CN109666634A - 一种脂肪间充质干细胞分离培养及制剂制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及脂肪间充质干细胞医疗美容领域，公开了一种脂肪间充质干细胞分离培养及制剂制备方法。本发明通过物理方法对自体脂肪组织处理，无需引入胶原酶及其长时间的繁琐处理，保留并充分利用细胞外基质，本发明进一步利用自体富血小板因子血浆对自体脂肪间充质干细胞扩增，获得足量的自体脂肪间充质干细胞及干细胞因子，脂肪间充质干细胞与细胞外基质对除皱、软组织修复和面部年轻化具有良好的效果，干细胞因子可广泛应用于皮肤修复。

Description

一种脂肪间充质干细胞分离培养及制剂制备方法

技术领域

本发明涉及一种脂肪间充质干细胞分离培养及制剂制备方法。本发明属于脂肪间充质干细胞医疗美容领域。

背景技术

干细胞是一类具有自我更新、自我复制能力的多潜能细胞。间充质干细胞是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层，在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，是再生医学理想的种子细胞。间充质干细胞存在于骨髓、脐带血和脐带组织、胎盘组织、脂肪组织等多种组织中。

脂肪间充质干细胞是近年来从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞。近年来，脂肪来源的干细胞已经成为组织工程和再生医学最受欢迎的干细胞之一。自体脂肪源性干细胞来源广泛，能够分泌出大量的生长因子，如表皮、血管、内皮以及成纤维等生长因子，能够促进人体胶原合成，增加血管，更易成活，使得人体皮肤质地产生变化，减少面部斑点，淡化面部皱纹，改善面部凹陷，从而达到面部年轻化的改变。但是只有足够数量、活性强的细胞才能发挥持久的疗效，并且细胞外基质对细胞的植入和功能的发挥具有重要的作用。

尽管骨髓、脐带、胎盘、牙髓等组织中均可分离出间充质干细胞，但是其来源受限，或者自体采集损伤较大。虽然间充质干细胞免疫原性低，但是异体输注依然存在排斥反应。自体脂肪来源丰富、易于采集，且间充质干细胞含量高、增殖活性强、自体来源无排斥，且脂肪组织中可提炼出适用于填充的细胞外基质，是医疗美容领域最合适的种子来源。

间充质干细胞体外培养存在外源污染的风险，如培养体系中牛源血清的使用可能引入牛源支原体、病毒等病原微生物污染的风险，培养体系中猪源胰蛋白酶的使用可能引入猪源支原体、病毒等病原微生物污染的风险。在培养获得足够数量间充质干细胞的同时，应保持细胞干性，避免引入外源病原体的污染。通过物理方法提取脂肪间充质干细胞，快速简洁，避免了胶原酶长时间的操作和外源胶原酶的引入；使用自体富血小板因子血浆及重组胰酶可有效规避动物源性病毒和支原体污染风险；自体富血小板因子血浆能够有效对脂肪间充质干细胞扩增，且保持其多项分化潜能。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中存在的细胞数量、细胞活性、操作程序、应用风险等缺陷，提供一种简单分离、高效扩增、多向分化潜能、移植后存活效率高的脂肪间充质干细胞制剂方法。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明提供一种脂肪干细胞分离方法，通过机械破碎脂肪细胞，过滤去除体积较大的基质，离心获得富含干细胞的组份，包括以下步骤：

1)将脂肪组织置于无菌洁净容器内，加入生理盐水，吸去上层油脂和下层生理盐水，如此重复3遍，以去除杂质。

2)将洗涤后的脂肪组织转移至注螺口射器中，接上1.2mm脂肪乳化器和另一螺口注射器，反复推注10-20次后；更换1.0mm脂肪乳化器，反复推注10-20次；更换0.8mm脂肪乳化器，反复推注10-20次；更换0.6mm脂肪乳化器，反复推注10-20次。

3)将破碎的脂肪组织推至一侧注射器，拆下脂肪乳化器后，接上0.2mm的滤头和一只新的注射器，单次推送至新的注射器中。

4)将过滤后的脂肪组织转移至50ml离心管，300g离心5分钟。沉淀即为富含脂肪干细胞的组份。上层油脂冻存待用。

进一步的，本发明还提出了一种脂肪干细胞培养方法，包括以下步骤：

1)EDTA抗凝管采集外周血，700g离心10分钟，吸取上层黄色血浆至洁净离心管中，剩下的血液加入生理盐水至原体积。

2)向离心管中加入密度为1.037-1.077的分离液，优选的，分离液为1.057的Percoll，再缓慢加入上述生理盐水稀释的外周血，500g离心20分钟。

3)吸取中间层血小板，至洁净离心管中，400g离心8分钟。

4)上清转移至洁净离心管，1600g离心5分钟。

5)弃上清，取步骤1中的血浆重悬血小板沉淀。

6)将含有富血小板血浆的离心管置于液氮中30秒，然后于37℃水浴锅解冻，如此重复操作3遍。

7)将冻融后的富血小板血浆2000g离心5分钟，上清液转移至注射器中，用0.22um滤头过滤。

8)用含富血小板血浆的培养基，包括但不限于MEM、DMEM等重悬富含脂肪干细胞组份，接种于T75培养瓶，37℃、5％CO2培养。

9)待脂肪干细胞生长融合至80％，用0.05％的重组胰蛋白酶消化，待细胞缩小变圆，立即加入胰酶抑制剂终止消化，将细胞转移至50ml离心管。

10)300g离心5分钟，弃上清，加入含富血小板血浆的培养基重悬，按10000/cm²接种到新的培养瓶，37℃、5％CO2培养。

更进一步的，本发明还提出了一种脂肪干细胞制剂方法，包括以下步骤：

1)上述操作中冻存的油脂于37℃解冻，取每10ml至一个50ml密封注射器中。

2)反复抽拉注射器栓的同时震荡摇晃，待细胞外基质从油脂析出，将混合物转移至50ml离心管，3000g离心弃上层油脂，获得细胞外基质成分。

3)取培养后的脂肪间充质干细胞，待其融合度达到80-90％，收集上清液至250ml离心瓶，2000g离心后取上清过滤，获得自体干细胞因子。

4)对培养后的脂肪间充质干细胞用PBS洗涤后，用0.05％的重组胰蛋白酶消化，待细胞缩小变圆，立即加入胰酶抑制剂终止消化，将细胞转移至50ml离心管。

5)300g离心5分钟，弃上清，加入生理理水洗涤两遍。

6)弃上清获得脂肪间充质干细胞沉淀，将其与细胞外基质成分混匀至注射器中。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

本发明克服了现有技术中间充质干细胞数量少、培养过程中引入具有免疫原性的培养物、细胞植入后活性效率低的问题，提供了一种安全、高效的自体脂肪干细胞分离培养和制剂制备方法。

和常规脂肪制剂相比：1.本发明通过高效扩增获得大量自体脂肪间充质干细胞；2.本发明通过自体富血小板因子血浆扩增自体脂肪间充质干细胞，避免引入具有免疫原性的外源培养物；3.本发明通过去油处理获得脂肪细胞外基质，将脂肪间充质干细胞与脂肪细胞外基质混合，有助于脂肪间充质干细胞的植入存活和功能的发挥。

综上，本发明通过优化的方法对脂肪干细胞进行提取，再选用自体血液和脂肪来源的材料对脂肪间充质干细胞进行培养、扩增，摒弃了有外源生物源性污染风险的成份，为细胞美容安全、有效的实施提供了基本的保障。与现有的技术相比，本发明不仅安全性高，不使用有潜在致病风险的动物源性血清等，通过自体来源材料安全无排斥。并且该方法简便易行，脂肪间充质干细胞联合细胞外基质可对皱纹进行有效填充，自体干细胞因子外用可有效改善皮肤肤质，联合应用效果大大优于常规脂肪干细胞填充。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

实施例1：

1)EDTA抗凝管采集外周血60，在生物安全柜内转移至2支50ml离心管。700g离心10分钟，吸取上层黄色血浆至洁净50ml离心管中，剩下的血液加入生理盐水至原体积。

2)向2支50ml离心管中加入15ml密度为1.057的Percoll，再缓慢加入30ml上述生理盐水稀释的外周血，500g离心20分钟。

3)吸取中上层血小板，至洁净50ml离心管中，400g离心8分钟。

4)上清转移至洁净50ml离心管，1600g离心5分钟。

5)弃上清，取步骤1中的血浆重悬血小板沉淀。

6)将含有富血小板血浆的离心管置于液氮中30秒，然后于37℃水浴锅解冻，如此重复操作3遍。

7)将冻融后的富血小板血浆2000g离心5分钟，上清液转移至注射器中，用0.22um滤头过滤，滤出液即为富血小板因子血浆，置于4℃冰箱待用。

8)吸脂术获得50ml脂肪，将脂肪转移至200ml离心瓶，加入150ml生理盐水，吸弃上层油脂和下层生理盐水，重复三遍。

9)300g离心3分钟，吸弃上层油脂和下层生理盐水。

10)将剩余的中层脂肪组织转移至2个50ml螺口注射器，接上1.2mm脂肪乳化器和另一50ml螺口注射器，反复推注20次后；更换1.0mm脂肪乳化器，反复推注20次；更换0.8mm脂肪乳化器，反复推注20次；更换0.6mm脂肪乳化器，反复推注20次。

11)将破碎的脂肪组织的注射器接上0.2mm的滤头和一只新的注射器，单次推送至新的注射器中。

12)将脂肪组织转移至50ml离心管，300g离心，上层脂肪液收集置于冷冻冰箱保存待用，细胞沉淀用含5％富血小板因子血浆的MEM培养基重悬、接种至两个T75，37℃、5％CO2培养培养。

13)待脂肪间充质干细胞生长融合至80％，PBS洗涤，用重组胰蛋白酶消化，待细胞缩小，用胰酶抑制剂终止消化，300g离心5分钟，弃上清，用含5％富血小板因子血浆的MEM培养基调整细胞密度，按10000细胞/cm2接种至T225培养瓶。

14)重复步骤13)对细胞行传代处理，至获得足量脂肪间充质干细胞。

15)待脂肪间充质干细胞生长融合至80％-90％，收集上清液至离心管，2000g离心后取上清0.22um过滤，获得自体干细胞因子。

16)对培养后的脂肪间充质干细胞用PBS洗涤后，用重组胰蛋白酶消化，待细胞缩小，用胰酶抑制剂终止消化，300g离心5分钟，弃上清，获得脂肪间充质干细胞沉淀。

17)解冻步骤5)中冷冻的脂肪液，将解冻后的脂肪液按每10ml转移至50ml密封注射器，反复抽拉注射器栓的同时震荡摇晃，待细胞外基质从油脂析出，将混合物转移至50ml离心管，3000g离心弃上层油脂，获得细胞外基质沉淀。

18)将步骤8)中的细胞外基质沉淀与步骤7)中的脂肪间充质干细胞沉淀混匀。

19)将混合的脂肪间充质干细胞和脂肪细胞外基质转移至注射器进行填充注射。

以上实施例只为说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

Claims (10)

1.一种脂肪间充质干细胞分离培养及制剂制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)血小板分离和富血小板因子血浆制备；

2)脂肪间充质干细胞的分离、培养；

3)脂肪间充质干细胞制剂制备；

4)干细胞因子制备。

2.根据权利要求1所述的血小板分离和富血小板因子血浆制备，其特征在于，用密度梯度离心法和差速离心法获得血小板，用自体血浆重悬血小板后，经过3次反复冻融，2000g离心，上清液过滤至洁净容器中。

3.根据权利要求1所述的脂肪间充质干细胞和细胞外基质的分离，其特征在于，对洗涤后的脂肪依次通过1.2mm、1.0mm、0.8mm、0.6mm孔径的纳米脂肪乳化器反复推注20次、0.1-0.2mm筛网过滤、300g离心细胞沉淀用含富血小板因子血浆的培养基重悬、接种培养，上清收集置于冷冻冰箱保存，制剂时解冻后转移每10ml至50ml密封注射器中，反复抽拉注射器栓的同时震荡摇晃，待细胞外基质从油脂析出，将混合物置于50ml离心管，3000g离心弃上清取细胞外基质沉淀。

4.根据权利要求1所述的脂肪间充质干细胞制剂的制备，其特征在于，待脂肪间充质干细胞生长融合至80％，用重组胰蛋白酶消化，待细胞缩小用胰酶抑制剂终止消化，离心洗涤两遍，将收获的脂肪间充质干细胞与细胞外基质沉淀混合。

5.根据权利要求1所述的干细胞因子的制备，其特征在于，收集培养干细胞的上清夜，经过离心、过滤获得干细胞因子。

6.根据权利要求2所述的密度梯度离心法，其特征在于，分离液密度为1.037-1.077，优选的分离液密度为1.057，其原料包括但不限于聚蔗糖-泛影葡胺和聚乙烯吡咯烷酮硅胶。

7.根据权利要求2所述的密度梯度离心法和差速离心法，其特征在于，离心条件为400-800g/15-30分钟/慢升慢降，优选的离心条件为500g/20分钟/慢升慢降，吸取中上层血小板后加入生理盐水，400g/8分钟离心取上层液体，1600g/5分钟离心弃上清。

8.根据权利要求2所述的冻融，其特征在于，置于液氮中30秒后迅速于37℃水浴锅解冻。

9.根据权利要求3所述的含富血小板因子血浆的培养基，其特征在于，富血小板因子血浆的浓度为1％-5％，优选的浓度为2.5％，培养基包括但不限于MEM、DMEM的基础培养基及各种干细胞无血清培养基。

10.根据权利要求6所述的干细胞因子，其特征在于，不含动物源性成分，为自体血小板因子和自体脂肪干细胞因子的混合物，可直接应用，也可经过超滤工序后，与维生素C、维生素E、玻尿酸等联合应用。