CN110468098A - 一种牙髓干细胞制备方法 - Google Patents

一种牙髓干细胞制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110468098A
CN110468098A CN201910606448.0A CN201910606448A CN110468098A CN 110468098 A CN110468098 A CN 110468098A CN 201910606448 A CN201910606448 A CN 201910606448A CN 110468098 A CN110468098 A CN 110468098A
Authority
CN
China
Prior art keywords
dental pulp
stem cell
broach
transport
pulp
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201910606448.0A
Other languages
English (en)
Inventor
张彦茹
黄宇
唐雯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Zhongrui United Biotechnology Co Ltd
Original Assignee
Beijing Zhongrui United Biotechnology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Zhongrui United Biotechnology Co Ltd filed Critical Beijing Zhongrui United Biotechnology Co Ltd
Priority to CN201910606448.0A priority Critical patent/CN110468098A/zh
Publication of CN110468098A publication Critical patent/CN110468098A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0663—Bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
    • C12N2509/10—Mechanical dissociation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种牙髓干细胞制备方法,包括如下步骤：牙髓的运输，取乳牙放入取样瓶中，把取样瓶及医用冰袋放回运输箱中运回实验室；牙髓干细胞的分离，用镊子夹住牙齿冠部，再用注射器吸取生理盐水从牙根断面向里吹打牙髓腔，冲洗松动牙髓；使用拔髓针取出牙髓；牙髓干细胞的扩增培养，取完全培养基，重悬牙髓沉淀，并转移到12孔板中；用一个拔髓针固定牙髓，用另一个拔髓针上的倒钩剥离牙髓，使牙髓形成细小碎片，释放其中的细胞，然后培养。该制备方法使用拔髓针对凝聚的牙髓进行剥离,释放其中的干细胞，避免使用胶原酶酶等对牙髓干细胞的损伤，可以排除消化过程对牙髓干细胞的损伤，使牙髓干细胞提取成功率达到100%，应用简单方便。

Description

一种牙髓干细胞制备方法
技术领域
本发明涉及细胞生命科学技术领域，具体来说，涉及一种牙髓干细胞制备方法。
背景技术
牙髓干细胞（DPSC）是存在于牙髓组织中的一种间充质干细胞，获取方便，可从更换的乳牙中获取，不会给供体部位带来功能及健康方面的损害，其在体外培养增殖能力强，拥有干细胞所具有的多项性能，在不同诱导条件下可向成骨细胞、脂肪细胞、神经细胞、内皮细胞等方向分化。有研究将DPSC与骨髓间充质干细胞进行比较，结果发现，它们具有相似的免疫表型，但牙髓干细胞具有更高的克隆形成率和增殖率，且表现出很强的钙化组织形成能力。尤其是DPSC低表达MHC-Ⅱ类分子等，具有低免疫原性和免疫耐受作用，使其能逃逸免疫监控，可以使其作为自体或异体组织工程种子细胞。因此，DPSC作为组织再生及细胞治疗的种子细胞，在自体或异体牙髓／牙本质再生、牙周病、组织工程骨、神经损伤等细胞治疗应用中具有广阔前景。
虽然牙髓干细胞在再生医学领的巨大潜能受到越来越多人的关注，但是其在临床前研究和应用中的问题也不断展现：成功率低，牙齿从离体后，因运输温度波动大，运输液营养条件缺乏、口腔微生物感染等，导致牙髓干细胞在运输过程大量死亡，此外，牙髓干细胞本身含量少，现有分离体系较多以酶消化牙髓为主，对细胞损伤较大，后期培养过程中经常导致老化、凋亡或分化情况发生，导致牙髓干细胞培养成功率低，到目前为止，大多数分离、扩增方法还不能完全令人满意。
发明内容
针对相关技术中的上述技术问题，本发明提出一种牙髓干细胞制备方法，能够克服现有技术的上述不足。
为实现上述技术目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种牙髓干细胞制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）牙髓的运输，把牙髓干细胞的运输箱交于供者，供者接收到运输箱后，把运输箱中的取样瓶放至冷藏冰箱，医用冰袋放至冷冻冰箱，供者乳牙自行脱落后，采取乳牙放入取样瓶中，把取样瓶及医用冰袋放回运输箱中，24小时内运回实验室；
（2）牙髓干细胞的分离，把乳牙从取样瓶取出，用生理盐水清洗乳牙后，用镊子夹住牙齿冠部，再用注射器吸取生理盐水从牙根断面向里吹打牙髓腔，冲洗松动牙髓；使用拔髓针从牙根断处插入牙髓腔中，慢慢拧动，向外轻拉，取出牙髓，放至离心管中，用注射器重新吸取生理盐水，冲洗牙髓腔一次，收集两次冲洗牙髓腔的生理盐水加入放置牙髓的离心管中，离心去除生理盐水，收集牙髓；
（3）牙髓干细胞的扩增培养，取完全培养基，重悬牙髓沉淀，并转移到12孔板中；用一个拔髓针固定牙髓，用另一个拔髓针上的倒钩剥离牙髓，使牙髓形成细小碎片，释放其中的细胞，然后放在37℃、5％ CO2、饱和湿度条件下培养。
进一步的，步骤（1）中所述取样瓶内放置有运输液，所述运输液配方为每100ml含有:注射用葡萄糖钙0.1ml、注射用人血白蛋白5ml、注射用右旋糖苷40葡萄糖注射液44.9ml，注射用三磷酸腺苷50ml，青霉素钠2万单位，硫酸链霉素2万单位。
进一步的，步骤（3）中，使用拔髓针上的倒钩把牙髓剥离为1-2mm3细小碎片。
进一步的，步骤（3）中，培养2天后，用新鲜培养基进行半量换液，继续诱导培养，每隔2天半量换液一次。
进一步的，步骤（3）中，待细胞融合度达到80%时进行第一次传代。
本发明的有益效果：采用钙离子促进运输中的牙髓中血液凝血，形成纤维蛋白网住牙髓细胞并停留在牙齿中，维持原有的牙髓微环境；使用葡萄糖及三磷酸腺苷等为牙髓提供营养，有效减轻牙髓干细胞在运输过程中细胞损伤及凋亡，保障牙髓中细胞的存活率；使用拔髓针对凝聚的牙髓进行剥离,释放其中的干细胞，避免使用胶原酶酶等对牙髓干细胞的损伤，可以排除消化过程对牙髓干细胞的损伤，使牙髓干细胞提取成功率达到100%，应用简单方便。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是细胞原代从牙髓爬出照片；
图2是细胞融合90%照片；
图3是流式细胞术检测细胞表型。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1、牙髓的运输
1）把牙髓干细胞运输箱交于供者，运输箱中有取样瓶和医用冰袋，取样瓶中有运输液，运输液配方为每100ml含有:注射用葡萄糖钙0.1ml（含钙量为10mg/100ml）、注射用人血白蛋白5ml、注射用右旋糖苷40葡萄糖注射液44.9ml，注射用三磷酸腺苷50ml（三磷酸腺苷含量为10mg/100ml），青霉素钠2万单位，硫酸链霉素2万单位；
2）供者接收到运输箱后，把取样瓶放置冷藏冰箱，医用冰袋放置冷冻冰箱；
3）供者乳牙自行脱落后，采取乳牙放入取样瓶中；
4）把取样瓶及医用冰袋放回小号密封运输箱中，24小时内运回实验室；
实施例2、牙髓干细胞的分离
1）用医用镊子把牙齿从取样瓶取出，放入医用不锈钢小盘中，使用20ml注射器各抽取100mL生理盐水清洗两遍牙齿，倾倒清洗液。
3）用镊子夹住牙齿冠部，用5mL注射器吸5mL生理盐水从牙根断面（如断面较小，可以用剪刀进行剪切）向里吹打牙髓腔，冲洗松动牙髓。
4）使用拔髓针从牙根断处插入牙髓腔中，慢慢拧动，向外轻拉，取出牙髓，放置15mL离心管中。
5）用5mL注射器重新吸5mL生理盐水，冲洗牙髓腔一次。
6）收集两次5mL生理盐水加入放置牙髓的离心管中；
7）1300rpm离心10min，去除生理盐水，收集牙髓。
实施例3、牙髓干细胞的扩增培养
1）取2mL完全培养基，重悬牙髓沉淀，并转移到12孔板中；
2）一个拔髓针固定牙髓，用另一个拔髓针上的倒钩慢慢剥离牙髓，使牙髓形成1-2mm3细小碎片，结束分离，37℃、5％ CO2、饱和湿度条件下培养；细胞原代从牙髓爬出照片如图1所示；
3）接种2天后，用新鲜培养基进行半量换液，继续诱导培养，每隔2天半量换液一次；
4）在分离后的第4-6天，可以看到有较多牙髓干细胞单克隆生长，待细胞融合度达到80%左右时，可以进行第一次传代；细胞融合90%照片如图2所示；
5）轻吹悬浮起细胞进行传代，细胞计数，调整细胞浓度7000-10000/cm2传代至12孔板新孔中；
6）待细胞融合度再次达到80%左右时，进行第二次传代；
7）轻吹悬浮起细胞进行传代，细胞计数，调整细胞浓度3000-5000/cm2传入新的T175培养瓶中。
实施例4、牙髓干细胞的冻存
1）用0.1％（M/V）胰酶（购自armesco）消化，收集悬浮细胞；
2）1000rpm，离心10分钟。弃上清，用MSC细胞冷冻保护液重悬细胞，调整细胞密度为1~5×106cells/mL。
3）将细胞悬液分装至细胞冻存管中，按照需求标记。
4）直接将细胞冻存管放入-80℃冰箱，24h后，转入液氮保存。
5）后期可以根据需要，进行牙髓干细胞的复苏扩增或临床应用研究。
图3是流式细胞术检测所得牙髓干细胞细胞表型结果，CD90结果为99.85%；CD73结果为98.52%；CD105结果为99.8%；CD45结果为0.47%；CDHLA-DR结果为0.67%。
综上所述，借助于本发明的上述技术方案，通过采用钙离子促进运输中的牙髓中血液凝血，形成纤维蛋白网住牙髓细胞并停留在牙齿中，维持原有的牙髓微环境；使用葡萄糖及三磷酸腺苷等为牙髓提供营养，有效减轻牙髓干细胞在运输过程中细胞损伤及凋亡，保障牙髓中细胞的存活率；使用拔髓针对凝聚的牙髓进行剥离,释放其中的干细胞，避免使用胶原酶酶等对牙髓干细胞的损伤，可以排除消化过程对牙髓干细胞的损伤，使牙髓干细胞提取成功率达到100%，应用简单方便。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种牙髓干细胞制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）牙髓的运输，把牙髓干细胞的运输箱交于供者，供者接收到运输箱后，把运输箱中的取样瓶放至冷藏冰箱，医用冰袋放至冷冻冰箱，供者乳牙自行脱落后，采取乳牙放入取样瓶中，把取样瓶及医用冰袋放回运输箱中，24小时内运回实验室；
（2）牙髓干细胞的分离，把乳牙从取样瓶取出，用生理盐水清洗乳牙后，用镊子夹住牙齿冠部，再用注射器吸取生理盐水从牙根断面向里吹打牙髓腔，冲洗松动牙髓；使用拔髓针从牙根断处插入牙髓腔中，慢慢拧动，向外轻拉，取出牙髓，放至离心管中，用注射器重新吸取生理盐水，冲洗牙髓腔一次，收集两次冲洗牙髓腔的生理盐水加入放置牙髓的离心管中，离心去除生理盐水，收集牙髓；
（3）牙髓干细胞的扩增培养，取完全培养基，重悬牙髓沉淀，并转移到12孔板中；用一个拔髓针固定牙髓，用另一个拔髓针上的倒钩剥离牙髓，使牙髓形成细小碎片，释放其中的细胞，然后放在37℃、5％ CO2、饱和湿度条件下培养。
2.根据权利要求1所述的牙髓干细胞制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述取样瓶内放置有运输液，所述运输液配方为每100ml含有:注射用葡萄糖钙0.1ml、注射用人血白蛋白5ml、注射用右旋糖苷40葡萄糖注射液44.9ml，注射用三磷酸腺苷50ml，青霉素钠2万单位，硫酸链霉素2万单位。
3.根据权利要求1所述的牙髓干细胞制备方法，其特征在于，步骤（3）中，使用拔髓针上的倒钩把牙髓剥离为1-2mm3细小碎片。
CN201910606448.0A 2019-07-05 2019-07-05 一种牙髓干细胞制备方法 Pending CN110468098A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910606448.0A CN110468098A (zh) 2019-07-05 2019-07-05 一种牙髓干细胞制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910606448.0A CN110468098A (zh) 2019-07-05 2019-07-05 一种牙髓干细胞制备方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110468098A true CN110468098A (zh) 2019-11-19

Family

ID=68507105

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910606448.0A Pending CN110468098A (zh) 2019-07-05 2019-07-05 一种牙髓干细胞制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110468098A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111334465A (zh) * 2019-12-30 2020-06-26 上海循益生物技术有限公司 一种牙髓间充质干细胞的制备方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101717750A (zh) * 2009-12-09 2010-06-02 中国人民解放军第四军医大学 人牙髓干细胞库的构建方法
CN102807967A (zh) * 2012-08-31 2012-12-05 沙船（天津）生物科技发展有限公司 乳牙牙髓在制备间充质干细胞中的应用和乳牙牙髓间充质干细胞的培养方法
CN105602895A (zh) * 2016-02-02 2016-05-25 江苏赫柏慧康再生医疗技术研究院有限公司 一种乳牙牙髓间充质干细胞的制备方法
CN107177546A (zh) * 2017-07-20 2017-09-19 深圳市茵冠生物科技有限公司 一种人牙髓干细胞培养基及人牙髓干细胞的制备方法
CN107970258A (zh) * 2017-11-20 2018-05-01 英普乐孚生物技术(上海)有限公司 一种嵌合抗原受体t细胞制剂

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101717750A (zh) * 2009-12-09 2010-06-02 中国人民解放军第四军医大学 人牙髓干细胞库的构建方法
CN102807967A (zh) * 2012-08-31 2012-12-05 沙船（天津）生物科技发展有限公司 乳牙牙髓在制备间充质干细胞中的应用和乳牙牙髓间充质干细胞的培养方法
CN105602895A (zh) * 2016-02-02 2016-05-25 江苏赫柏慧康再生医疗技术研究院有限公司 一种乳牙牙髓间充质干细胞的制备方法
CN107177546A (zh) * 2017-07-20 2017-09-19 深圳市茵冠生物科技有限公司 一种人牙髓干细胞培养基及人牙髓干细胞的制备方法
CN107970258A (zh) * 2017-11-20 2018-05-01 英普乐孚生物技术(上海)有限公司 一种嵌合抗原受体t细胞制剂

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
杨雪超等: "成体人牙髓干细胞的分离与鉴定", 《中华口腔医学杂志》 *
邹智群等: "乳牙牙根吸收情况对乳牙牙髓干细胞提取结果的影响", 《中国组织工程研究》 *
霍永标等: "乳牙牙髓干细胞库的构建及其研究进展", 《国际口腔医学杂志》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111334465A (zh) * 2019-12-30 2020-06-26 上海循益生物技术有限公司 一种牙髓间充质干细胞的制备方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6767740B2 (en) Stem cell and dental pulp harvesting method and apparatus
CN105586309B (zh) 一种获得安全、有效的脐带间充质干细胞的方法
US4553272A (en) Regeneration of living tissues by growth of isolated cells in porous implant and product thereof
CN108823156A (zh) 用于修复的临床级人脐带间充质干细胞复合因子及冻干粉的制备方法
CN105941390B (zh) 一种牙髓或牙髓干细胞的冻存液及其冻存方法
CN105907711A (zh) 乳牙间充质干细胞的制备方法及配合使用的试剂盒
CN107299082A (zh) 从组织中分离胎盘间质细胞并培养成间充质干细胞的方法
EP2467149B1 (en) Fluid from skin and omentum for medical use
CN101591644A (zh) 临床治疗用脐带间充质干细胞的制备和储存
CN109825469A (zh) 一种促进人源脐带间充质干细胞向软骨细胞分化的诱导方法
CN102154200A (zh) 临床治疗用脐带间充质干细胞的制备和保存
US20130217123A1 (en) Method for dental pulp cryopreservation
JP2022013659A (ja) 滑膜由来間葉系幹細胞の製造方法および関節治療用細胞製剤の製造方法
AU2002364664A1 (en) Device for active phase cell or tissue sampling and uses thereof
CN106701682A (zh) 由脐血分离造血干细胞并扩增cd34阳性细胞的方法
CN110468098A (zh) 一种牙髓干细胞制备方法
CN108949682A (zh) 一种牙髓间充质干细胞的制备、培养及纯化方法
CN107338219A (zh) 一种胎盘间充质干细胞的分离及培养方法
CN112640890A (zh) 在细胞培养中延缓细胞生长的细胞保存液及其制备方法
CN109628388A (zh) 用消化酶组合物从胎盘血管分离间充质干细胞
CN105695401B (zh) 一种脐带动脉和静脉血管周干细胞的制备和保存方法
CN111840330A (zh) 一种防脱发修复组合物及应用
CN110237026A (zh) 一种透明质酸钠复合脂肪干细胞条件培养基冻干制剂
CN109666634A (zh) 一种脂肪间充质干细胞分离培养及制剂制备方法
CN111172106B (zh) 一种从人胎盘或脐带中提取间充质干细胞及提取其分泌物的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination