优选为3～4。所述酸溶液优选包括盐酸溶液或乙酸溶液。所述盐酸溶液的体积浓度优选为0.8～3％，更优选为1％。所述乙酸溶液的体积浓度优选为0.2％～0.4％，更优选为0.3％。本发明中，所述酸溶液的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的酸溶液的来源即可。

本发明中，所述溶解的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的溶解方法即可。所述壳聚糖溶液的质量浓度优选为1～5mg/mL，更优选为2～4mg/mL，最优选为3mg/mL。

本发明将植酸钠与纯水混合，得到植酸钠溶液。

本发明中，所述混合的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的混合方法即可。

本发明中，植酸钠溶液的质量浓度优选为0.25～2mg/mL，更优选为0.5～1.5mg/mL，最优选为1.0mg/mL。

得到植酸钠溶液和壳聚糖溶液后，本发明将所述植酸钠溶液滴加到所述壳聚糖溶液中，在20～35℃条件下以200～400rpm的速度进行搅拌，得到壳聚糖-植酸钠纳米颗粒；所述植酸钠与壳聚糖的质量比为9:1～18:1；搅拌过程中壳聚糖溶液的pH值为3～5。

本发明中，滴加的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的滴加方法即可。所述滴加的速度优选为1～3滴/s，更优选为2滴/s；所述每滴植酸钠溶液的体积优选为0.05～0.1mL，更优选为0.08mL。

本发明中，所述搅拌的温度优选为25～30℃，更优选为28℃。所述搅拌的速度优选为250～350rpm，更优选为300rpm。所述搅拌的时间优选为6～12h，更优选为8～10h，最优选为9h。

本发明中，所述植酸钠与壳聚糖的质量比为9:1～18:1，优选为12～15:1，更优选为14:1。搅拌过程中壳聚糖溶液的pH值为3～5，优选为3.5～4.5。所述调整pH值的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的调整pH值的方法即可。

所述搅拌后，本发明优选将得到的物料进行固液分离，将所述固液分离得到的固体物料洗涤和真空冷冻干燥，得到壳聚糖-植酸钠纳米颗粒。

本发明中，所述固液分离优选为离心。所述离心的转速优选为10000～15000rpm，更优选为12000rpm。所述离心的时间优选为10～20min，更优选为15min。所述离心的温度优选为20～30℃，更优选为25℃。

所述固液分离后，收集沉淀，将所述沉淀进行洗涤。

本发明中，所述洗涤的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的洗涤方法即可。本发明实施例中，水洗的方式为：向沉淀中加入洗涤剂，将沉淀旋起。所述洗涤剂优选为去离子水。所述洗涤的次数优选为2～3次。

得到洗涤后的沉淀后，本发明将所述沉淀冻干。

本发明中，所述冻干的真空度优选为5～10Pa，更优选为8Pa。冻干的温度优选为-80～-60℃，更优选为-70℃。冻干的时间优选为48～72h，更优选为56h。

本发明提供了上述技术方案制备的壳聚糖-植酸钠纳米颗粒，具有球形或椭球形结构，所述球状的壳聚糖-植酸钠纳米颗粒的粒径为50～150nm；椭球形纳米颗粒的长轴为150～200nm，短轴为80-150nm。针对低粘度壳聚糖，当壳聚糖溶液的浓度不超过3mg/ml时，壳聚糖-植酸钠纳米颗粒的直径约为30～80nm。浓度高于3mg/ml后，纳米颗粒的形态多为椭圆形；当植酸钠溶液的浓度为1mg/ml时，纳米粒子的粒径在20～80纳米范围之间。然而，浓度低于或高于1mg/ml，所形成的纳米粒子的大小约为100～150纳米。然而，对于中粘度壳聚糖，纳米颗粒的粒径大小为80～100nm，当植酸钠的浓度为1mg/ml时，纳米粒子的粒径50纳米左右，低于或高于此浓度，所形成的纳米粒子的大小约为100～200纳米。

本发明还提供了一种用于抑制细菌的抑菌剂，包括所述方法制备的壳聚糖-植酸钠纳米颗粒或所述的壳聚糖-植酸钠纳米颗粒和抑菌剂中可接受的辅料。

本发明中，所述抑菌剂中可接受的辅料采用本领域常规的辅料即可。纳米颗粒和辅料的质量比优选为常规方法进行配比。

所述抑菌剂的用法：配成溶液直接添加或涂抹用和有效浓度6～24mg/mL。

下面结合实施例对本发明提供的一种壳聚糖-植酸钠纳米颗粒及其制备方法和抑菌剂进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

按照如下步骤制备壳聚糖-植酸钠纳米颗粒：

(1)壳聚糖溶液的制备：首先配制1％(v/v)乙酸溶液，再将低粘度壳聚糖(分子量200mPa.s)粉末溶于的乙酸溶液中，配制1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL和4mg/mL的壳聚糖溶液，搅拌过夜溶解，搅拌温度为25℃，搅拌速率为200rpm，得到壳聚糖溶液；

(2)植酸钠溶液的制备：将植酸钠粉末溶于纯水中，配制质量体积比为1.0mg/mL的植酸钠溶液；

(3)壳聚糖-植酸钠纳米颗粒的制备：首先将上步骤得到的植酸钠溶液，按照植酸钠与壳聚糖的质量比为12:1，将植酸钠逐滴滴加到上步骤得到的壳聚糖溶液中，滴加过程用0.1M的盐酸或氢氧化钠将pH调到3，在25℃持续搅拌6h，搅拌结束后，将悬浮液在12000rpm条件下离心10min，去除上清液，取沉淀，用去离子水洗涤三次，再离心10min，得到沉淀，将沉淀在10Pa、-70℃下冻干60小时冻干得到壳聚糖-植酸钠纳米颗粒粉末。

实施例2

按照如下步骤制备壳聚糖-植酸钠纳米颗粒：

(1)壳聚糖溶液的制备：首先配制0.4％(v/v)乙酸溶液，再将中粘度壳聚糖(分子量400mPa.s)粉末溶于的乙酸溶液中，配制1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL和4mg/mL的壳聚糖溶液，搅拌过夜溶解，搅拌温度为25℃，搅拌速率为400rpm，得到壳聚糖溶液；

(2)植酸钠溶液的制备：将植酸钠粉末溶于蒸馏水中，配制质量体积比为2mg/mL的植酸钠溶液；

(3)壳聚糖-植酸钠纳米颗粒的制备：首先将上步骤得到的植酸钠溶液，按照植酸钠与壳聚糖的质量比为15:1，将植酸钠逐滴滴加到上步骤得到的壳聚糖溶液中，滴加过程中用0.1M的盐酸或氢氧化钠将pH调到4，在30℃持续搅拌12h，搅拌结束后，将悬浮液在10000rpm条件下离心15min，去除上清液，取沉淀，用去离子水洗涤三次，再离心15min，得到沉淀，将沉淀在5Pa、-60℃下冻干72小时冻干得到壳聚糖-植酸钠纳米颗粒粉末。

实施例3

按照如下步骤制备壳聚糖-植酸钠纳米颗粒：

(1)壳聚糖溶液的制备：首先配制0.2％(v/v)乙酸溶液，再将低粘度壳聚糖(分子量300mPa.s)粉末溶于的乙酸溶液中，配制3mg/mL的壳聚糖溶液，搅拌过夜溶解，搅拌温度为25℃，搅拌速率为200rpm，得到壳聚糖溶液；

(2)植酸钠溶液的制备：将植酸钠粉末溶于蒸馏水中，配制质量体积比为0.25mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL的植酸钠溶液；

(3)壳聚糖-植酸钠纳米颗粒的制备：首先将上步骤得到的植酸钠溶液，按照植酸钠与壳聚糖的质量比为12:1，将植酸钠逐滴滴加到上步骤得到的壳聚糖溶液中，滴加完后用0.1M的盐酸或氢氧化钠将pH调到3，在25℃持续搅拌6h，搅拌结束后，将悬浮液在12000rpm条件下离心10min,去除上清液，取沉淀，用去离子水洗涤三次，再离心10min，得到沉淀，将沉淀在10Pa、-70℃下冻干60小时冻干得到壳聚糖-植酸钠纳米颗粒粉末。

实施例4

按照如下步骤制备壳聚糖-植酸钠纳米颗粒：

(1)壳聚糖溶液的制备：首先配制0.4％(v/v)乙酸溶液，再将中粘度壳聚糖(分子量200mPa.s)粉末溶于的乙酸溶液中，配制3mg/mL的壳聚糖溶液，搅拌过夜溶解，搅拌温度为25℃，搅拌速率为400rpm，得到壳聚糖溶液；

(2)植酸钠溶液的制备：将植酸钠粉末溶于蒸馏水中，配制质量体积比为0.5mg/mL的植酸钠溶液；

(3)壳聚糖-植酸钠纳米颗粒的制备：首先将上步骤得到的植酸钠溶液，按照植酸钠与壳聚糖的质量比为9:1，将植酸钠逐滴滴加到上步骤得到的壳聚糖溶液中，滴加完后用0.1M的盐酸或氢氧化钠将pH调到4，在30℃持续搅拌12h，搅拌结束后，将悬浮液在10000rpm条件下离心15min，去除上清液，取沉淀，用去离子水洗涤三次，再离心15min，得到沉淀，将沉淀在5Pa、-60℃下冻干72小时冻干得到壳聚糖-植酸钠纳米颗粒粉末。

实施例5

实施例1～4所制备的壳聚糖-植酸钠纳米颗粒的大小及形态

将实施例1～4制得的壳聚糖-植酸钠纳米颗粒悬浮液，滴于带有碳支持膜的铜网上，再将铜网按照上述实施例4的冷冻干燥方法进行冷冻干燥测定。

图1为实施例1中不同浓度的壳聚糖(1～4mg/ml)和植酸钠制备的壳聚糖-植酸钠纳米颗粒的透射图。图1中的A部分代表浓度为1mg/ml的纳米颗粒，B部分代表浓度为2mg/ml的纳米颗粒，C部分代表浓度为3mg/ml的纳米颗粒，D部分代表浓度为4mg/ml的纳米颗粒，壳聚糖-植酸钠纳米颗粒形态为球形。当壳聚糖溶液的浓度不超过3mg/ml时，壳聚糖-植酸钠纳米颗粒的直径约为30～80nm。浓度高于3mg/ml后，纳米颗粒的形态多为椭圆形，且直径随壳聚糖溶液浓度的增加而增加。

图2为实施例2中不同浓度的壳聚糖(1～4mg/ml)和植酸钠制备的壳聚糖-植酸钠纳米颗粒的透射图。图2中的A部分代表浓度为1mg/ml的纳米颗粒，B部分代表浓度为2mg/ml的纳米颗粒，C部分代表浓度为3mg/ml的纳米颗粒，D部分代表浓度为4mg/ml的纳米颗粒，纳米颗粒的粒径大小为80～100nm，而且随壳聚糖含量的增加颗粒更加密实。

图3为实施例3壳聚糖和不同浓度的植酸钠(0.25～1mg/ml)制备的壳聚糖-植酸钠纳米颗粒的透射图。图3中的A部分代表浓度为0.25mg/ml的纳米颗粒，B部分代表浓度为0.5mg/ml的纳米颗粒，C部分代表浓度为1mg/ml的纳米颗粒，D部分代表浓度为2mg/ml的纳米颗粒，当植酸钠溶液的浓度为1mg/ml时，纳米粒子的粒径是最小的，在20～80纳米范围之间。然而，浓度低于或高于1mg/ml，所形成的纳米粒子的大小约为100～150纳米。

图4为实施例4壳聚糖和不同浓度的植酸钠(0.25～2mg/ml)制备的壳聚糖-植酸钠纳米颗粒的透射图。图4中的A部分代表浓度为0.25mg/ml的纳米颗粒，B部分代表浓度为0.5mg/ml的纳米颗粒，C部分代表浓度为1mg/ml的纳米颗粒，D部分代表浓度为2mg/ml的纳米颗粒。同样，当植酸钠的浓度为1mg/ml时，纳米粒子的粒径是最小的(50纳米左右)、最致密。然而，低于或高于此浓度，所形成的纳米粒子的大小约为100～200纳米。

实施例6

壳聚糖-植酸钠纳米颗粒激光动态光散射粒径和电位图

采用马尔文粒度仪仪器测定激光动态光散射粒径和电位图。

图5和6分别将实施例1和2中浓度为3mg/mL壳聚糖与植酸钠按照一定质量比例9:1～27:1制得的壳聚糖-植酸钠纳米颗粒分散在超纯水中测定激光动态光散射粒径图，分散在超纯水中的浓度是0.05％。如图5可见，当壳聚糖与植酸钠的质量比为24:1时，壳聚糖-植酸钠纳米颗粒的平均粒径最小为220nm。如图6可见，壳聚糖与植酸钠的质量比为21:1时，壳聚糖-植酸钠纳米颗粒的平均粒径最小为250nm。

图7和8分别为实施例1和2中浓度为3mg/mL壳聚糖与植酸钠按照一定质量比例9:1-27:1制得的壳聚糖-植酸钠纳米颗粒分散在超纯水中测定激光动态光散射电位图。如图7可见，随着壳聚糖与植酸钠的质量比的增加，壳聚糖-植酸钠纳米颗粒电位不断增加；当壳聚糖与植酸钠的质量比为24:1时，电荷为+62.5mV。如图8可见，也是随着壳聚糖与植酸钠的质量比的增加，壳聚糖-植酸钠纳米颗粒电位不断增加；当壳聚糖与植酸钠的质量比为21:1时，电荷为+58.5mV。纳米颗粒抑菌机理之一就是带正电核的纳米颗粒与带负电荷的细菌细胞膜发生静电作用，是细菌细胞膜破坏，导致内容物泄漏，从而起到抑菌作用。因此，纳米颗粒所带正电荷越多，与细菌作用就越好，杀菌效果会越好。

实施例7

壳聚糖-植酸钠纳米颗粒敏感环境(盐离子、pH、温度)稳定性测试：

①将实施例3和4中植酸钠浓度为1mg/mL得到的壳聚糖-植酸钠纳米颗粒干粉分别分散在盐浓度为0、10、50、100、250和500mM的pH＝7.4磷酸缓冲体系中，配制成1mg/mL的溶液，37℃搅拌0.5h，冷却至室温。观察纳米颗粒浊度变化。如图9和10所示，随着盐浓度的增加，浊度是逐渐降低的，表明随着盐离子的增加，纳米颗粒中的壳聚糖和植酸钠之间的静电作用逐渐削弱。

②将实施例3和4中植酸钠浓度为1mg/mL得到的壳聚糖-植酸钠纳米颗粒干粉分别分散在pH值为3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0和7.0的1M磷酸缓冲体系中，配制成1mg/mL的溶液，37℃搅拌0.5h，冷却至室温。观察纳米颗粒粒径变化。实施例3制备的壳聚糖-植酸钠纳米颗粒的耐pH值稳定性测试结果如图11所示，随着pH值增加纳米颗粒粒径也增加，酸性条件下纳米颗粒粒径最小，当pH＝3.5，粒径最小为190nm。实施例4制备的壳聚糖-植酸钠纳米颗粒的耐pH值稳定性测试结果如图12所示，随着pH值增加纳米颗粒粒径也增加，pH＝3.5时，粒径为200nm，粒径相对增加。表明壳聚糖-植酸钠纳米颗粒在酸性条件下较稳定，碱性条件下不稳定。

③将实施例3和4中植酸钠浓度为1mg/mL得到的壳聚糖-植酸钠纳米颗粒干粉分别分散在温度为0、25、60、80和100℃的1M磷酸缓冲体系中，配制成1mg/mL的溶液，37℃搅拌0.5h，冷却至室温。观察纳米颗粒粒径变化。如图13～14所示，随着温度增加纳米颗粒粒径变化不是很明显，表明纳米颗粒有强的耐高温性。

实施例8

壳聚糖-TPP纳米颗粒抑菌性测试

将壳聚糖-TPP纳米颗粒配制一系列浓度(0.009％-0.15％w/v)，将菌液接种于新鲜肉汤中，浓度为1×10⁵CFU/mL。向菌悬液LB肉汤培养基中加入不同浓度的壳聚糖-TPP纳米颗粒，在28℃(假单胞菌和欧文氏杆菌)和37℃(大肠杆菌)下培养24h。在紫外分光光度仪下测定600nm处的吸光度。

壳聚糖-植酸钠纳米颗粒抑菌性测试

将壳聚糖(3mg/mL)、植酸钠(1mg/mL)、实施例1和2壳聚糖为3mg/mL制备的壳聚糖-植酸钠纳米颗粒配制一系列的浓度，分别为0、0.375、0.75、1.5、3、6、12和24mg/mL。将金黄色葡萄球菌和大肠杆菌菌种接种于新鲜肉汤中，浓度为1×10⁶CFU/mL。向菌悬液LB肉汤培养基中加入不同浓度的壳聚糖、植酸钠、壳聚糖纳米颗粒，在37℃下培养24h。在紫外分光光度仪下测定600nm处的吸光度，计算抑菌率。结果如图15和16所示。

图15分别为纳米颗粒对金黄色葡萄球菌抑菌图，随着溶液浓度增加，样品的抑菌率均增加。其中低粘度壳聚糖抑菌率最高达到68.80±0.85％，中粘度壳聚糖为70.99±0.28％，植酸钠为66.61±0.74％，低粘度壳聚糖-植酸钠纳米颗粒为100±0.98％，中粘度壳聚糖-植酸钠纳米颗粒98.48±0.35％；

图16为纳米颗粒对大肠杆菌抑菌率图，随着溶液浓度增加，所有测试样品抑菌率也都增加。其中低粘度壳聚糖抑菌率最高达到70.87±0.28％，中粘度壳聚糖为68.28±0.99％，植酸钠为66.02±0.85，低粘度壳聚糖-植酸钠纳米颗粒为100±0.49％，中粘度壳聚糖-植酸钠纳米颗粒96.60±0.45％。对于四组样品，植酸钠的抗菌活性明显弱于壳聚糖；与纯壳聚糖和植酸钠溶液相比，壳聚糖-植酸钠纳米颗粒的抗菌活性最强，且低粘度壳聚糖-植酸钠纳米颗粒比中壳聚糖-植酸钠纳米颗粒抑菌活性更强。因此，测试样品的抗菌活性顺序为低粘度壳聚糖-植酸钠纳米颗粒>中粘度壳聚糖-植酸钠纳米颗粒>壳聚糖>植酸钠。此外，壳聚糖-植酸钠纳米颗粒对大肠杆菌的抑制效果比对金黄色葡萄球菌要强，这表明壳聚糖-植酸钠纳米颗粒对阴性菌抑制效果比对阳性菌更好。

实施例9

壳聚糖-植酸钠纳米颗粒体外细胞毒性测试

壳聚糖，植酸钠和壳聚糖-植酸钠纳米颗粒的体外细胞毒性采用MTT法测定，将细胞培养基中的小鼠正常肝细胞(AML-12)分别培养在96孔的细胞培养板上培养24-36h。再分别取100mL的壳聚糖，植酸钠和壳聚糖-植酸钠纳米颗粒(浓度为0、25、50、75、100、125和150μg/mL)于细胞培养板上37℃培养24h(5％CO₂环境)。将100μLMTT溶液(5mg/mL)加到细胞培养板上进一步在37℃培养4h。通过测得570nm处吸光度值来判断活细胞数量，计算细胞活性。

结果如图17和18所示。如图17和18所示，所有样品的细胞活性都达到90％以上，高者能达到100％。因此，本发明提供的壳聚糖-植酸钠纳米颗粒与壳聚糖和植酸钠一样，均没有细胞毒性，对人体没有任何伤害和副作用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种壳聚糖-植酸钠纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：

1)将壳聚糖溶解于酸溶液中，得到壳聚糖溶液；所述酸溶液的pH值为2～5；

2)将植酸钠与纯水混合，得到植酸钠溶液；

3)将所述步骤2)得到的植酸钠溶液滴加到所述步骤1)得到的壳聚糖溶液中，在20～35℃条件下以200～400rpm的速度进行搅拌，得到壳聚糖-植酸钠纳米颗粒；所述植酸钠与壳聚糖的质量比为9:1～18:1；搅拌过程中壳聚糖溶液的pH值为3～5；

所述步骤1)和步骤2)没有时间顺序的限制。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中壳聚糖溶液的质量浓度为1～5mg/mL。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中植酸钠溶液的质量浓度为0.25～2mg/mL。

4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3)中滴加的速度为1～3滴/s；每滴植酸钠溶液的体积为0.05～0.1mL。

5.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中酸溶液包括盐酸溶液、磷酸溶液或乙酸溶液。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3)中搅拌的时间为6～12h。

7.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中壳聚糖脱乙酰度≥80％，壳聚糖的粘度≤400mPa.s。

8.权利要求1～8任意一项所述方法制备的壳聚糖-植酸钠纳米颗粒，具有球形或椭球形结构，所述壳聚糖-植酸钠纳米颗粒的粒径为50～150nm。

9.一种用于抑制细菌的抑菌剂，包括权利要求1～7任意一项所述方法制备的壳聚糖-植酸钠纳米颗粒或权利要求8所述的壳聚糖-植酸钠纳米颗粒和抑菌剂中可接受的辅料。