CN112640890A - 在细胞培养中延缓细胞生长的细胞保存液及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种在细胞培养中延缓细胞生长的细胞保存液，包括硫代硫酸钠、甘露醇、蔗糖、人血白蛋白、磷酸缓冲液。本发明通过提出一种在细胞培养中延缓细胞生长的细胞保存液及其制备方法，以解决相关技术中细胞保存液中的细胞生长过快的技术问题。
Description
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种在细胞培养中延缓细胞生长的细胞保存液及其制备方法。
背景技术
间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一种具有较强自我更新能力和多向分化能力的成体干细胞。间充质干细胞的来源广泛，可以从牙髓、骨髓、脐带血、脐带、脂肪、毛囊等组织中提取；并且，在一定的诱导条件下，其可向成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞等细胞组织分化。间充质干细胞的优点诸多：其能支持造血和促进造血干细胞植入、调节免疫、旁分泌促进组织修复作用以及分离培养操作简便等；并且相较于原始胚胎干细胞，其安全性能更高。基于上述优点，间充质干细胞在移植物抗宿主病、类风湿性关节炎、联合造血干细胞移植、肝纤维化、糖尿病足等方面得到了广泛的临床应用。基于上述优点，自体间充质干细胞在组织工程以及器官工程上，成为一种安全可靠的种子细胞。
脐带间充质干细胞(UC-MSCs)已经广泛应用于细胞移植替代治疗。而移植和替代治疗中细胞的活性与细胞质量是治疗成功的关键，脐带间充质干细胞培养之后，直至移植手术和操作之前，都是采用临床常用细胞保存液对UC-MSCs进行短期保存。相关技术中，处于细胞保存液中的UC-MSCs会继续生长，取用时，部分UC-MSCs可能处于衰亡期，从而造成UC-MSCs活性与质量的下降，影响治疗效果。
发明内容
针对现有技术中所存在的不足，本发明提供了一种在细胞培养中延缓细胞生长的细胞保存液及其制备方法，以解决相关技术中细胞保存液中的细胞生长过快的技术问题。
本发明提供了一种在细胞培养中延缓细胞生长的细胞保存液，包括硫代硫酸钠、甘露醇、蔗糖、人血白蛋白、磷酸缓冲液。
可选地，其质量百分数占比为：
硫代硫酸钠 1～5％；
甘露醇 0.1～0.5％；
蔗糖 0.05～0.2％；
人血白蛋白 10～20％；
磷酸缓冲液 74.3～88.85％。
本发明还提供一种细胞保存液的制备方法，所述制备方法的步骤包括：
按指定比例分别取硫代硫酸钠、甘露醇、蔗糖、人血白蛋白、磷酸缓冲液，然后将硫代硫酸钠、甘露醇、蔗糖、人血白蛋白于磷酸缓冲液中溶解，得细胞保存液；
将细胞保存液于小于或者等于5℃下，密封避光保存。
本发明还提供一种细胞保存方法，采用如上所述的在细胞培养中延缓细胞生长的细胞保存液。
可选地，所述细胞为脐带间充质干细胞。
可选地，细胞保存的具体步骤包括：
弃培养中细胞的培养基，取细胞保存液加入细胞中；其中，每毫升细胞保存液与每平方厘米细胞培养面积的比例为0.1～0.15：1；
密封，阶梯降温，保藏。
可选地，所述阶梯降温的具体步骤包括：
先将加入保存液的细胞以5℃/min的降温速度降至20℃；然后以3℃/min的降温速度降至10℃；最后以1℃/min的降温速度降至4℃。
本发明还提供一种如上所述的细胞保存液在保存脐带间充质干细胞中的应用。
本发明还提供一种如上所述的细胞保存液在延缓细胞生长中的应用。
本发明还提供一种在细胞培养中延缓细胞生长的细胞保存液的制备方法，将细胞加入如权利要求1或2所述的在细胞培养中延缓细胞生长的细胞保存液中，密封，小于或者等于5℃下，避光保存。
可选地，所述保存温度为4℃。
相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：
本发明技术中，通过设置细胞保存液的组分及各组分占比，以延缓培养中的细胞生长，从而减小细胞在保存液中的凋亡、维持细胞的活性，以在从保存液中取出细胞时，可继续从存入保存液中的细胞生长环节处培养细胞，细胞的活性与质量得到保证。如此，降低了细胞冻存成本、培养成本，延长了细胞培养的时间。并且，通过本发明的细胞保存液保存的细胞，可在保证其干细胞性能的基础上，对细胞低温保存7天。
附图说明
图1为本发明一实施例中脐带间充质干细胞在细胞保存液中的电镜图；
图2至图5为本发明一实施例中脐带间充质干细胞在细胞保存液中的流式检测图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及有益效果更加清楚明白，下面结合附图及实施例对本发明中的技术方案进一步说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明提供了一种在细胞培养中延缓细胞生长的细胞保存液，包括硫代硫酸钠、甘露醇、蔗糖、人血白蛋白、磷酸缓冲液。
可选地，其质量百分数占比为：
硫代硫酸钠 1～5％；
甘露醇 0.1～0.5％；
蔗糖 0.05～0.2％；
人血白蛋白 10～20％；
磷酸缓冲液 74.3～88.85％。
本发明还提供一种细胞保存液的制备方法，所述制备方法的步骤包括：
按指定比例分别取硫代硫酸钠、甘露醇、蔗糖、人血白蛋白、磷酸缓冲液，然后将硫代硫酸钠、甘露醇、蔗糖、人血白蛋白于磷酸缓冲液中溶解，得细胞保存液；
将细胞保存液于小于或者等于5℃下，密封避光保存。
本发明还提供一种细胞保存方法，采用如上所述的在细胞培养中延缓细胞生长的细胞保存液。
可选地，所述细胞为脐带间充质干细胞。
可选地，细胞保存的具体步骤包括：
弃培养中细胞的培养基，取细胞保存液加入细胞中；其中，每毫升细胞保存液与每平方厘米细胞培养面积的比例为0.1～0.15：1；
密封，阶梯降温，保藏。
可选地，所述阶梯降温的具体步骤包括：
先将加入保存液的细胞以5℃/min的降温速度降至20℃；然后以3℃/min的降温速度降至10℃；最后以1℃/min的降温速度降至4℃。
本发明还提供一种如上所述的细胞保存液在保存脐带间充质干细胞中的应用。
本发明还提供一种如上所述的细胞保存液在延缓细胞生长中的应用。
本发明还提供一种在细胞培养中延缓细胞生长的细胞保存液的制备方法，将细胞加入如权利要求1或2所述的在细胞培养中延缓细胞生长的细胞保存液中，密封，小于或者等于5℃下，避光保存。
可选地，所述保存温度为4℃。
本发明技术方案中，由于优化设计了细胞保存液的组分以及各组分在细胞保存液中的占比，在不影响间充质干细胞特性的前提下，大大延长了细胞培养的时间，延长了细胞凋亡的时间，给相关作业人员可以更灵活的处理细胞。
为进一步对本发明一种在细胞培养中延缓细胞生长的细胞保存液的效果进行深入的说明，选用以下实施例进行详细阐述。应当理解，下列实施例仅用于说明本发明中细胞保存液的效果，并不限制本发明的在细胞培养中延缓细胞生长的细胞保存液。
需要说明的是，下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、器材等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例脐带间充质干细胞的培养和保存
1、实验操作：
步骤S1，取脐带，分别检测其HbsAg、抗-HCV、抗-HDV、抗-HIV、抗-TP、CWV-lgM，至检测结果均为阴性，将采集的脐带放入装有保护剂的无菌瓶中，4℃保存并运输至无菌实验室，用75％酒精擦拭表面后，放入生物安全柜中，备用；
步骤S2，取出脐带，使其恢复至室温，分离；其中，分离的具体步骤包括：分离脐带组织，将脐静脉和脐动脉去除，剥离华通氏胶、洗涤；
步骤S3，将步骤S2中得到的华通氏胶剪碎为1～3mm的组织块；
步骤S4，将步骤S3中得到的组织块接种至T75培养瓶中，摇晃T75培养瓶瓶身，使组织块均匀分散至T75培养瓶瓶底；每一T75培养瓶中添加15mL间充质干细胞完全培养基(优选地，间充质干细胞完全培养基为无血清培养基)，然后将T75培养瓶置于37℃、5％二氧化碳浓度、95％饱和湿度的培养箱中静置培养7～20天；
步骤S5，将步骤S4中的组织块于培养箱中培养至7天时，对培养基进行半量换液作业；具体地，吸弃旧培养基中的8mL培养基，然后加入等量新鲜的完全培养基；更换完毕后，放置入培养箱中继续培养；之后，每3～4天进行培养基的半量换液作业；
步骤S6，培养至15天左右，可观察到细胞从组织块中迁出，至迁出的细胞融合度达到80％～90％，收取脐带间充质干细胞；
具体地，轻轻拍打培养瓶，以使大部分组织块脱落，然后将组织块与旧培养基一同吸弃；加入适量生理盐水，并轻轻摇晃培养瓶，至生理盐水完全浸润培养瓶瓶底，然后将生理盐水吸弃，以实现对培养瓶的重复洗涤；向洗涤后的培养瓶中加入消化液，至培养瓶地面完全浸润，静置1min，摇晃培养瓶，以使消化液充分接触细胞，通过显微镜观察90％细胞皱缩变圆，轻拍培养瓶，细胞脱落后，向培养瓶中加入完全培养基以终止消化；最后，将含有脐带间充质干细胞的细胞悬液转移至离心管中，计数，得到原代脐带间充质干细胞；
步骤S7，将步骤S6中得到的原代脐带间充质干细胞用完全培养基重悬后，以一定细胞浓度接种至新的培养瓶中，例如但不限于，该脐带间充质干细胞的细胞浓度为10000个/cm2，该培养瓶为T150培养瓶；将培养瓶摇匀，并将培养瓶放入培养箱中培养；其中，培养箱的培养条件为：37℃、5.0％二氧化碳浓度、95％饱和湿度；培养7～20天，至细胞融合度达到60％左右，消化液获取细胞，得到第一代脐带间充质干细胞；
步骤S8，重复上述细胞培养作业，至细胞融合度达到60％左右，消化液获取细胞，得到目的代脐带间充质干细胞；
步骤S9，对培养中的脐带间充质干细胞的保存：吸弃步骤S8中的培养中的细胞培养基，加入本申请中申请保护的细胞保存液，然后将培养瓶的透气盖更换为密封盖，以对培养中的细胞进行密封保存，然后将培养瓶的温度从室温阶梯降低至4℃，避光保存。
2、不同细胞保存液的配比
实施例1
1.1、细胞保存液为：1％硫代硫酸钠、0.1％甘露醇、0.1％蔗糖、10％人血白蛋白及88.8％磷酸缓冲液。
1.2、将培养中的细胞进行细胞保存的方法：取正在培养中的融合度至60％左右的脐带间充质干细胞进行细胞保存，吸弃原培养基，按每T75瓶10mL细胞保存液(或每T150瓶18mL细胞保存液、或每T175瓶20mL细胞保存液)取细胞保存液；然后将取得的细胞保存液加入培养瓶中，并完全浸没脐带间充质干细胞；用封口膜密封培养瓶上的透气瓶盖，以对细胞进行密封保存；然后将密封好的培养瓶经降温程序进行降温后移至4℃冰箱中保存，其中，降温程序包括：先以5℃/min的降温速度降低至20℃，然后以3℃/min的降温速度降低至10℃，最后以1℃/min的降温速度降低至4℃；保存期不超过7天，在保存期间内，需要继续培养或使用时，直接取出培养瓶、更换完全培养基继续培养即可。并得到如图1所示的处于细胞保存液中的细胞生长图。
1.3结果分析：由图1可知，从将培养中的细胞放置入本申请中的申请保护的细胞保存液中的第三天时，细胞开始出现皱缩，但是并没有脱落；至在细胞保存液中保存6天后，大部分细胞已未见明显羧型形态；对细胞复培4.5小时后，脐带间充质干细胞恢复正常形态。可知，本发明申请保护的细胞保存液能在低温条件下很好地减缓细胞的新陈代谢，对细胞进行复培作业后，细胞能很好恢复原有状态。
实施例2
2.1、细胞保存液为：2.5％硫代硫酸钠、0.25％甘露醇、0.05％蔗糖、15％人血白蛋白及82.2％磷酸缓冲液。
2.2、将培养中的细胞进行细胞保存的方法：取正在培养中的融合度至60％左右的脐带间充质干细胞进行细胞保存，吸弃原培养基，按每T75瓶10mL细胞保存液(或每T150瓶18mL细胞保存液、或每T175瓶20mL细胞保存液)取细胞保存液；然后将取得的细胞保存液加入培养瓶中，并完全浸没脐带间充质干细胞；用封口膜密封培养瓶上的透气瓶盖，以对细胞进行密封保存；然后将密封好的培养瓶经降温程序进行降温后移至4℃冰箱中保存，其中，降温程序包括：先以5℃/min的降温速度降低至20℃，然后以3℃/min的降温速度降低至10℃，最后以1℃/min的降温速度降低至4℃；保存期不超过7天，在保存期间内，需要继续培养或使用时，直接取出培养瓶、更换完全培养基继续培养即可。
实施例3
3.1、细胞保存液为：5％硫代硫酸钠、0.5％甘露醇、0.2％蔗糖、20％人血白蛋白及74.3％磷酸缓冲液。
3.2、将培养中的细胞进行细胞保存的方法：取正在培养中的融合度至60％左右的脐带间充质干细胞进行细胞保存，吸弃原培养基，按每T75瓶10mL细胞保存液(或每T150瓶18mL细胞保存液、或每T175瓶20mL细胞保存液)取细胞保存液；然后将取得的细胞保存液加入培养瓶中，并完全浸没脐带间充质干细胞；用封口膜密封培养瓶上的透气瓶盖，以对细胞进行密封保存；然后将密封好的培养瓶经降温程序进行降温后移至4℃冰箱中保存，其中，降温程序包括：先以5℃/min的降温速度降低至20℃，然后以3℃/min的降温速度降低至10℃，最后以1℃/min的降温速度降低至4℃；保存期不超过7天，在保存期间内，需要继续培养或使用时，直接取出培养瓶、更换完全培养基继续培养即可。
3、对处于细胞保存液中的脐带间充质干细胞的流式检测
3.1实验操作：分别于第一天、第三天、第五天及第七天时，取实施例1中的在细胞保存液中的细胞进行细胞的流式检测实验，并得到如图2至5所示的结果。
3.2结果分析：由图2至4可知，对处于细胞保存液中的细胞进行流式检测，细胞的各标志物均合格，且处于稳定状态。由图5可知，对进行细胞保存后的细胞进行复培作业4.5小时后，细胞的各标志物均合格，并且与第一天的细胞相比，其各项标志物未见明显差异。可知，经本发明申请保护的细胞保存液可有效保护细胞的性能，并且在细胞保存期间延缓细胞的生长。
综上，本发明提供的细胞保存液有效降低了细胞的冻存保存成本及培养成本。通过本发明中的细胞保存液有效延长了细胞培养的时间，延长了细胞的生长周期，有利于细胞培养行业的发展。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (9)
1.一种在细胞培养中延缓细胞生长的细胞保存液，其特征在于，包括硫代硫酸钠、甘露醇、蔗糖、人血白蛋白、磷酸缓冲液。
2.如权利要求1所述的在细胞培养中延缓细胞生长的细胞保存液，其特征在于，其质量百分数占比为：
硫代硫酸钠 1～5％；
甘露醇 0.1～0.5％；
蔗糖 0.05～0.2％；
人血白蛋白 10～20％；
磷酸缓冲液 74.3～88.85％。
3.一种细胞保存液的制备方法，其特征在于，所述制备方法的步骤包括：
按指定比例分别取硫代硫酸钠、甘露醇、蔗糖、人血白蛋白、磷酸缓冲液，然后将硫代硫酸钠、甘露醇、蔗糖、人血白蛋白于磷酸缓冲液中溶解，得细胞保存液；
将细胞保存液于小于或者等于5℃下，密封避光保存。
4.一种细胞保存方法，其特征在于，采用如权利要求1或2所述的在细胞培养中延缓细胞生长的细胞保存液。
5.如权利要求4所述的细胞保存方法，其特征在于，所述细胞为脐带间充质干细胞。
6.如权利要求4所述的细胞保存方法，其特征在于，细胞保存的具体步骤包括：
弃培养中细胞的培养基，取细胞保存液加入细胞中；其中，每毫升细胞保存液与每平方厘米细胞培养面积的比例为0.1～0.15：1；
密封，阶梯降温，保藏。
7.如权利要求6所述的细胞保存方法，其特征在于，所述阶梯降温的具体步骤包括：
先将加入保存液的细胞以5℃/min的降温速度降至20℃；然后以3℃/min的降温速度降至10℃；最后以1℃/min的降温速度降至4℃。
8.如权利要求1或2所述的细胞保存液在保存脐带间充质干细胞中的应用。
9.如权利要求1或2所述的细胞保存液在延缓细胞生长中的应用。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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