CN103071191B - 一种自体富血小板因子血浆pfrp制剂的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种自体富血小板因子血浆PFRP制剂的制备方法，其特征在于：A、自体富血小板因子血浆PFRP的制备，采集自体全血，利用离心加冻融的方式制备得到自体富血小板因子血浆PFRP；B、自体富血小板因子血浆PFRP制剂的制备，将得到的自体富血小板因子血浆PFRP与生物支架/自体成体细胞按体积比3:1-1:1混合得到PFRP制剂。通过对自体全血的特殊处理得到的自体富血小板因子血浆PFRP，减少了因添加激活剂可能导致的污染风险，避免了异体使用时膜抗原存在的免疫风险。通过该方法制备的自体富血小板因子血浆PFRP制剂，不仅对半月板等组织损伤具有很好的修复作用；还具有很好的抗皱、填充及提升效果。

Description

一种自体富血小板因子血浆PFRP制剂的制备方法

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种自体富血因子血浆PFRP制剂，具体涉及一种自体富血因子血浆PFRP（Platele-factor-richplasma）制剂的制备方法。

背景技术

临床研究中有报道用富血小板血浆PRP（Plate-richplasma）凝胶治疗半月板损伤，制备富血小板血浆PRP凝胶需要在富血小板血浆PRP中添加凝血酶和钙离子。凝血酶是血小板活化剂中最有效的成分。动物原性凝血酶以及钙离子的使用，有可能导致外源性的污染，使用剂量不当时也有可能导致组织的损伤。此外，使用富血小板血浆PRP凝胶皮下注射，疼痛明显且充填效果不持久。

发明内容

本发明的目的在于针对上述现有技术的不足，提供一种创新型的自体富血小板因子血浆PFRP制剂的制备方法，制备出疗效好、无明显副作用的自体富血小板因子血浆PFRP制剂。

本发明的另一个目的是提供一种多用途的自体富血小板因子血浆PFRP制剂，异体使用时也不存在免疫风险。不仅能够加速半月板损伤、外伤组织的修复愈合，还能满足医疗美容等多方面的需求。

为达到上述目的，本发明采取的技术方案是：提供一种自体富血小板因子血浆PFRP制剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

A、自体富血小板因子血浆PFRP的制备，采集自体全血，利用离心+冻融的方式制备得到自体富血小板因子血浆PFRP；

B、自体富血小板因子血浆PFRP制剂的制备，将得到的自体富血小板因子血浆PFRP与生物支架/自体成体细胞按体积比3:1-1:1混合得到自体富血小板因子血浆PFRP制剂；

步骤A包括以下分步骤：

A1、自体富血小板血浆PRP的制备，采集自体全血，离心后，弃去上段贫血小板血浆和下段红细胞，留取中段自体富血小板血浆PRP并深低温（低于-20℃）冻存；

A2、自体富血小板因子血浆PFRP的制备，将自体富血小板血浆PRP冻融后离心，取富血小板因子血浆PFRP备用，弃去底部膜碎片。

步骤A1中利用抗凝管采集自体外周血。

步骤A1，离心过程中的离心力小于2000g，离心时间为8-10min。

步骤A2，离心过程中的离心力为4000g，离心时间为8-10min。

步骤A2制备的自体富血小板因子血浆PFRP包含的细胞活性分子包括自体全血血浆中的所有非细胞成分，例如细胞因子、生长因子、趋化因子、免疫调节因子、酶、激素等；其中，生长因子包括胰岛素样生长因子IGF-1、转录生长因子TGF-β1、碱性成纤维细胞生长因子FGF-b和血管内皮细胞生长因子VEGF等。

步骤A2制得的自体富血小板因子血浆PFRP中各种生长因子的浓度为自体全血中相应生长因子浓度的2~5倍。

步骤B中的生物支架为商品化的胶原蛋白、透明质酸钠、纳米羟基磷灰石、聚乳酸等可应用于组织修复的生物支架。

步骤B中的自体成体细胞为自体脂肪细胞、自体成纤维细胞、自体间充质干细胞及其它可应用于修复作用的细胞。

所述透明质酸钠包括交联透明质酸钠和不交联透明质酸钠。

一种通过自体富血小板因子血浆PFRP制剂的制备方法制备的自体富血小板因子血浆PFRP制剂。

一种含有自体富血小板因子血浆PFRP制剂的敷料，由敷布浸在自体富血小板因子血浆PFRP制剂中制得。

本发明采用的生物支架为生物体可吸收、可降解的材料；生物支架起到载体、填充和缓释的作用。

本发明采用的胶原蛋白（collagen）是一种生物性高分子物质，是一种白色、不透明、无支链的纤维性蛋白质。它可以补充皮肤各层所需的营养，使皮肤中胶原活性增强，有滋润皮肤，延缓衰老、美容、消皱、养发等功效；本发明中采用的是双美（Sunmax）胶原蛋白植入剂，注册证号为国食药监械（许）字2009第3460037号，由台湾双美生物科技有限公司研制。

本发明采用的透明质酸钠本身是人体皮肤的构成成分之一，是人体内分布最广的一种酸性黏糖，存在于结缔组织的基质中，具有良好的保湿作用，促进伤口愈合的作用。本发明采用的注射级透明质酸钠，生产厂家为西安力邦制药有限公司，国药准字H20054738。

本发明采用的纳米羟基磷灰石，是一种典型的生物材料，具有优良的生物相容性和生物活性，可作为骨替代材料、整形和整容外科、齿科、层析纯化、补钙剂等。本发明采用的是医用纳米羟基磷灰石/聚酰胺66复合骨充填材料，生产厂家为四川国纳科技有限公司，国食药监械(准)字2007第3460598号。

本发明采用的聚乳酸具有优异的生物相容性和生物可降解性，以及良好的抗拉强度及延展度，可作为优良的组织工程材料。本发明采用的是美国NatureWorksLLC聚乳酸PLAIngeo3251D。

本发明采用的自体成体细胞包括自体脂肪细胞、自体成纤维细胞、自体间充质干细胞及其它可应用于组织修复的细胞，上述细胞从自体获得，如手术等，可以预存。

本发明提供的自体富血小板因子血浆PFRP制剂的制备方法具有以下有益效果：

1、通过对自体全血的特殊处理得到自体富血小板因子血浆PFRP，避免引入污染源，减少了污染风险；

2、由于采用的自体富血小板因子血浆PFRP不含膜抗原，即使异体使用也不存在免疫风险；

3、通过该方法制备的自体富血小板因子血浆PFRP制剂，对半月板损伤等具有很好的组织修复作用，无疼痛且疗效持久；

4、通过该方法制备的自体富血小板因子血浆PFRP制剂，具有很好的抗皱、填充和提升效果；

5、制备方法简便、成本低，适于普通人群，具有很好的经济效益和社会效益。

附图说明

图1为患者脸部凹陷部位图片；

图2为经治疗后患者脸部凹陷部分图片；

图3为患者手部黑斑图片；

图4为经治疗后患者手部黑斑图片。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进行详细的描述，但它们不是对本发明的进一步限制。

实施例

1、材料：自体外周抗凝血，注射级透明酸钠溶液（透明质酸钠分子量为30万~300万，质量浓度范围为0.01~2%，质检合格），一次性离心管、吸管等；

2、设备：生物安全柜、低速离心机、低温冰箱等；

3、操作地点：无菌实验室

实施例1

1、自体富血小板血浆PRP的制备，采集自体外周抗凝血20ml，采血后2h内离心，离心力1800g，离心时间为8min；离心后弃去上段贫血小板血浆和下段红细胞，留取中段自体富血小板血浆PRP（上段贫血小板血浆、中段富血小板血浆PRP、下段红细胞的颜色各不相同，因此可以以颜色区分），制备得到的自体富血小板血浆PRP放入-80℃冻存备用，全程无菌操作；

2、自体富血小板因子血浆PFRP的制备，将-80℃保存的自体富血小板血浆PRP取出，在37℃溶化后离心取富血小板因子血浆PFRP备用，弃去底部膜碎片；离心过程中的离心力为4000g，离心时间为10min，全程无菌操作；

3、自体富血小板因子血浆PFRP制剂的制备，将得到的自体富血小板因子血浆PFRP与透明质酸钠按1：1体积比混合得到自体富血小板因子血浆PFRP制剂。本实施例采用的是含有透明质酸钠的注射级透明质酸钠溶液，透明质酸钠分子量为100万，质量浓度为0.5%；全程无菌操作。

实施例2

1、自体富血小板因子血浆PRP的制备，采集自体抗凝血20ml，采血后2h内离心，离心力1600g，离心时间为10min；离心后弃去上段贫血小板血浆和下段红细胞，留取中段自体富血小板血浆PRP低温冻存，全程无菌操作；

2、自体富血小板因子血浆PFRP的制备，将制备的自体富血小板血浆PRP冻融后离心取富血小板因子血浆PFRP备用，弃去底部膜碎片；离心过程中的离心力为4000g，离心时间为10min，全程无菌操作；

3、自体富血小板因子血浆PFRP制剂的制备，将得到的自体富血小板因子血浆PFRP与透明质酸钠按2：1体积比.混合得到自体富血小板因子血浆PFRP制剂。本实施例采用的是注射级透明质酸钠溶液，透明质酸钠分子量为30万，质量浓度为0.01%；全程无菌操作。

实施例3

1、自体富血小板血浆PRP的制备，采集自体外周抗凝血20ml，采血后2h内离心，离心力1200g，离心时间为10min；离心后弃去上段贫血小板血浆和下段红细胞，留取中段自体富血小板血浆PRP，制备得到的自体富血小板因子血浆PRP放入-80℃保存备用，全程无菌操作；

2、自体富血小板因子血浆PFRP的制备，将-80℃保存的自体富血小板血浆PRP取出，在37℃溶化后离心取富血小板因子血浆PFRP备用，弃去底部膜碎片。离心过程中的离心力为4000g，离心时间为10min，全程无菌操作；

3、自体富血小板因子血浆PFRP制剂的制备，将得到的自体富血小板因子血浆PFRP与透明质酸钠按3：1体积比混合得到自体富血小板因子血浆PFRP制剂。本实施例采用的是注射级透明质酸钠溶液，透明质酸钠分子量为300万，质量浓度为2%；全程无菌操作。

实施例4

1、自体富血小板血浆PRP的制备，采集自体抗凝血20ml，采血后2h内离心，离心力1800g，离心时间为9min；离心后弃去上段贫血小板血浆和下段红细胞，留取中段自体富血小板血浆PRP低温冻存；

2、自体富血小板因子血浆PFRP的制备，将自体富血小板血浆PRP冻融后离心取富血小板因子血浆PFRP备用，弃去底部膜碎片，离心过程中的离心力为4000g，离心时间为8min；全程无菌操作；

3、自体富血小板因子血浆PFRP制剂的制备，将得到的自体富血小板因子血浆PFRP与胶原蛋白按2：1体积比混合得到自体富血小板因子血浆PFRP制剂，全程无菌操作。

实施例5

1、自体富血小板血浆PRP的制备，采集自体外周抗凝血20ml，采血后2h内离心，离心力1800g，离心时间为9min；离心后弃去上段贫血小板血浆和下段红细胞，留取中段自体富血小板血浆PRP，制备得到的自体富血小板血浆PRP放入-80℃保存备用，全程无菌操作；

2、自体富血小板因子血浆PFRP的制备，将-80℃保存的自体富血小板血浆PRP取出，在37℃溶化后离心取富血小板因子血浆PFRP备用，弃去底部膜碎片；离心过程中的离心力为4000g，离心时间为10min；全程无菌操作；

3、自体富血小板因子血浆PFRP制剂的制备，将得到的自体富血小板因子血浆PFRP与纳米羟基磷灰石按1：1体积比混合得到自体富血小板因子血浆PFRP制剂，全程无菌操作。

实施例6

1、自体富血小板血浆PRP的制备，采集自体外周抗凝血20ml，采血后2h内离心，离心力1800g，离心时间为8min；离心后弃去上段贫血小板血浆和下段红细胞，留取中段自体富血小板血浆PRP，制备得到的自体富血小板因子血浆PRP放入-80℃保存备用，全程无菌操作；

2、自体富血小板因子血浆PFRP的制备，将-80℃保存的自体富血小板血浆PRP取出，在37℃溶化后离心取富血小板因子血浆PFRP备用，弃去底部膜碎片；离心过程中的离心力为4000g，离心时间为10min；全程无菌操作；

3、自体富血小板因子血浆PFRP制剂的制备，将得到的自体富血小板因子血浆PFRP与聚乳酸按1：1体积比混合得到自体富血小板因子血浆PFRP制剂，全程无菌操作。

实施例7

1、自体富血小板血浆PRP的制备，采集自体外周抗凝血20ml，采血后2h内离心，离心力1800g，离心时间为8min；离心后弃去上段贫血小板血浆和下段红细胞，留取中段自体富血小板血浆PRP，制备得到的自体富血小板因子血浆PRP放入-80℃冻存备用，全程无菌操作；

2、自体富血小板因子血浆PFRP的制备，将-80℃保存的自体富血小板血浆PRP取出，在37℃溶化后离心取富血小板因子血浆PFRP备用，弃去底部膜碎片。离心过程中的离心力为4000g，离心时间为9min；全程无菌操作；

3、自体富血小板因子血浆PFRP制剂的制备，将得到的自体富血小板因子血浆PFRP与自体脂肪细胞按1：1体积比混合得到自体富血小板因子血浆PFRP制剂，全程无菌操作；

试验例：

试验例1：

甲、乙、丙、丁分别代表不同的自体供者，各采集自体抗凝血20ml，采用实施例1方法制备PFRP，用酶标法测定原血浆和PFRP中数种生长因子的浓度，结果见表1

表1

从上表中可以看出，对于甲、乙、丙、丁4个个体，自体富血小板因子血浆中的胰岛素样生长因子IGF-1、转录生长因子TGF-β1、碱性成纤维细胞生长因子FGF-b和血管内皮细胞生长因子VEGF的浓度相对于自体原血浆的浓度提高了2~5倍，个别达到6倍、9倍。生长因子浓度的增加，能够有效地促进组织再生和修复。

试验例2

对象：一脸部划伤留下凹陷多年的患者；

方法：患者脸部真皮内注射＜2ml自体富血小板因子血浆PFRP制剂（通过实施例1提供的方法制备得到），1个月后观察疗效；

结果：如图1及图2所示，治疗前凹陷最深的地方约有1mm，经治疗后凹陷明显减轻，有些地方凹陷甚至已经消失。

试验例3

对象：一手部因擦伤留下黑斑多年的患者，

方法：向患者受伤手部真皮内注射＜2ml自体富血小板因子血浆PFRP制剂（通过实施例2提供的方法制备得到），1个月后观察疗效；

结果：如图3及图4所示，治疗前黑斑覆盖面积大约有3cm²，经治疗后黑斑明显淡化且黑斑覆盖面积也减小为原来的一半左右。

试验例4

对象：一膝关节退行病变患者，局部疼痛，向患者膝关节部位真皮下注射＜5ml自体富血小板因子血浆PFRP制剂（通过实施例3提供的方法制备得到），观察疗效周期为1个月；

结果：患者无不良反应，感觉舒适，疼痛消失。

综上所述，通过本发明提供的自体富血小板因子血浆PFRP制剂，在避免引入污染源、膜抗原的同时，获得的自体富血小板因子血浆PFRP，各种生长因子的浓度浓缩为自体全血血浆浓度的2~5倍，甚至更多，从而获得更有效的组织再生，促进受损部分修复。上述自体富血小板因子血浆PFRP制剂可以用于治疗外伤、烧伤、半月板损伤，也可以用于溃疡修复，治疗退行性牙周炎、关节炎；还可以用于面部和身体除皱、填充、提升等。

Claims (6)

1.一种自体富血小板因子血浆PFRP制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

A、自体富血小板因子血浆PFRP的制备，采集自体全血，利用离心加冻融方式制备得到自体富血小板因子血浆PFRP；

步骤A包括以下分步骤：

A1、自体富血小板血浆PRP的制备，采集自体全血，离心分层后，弃去上段贫血小板血浆和下段红细胞，留取中段自体富血小板血浆PRP，立即于低于-20℃的深低温冻存；离心过程中的离心力小于2000g，离心时间为8-10min；

A2、自体富血小板因子血浆PFRP的制备，将自体富血小板血浆PRP冻融后，离心取上层富血小板因子血浆PFRP备用，弃去底部膜碎片；离心过程中的离心力为4000g，离心时间为8-10min；制得的自体富血小板因子血浆PFRP中的生长因子的浓度为自体全血中生长因子的2～5倍；

B、自体富血小板因子血浆PFRP制剂的制备，将得到的自体富血小板因子血浆PFRP与生物支架/自体成体细胞按体积比3:1-1:1混合得到自体富血小板因子血浆PFRP制剂。

2.根据权利要求1所述的自体富血小板因子血浆PFRP制剂的制备方法，其特征在于：步骤A1中利用抗凝管采集自体外周血。

3.根据权利要求1所述的自体富血小板因子血浆PFRP制剂的制备方法，其特征在于：步骤B中的生物支架为商品化的胶原蛋白、透明质酸钠、纳米羟基磷灰石、聚乳酸中的一种；自体成体细胞为自体脂肪细胞、成纤维细胞、间充质干细胞中的一种。

4.根据权利要求3所述的自体富血小板因子血浆PFRP制剂的制备方法，其特征在于：所述透明质酸钠包括交联透明质酸钠和不交联透明质酸钠。

5.一种通过权利要求1至4任一所述的自体富血小板因子血浆PFRP制剂的制备方法制备的自体富血小板因子血浆PFRP制剂。

6.一种含有权利要求5所述的自体富血小板因子血浆PFRP制剂的敷料，其特征在于：由敷布浸在自体富血小板因子血浆PFRP制剂中制得。