CN110343662A - 一种促进骨髓间充质干细胞成骨分化的诱导方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种促进骨髓间充质干细胞成骨分化的诱导方法，包括以下步骤：S1、取骨髓细胞，接种于完全培养基中进行培养，待细胞长至80‑90％融合时消化并传代，获得纯化的骨髓间充质干细胞；S2、取第3‑5代骨髓间充质干细胞，先接种于完全培养基中进行培养，待细胞长至80‑90％融合时更换为成骨分化诱导培养基，进行成骨诱导分化。本发明能有效提高骨髓间充质干细胞分化成骨的效率，在骨修复领域具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种促进骨髓间充质干细胞成骨分化的诱导方法。
背景技术
骨髓间充质干细胞是一类具有自我增殖和广泛的多分化潜能的干细胞，具有来源丰富，易于分离培养、扩增和纯化，免疫原性低等特点，同种异体移植免疫排斥反应弱，是细胞移植治疗和组织工程器官构建的理想种子细胞，在组织修复和原位重建中具有广阔的应用前景。
成骨细胞是骨形成的物质基础，是一种重要的功能细胞。骨髓间充质干细胞具有良好的成骨分化潜能，可以应用于骨修复领域。通常的骨修复策略是将骨髓间充质干细胞在体外分离、扩增培养，进而诱导定向分化为成骨细胞，和支架材料复合后构建组织工程化骨植入体内。其关键在于如何诱导形成足够数量的成骨种子细胞。
发明内容
基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种促进骨髓间充质干细胞成骨分化的诱导方法，提高骨髓间充质干细胞成骨分化，形成成骨细胞的效率。
一种促进骨髓间充质干细胞成骨分化的诱导方法，包括以下步骤：
S1、取骨髓细胞，接种于完全培养基中进行培养，待细胞长至80-90％融合时消化并传代，获得纯化的骨髓间充质干细胞；
S2、取第3-5代骨髓间充质干细胞，先接种于完全培养基中进行培养，待细胞长至80-90％融合时更换为成骨分化诱导培养基，进行成骨诱导分化；
所述成骨分化诱导培养基包括含有10％胎牛血清的DMEM/F12培养基和以下终浓度的组分：地塞米松10-12nmol/L，抗坏血酸50-60μmol/L，β-甘油磷酸钠8-10mmol/L，表没食子儿茶素没食子酸酯200-250nmol/L，人参皂苷Rh240-80nmol/L，雷公藤甲素20-30nmol/L。
优选地，促进骨髓间充质干细胞成骨分化的诱导方法包括以下步骤：
S1、取骨髓细胞，按1-2×106/cm2的接种密度接种于培养皿中，用完全培养基进行培养，培养条件为5％CO2、37℃，48h后更换新鲜完全培养基，之后每1-2d更换一次新鲜完全培养基，待细胞长至80-90％融合时消化并传代，获得纯化的骨髓间充质干细胞；
S2、取第3-5代骨髓间充质干细胞，按1-2×105/cm2的接种密度接种于培养皿中，用完全培养基进行培养，待细胞长至80-90％融合时更换为成骨分化诱导培养基，进行成骨诱导分化，每2-3d更换一次新鲜成骨分化诱导培养基。
3、根据权利要求1或2所述的促进骨髓间充质干细胞成骨分化的诱导方法，其特征在于，所述步骤S1中，消化的具体步骤为：用0.25％的胰酶在37℃消化2-3min，然后添加完全培养基终止消化。
优选地，所述步骤S1中，每3-4d传一代。
优选地，所述完全培养基为含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基。
优选地，所述成骨分化诱导培养基的组分中，表没食子儿茶素没食子酸酯、人参皂苷、雷公藤甲素的摩尔比为10:2:1。
更优选地，所述成骨分化诱导培养基包括含有10％胎牛血清的DMEM/F12培养基和以下终浓度的组分：地塞米松10nmol/L，抗坏血酸50μmol/L，β-甘油磷酸钠8.5mmol/L，表没食子儿茶素没食子酸酯240nmol/L，人参皂苷Rh248nmol/L，雷公藤甲素24nmol/L。
本发明的有益效果如下：
本发明通过调节成骨分化诱导培养基的成分起到促进骨髓间充质干细胞成骨分化的效果，其中成骨分化诱导培养基包括含有10％胎牛血清的DMEM/F12培养基、地塞米松、抗坏血酸、β-甘油磷酸钠、表没食子儿茶素没食子酸酯、人参皂苷Rh2、雷公藤甲素。地塞米松能通过促进Cbfal mRNA和Osterix mRNA的表达而促进骨髓基质细胞向成骨细胞分化，β-甘油磷酸钠起到促进地塞米松诱导分化的作用，抗坏血酸能增加钙盐的沉积，促进矿化结节的形成。在此基础上，通过表没食子儿茶素没食子酸酯、人参皂苷Rh2和雷公藤甲素配合，能更有效地诱导P38MARK(丝裂原活化蛋白激酶亚族p38)以及ERK1/2(细胞外信号调节激酶1/2)的磷酸化，使BMP-2(人骨形态发生蛋白2)的表达增加，通过ERK、P38MARK通路以及TGF-β/BMPs通路的交互作用，大大增强骨髓间充质干细胞的成骨分化能力。本发明能有效提高骨髓间充质干细胞的成骨分化效率，在骨修复领域具有良好的应用前景。
具体实施方式
下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
实施例1
配制完全培养基和成骨分化诱导培养基，其中，完全培养基为含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基；成骨分化诱导培养基包括含有10％胎牛血清的DMEM/F12培养基和以下终浓度的组分：地塞米松10nmol/L，抗坏血酸50μmol/L，β-甘油磷酸钠8mmol/L，表没食子儿茶素没食子酸酯200nmol/L，人参皂苷Rh2 40nmol/L，雷公藤甲素20nmol/L。
取小鼠骨髓细胞，按1×106/cm2的接种密度接种于培养皿中，用完全培养基进行培养，培养条件为5％CO2、37℃，48h后更换新鲜完全培养基，之后每1d更换一次新鲜完全培养基，待细胞长至80％融合时，用0.25％的胰酶在37℃消化2min，然后添加完全培养基终止消化并传代，每3d传一代，获得纯化的小鼠骨髓间充质干细胞；
取第3代小鼠骨髓间充质干细胞，按1×105/cm2的接种密度接种于培养皿中，用完全培养基进行培养，待细胞长至80％融合时更换为成骨分化诱导培养基，进行成骨诱导分化，每2d更换一次新鲜成骨分化诱导培养基。
其中，完全培养基为含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基。
实施例2
实施例2与实施例1的区别仅为使用的成骨分化诱导培养基不同，具体使用的成骨分化诱导培养基包括含有10％胎牛血清的DMEM/F12培养基和以下终浓度的组分：地塞米松10nmol/L，抗坏血酸50μmol/L，β-甘油磷酸钠8.5mmol/L，表没食子儿茶素没食子酸酯240nmol/L，人参皂苷Rh2 48nmol/L，雷公藤甲素24nmol/L。
实施例3
实施例3与实施例1的区别仅为使用的成骨分化诱导培养基不同，具体使用的成骨分化诱导培养基包括含有10％胎牛血清的DMEM/F12培养基和以下终浓度的组分：地塞米松10nmol/L，抗坏血酸50μmol/L，β-甘油磷酸钠8mmol/L，表没食子儿茶素没食子酸酯250nmol/L，人参皂苷Rh2 80nmol/L，雷公藤甲素30nmol/L。
对比例1
对比例1与实施例1的区别仅为使用的成骨分化诱导培养基不同，具体使用的成骨分化诱导培养基为常规成骨分化诱导培养基，包括含有10％胎牛血清的DMEM/F12培养基和以下终浓度的组分：地塞米松10nmol/L，抗坏血酸50μmol/L，β-甘油磷酸钠10mmol/L。
对比例2
对比例2与实施例1的区别仅为使用的成骨分化诱导培养基不同，具体使用的成骨分化诱导培养基包括含有10％胎牛血清的DMEM/F12培养基和以下终浓度的组分：地塞米松10nmol/L，抗坏血酸50μmol/L，β-甘油磷酸钠8mmol/L，表没食子儿茶素没食子酸酯200nmol/L，人参皂苷Rh2 40nmol/L。
对比例3
对比例3与实施例1的区别仅为使用的成骨分化诱导培养基不同，具体使用的成骨分化诱导培养基包括含有10％胎牛血清的DMEM/F12培养基和以下终浓度的组分：地塞米松10nmol/L，抗坏血酸50μmol/L，β-甘油磷酸钠8mmol/L，表没食子儿茶素没食子酸酯200nmol/L，雷公藤甲素20nmol/L。
对比例4
对比例4与实施例1的区别仅为使用的成骨分化诱导培养基不同，具体使用的成骨分化诱导培养基包括含有10％胎牛血清的DMEM/F12培养基和以下终浓度的组分：地塞米松10nmol/L，抗坏血酸50μmol/L，β-甘油磷酸钠8mmol/L，人参皂苷Rh2 40nmol/L，雷公藤甲素20nmol/L。
试验例
将BALB/C纯系小鼠脱臼处死，75％乙醇浸泡5min，在无菌条件下分离双侧股骨及胫骨，用含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基冲洗骨髓腔，将骨髓冲入培养瓶，反复吹打制成单细胞悬液，在1000r/min条件下离心5min，收集得到小鼠骨髓细胞。
将获得的小鼠骨髓细胞按实施例1-3和对比例1-4的方法进行处理，待成骨诱导分化21d后，用PBS洗涤3次，加入4％多聚甲醛固定30min，再用蒸馏水洗涤3次，加入0.2％的茜素红S室温染色30min，然后弃去染色液，用蒸馏水洗涤3次，显微镜下观察并采集图像，对矿化面积百分比进行分析统计。统计结果如表1所示：
表1矿化面积百分比
由此可见，本发明的诱导方法能有效提高骨髓间充质干细胞分化成骨的效果。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种促进骨髓间充质干细胞成骨分化的诱导方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、取骨髓细胞，接种于完全培养基中进行培养，待细胞长至80-90％融合时消化并传代，获得纯化的骨髓间充质干细胞；
S2、取第3-5代骨髓间充质干细胞，先接种于完全培养基中进行培养，待细胞长至80-90％融合时更换为成骨分化诱导培养基，进行成骨诱导分化；
所述成骨分化诱导培养基包括含有10％胎牛血清的DMEM/F12培养基和以下终浓度的组分：地塞米松10-12nmol/L，抗坏血酸50-60μmol/L，β-甘油磷酸钠8-10mmol/L，表没食子儿茶素没食子酸酯200-250nmol/L，人参皂苷Rh240-80nmol/L，雷公藤甲素20-30nmol/L。
2.根据权利要求1所述的促进骨髓间充质干细胞成骨分化的诱导方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、取骨髓细胞，按1-2×106/cm2的接种密度接种于培养皿中，用完全培养基进行培养，培养条件为5％CO2、37℃，48h后更换新鲜完全培养基，之后每1-2d更换一次新鲜完全培养基，待细胞长至80-90％融合时消化并传代，获得纯化的骨髓间充质干细胞；
S2、取第3-5代骨髓间充质干细胞，按1-2×105/cm2的接种密度接种于培养皿中，用完全培养基进行培养，待细胞长至80-90％融合时更换为成骨分化诱导培养基，进行成骨诱导分化，每2-3d更换一次新鲜成骨分化诱导培养基。
3.根据权利要求1或2所述的促进骨髓间充质干细胞成骨分化的诱导方法，其特征在于，所述步骤S1中，消化的具体步骤为：用0.25％的胰酶在37℃消化2-3min，然后添加完全培养基终止消化。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的促进骨髓间充质干细胞成骨分化的诱导方法，其特征在于，所述步骤S1中，每3-4d传一代。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的促进骨髓间充质干细胞成骨分化的诱导方法，其特征在于，所述完全培养基为含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的促进骨髓间充质干细胞成骨分化的诱导方法，其特征在于，所述成骨分化诱导培养基的组分中，表没食子儿茶素没食子酸酯、人参皂苷、雷公藤甲素的摩尔比为10:2:1。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的促进骨髓间充质干细胞成骨分化的诱导方法，其特征在于，所述成骨分化诱导培养基包括含有10％胎牛血清的DMEM/F12培养基和以下终浓度的组分：地塞米松10nmol/L，抗坏血酸50μmol/L，β-甘油磷酸钠8.5mmol/L，表没食子儿茶素没食子酸酯240nmol/L，人参皂苷Rh2 48nmol/L，雷公藤甲素24nmol/L。
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