CN107912421A

CN107912421A - 一种用于骨髓间充质干细胞移植的干细胞保存液

Info

Publication number: CN107912421A
Application number: CN201711153485.8A
Authority: CN
Inventors: 陈永平; 陈达之; 萧云蕾; 许烂漫; 李骥; 卢明芹; 金晓芝
Original assignee: First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University
Current assignee: First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University
Priority date: 2017-11-20
Filing date: 2017-11-20
Publication date: 2018-04-17

Abstract

本发明公开了一种用于骨髓间充质干细胞移植的干细胞保存液，所述干细胞保存液包括血浆、低分子量肝素钠、磷酸氢二钾溶液和腺苷；其中：血浆中含有大量白蛋白，可提供细胞所需的营养支持，且有合适的渗透压和较合适的电解质及缓冲对，可维持细胞正常活性；低分子量肝素钠可抑制骨髓间充质干细胞粘附；磷酸氢二钾溶液为细胞提供稳定的外环境支持；腺苷可促进细胞的自我修复能力，发挥保护作用，维持细胞增殖能力。因此，本发明所述干细胞保存液采用血浆、低分子量肝素钠、磷酸氢二钾溶液和腺苷为主要成分，使骨髓间充质干细胞在离体后保持较高活性，减少细胞因未及时输回体内造成的损失，并避免细胞间粘附成团，且细胞复温后能保证较高的增殖能力。

Description

一种用于骨髓间充质干细胞移植的干细胞保存液

技术领域

本发明属于生物医学领域，涉及细胞保存液，具体涉及干细胞保存液，特别地，涉及骨髓间充质干细胞保存液。

背景技术

干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞，具有不断自我繁殖的能力。目前，干细胞研究主要集中在成体干细胞、胚胎干细胞、诱导性多能干细胞。间充质干细胞是一类中胚层来源的有多向分化能力的干细胞，广泛存在于全身各种组织中。因其具有极低的免疫原性和较强的免疫调节能力，间充质干细胞在造血重建、免疫治疗和组织修复等领域具有非常广阔的临床应用前景。其中，骨髓间充质干细胞因易获取、损伤小等特点被广泛应用。

目前，国内能实现人骨髓间充质干细胞分离并大规模培养的医疗机构非常少。鉴于骨髓间充质干细胞广泛的临床用途，骨髓间充质干细胞保存液的研究至关重要，甚至决定着干细胞的应用推广和治疗效果。

临床上骨髓间充质干细胞自患者体内取出后经分离试剂盒处理，与生理盐水混合后必须立即输回体内，不能长期保存。实验研究中常规的细胞保存液含有DMSO，即二甲基亚砜，是一种渗透性保护剂，能够降低细胞冰点，减少冰晶形成，减少自由基对细胞的损害。

但DMSO存在一定的毒性作用，可与蛋白质疏水基团发生作用，导致蛋白质变性，具有血管毒性和肝肾毒性。用含DMSO 的保存液保存细胞时，要求超低温保存。并且，移植前要先复温至37℃并通过离心去除细胞保存液，获得的细胞沉淀再用生理盐水重悬输入受者体内。这一过程增加了细胞污染的可能性，同时细胞的活力也受到破坏。

因此亟需一种低毒性骨髓间充质干细胞保存液，并且，在所述保存液中，干细胞不需要超低温保存，低温即可。

发明内容

为了克服上述问题，本发明人进行了锐意研究，采用血浆、磷酸二氢钾、低分子量肝素钠和腺苷为主要成分的干细胞保存液，其中，血浆可维持细胞正常活性，低分子量肝素钠可用来抑制骨髓间充质干细胞粘附，磷酸二氢钾为细胞提供稳定的外环境支持，腺苷可促进细胞的自我修复能力，发挥保护作用，从而完成本发明。

本发明的一方面在于提供一种用于骨髓间充质干细胞移植的干细胞保存液，具体体现在以下几个方面：

(1)一种用于骨髓间充质干细胞移植的干细胞保存液，其中，所述干细胞保存液包括血浆、低分子量肝素钠、磷酸氢二钾溶液和腺苷。

(2)根据上述(1)所述的干细胞保存液，其中，所述干细胞保存液包括100％血浆、400～700U/mL低分子量肝素钠、 40～70mmol/L磷酸氢二钾溶液和0.4～10μmol/L腺苷。

(3)根据上述(1)或(2)所述的干细胞保存液，其中，所述干细胞保存液包括100％血浆、500～600U/mL低分子量肝素钠、终浓度为50～60mmol/L磷酸氢二钾溶液和2～10μmol/L 腺苷；

优选地，所述干细胞保存液包括100％血浆、550～600U/mL 低分子量肝素钠、终浓度为55～60mmol/L磷酸氢二钾溶液和5～10μmol/L腺苷，优选10μmol/L腺苷。

(4)根据上述(1)至(3)之一所述的干细胞保存液，其中，

所述血浆优选与骨髓间充质干细胞同源；和/或

所述低分子量肝素钠的分子量为400～600Da；和/或

所述磷酸氢二钾溶液的内毒素含量<5EU/mL；和/或

所述腺苷的内毒素含量<5EU/mL。

(5)根据上述(1)至(4)之一所述的干细胞保存液，其中，所述干细胞保存液还包括表没食子儿茶素没食子酸酯 (EGCG)。

(6)根据上述(1)至(5)之一所述的干细胞保存液，其中，所述表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)的用量为1～20 mg/mL，优选为5～10mg/mL。

(7)根据上述(1)至(6)之一所述的干细胞保存液，其中，所述干细胞保存液还包括非渗透性低温保护剂；

优选地，所述非渗透性低温保护剂选自海藻糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖、甘露醇、山梨醇、聚合物羟乙基淀粉和聚乙烯吡咯烷酮中的一种或多种；

更优选地，所述非渗透性低温保护剂选自海藻糖、葡萄糖、甘露醇、山梨醇和聚合物羟乙基淀粉中的一种或几种，例如海藻糖和/或甘露醇。

(8)根据上述(1)至(7)之一所述的干细胞保存液，其中，所述非渗透性低温保护剂的用量为1～10mg/mL，优选为2～8mg/mL，更优选为4～6mg/mL。

(9)根据上述(1)至(8)之一所述的干细胞保存液，其中，所述干细胞保存液还包括人参皂苷Rb1。

(10)根据上述(1)至(9)之一所述的干细胞保存液，其中，人参皂苷Rb1的用量为0.5～10mg/mL，优选为1～5 mg/mL。

附图说明

图1A和图1B示出实验例1培养的人骨髓间充质干细胞的形态；

图2A～图2F示出实验例1P3代人BMSC的表型特征流式图；

图3A和图3B分别示出实验例1中人骨髓MSC经诱导后成骨和成脂鉴定图；

图4示出实验例2得到的细胞增殖率结果图。

具体实施方式

下面通过实施例和实验例对本发明进一步详细说明。通过这些说明，本发明的特点和优点将变得更为清楚明确。

本发明提供了一种用于骨髓间充质干细胞移植的干细胞保存液，所述干细胞保存液包括血浆、低分子量肝素钠、磷酸氢二钾溶液和腺苷。

其中：(1)骨髓间充质干细胞为贴壁细胞，有自发聚集粘附的特性，这使骨髓间充质干细胞的保存受到极大限制，而低分子量肝素有较长半衰期，生物活性高，出血副作用较肝素明显减少，不需监测凝血指标，故用其抑制骨髓间充质干细胞粘附；(2)血浆中含有大量白蛋白，可提供细胞所需的营养支持，且有合适的渗透压和较合适的电解质及缓冲对，可维持细胞正常活性，渗透压也有利于细胞吸收营养进行新陈代谢，保持活性；(3)但血浆中K离子偏低，且含有纤维蛋白原，若与游离钙离子结合，血浆则会凝固(也是由于这个原因，采用低分子量肝素钠而非低分子量肝素钙)，因此，我们可以添加部分钾盐为细胞提供稳定的外环境支持；(4)腺苷， C₁₀H₁₃N₅O₄，是一种遍布人体细胞的内源性核苷，可微调各种生命进程，是细胞维持自身稳态的重要物质，腺苷可促进细胞的自我修复能力，发挥保护作用，维持细胞增殖能力。

因此，在本发明中，提出一种骨髓间充质干细胞保存液，其主要成分包括血浆、低分子量肝素钠、磷酸二氢钾和腺苷，能使骨髓间充质干细胞在离体后较长时间保证其细胞活性，减少细胞粘附，并能维持细胞增殖能力。

根据本发明一种优选的实施方式，所述干细胞保存液包括 100％血浆、400～700U/mL低分子量肝素钠、40～70mmol/L磷酸氢二钾溶液和0.4～10μmol/L腺苷。

在进一步优选的实施方式中，所述干细胞保存液包括 100％血浆、500～600U/mL低分子量肝素钠、终浓度为50～60 mmol/L磷酸氢二钾溶液和2～10μmol/L腺苷。

在更进一步优选的实施方式中，所述干细胞保存液包括 100％血浆、550～600U/mL低分子量肝素钠、终浓度为55～60 mmol/L磷酸氢二钾溶液和5～10μmol/L腺苷，优选10μmol/L腺苷。

其中，所述血浆为临床批准的人用的冰冻血浆，优选与骨髓间充质干细胞同源；所述低分子量肝素钠的分子量为小于 8000Da；所述磷酸氢二钾溶液为无细菌、病毒、支原体污染，内毒素含量<5EU/mL，加入后溶液中钾离子浓度与细胞内钾离子浓度相似，这对于保持细胞内外的水平衡从而维持细胞的正常形态及其功能极为重要；所述腺苷为无细菌、病毒、支原体污染，内毒素含量<5EU/mL。在本发明中，发明人经过大量实验发现，腺苷的加入对维持细胞增殖能力具有重要作用，而10 μmol/L腺苷的作用最佳。

在本发明中，所述骨髓间充质干细胞保存液能使骨髓间充质干细胞在离体后保持较高活性，减少细胞因未及时输回体内造成的损失，并避免细胞间粘附成团，且细胞复温后能保证较高的增殖能力。

根据本发明一种优选的实施方式，所述干细胞保存液还包括表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)。

在进一步优选的实施方式中，所述表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)的用量为1～20mg/mL。

在更进一步优选的实施方式中，所述表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)的用量为5～10mg/mL。

其中，表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)是绿茶提取物中最有效的抗氧化多酚化合物，其还原性甚至可达L-异坏血酸的100倍，因此，将EGCG应用于干细胞保存液中，可以有效避免干细胞因被氧化而死亡，大大地提高了干细胞在保存期间的存活率。

根据本发明一种优选的实施方式，所述干细胞保存液还包括非渗透性低温保护剂。

在进一步优选的实施方式中，所述非渗透性低温保护剂选自海藻糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖、甘露醇、山梨醇、聚合物羟乙基淀粉和聚乙烯吡咯烷酮中的一种或多种。

在更进一步优选的实施方式中，所述非渗透性低温保护剂选自海藻糖、葡萄糖、甘露醇、山梨醇和聚合物羟乙基淀粉中的一种或几种，例如海藻糖和/或甘露醇。

其中，所述非渗透性低温保护剂用于干细胞在低温保存时的保护，具体地，所述非渗透性低温保护剂不能渗入导致细胞外浓度增大，在低温下(5℃以下)形成反渗透而脱水，减少细胞内冰晶的形成，对细胞膜具有保护作用。

根据本发明一种优选的实施方式，所述非渗透性低温保护剂的用量为1～10mg/mL。

在进一步优选的实施方式中，所述非渗透性低温保护剂的用量为2～8mg/mL。

在更进一步优选的实施方式中，所述非渗透性低温保护剂的用量为4～6mg/mL。

其中，加入适量的非渗透性低温保护剂可以保护细胞骨架的完整性，防止细胞水肿。

根据本发明一种优选的实施方式，所述干细胞保存液还包括人参皂苷Rb1。

其中，人参皂苷Rb1是从人参中提取的生物活性物质，将其应用于干细胞保存液中可以抑制细胞凋亡，提成细胞的生物活性，进一步提高干细胞在保存过程中的存活率。

在进一步优选的实施方式中，人参皂苷Rb1的用量为 0.5～10mg/mL。

在更进一步优选的实施方式中，人参皂苷Rb1的用量为 1～5mg/mL。

具体地，人参皂苷Rb1可以抑制促凋亡基因Bax、Bad、Fas 的表达，以提高细胞活性。

因此，在本发明中，开发了一种新型骨髓干细胞保存液，其主要成分为血浆、低分子量肝素钠、磷酸氢二钾溶液和腺苷，使骨髓间充质干细胞在离体后较长时间保证其细胞活性，减少细胞粘附，并能维持细胞增殖能力。另外，为了进一步提高干细胞的活性，即提高其保存期间的存活率，所述干细胞保存液还可以包括表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、非渗透性低温保护剂和人参皂苷Rb1中的一种或多种。

本发明所具有的有益效果包括：

(1)本发明所述干细胞保存液采用血浆、低分子量肝素钠、磷酸氢二钾溶液和腺苷为主要成分，使骨髓间充质干细胞在离体后保持较高活性，减少细胞因未及时输回体内造成的损失，并避免细胞间粘附成团，且细胞复温后能保证较高的增殖能力；

(2)本发明所述干细胞保存液还可以包括表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、非渗透性低温保护剂和人参皂苷Rb1 中的一种或多种，进一步提高干细胞在保存期间的细胞活性，即提高细胞存活率；

(3)本发明所述干细胞保存液无毒，并且无需液氮超低温保存，于低温(4℃)左右保存即可，并且细胞的存活率达到90％以上；

(4)本发明所述干细胞保存液可使骨髓间充质干细胞于 4℃在72小时内保持相应的细胞活力和增殖能力，且复温至 37℃后可直接输回人体内，避免后续操作对干细胞活性减弱及污染可能。

实施例骨髓间充质干细胞保存液配制

以下通过具体实施例进一步描述本发明。不过这些实施例仅仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。

实施例1

取6mmol磷酸二氢钾溶于10mL生理盐水中，制成600 mmol/L磷酸二氢钾溶液，高温消毒灭菌后于4℃保存。

取5.35mg腺苷溶于2mL生理盐水中，0.22μ滤器过滤除菌，于4℃保存。

用血浆分别稀释、溶解磷酸二氢钾溶液、低分子量肝素钠和腺苷，配制以下干细胞保存液：包含血浆、500～600U/mL 低分子量肝素钠、50～60mmol/L磷酸氢二钾和0.5μmol/L腺苷。溶液于4℃保存。

实施例2

用血浆分别稀释、溶解磷酸二氢钾溶液、低分子量肝素钠和腺苷，配制以下干细胞保存液：包含血浆、500～600U/mL 低分子量肝素钠、50～60mmol/L磷酸氢二钾和2μmol/L腺苷。溶液于4℃保存。

实施例3

用血浆分别稀释、溶解磷酸二氢钾溶液、低分子量肝素钠和腺苷，配制以下干细胞保存液：包含血浆、500～600U/mL 低分子量肝素钠、50～60mmol/L磷酸氢二钾和10μmol/L腺苷。调节其PH值为7.45±0.1。溶液于4℃保存。

实施例4

重复实施例3的过程，区别在于：再加入5mg/mL的表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)。

实施例5

重复实施例3的过程，区别在于：再加入5mg/mL的表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、1mg/mL的甘露醇和2mg/mL 的人参皂苷Rb1。

实施例6

重复实施例3的过程，区别在于：再加入2mg/mL的人参皂苷Rb1。

对比例骨髓间充质干细胞保存液配制

对比例1

重复实施例1的过程，区别在于：没有加入腺苷。

对比例2

重复实施例1的过程，区别在于：采用100％生理盐水代替 100％血浆。

实验例

实施例1髓间充质干细胞的分离、培养和鉴定

分离：

肝硬化患者签署知情同意书后至骨髓采集室，嘱患者取俯卧位，以髂后上棘为穿刺点，常规消毒铺巾，局部以利多卡因针浸润麻醉，取9号骨穿针穿刺，分多层多点以50mL无菌注射器针抽取骨髓约130-150mL(加上肝素钠抗凝剂共约200mL)；再将骨髓液经100目、300目滤器过滤至血液收集袋，拔除骨穿针，无菌辅料覆盖包扎，按压5min。密切观察穿刺点有无出血及患者生命体征情况。并将抽取的骨髓液送至层流细胞分离室超净工作台中行干细胞分离，同时分离相应血浆，进行病毒灭活出来。用临床上使用的骨髓干细胞分离试剂盒分离获取骨髓干细胞。

培养：

细胞以1×10⁴/mL种植于25cm²塑料培养瓶中，予含 10％FBS的α-MEM培养液培养。人骨髓BMSC经原代分离培养 72小时后换液可见培养瓶底有圆形或梭形贴壁细胞，并逐渐呈集落状生长、融合，镜下(100×)观察细胞形态均一、长梭形、漩涡状生长(如图1A和图1B所示)。

鉴定：

(1)流式鉴定：细胞分别予加入(FITC)-CD44、 (FITC)-CD13、(FITC)-CD29、(APC)-105、(APC)-HLA-DR、 (APC)-CD34、(PE)-CD73、(PE)-CD49d、(PE)-CD31等抗体孵育后上机流式检测；(2)成骨分化能力的鉴定：用人MSCs 成骨诱导培养基(广州赛业)根据说明书进行成骨诱导，并用 Alizarin Red S染色，镜下观察并拍照；(3)成脂分化能力的鉴定：用人MSCs成脂诱导培养基(广州赛业)进行成脂诱导，用Oil Red O染色，镜下观察并拍照。

P3代人BMSC的流式细胞鉴定结果示HLA-DR阴性CD44 阳性细胞占99.65％，其中CD31阴性细胞占99.78％；CD34阴性 CD13阳性细胞占99.51％，其中CD49d阴性细胞占99.07％； CD105阳性CD29阳性细胞占94.64％，其中CD73阳性细胞占 100％；该流式图说明分离的人MSCs与国际公认的人MSC表面标记一致，均为CD44、CD13、CD29、CD105、CD73基本为阳性，HLA-DR、CD34、CD49d、CD31基本为阴性(如图2A～图2F所示)。

人骨髓MSC经诱导后分别向成骨和成脂细胞分化。如图 3A所示，在成骨细胞中可见大小不一的红色颗粒，提示存在矿化基质沉积，另图3B中可见成脂细胞胞浆内脂滴形成，油红O染色阳性，其中，在图3A中，黑色区域即为上述“红色”，在图3B中，黑色区域即为上述“油红O染色”。

实验例2细胞增殖率的测定

将实验例1得到的人骨髓间充质干细胞分别用实施例1～3 所得保存液、对比例1所得保存液和生理盐水重悬至5×10⁵/mL。每种保存液重复3管，每管2.5mL，置于15mL灭菌离心管中， 4℃保存48小时。

水浴复温至37℃，200×g离心5分钟，弃上清，沉淀用含10％胎牛血清的完全培养基重悬，并调整细胞密度为4×10⁵/mL，接种于96孔板中，37℃，5％CO₂培养箱分别培养4、8、12、24、 36、48小时。在上述时间点用CCK8试剂盒检测细胞增殖率。

结果判断：酶标仪检测各孔吸光度值。细胞增殖率(％) ＝(时间点吸光度-无细胞培养基吸光度)/(4小时吸光度-无细胞培养基吸光度)×100％。结果如图4所示。

在图4中可以看出，(1)采用本发明所述保存液进行保存的干细胞的增殖率远高于采用生理盐水进行保存的干细胞的增殖率；(2)采用实施例3得到的保存液进行保存时，细胞的增殖率最高，在48h时几乎达到了生理盐水组的2倍；(3)采用本发明所述保存液进行保存的干细胞的增殖率也高于对比例1，说明，腺苷对维持细胞增殖率起到重要作用。

实验例3细胞存活率的测定

将实验例1得到的人骨髓间充质干细胞分别用实施例1～3 所得保存液、对比例1所得保存液和纯生理盐水重悬至 5×10⁵/mL。每种保存液重复3管，每管2.5mL，置于15mL灭菌离心管中，4℃保存。24小时后台盼蓝染色计数细胞存活率。

结果判断：显微镜下观察，死细胞被染成明显的蓝色，而活细胞拒染呈无色透明状。细胞存活率(％)＝(100-着色细胞数/细胞总数)×100％。结果如表1所示。

表1：

	细胞总数	着色细胞数	细胞存活率(％)
				实施例1	300	76±9	74.67±3.00
实施例2	300	58±7	80.67±2.33
				实施例3	300	25±5	91.67±1.67
实施例4	300	18±3	94.00±1.00
				实施例5	300	22±4	92.67±1.33
实施例6	300	15±3	95.00±1.00
				对比例1	300	89±10	70.33±3.33
对比例2	300	168±15	44.00±5.00
				生理盐水组	300	182±16	39.33±5.33

由上表1可知：采用本发明所述保存液进行保存的细胞存活率为生理盐水组的数倍，较好效果达到了90％以上。

以上结合优选实施方式和范例性实例对本发明进行了详细说明。不过需要声明的是，这些具体实施方式仅是对本发明的阐述性解释，并不对本发明的保护范围构成任何限制。在不超出本发明精神和保护范围的情况下，可以对本发明技术内容及其实施方式进行各种改进、等价替换或修饰，这些均落入本发明的保护范围内。本发明的保护范围以所附权利要求为准。

Claims

1.一种用于骨髓间充质干细胞移植的干细胞保存液，其特征在于，所述干细胞保存液包括血浆、低分子量肝素钠、磷酸氢二钾溶液和腺苷。

2.根据权利要求1所述的干细胞保存液，其特征在于，所述干细胞保存液包括100％血浆、400～700U/mL低分子量肝素钠、40～70mmol/L磷酸氢二钾溶液和0.4～10μmol/L腺苷。

3.根据权利要求1或2所述的干细胞保存液，其特征在于，所述干细胞保存液包括100％血浆、500～600U/mL低分子量肝素钠、终浓度为50～60mmol/L磷酸氢二钾溶液和2～10μmol/L腺苷；

优选地，所述干细胞保存液包括100％血浆、550～600U/mL低分子量肝素钠、终浓度为55～60mmol/L磷酸氢二钾溶液和5～10μmol/L腺苷，优选10μmol/L腺苷。

4.根据权利要求1至3之一所述的干细胞保存液，其特征在于，

所述血浆优选与骨髓间充质干细胞同源；和/或

所述低分子量肝素钠的分子量为400～600Da；和/或

所述磷酸氢二钾溶液的内毒素含量<5EU/mL；和/或

所述腺苷的内毒素含量<5EU/mL。

5.根据权利要求1至4之一所述的干细胞保存液，其特征在于，所述干细胞保存液还包括表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)。

6.根据权利要求1至5之一所述的干细胞保存液，其特征在于，所述表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)的用量为1～20mg/mL，优选为5～10mg/mL。

7.根据权利要求1至6之一所述的干细胞保存液，其特征在于，所述干细胞保存液还包括非渗透性低温保护剂；

8.根据权利要求1至7之一所述的干细胞保存液，其特征在于，所述非渗透性低温保护剂的用量为1～10mg/mL，优选为2～8mg/mL，更优选为4～6mg/mL。

9.根据权利要求1至8之一所述的干细胞保存液，其特征在于，所述干细胞保存液还包括人参皂苷Rb1。

10.根据权利要求1至9之一所述的干细胞保存液，其特征在于，人参皂苷Rb1的用量为0.5～10mg/mL，优选为1～5mg/mL。