CN115976144B - 一种具有成骨活性的乌贼酶解产物的制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种具有成骨活性的乌贼酶解产物的制备方法及应用，属于海洋生物医药领域。所述具有成骨活性的乌贼酶解产物的制备方法，包括匀浆、酶解、纳滤脱盐、超滤分离、浓缩和冷冻干燥等步骤。本发明采用生物酶解、超滤分离的方法，得到大量乌贼总酶解产物及目标分子量酶解产物，操作简单，生产条件温和，可满足大规模生产的需要；所得乌贼酶解产物具有高活性、易储存等特点；通过细胞实验，结果显示乌贼酶解产物对人成骨样MG‑63细胞和人骨髓间充质干细胞HBMSCs的增殖具有促进作用，说明乌贼酶解产物具有一定的成骨活性，可用于制作具有成骨活性的功能性食品或药品。

Description

一种具有成骨活性的乌贼酶解产物的制备方法及应用

技术领域

本发明涉及功能性食品制备或生物制药技术，尤其涉及一种具有成骨活性的乌贼酶解物的制备方法及应用，属于海洋生物医药领域。

背景技术

骨质疏松症是一种以骨量低下，骨微结构破坏，导致骨脆性增加，易发生骨折为特征的全身性骨病。骨重建的失衡是导致骨质疏松症的细胞学基础，因此任何物质如果能直接或间接作用于成骨细胞，则有可能作为促进骨形成和增加骨量的有效途径。目前治疗骨质疏松症的相关药物虽然种类繁多，但是普遍具有一定的副作用，食源性生物活性物质因其具有安全、无毒副作用、价格竞争力强和易于吸收等优点在骨质疏松领域受到了越来越广泛的关注。

乌贼亦称墨鱼、墨斗鱼，是软体动物门头足纲乌贼目的动物，分布在我国沿海，以黄、渤海产量较多。乌贼古书记载：味咸，平，入肝、肾经。功效养血滋阴，治血虚经闭，崩漏，带下。现代研究表明，乌贼具有良好的抗肿瘤、抗氧化、降血糖等生物活性。乌贼含人体所必需的多种氨基酸，是一种待开发的优质蛋白资源，具有较高的研究价值。越来越多的研究表明，海洋资源中潜在的生物活性物质可以通过酶法水解得到释放并且更易于人体吸收。目前，乌贼主要鲜用、加工成罐头食品或干制品。到目前为止，以乌贼为原料，利用酶解、超滤等技术制备高成骨活性的酶解产物及其应用未见报道。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的是提供一种操作简单，生产条件温和的制备具有成骨活性的乌贼酶解产物的方法，以解决乌贼酶解产物制备工艺不完善的问题。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种具有成骨活性的乌贼酶解产物的制备方法，包括以下步骤：

S1：取乌贼全体清洗，取出海螵蛸，其余部分切段，匀浆1～2min，得乌贼浆；

S2：取步骤S1中乌贼浆，按料液重量比1:（5～50）加水复溶成溶液，向所述溶液中加入生物蛋白酶，搅拌酶解，每克乌贼浆加入生物蛋白酶40～8000U；

S3：将步骤S2中酶解产物升温至95℃灭酶10～20min，冷却至室温，离心处理10～20min，收集上清液；

S4：将步骤S3中上清液通过截留分子量为150～300Da的纳滤膜进行脱盐浓缩；

S5：将步骤S4脱盐后的溶液浓缩至一定体积，再进行冷冻干燥，得到具有成骨活性的乌贼总酶解产物。

进一步地，S1中所述的乌贼品种包括无针乌贼、金乌贼、针乌贼、虎斑乌贼或枪乌贼。

进一步地，S2中所述的生物蛋白酶为中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、胰酶中的一种或复配。

进一步地，S2中酶解条件为温度30～70℃、搅拌速度50～300rpm、酶解时间2～5h。

进一步地，S3中离心速度为3000～10000r/min。

进一步地，S4中所述纳滤过程为：将溶液置于容器中，加入双蒸水，纳滤浓缩至一半体积后加水至原体积，重复直至流出液中电导率值与双蒸水相同为止。

进一步地，S5中所述浓缩为真空旋转蒸发，温度为30～60℃；冷冻干燥时间为3～5天，真空度在15～50Pa，真空泵启动温度为-60℃～-50℃。

进一步地，在S3之后还包括超滤分离的步骤：采用截留分子量为3000Da的超滤膜对S3上清液进行超滤分离，收集分子量<3000Da的溶液，再经步骤S4和S5后，得到具有成骨活性的乌贼分子量<3000Da的酶解产物。

进一步地，所述超滤分离过程为：将S3上清液置于容器中，加入双蒸水后对其进行超滤分离，所述双蒸水的用量为上清液体积的5～20倍，超滤至一半体积后加水至原体积，重复两次。

进一步地，本发明制备的乌贼总酶解产物及分子量<3000Da酶解产物，用于制作具有成骨活性的功能性食品或药品的应用。

与现有的技术相比，本发明有以下有益之处：

1）使用生物酶解、超滤分离的方法，得到大量目标分子量的乌贼酶解产物，操作简单，生产条件温和；通过细胞实验进行了活性测定，其产品安全性高。

2）采用冷冻干燥技术对具有成骨活性的乌贼酶解产物进行冻干，增加了产品的保存时间。

3）得到的乌贼酶解产物具有一定的成骨活性，可以作为制备功能食品或药品的良好原料。

具体实施方式

以下通过具体实施例对发明作进一步说明，需要指出的是，下述实施例不应当被理解为是对本发明的限制。

实施例1：本实施例为完整的制备过程。

S1：取市售无针乌贼全体清洗，取出海螵蛸，其余部分切段，匀浆2min，得乌贼浆。

S2：向S1中乌贼浆按料液重量比1:10加水，复溶成溶液，向所述溶液中加入碱性蛋白酶，搅拌酶解（50℃、150rpm）4h。每克乌贼浆加入碱性蛋白酶4000U。

S3：将S2中酶解产物升温至95℃灭酶10min，冷却至室温，10000rpm离心处理10min，收集离心上清液。

S4：将S3中上清液以150～300Da的纳滤膜（GE公司）进行脱盐浓缩，具体过程为：将溶液置于容器中，加入双蒸水，纳滤浓缩至一半体积后加水至原体积，重复直至流出液中电导率值与双蒸水相同为止，最后得到脱盐浓缩的溶液。

S5：将S4脱盐后得到的溶液真空旋转蒸发，温度为40℃，浓缩至50～100mL；然后，在真空度15～50Pa，真空泵启动温度为-60℃～-50℃，冷冻干燥3～5天，得到具有成骨活性的乌贼总酶解产物。

进一步地，平行制备样品，经步骤S1、S2、S3后，将S3上清液引入超滤设备中进行超滤分离，所述超滤设备中使用截留分子量为3000Da的超滤膜（Millipore公司），进行超滤分离。具体过程为：将S3上清液置于容器中，加入双蒸水后对其进行超滤，所述双蒸水的用量为上清液体积的5～20倍，超滤至一半体积后加水至原体积，重复两次。最后，收集分子量<3000Da的溶液。经步骤S4、S5后，得到具有成骨活性的乌贼分子量<3000Da的酶解产物。

该实施例同时获得乌贼总酶解产物和乌贼分子量<3000Da的酶解产物，两者虽有关联性，但为两个独立的样品，两者均为具有成骨活性的酶解产物。

实施例2：本实施例，除以下步骤不同外，其余步骤同实施例1。

S2：向S1中乌贼浆，按料液重量比1:10加水复溶成溶液，向所述溶液中加入中性蛋白酶，搅拌酶解（50℃、150rpm）4h，每克乌贼浆加入中性蛋白酶800U。

实施例3：本实施例，除以下步骤不同外，其余步骤同实施例1。

S2：向S1中乌贼浆，按料液重量比1:10加水复溶成溶液，向所述溶液中加入木瓜蛋白酶，搅拌酶解（50℃、150rpm）4h，每克乌贼浆加入木瓜蛋白酶4000U。

实施例4：本实施例，除以下步骤不同外，其余步骤同实施例1。

S2：向S1中乌贼浆，按料液重量比1:10加水复溶成溶液，向所述溶液中加入菠萝蛋白酶，搅拌酶解（37℃、150rpm）4h，每克乌贼浆加入菠萝蛋白酶4000U。

实施例5：本实施例，除以下步骤不同外，其余步骤同实施例1。

S2：向S1中乌贼浆，按料液重量比1:10加水复溶成溶液，向所述溶液中加入胰酶，搅拌酶解（50℃、150rpm）4h，每克乌贼浆加入胰酶40U。

实施例6：本实施例，除以下步骤不同外，其余步骤同实施例1。

S1：取市售无针乌贼全体清洗，取出海螵蛸，其余部分切段，匀浆1min，得乌贼浆。

S2：向S1中乌贼浆按料液重量比1:5加水，复溶成溶液，向所述溶液中加入碱性蛋白酶，搅拌酶解（30℃、300rpm）2h。每克乌贼浆加入碱性蛋白酶8000U。

S3：将S2中酶解产物升温至95℃灭酶20min，冷却至室温，3000rpm离心处理20min，收集离心上清液。

实施例7：本实施例，除以下步骤不同外，其余步骤同实施例1。

S2：向S1中乌贼浆按料液重量比1:50加水，复溶成溶液，向所述溶液中加入碱性蛋白酶，搅拌酶解（70℃、50rpm）5h。每克乌贼浆加入碱性蛋白酶2000U。

S3：将S2中酶解产物升温至95℃灭酶15min，冷却至室温，6000rpm离心处理15min，收集离心上清液。

测定以上实施例1～7中不同产物的结果见表1。

表1 实施例1～7结果统计表

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从表1中可以看出，实施例1～7中，总酶解产物具有较高的产品得率（10.34%～17.11%），分子量<3000Da部分得率也较高（6.07%～10.98%）；且分子量<3000Da部分占总酶解产物比例超过50%以上，说明总酶解产物中大部分为分子量<3000Da部分。

效果实施例1：

选取实施例1～7所得乌贼酶解产物作为样品组，采用对人成骨样MG-63细胞生长的影响实验，MG-63培养于含10%胎牛血清，100U/mL的青霉素和链霉素的DMEM培养基中，培养条件为恒温37℃，饱和湿度，CO₂含量为5%。将收集的处于对数期的细胞悬浮液接种于96孔板中，调整细胞浓度为3×10⁴个/mL，按照每孔100μL悬浮液进行接种。待培养24h细胞贴壁后，吸去培养基，加入100μL含有乌贼酶解产物组的培养基进行处理，空白对照组不接种细胞，但给予相应的完全培养基，实验对照组的细胞完全培养基处理，每个浓度设置3个复孔。培养48h后，每孔加入10 μL CCK-8试剂并与培养液充分混匀，1h后测定在450nm波长处的吸光度值。细胞活力按照下面的公式进行计算：细胞活力(%)=[（实验组平均吸光值-空白对照组平均吸光值）/（实验对照组吸光值-空白对照组平均吸光值）]×100。结果统计见表2。

表2 乌贼酶解产物对MG-63细胞增殖的影响

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从表2中的数据可以看出，实施例1～7的总酶解产物和分子量<3000Da酶解产物细胞活力整体均较高，说明均具有较好的促MG-63细胞增殖作用；且分子量<3000Da的酶解产物活力明显高于总酶解产物，说明经进一步分离后，酶解产物的细胞活力有所提高。

效果实施例2：

选取实施例1～7所得乌贼酶解产物作为样品组，采用对人骨髓间充质干细胞HBMSCs体外增值影响实验，取生长良好的P3代HBMSCs，制成2×10⁴/mL的单细胞悬液，每孔150µL均匀地接种于96孔板中，待细胞贴壁后吸弃培养液，实验组每孔加入乌贼酶解产物150µL，对照组和调零孔只加150µL的LG-DMEM培养液，每组3个复孔，培养72小时后，每孔加入MTT溶液（5mg/mL）20µL，37 ℃培养4小时后，弃上清，每孔加入150µL DMSO，振荡10min，490nm波长测各孔光吸收值，结果统计见表3。

表3 乌贼酶解产物对HBMSCs细胞增殖的影响

。

从表3中的数据可以看出，实施例1～7的总酶解产物和分子量<3000Da酶解产物细胞活力整体均较高，说明均具有较好的促HBMSCs细胞增殖作用；且分子量<3000Da酶解产物活力稍高于总酶解产物，说明经进一步分离后，酶解产物的细胞活力有所提高。

综上研究，可以发现乌贼总酶解产物和分子量<3000Da酶解产物都可以促进人成骨样MG-63细胞和人骨髓间充质干细胞HBMSCs的增殖，具有一定的成骨活性；且分子量<3000Da酶解产物成骨活性相比于总酶解产物有所提高。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种具有成骨活性的乌贼酶解产物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：取乌贼全体清洗，取出海螵蛸，其余部分切段，匀浆1～2min，得乌贼浆；

S2：取步骤S1中乌贼浆，按料液重量比1:（5～50）加水复溶成溶液，向所述溶液中加入生物蛋白酶，搅拌酶解，每克乌贼浆加入生物蛋白酶40～8000U，酶解条件为温度30～70℃、搅拌速度50～300rpm、酶解时间2～5h；所述的生物蛋白酶为中性蛋白酶、碱性蛋白酶中的一种；

S3：将步骤S2中酶解产物升温至95℃灭酶10～20min，冷却至室温，离心处理10～20min，收集离心上清液；

S4：将步骤S3中上清液通过截留分子量为150～300Da的纳滤膜进行脱盐；

S5：将步骤S4脱盐后的溶液浓缩后再进行冷冻干燥，得到具有成骨活性的乌贼总酶解产物。

2.如权利要求1所述的乌贼酶解产物的制备方法，其特征在于，所述乌贼品种包括无针乌贼、金乌贼、针乌贼或虎斑乌贼。

3.如权利要求1所述的乌贼酶解产物的制备方法，其特征在于，步骤S2中所述的生物蛋白酶为木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、胰酶中的一种。

4.如权利要求1所述的乌贼酶解产物的制备方法，其特征在于，步骤S3中离心速度为3000～10000r/min。

5.如权利要求1所述的乌贼酶解产物的制备方法，其特征在于，步骤S4中所述纳滤过程为：将溶液置于容器中，加入双蒸水，纳滤脱盐至一半体积后加水至原体积，直至流出液中电导率值与双蒸水接近为止。

6.如权利要求1所述的乌贼酶解产物的制备方法，其特征在于，步骤S5中所述浓缩为真空旋转蒸发，温度为30～60℃；所述冷冻干燥时间为3～5天，真空度在15～50Pa，真空泵启动温度为-60℃～-50℃。

7.如权利要求1所述的乌贼酶解产物的制备方法，其特征在于，步骤S3之后还包括超滤分离的步骤：采用截留分子量为3000Da的超滤膜对步骤S3上清液进行超滤分离，收集分子量<3000Da的溶液，再经过步骤S4和S5后，得到分子量<3000Da的具有成骨活性的乌贼酶解产物。

8. 如权利要求7所述的乌贼酶解产物的制备方法， 其特征在于，所述超滤分离过程为：将步骤S3上清液置于容器中，加入双蒸水后对其进行超滤分离，所述双蒸水的用量为上清液体积的5～20倍，超滤至一半体积后加水至原体积，重复两次。

9.权利要求1～8任一项制备方法制备得到的乌贼酶解产物在制备促进成骨细胞增殖的药品中的应用。