CN111920827B - 促组织愈合的复方缓释纳米粒的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种促组织愈合的复方缓释纳米粒的制备方法，包括以下步骤：配制浓度为(15±1)mg/mL茶多糖的三聚磷酸钠混合溶液；配制浓度为(6.0±0.5)mg/mL的季铵化壳聚糖水溶液；季铵化壳聚糖溶液(400±20)ml中加入PRP冻干粉6.0g，磁力搅拌，再滴加茶多糖三聚磷酸钠溶液(200±20)ml；滴加完成后，继续搅拌，得茶多糖和PRP的复方纳米粒混悬液。该复方缓释纳米粒具有对皮肤损伤后创面快速修复、组织再生、血管形成和血运恢复等作用。

Description

促组织愈合的复方缓释纳米粒的制备方法

技术领域

本发明涉及一种促组织愈合的复方缓释纳米粒的制备方法。

背景技术

皮肤伤害(包括压伤、挤伤、碾压等)为日常最常见的医学表皮损伤，尤其碾压造成的皮肤损伤在我国每年将近有2％人面临威胁，交通事故、地震等自然灾害所导致的每年约有500万人遭受不同程度的皮肤碾压损伤。皮肤伤害会造成皮肤组织血液循环障碍，组织瘀血、感染、坏死等病理性改变，往往造成损伤皮肤进一步感染、水电解质失衡等一系列病理生理学变化。因此损伤后的皮肤修复问题是各种表皮损伤发生后面临的最主要问题，尽早修复和保护损伤皮肤是解决这些伤害的根本任务。

现代研究发现，对于治疗及恢复皮肤损伤，能够快速重塑血液循环的各种药物、细胞因子或生长因子的使用具有重要意义，而病变组织的愈合需要多种细胞因子和生长因子的参与，采用缓释细胞因子和生长因子的制剂进行干预，能够显著促进受伤皮肤组织的愈合。因此，各种富含细胞因子或生长因子的制剂营运而生。有研究采用向敷料或皮下注射制剂中添加细胞生长因子等促进皮肤愈合，然而单纯增加一种或几种细胞因子往往活性并不显著，难以达到明显治疗效果。开发模拟生理模型的天然配比的细胞因子制剂来治疗损伤皮肤将会产生重要临床意义，而血小板浓缩制剂的临床使用为模拟并增强创面愈合的生理性过程提供了一种新的治疗干预途径。

富血小板血浆(PRP)是血小板浓缩制剂研究领域的一种最简单的富含各种生理性细胞因子和组织生长因子的一类血浆来源制剂，主要是将自身外周血中的血小板和细胞因子浓缩后获得的一种制剂，其中血小板浓度至少需达到生理全血的4倍。可依据常规的各类外周血血小板分离液试剂盒(例如大鼠外周血血小板分离液试剂盒、人外周血血小板分离液试剂盒)进行制备获得。富血小板血浆(PRP)于-65～-75℃干燥24～48h，即得到PRP(富血小板血浆)冻干粉。

大量现代生物治疗研究表明，血小板浓缩制剂对于治疗不同器官组织的修复愈合发挥了显著作用。有学者开展了PRP对膝关节骨性关节炎关节功能及疼痛的治疗作用，PRP可显著缓解膝关节疼痛，恢复运动功能。骨质疏松症是一类全身性骨骼组织微结构变化以及低骨量为特点的疾病，主要导致骨骼脆性增加，极易发生骨折，有研究指出PRP内含有大量细胞生长因子，能够有效加速骨细胞活化，进而实现骨缺损修复以及骨组织诱导再生。糖尿病足是一种重要的糖尿病并发症，主要由糖尿病引起的神经病变所导致的下肢足部深层次病理性改变，包括末梢神经感觉障碍及植物神经损害，下肢血管的病变(如动脉硬化)往往引起周围小动脉闭塞症，或皮肤微血管病变以及细菌感染所导致的足部疼病、足部溃疡及足坏疽等病变。常常由于缺血、神经病变和感染三种因素协同发生作用，从而足部病理难以愈合。有研究报道了采用自体PRP可促进创面修复，具有减轻创面疼痛，封闭保护创面，抑制局部细菌生长等特点。

茶多糖(Tea Polysacharide,TP)是我国主要传统饮料茶叶中极具开发价值的一种生理活性物质，具有调节血糖、调节血脂、抗氧化、抗辐射和提高机体免疫功能等作用，茶多糖主要由糖类、蛋白质和果胶组成，可作为功能保健食品用于糖尿病人、心脑血管病人的辅助治疗，开发前景广阔。近年来，许多研究证实体外实验和动物体内实验均显示出茶多糖是治疗糖尿病的一种有效活性成分，并通过减少葡萄糖吸收、抑制小肠淀粉酶和葡萄糖苷酶活性、改善胰岛素抵抗、增加糖耐量和降低血糖水平等途径发挥降血糖功能。有研究发现茶多糖能够显著抑制脂肪细胞增殖分化，并上调体内脂联素以激活蛋白激酶信号通路达到调控脂肪细胞因子目的，从而发挥茶多糖的降血脂活性。有学者开展了茶多糖抗凝和抗血栓活性研究，研究发现小鼠腹腔给予茶多糖后，凝血时间显著延长，并抑制家兔实验性血栓形成。茶多糖在体内和体外均有显著性的抗凝作用，并减少血小板数量，延长血凝，从而影响血栓形成。此外，茶多糖在抗氧化、清除自由基、提高机体免疫力以及抗射线辐射等方面均有研究的报道，说明茶多糖具有多种药理活性。

虽然富血小板血浆(PRP)和茶多糖具有多种生物活性优势，但是单独使用时均存在不足之处：

1、PRP虽然具有多种生物学活性，在临床前和临床研究方面PRP已经得到了多方面的应用，虽然PRP能够显著促进毛细血管生成和增加血液循环，但由于碾压导致受损的皮肤组织以及制备PRP过程中加入的其他物质加入的PRP制备所用异物，均对血液循环和血凝具有影响，从而导致是组织坏死，难以愈合。

2、茶多糖研究表明具有多种多样的生物学活性，具有调节血糖代谢、血脂代谢以及抗凝和抗氧化等药理学作用，但毕竟茶多糖属于茶叶提取物，属于天然活性产物，难以全面发挥毛细血管再生等功能。

因此，开发混合型PRP和茶多糖复方纳米颗粒制剂，充分发挥PRP生物制剂和茶多糖天然产物的药理学生物活性，对于深层次开发和利用茶多糖等“药食同源”类天然产物以及具有PRP生物药物具有重要意义。

201910135188.3告知了一种复方肌肤损伤再生修复剂，是以血浆高分子蛋白提取物、茶树根提取物和神经酰胺为主料，以冰片、聚乙二醇(4000-8000)、甘油、ε-多聚赖氨酸、卡波姆中的一种或多种为辅料制备而成；其中，血浆高分子蛋白提取物的占比为1.5-10％，茶树根提取物的占比为10-30％，神经酰胺的占比为0.05-0.2％；所述复方肌肤损伤再生修复剂为水剂、膏剂或冻干粉剂型。茶树根精制提取液中，总黄酮含量≥30％，茶多糖含量应≥10％。该专利告知：茶树根提取物中总黄酮、茶多糖等各种活性成分具备抗炎镇痛、修复体表溃疡，增强机体免疫力、改善局部血液循环等多种功能，可以有效辅助的发病机制复杂的慢性难愈合创面的再生修复。

血浆高分子蛋白提取物中的成分主要是血浆蛋白(包括清蛋白、球蛋白和纤维蛋白原等)，含有部分细胞因子；而富血小板血浆(PRP)中的成分主要是血小板；两者的主要功能不同；血浆高分子蛋白提取物主要是营养功能、参与机体的免疫功能，而富血小板血浆(PRP)主要是抗凝血、增加血液循环功能。茶树根提取物中的茶多酚类成分具有沉淀蛋白、血凝等副作用，存在着会大大削弱茶多糖的活性的可能性。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种促组织愈合的复方缓释纳米粒的制备方法；本发明的纳米粒可以在皮肤创面损伤修复方面发挥促进作用，从而起到皮肤损伤后创面快速修复等作用。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种促组织愈合的复方缓释纳米粒的制备方法，包括以下步骤：

1)、将茶多糖加入至浓度为(1.0±0.1)mg/mL的三聚磷酸钠溶液中，混合均匀，得浓度为(15±1)mg/mL茶多糖的三聚磷酸钠混合溶液；

2)、配制浓度为(6.0±0.5)mg/mL的季铵化壳聚糖水溶液；

3)、向步骤2)所得的季铵化壳聚糖溶液(400±20)ml中加入PRP(富血小板血浆)冻干粉6.0g，磁力搅拌；

4)、于搅拌条件下，取步骤1)中配制的茶多糖三聚磷酸钠溶液(200±20)ml滴加至步骤3)所得物中(滴加时间约为60～80分钟)；

滴加完成后，继续搅拌，得茶多糖和PRP的复方纳米粒混悬液(即，促组织愈合的复方缓释纳米粒)。

作为本发明的促组织愈合的复方缓释纳米粒的制备方法的改进：步骤2)中，先利用冰醋酸将水调节至pH为(5.0±0.5)，然后，加入季铵化壳聚糖，得浓度为(6.0±0.5)mg/mL的季铵化壳聚糖水溶液。

作为本发明的促组织愈合的复方缓释纳米粒的制备方法的进一步改进：将茶多糖和PRP的复方纳米粒混悬液冷冻(-75℃)干燥至恒重，得冷冻干燥后的茶多糖和PRP复方纳米粒。

作为本发明的促组织愈合的复方缓释纳米粒的制备方法的进一步改进：

季铵化壳聚糖的分子量10～20万，纯度＞99％，取代度＞95％。

作为本发明的促组织愈合的复方缓释纳米粒的制备方法的进一步改进：所述步骤3)和步骤4)的搅拌时间均为20～40分钟。

在本发明中，三聚磷酸钠主要作为壳聚糖纳米粒的交联剂，季铵化壳聚糖作为纳米粒的包壁材料。PRP浓缩细胞因子的促血管生成作用与茶多糖的抗凝血、抗血栓功能相互协同，相辅相成。茶多糖的多羟基结构与壳聚糖羟基、氨基等基团发生氢键相互作用，尤其是茶多糖羟基负电荷与壳聚糖氨基的正电荷相互作用，有效促进壳聚糖纳米粒生成。本发明的季铵化壳聚糖纳米粒包载的PRP和茶多糖，具有显著缓释功能，在损伤部位逐步释放，从而不至于在局部迅速形成太高浓度，因此能降低副作用。

本发明在发明过程中，使用了如下的常规评价方法：

方法一、表皮生长因子(EGF)包封率

将6g的PRP冻干粉溶于一定量的PBS缓冲溶液中，进行磁力搅拌，使其全部溶解，然后根据大鼠血清中表皮生长因子ELISA试剂盒说明书，进行冻干粉溶于中表皮生长因子含量测定，并计算PRP冻干粉中表皮生长因子含量。

然后将一定体积的本发明制备的复方纳米粒混悬液用超速低温离心机在10000r/min下离心10min，将离心后得到的上清液根据ELISA试剂盒分析。计算包封率，包封率(％)＝{(PRP冻干粉中EGF含量—滤液中EGF含量)/冻干粉中EGF含量}×100％。备注说明：为了确保实验数据的相对正确性，重复后取平均值。

方法二、表皮生长因子(EGF)体外释放半衰期

将本发明的茶多糖和PRP的复方纳米粒混悬液冷冻(-75℃)干燥至恒重，得冷冻干燥后的PRP复方纳米粒(即，冷冻干燥后的茶多糖和PRP复方纳米粒)。

取6g冷冻干燥后的PRP复方纳米粒置于离心管中，向其中加入PBS缓冲液5mL，于37℃条件下静置，分别于0.5h、1h、2h、6h、12h、24h、72h、168h收集浸出液，并利用表皮生长因子试剂盒进行定量检测，根据释放时间(h)和释放量，计算不同处理组PRP复方纳米粒中表皮生长因子的释放半衰期(t1/2)。

说明：释放量的检测方法与上述冻干粉中表皮生长因子含量的检测方法。

方法三、大鼠皮肤损伤创面的修复

SPF级SD雄性大鼠购于杭州师范大学实验动物中心，合格证：SYXK(浙)2016-0014，体重200±20g，于实验前适应性养殖一周，实验方案学校伦理委员会审核批准。实验分为对照组和实验组，每组10只大鼠，实验组大鼠于实验前背部脱毛，将大鼠用水合氯醛麻醉后，用大鼠背部按照2*6cm制备大鼠皮瓣，并利用2.5kg的重量对游离皮瓣进行碾压，造成碾压伤，然后将大鼠缝合，同时大鼠适量肌肉注射抗生素(抗生素的用量为120万单位青霉素/只大鼠)，预防大鼠大鼠皮瓣感染。

大鼠皮肤创面缝合后，向皮瓣下面注入0.1mL复方纳米粒溶液，每天注射一次，连续注射3天，并每天观察伤口愈合情况(未愈合的创面会发黑和结痂)。根据伤口愈合情况，采用数码相机对创面进行拍照，比较创面恢复，并利用Image-Pro Plus6.0软件测算创面未愈合面积，计算创面愈合率。创面愈合率＝(创面初始面积—未愈合面积)÷创面初始面积×100％。

说明：创面初始面积，就是指最初手术所制备的皮瓣原始面积。

本发明促组织愈合的复方缓释纳米粒的制备方法，具有如下的技术优势：

(1)PRP浓缩细胞因子的促血管生成作用与茶多糖的抗凝血、抗血栓功能相互协同，相辅相成。

(2)茶多糖的多羟基结构与壳聚糖羟基、氨基等基团发生氢键相互作用，尤其是茶多糖羟基负电荷与壳聚糖氨基的正电荷相互作用，更加促进壳聚糖纳米粒生成。

(3)季铵化壳聚糖纳米粒包载的PRP和茶多糖，具有显著缓释功能，在损伤部位逐步释放，不至于在局部迅速形成太高浓度，降低副作用。

(4)、具有对皮肤损伤后创面快速修复、组织再生、血管形成和血运恢复等作用。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

茶多糖、季铵化壳聚糖等均可通过常规市购的方式获得。

PRP(富血小板血浆)可通过常规市购的方式获得；也可以通过已经分离至动物体/人体的血液，按照背景技术所述的现有技术进行制备；然后按照常规的冷冻方式(于-65～-75℃干燥24～48h)，即得到PRP(富血小板血浆)冻干粉。

实施例1、一种促组织愈合的复方缓释纳米粒的制备方法，包括以下步骤：

1)、准确称取茶多糖3.0g于圆底烧瓶中，向其中加入浓度为1.0mg/mL的三聚磷酸钠溶液定容至200mL，磁力搅拌，使其充分混合均匀，从而制备出浓度为15mg/mL茶多糖的三聚磷酸钠混合溶液200mL。

2)、先利用冰醋酸将水调节至pH约为5.0，然后，加入季铵化壳聚糖(分子量10-20万，纯度＞99％，取代度＞95％)，于25℃进行磁力搅拌，转速500r/min，直至季铵化壳聚糖全部溶解，得浓度为6.0mg/mL的季铵化壳聚糖水溶液400mL。

3)向步骤2)配制的季铵化壳聚糖溶液400mL中准确加入PRP(富血小板血浆)冻干粉6.0g，并于磁力搅拌器上搅拌30min，转速500r/min。

4)将步骤1)配制的全部的茶多糖三聚磷酸钠溶液(200mL)逐滴缓慢滴加至3)所得物中，滴加速度约为60滴/分钟，70分钟滴完，滴加过程中不停搅拌。

5)滴加完成后，反应体系于25℃温度下继续搅拌30min，即得茶多糖和PRP的复方纳米混悬液。

说明：通过透射电镜和纳米粒粒径分析仪可得知：该纳米粒的粒径约为185nm。

实施例2-1、一种促组织愈合的复方缓释纳米粒的制备：

将步骤1)中茶多糖和三聚磷酸钠溶液分别由3.0g和200mL改成6.0g和400mL；其余等同于实施例1。

实施例2-2、一种促组织愈合的复方缓释纳米粒的制备：

将步骤1)中茶多糖和三聚磷酸钠溶液分别由3.0g和200mL改成1.5g和100mL；其余等同于实施例1。

实施例2-3、一种促组织愈合的复方缓释纳米粒的制备：

将三聚磷酸钠改成六偏磷酸钠，其余等同于实施例1。

实施例3-1、一种促组织愈合的复方缓释纳米粒的制备：

将步骤3)中季铵化壳聚糖溶液体积由400mL改成800mL，其余等同于实施例1。

实施例3-2、一种促组织愈合的复方缓释纳米粒的制备：

将步骤3)中季铵化壳聚糖溶液体积由400mL改成200mL，其余等同于实施例1。

实施例3-3、一种促组织愈合的复方缓释纳米粒的制备：

将季铵化壳聚糖改成分子量100-200KD壳聚糖，用量不变；其余等同于实施例1。

实施例4、一种促组织愈合的复方缓释纳米粒的制备：

将步骤4)中滴加时间由70分钟滴完改成35分钟滴完，其余等同于实施例1。

对比例1、将实施例1中的季铵化壳聚糖包材换为乳清蛋白，用量不变；制备乳清蛋白微囊，其余等同于实施例1。

对比例2、将本发明中的季铵化壳聚糖包材换为大单室脂质体，用量不变；制备脂质体纳米粒，其余等同于实施例1。

试验1、检测表皮生长因子包封率：

将上述部分案例所得复方纳米粒按照上述方法一进行检测，对应结果如下：

实施例1所得复方纳米粒包封率(％)＝36.37％；

实施例3-1所得复方纳米粒包封率(％)＝17.73％；

实施例3-2所得复方纳米粒包封率(％)＝15.07％

实施例3-3所得复方纳米粒包封率(％)＝11.64％

对比例1所得复方纳米粒包封率(％)＝16.28％

对比例2所得复方纳米粒包封率(％)＝10.27％。

试验2、检测表皮生长因子体外释放半衰期：

将上述案例所得复方纳米粒按照上述方法二进行检测，结果如表1：

表1.体外释放半衰期(h)

实施例	半衰期(h)
		实施例1	3.42
实施例2-1	2.29
		实施例2-2	2.34
实施例2-3	1.16
		实施例3-1	1.57
实施例3-2	2.31
		实施例3-3	1.83
实施例4	1.34
		对比例1	1.48
对比例2	1.52

试验3、大鼠皮肤损伤创面的修复：

将上述案例所得复方纳米粒按照上述方法三进行检测，第7天的结果如表2：

表2.大鼠皮肤损伤创面愈合率(％)

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明中PRP、茶多糖以及季铵化壳聚糖和多聚磷酸钠所组成纳米粒的具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (2)

1.促组织愈合的复方缓释纳米粒的制备方法，其特征是包括以下步骤：

1）、将茶多糖加入至浓度为1.0±0.1mg/mL的三聚磷酸钠溶液中，混合均匀，得浓度为15±1mg/mL茶多糖的三聚磷酸钠混合溶液；

2）、配制浓度为6.0±0.5mg/mL的季铵化壳聚糖水溶液：

先利用冰醋酸将水调节至pH为5.0±0.5，然后，加入季铵化壳聚糖，得浓度为6.0±0.5mg/mL的季铵化壳聚糖水溶液；

季铵化壳聚糖的分子量10~20万，纯度＞99%，取代度＞95%；

3）、向步骤2）所得的季铵化壳聚糖溶液400±20ml中加入PRP冻干粉6.0g， 磁力搅拌20~40分钟，转速500r/min；

4）、于搅拌条件下，取步骤1）中配制的茶多糖三聚磷酸钠溶液200±20ml滴加至步骤3）所得物中；70分钟滴完；

滴加完成后，继续搅拌20~40分钟，转速500r/min，得茶多糖和PRP的复方纳米粒混悬液。

2.根据权利要求1所述的促组织愈合的复方缓释纳米粒的制备方法，其特征是：

将茶多糖和PRP的复方纳米粒混悬液冷冻干燥至恒重，得冷冻干燥后的茶多糖和PRP复方纳米粒。