CN114836377B - 一种干细胞体外成骨诱导分化方法 - Google Patents

一种干细胞体外成骨诱导分化方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种干细胞体外成骨诱导分化方法，包括以下步骤：在成骨诱导的第7～14天添加鱿鱼多肽。该方法的提出可为人们从干细胞获得成骨细胞提供新的选择。该方法不仅可以有效促进成骨分化，且操作简便，有利于产业化实施和推广。

Description

一种干细胞体外成骨诱导分化方法
技术领域
本发明涉及细胞生物学技术领域，具体涉及一种干细胞体外成骨诱导分化方法。
背景技术
干细胞是一类具有自我更新和多向分化能力的细胞。干细胞包括胚胎干细胞和成体干细胞。常用的成体干细胞包括脂肪干细胞、骨髓间充质干细胞等。由于从脂肪组织提取干细胞取材容易，对供区损伤小，因此脂肪来源干细胞的研究已成为现阶段研究及应用的热点。研究发现脂肪来源的干细胞能被定向诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞、肌肉细胞及心肌细胞，可作为多种组织工程的种子细胞，在组织工程领域研究应用广泛。
多肽是α-氨基酸以肽键连接在一起而形成的化合物，由三个或三个以上氨基酸分子组成，是蛋白质水解的中间产物。多肽在干细胞成骨诱导分化方面已经有了一定的研究。例如，王晓龙等的研究指出鹿茸多肽可以促进ADSCs向成骨细胞转化。张郑瑶等的研究也表明鹿茸多肽纳米复合材料诱导兔骨髓间质细胞向成骨细胞分化的效应。目前，关于多肽在干细胞成骨诱导分化方面的研究还不多见，相关研究进展缓慢。因此提供一种新的有效促进干细胞体外成骨诱导分化的多肽及方法对领域内的相关研究及应用有重要的促进作用。
发明内容
发明人研究发现某些鱿鱼酶解多肽具有促成骨作用，可以用于干细胞体外成骨诱导分化。进一步研究发现这些鱿鱼酶解多肽可以在特定的诱导阶段发挥良好的作用。基于目前的研究成果，本申请提出一种干细胞体外成骨诱导方法。
本发明方案包括以下方面：
一种干细胞体外成骨诱导分化方法，包括以下步骤：在成骨诱导的第7～14天，添加鱿鱼多肽。
优选的，所述的鱿鱼多肽的制备方法，包括以下步骤：取鱿鱼蛋白，加入蒸馏水，加入胰蛋白酶酶解，水浴灭酶，冷却，离心，取上清液备用；进行超滤，收集分子量＜3kD滤出液，冷冻干燥，即得鱿鱼多肽。
优选的，酶解条件为：酶的用量为2～4w/w％，pH为7.0～8.5，酶解温度35～45℃，酶解时间2～3h。
优选的，所述鱿鱼多肽包括氨基酸序列为ICCFCPDGNR的多肽。
优选的，所述鱿鱼多肽的使用量为5～20μg·m L-1。
优选的，所述干细胞为脂肪干细胞。
另一方面，本发明还提供一种有效促进干细胞体外成骨诱导分化的多肽，其氨基酸序列为ICCFCPDGNR。
本发明还包括由前述制备方法制得的多肽。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供了一种新的干细胞体外成骨诱导分化的方法，该方法的提出可为人们从干细胞(特别是脂肪干细胞)获得成骨细胞提供新的选择。该方法不仅可以有效促进成骨分化，且操作简便，有利于产业化实施和推广。
附图说明
图1：试验1结果图。*代表与对照组相比差异显著。
图2：试验2结果图。*代表与对照组相比差异显著，#代表与处理组2相比差异显著。
图3：试验3结果图。*代表与对照组相比差异显著。
具体实施方式
为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
胰蛋白酶由市场购得，规格50 000U/g。
实施例1鱿鱼多肽的提取
蛋白的提取：采用碱提酸沉法提取鱿鱼蛋白。
取新鲜鱿鱼肉，打浆，按料液比1:5加入蒸馏水，用氢氧化钠溶液调节pH为11.0，高速均浆5min，搅拌2h后10000rpm离心10min，取上清液，用盐酸调节上清液pH为4.5，10000rpm离心10min，取沉淀，冷冻干燥即为鱿鱼蛋白；以上操作在4℃条件下进行。
蛋白的酶解：取鱿鱼蛋白，按料液比1:5加入蒸馏水，调节pH为8.0，加入胰蛋白酶酶解(酶/底物：2w/w％，酶解温度40℃，酶解时间3h)，水浴灭酶，冷却，10000r/min离心20min(4℃)，取上清液备用；
纯化：选取超滤膜进行超滤，收集分子量＜3kD滤出液，冷冻干燥，即得鱿鱼多肽。
实施例2鱿鱼多肽的提取
蛋白的提取：采用碱提酸沉法提取鱿鱼蛋白。
取新鲜鱿鱼肉，打浆，按料液比1:5加入蒸馏水，用氢氧化钠溶液调节pH为11.0，高速均浆5min，搅拌2h后10000rpm离心10min，取上清液，用盐酸调节上清液pH为4.5，10000rpm离心10min，取沉淀，冷冻干燥即为鱿鱼蛋白；以上操作在4℃条件下进行。
蛋白的酶解：取鱿鱼蛋白，按料液比1:5加入蒸馏水，调节pH为7.0，加入胰蛋白酶酶解(酶/底物：4w/w％，酶解温度45℃，酶解时间2h)，水浴灭酶，冷却，10000r/min离心20min(4℃)，取上清液备用；
纯化：选取超滤膜进行超滤，收集分子量＜3kD滤出液，冷冻干燥，即得鱿鱼多肽。
实施例3鱿鱼多肽的提取
蛋白的提取：采用碱提酸沉法提取鱿鱼蛋白。
取新鲜鱿鱼肉，打浆，按料液比1:5加入蒸馏水，用氢氧化钠溶液调节pH为11.0，高速均浆5min，搅拌2h后10000rpm离心10min，取上清液，用盐酸调节上清液pH为4.5，10000rpm离心10min，取沉淀，冷冻干燥即为鱿鱼蛋白；以上操作在4℃条件下进行。
蛋白的酶解：取鱿鱼蛋白，按料液比1:5加入蒸馏水，调节pH为8.5，加入胰蛋白酶酶解(酶/底物：4w/w％，酶解温度35℃，酶解时间3h)，水浴灭酶，冷却，10000r/min离心20min(4℃)，取上清液备用；
纯化：选取超滤膜进行超滤，收集分子量＜3kD滤出液，冷冻干燥，即得鱿鱼多肽。
实施例4干细胞体外成骨诱导分化方法
采用诱导培养基对干细胞进行成骨诱导，并在诱导的第7～14天，在培养基中按5μg/mL添加上述实施例1、实施例2或实施例3的鱿鱼多肽。
实施例5干细胞体外成骨诱导分化方法
采用诱导培养基对干细胞进行成骨诱导，并在诱导的第7～14天，在培养基中按10μg/mL添加上述实施例1、实施例2或实施例3的鱿鱼多肽。
实施例6干细胞体外成骨诱导分化方法
采用诱导培养基对干细胞进行成骨诱导，并在诱导的第7～14天，在培养基中按20μg/mL添加上述实施例1、实施例2或实施例3的鱿鱼多肽。
实施例7
经前期初步分析认为，所得鱿鱼多肽中的ICCFCPDGNR可能是主要活性多肽。为了进一步明确该多肽在干细胞成骨诱导方面的作用，采用常规固相合成法对该多肽进行合成，合成的多肽纯度为99.2％。
采用上述多肽行干细胞体外成骨诱导分化，其步骤为：采用诱导培养基对干细胞进行成骨诱导，并在诱导的第7～14天，在培养基中按5～20μg/mL添加ICCFCPDGNR多肽。
试验1多肽对兔脂肪干细胞成骨分化的影响
1.ADSCs的分离、培养：
采用胶原酶消化法获得兔脂肪干细胞。具体操作如下：
取4月龄新西兰大白兔的腹股沟皮下新鲜脂肪组织，超净台上用PBS冲洗，剔除小血管、包膜及多余组织，将脂肪组织剪碎呈糜状，加入3倍体积的0.1g/L的Ⅰ型胶原酶，37℃恒温摇床以80rpm摇速消化60min。1200rpm离心10min，去除上层油脂、脂肪组织，留下层细胞。用含10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的低糖DMEM培养液(Gibco)重悬细胞，用200目筛网过滤去除未消化的组织碎片，滤液接种于培养瓶中，在37℃、体积分数5％CO2、95％相对湿度的培养箱中培养。2天后第一次换液，之后每2～3天换一次液，每天观察细胞生长形态特征，细胞长满至90％左右时，用0.25％胰蛋白酶消化贴壁细胞。细胞按1:3比例传代。
2.成骨诱导：
取第3代细胞接种于24孔板，待细胞融合80％后，改用成骨诱导培养基进行诱导培养。诱导培养基为体积分数10％的胎牛血清+0.1μmol/L地塞米松+50μmol/L抗坏血酸+10mmol/Lβ-甘油磷酸钠+高糖DMEM培养基(Procell，含双抗)。每天换液1次。
以诱导培养的7～14天于诱导培养基中添加实施例1鱿鱼多肽为处理组，添加量为5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL分别作为处理A、处理组B、处理组C和处理组D，以未添加鱿鱼多肽为对照组。
3.茜素红染色及定量检测：
镜下观察细胞形态变化，诱导21天后行茜素红染色鉴定钙结节及定量检测。每组细胞经多聚甲醛固定后行茜素红染色。每孔加入500μL质量分数为1％的氯化十六烷基吡啶，反应后，选择540nm波长，用酶标仪检测吸光度值。每组取3个孔，每孔测量3次，结果取均值。
4统计分析
应用SPSS软件进行统计分析。采用单因素方差分析进行组间比较。以P＜0.05为差异有统计学意义。
5.结果与分析
处理组和对照组均出现大量钙结节，且处理组的钙结节数量明显多于对照组。定量分析结果显示，处理组OD值与对照组OD值差异显著，具有统计学意义。结果说明在诱导培养基中添加酶解鱿鱼多肽具有促进脂肪干细胞成骨分化的作用。在添加量为5～20μg/mL的范围内，随着添加量的增加，多肽对干细胞的成骨诱导分化能力增强，添加量高于20μg/mL时作用减弱。结果见图1。
试验2多肽添加时机对兔脂肪干细胞成骨分化的影响
为了分析多肽添加时机对兔脂肪干细胞成骨分化的影响，分别设计在诱导培养的7～14天于诱导培养基中添加10μg/mL实施例1鱿鱼多肽为处理组1，在诱导培养的14～21天于诱导培养基中添加10μg/mL实施例1鱿鱼多肽为处理组2。以未添加多肽为对照组。试验方法参照试验1。结果见图2。
结果显示：多肽的最优添加时机是诱导培养的第7～14天，在第14～21天添加多肽的效果不够明显。
试验3活性多肽对兔脂肪干细胞成骨分化的影响
以在诱导培养基中添加合成的ICCFCPDGNR多肽为处理组进行干细胞成骨分化实验，以未添加多肽为对照组。试验方法参照试验1。结果见图3。
结果显示：处理组和对照组均出现大量钙结节，且处理组的钙结节数量明显多于对照组。处理组OD值高于对照组，差异显著，具有统计学意义。结果说明ICCFCPDGNR多肽具有促进脂肪干细胞成骨分化的作用。在添加量为5～20μg/mL的范围内，随着添加量的增加，多肽对干细胞的成骨诱导分化能力增强，添加量高于20μg/mL时诱导作用有所下降。
对比试验1和试验3。试验1使用的是提取得到的含有多肽的混合物，试验3使用的是纯的ICCFCPDGNR多肽，结果显示，使用多肽混合物的效果优于使用ICCFCPDGNR多肽的效果，因此推测混合物中可能还含有其他活性成分。这些新的活性成分有待进一步的分析。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 海南济民博鳌国际医院有限公司
<120> 一种干细胞体外成骨诱导分化方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Ile Cys Cys Phe Cys Pro Asp Gly Asn Arg
1 5 10

Claims (3)

1.一种脂肪干细胞体外成骨诱导分化方法，其特征在于，包括以下步骤：在成骨诱导的第7～14天，添加鱿鱼多肽；所述鱿鱼多肽包括氨基酸序列为ICCFCPDGNR的多肽。
2.根据权利要求1所述的脂肪干细胞体外成骨诱导分化方法，其特征在于，所述鱿鱼多肽的使用量为5～20μg·mL-1。
3.一种有效促进脂肪干细胞体外成骨诱导分化的多肽，其特征在于，其氨基酸序列为ICCFCPDGNR。
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