CN113122604B - 一种海肠胶及其制备方法和应用 - Google Patents

一种海肠胶及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及食品加工和应用领域，具体涉及一种海肠胶及其制备方法和应用。采用酶法提取来自于海肠的胶原蛋白，进一步制备浓缩胶产品。通过测定其对巨噬细胞的增殖活性来评价该产品的活性，发现其可以显著促进巨噬细胞增殖。这不仅延长了海肠的保存期限，而且更有利于进一步海肠产品的开发，加大了资源利用度，并为以后海肠的研究和资源开发提供基础。

Description

一种海肠胶及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及食品加工和应用领域，具体涉及一种海肠胶及其制备方法和应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
随着经济的发展，人们收入水平逐渐提高，健康生活逐渐成为生活的主流思想。同时，快节奏、高压力的社会生活催生了大量的慢性病患者，需求的不断增长使得食品保健行业发展迅速。
胶剂是中药里历史悠久的剂型，其以动物的皮、角、骨、甲板、肉、镖等为原料，在特定的生产工艺条件下，生产制得的动物胶，其主要成分是动物水解蛋白类物质，基本原理是胶原蛋白在加热变性以后聚集产生明胶。人们熟知的阿胶就是用脱去毛的驴皮为原料，在特定的生产工艺条件下制得的动物明胶。
胶原蛋白是一类具有三螺旋结构的蛋白质的总称，分布在细胞外间质中，是属于结缔组织的结构蛋白，具有十分重要的地位。结缔组织如肌腱、皮肤和角膜，均富含胶原蛋白。一般来说，胶原含有丰富的甘氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸(后两者都是严格的亚胺酸)。在动物体内，胶原蛋白分布十分广泛，是哺乳动物体内含量最多的蛋白质。目前已经有29种胶原蛋白被发现。被广泛应用于食品，化妆品，生物医学等领域，但是由于动物体内累积的毒性，逐渐攀高的价格，某些地区的风俗习惯等原因，寻找更理想的替代品逐渐必要，而来自于水产动物的胶原蛋白，因为含有丰富的维生素和矿物质，加之具有许多与陆生动物的胶原蛋白相比更独特的性质，如具有更低的熔点和更低的胶凝温度等，越来越得到人们的关注。
发明人研究现有动物提取物或胶质产品发现，现有动物提取物成分和功能单一，仅具有一定的营养价值，无法用于药物或实验试剂。一些动物胶质产品制备复杂，需要加热加压才能制备得到，而且胶质产率低，不利于大范围推广或使用。
发明内容
针对现有技术的问题，发明人经长期的技术与实践探索，成功采用酶法提取来自于海肠的胶原蛋白，进一步制备浓缩胶产品。通过测定其对巨噬细胞的增殖活性来评价该产品的活性，发现其可以显著促进巨噬细胞增殖。这不仅延长了海肠的保存期限，而且更有利于进一步海肠产品的开发，加大了资源利用度，并为以后海肠的研究和资源开发提供基础。
具体地，本发明是通过如下所述的技术方案实现的：
本发明第一方面，提供一种海肠胶的制备方法，包括以下步骤：
将海肠与缓冲液、蛋白酶混合酶解得到酶解液，高温加热后干燥，即得。
本发明第二方面，提供一种海肠胶的制备方法制备得到的海肠胶。
本发明第三方面，提供一种海肠胶在制备促进巨噬细胞增殖药物和/或医疗保健行业中的应用。
本发明第四方面，提供一种促进巨噬细胞增殖药物，包括海肠胶。
本发明一个或多个实施例具有以下有益效果：
1)本发明中浓缩海肠胶的制备方法简单、易操作，温度低，制备过程安全、环保，完整保留了其中的活性成分，制备过程中采用试剂安全性高，不会产生溶剂残留之问题。以海肠为原料开发成的浓缩海肠胶是一种对人体有益的食用品和保健品。这不仅拓宽了海肠的利用途径，延长了海肠的保存期限，而且为海肠产业开发和研究提供了宝贵的经验和数据。
2)发明人通过实验首次发现，通过本发明方法制备得到的海肠胶还能促进巨噬细胞增殖，当在科研或实验中需要得到大量巨噬细胞时，可以使用本发明所述方法培养大量巨噬细胞，满足实验需求。此外，激发巨噬细胞增殖有助于相关免疫活性的提高。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为本发明实施例5MTT法分析海肠胶液对RAW264.7细胞增殖的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
海肠，学名单环刺螠(UrechisUnicictus)，广泛分布在山东烟台，青岛等地。海肠个体肥大，味道鲜美，营养价值丰富。海肠体壁肌含有丰富的氨基酸种类，包括必需氨基酸8种，且比例符合联合国粮食及农业组织和世界卫生组织关于蛋白质化学评价所推荐的成人需求组成模式，因此可以较高效率地被人体吸收利用，有较高的营养价值。除此之外，海肠体壁肌还中含有丰富的胶原蛋白、小分子多肽，多糖等生物活性物质。有研究表明，海肠体壁肌中的多糖具有抗氧化活性，能较好地清除羟基自由基。目前对于海肠的营养价值和药用价值的开发尚未完全，相关领域还有广阔的研究和应用的前景。海肠的氨基酸，活性多肽和多糖等有望应用于食品，药品，保健品以及化妆品等多个行业。研究发现，单环刺螠体壁肌中含水88.92％，蛋白质占体壁肌固形物的90％以上，其中胶原蛋白占全部蛋白质的7.1％，具有开发利用潜力。但是目前开发利用方式较为简单，仅以生鲜产品或是食品调味剂等利用，保藏条件等极大限制了海肠及其制品的推广利用，产品抗风险能力差，经济效率较低。面对广阔的应用前景，有必要开发出新的加工产品，改良制约其发展的诸多弊端，促进海肠产业的可持续发展。
针对现有技术的问题，发明人经长期的技术与实践探索，成功采用酶法提取来自于海肠的胶原蛋白，进一步制备浓缩胶产品。通过测定其对巨噬细胞的增殖活性来评价该产品的活性，发现其可以显著促进巨噬细胞增殖。这不仅延长了海肠的保存期限，而且更有利于进一步海肠产品的开发，加大了资源利用度，并为以后海肠的研究和资源开发提供基础。
具体地，本发明是通过如下所述的技术方案实现的：
本发明第一方面，提供一种海肠胶的制备方法，包括以下步骤：
将海肠与缓冲液、蛋白酶混合酶解得到酶解液，高温加热后干燥，即得。
先将海肠酶解的目的是提高海肠胶的收率，高温加热目的是除腥，干燥的目的是成胶，用烘箱加热干燥海肠胶液，并将干燥后的胶体切成长条后继续晾干，期间定期翻动胶块，保持同风和低湿度，防止胶块受潮，直至完全干燥成固体，即得到海肠胶成品。
为了从源头提高海肠胶的质量和纯度，所述海肠与缓冲液、蛋白酶混合前还包括预处理的步骤。
使用本发明方法可以处理新鲜海肠或冻海肠。
当海肠为冻海肠时，所述预处理步骤包括：取冻海肠，解冻，清洗，控干。
当海肠为新鲜海肠时，所述预处理步骤包括：取新鲜海肠，清洗，控干。
所述预处理步骤具体包括：将新鲜海肠或解冻后的海肠用自来水和双蒸水先后冲洗干净，剪碎，用双蒸水浸泡0.4～1h，除水。
缓冲液种类不同，体系中离子种类或数量都不相同，这些性能直接影响海肠胶的纯度和质量，因此在本发明一个或多个实施例中，所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液，优选为磷酸氢盐缓冲液，以便于后期水洗、加热过程中，杂质离子容易去除。
缓冲液目的是为海肠水解提供一定的pH环境，如果pH过高或过低，不仅影响酶解过程的进行，还会影响海肠自身品质，进而影响海肠胶的产率、纯度和性能。因此在本发明一个或多个实施例中，所述磷酸盐缓冲液的pH至6.8～7.2，优选7.0。
所述磷酸盐缓冲液添加量为海肠质量的0.8～1.2倍，优选为1倍海肠质量。缓冲液用量太多，使得海肠浓度过低，酶解容易破坏胶质组织。如果缓冲液用量太高，海肠浓度过高，酶解不充分。
所述蛋白酶选自中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶，使用蛋白酶的目的是分解海肠，提高海肠胶的收率，蛋白酶种类不仅影响酶解效果，还会影响获得的海肠胶成分和纯度，进而影响其对巨噬细胞的增殖效果。
所述蛋白酶的添加量为干燥海肠质量的2％～4％，优选3％。蛋白酶添加量影响海肠酶解效果，蛋白酶添加量过高，会影响海肠胶的结构和效果，蛋白酶添加过少，影响海肠胶的酶解效果，容易造成酶解不充分的问题。
同样，酶的种类、酶解温度和时间影响酶解效果和海肠胶质量，在本发明一个或多个实施例中，所述酶选自中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶，优选菠萝蛋白酶，酶解温度为40～60℃，优选为40℃。所述酶解pH为6.8～7.2，优选为7.0，酶解时间为4～6h，优选为5h。
为了避免过度酶解，所述酶解结束后采用高温灭活方式停止酶解反应。所述高温灭活方式包括：灭活温度70～90℃，优选为80℃，灭活时间为3～5min，优选为4min；而后将酶解液迅速冷却到30℃以下，放置20～40min，优选为30min彻底停止反应的进行。
所述酶解反应停止后还包括离心分离，离心速率为1000rpm，离心时间为10～30min，优选20min；
高温加热过程中加热温度为50～80℃，时间为48h～72h，优选地，加热温度为60℃，时间为72h。
离心后取上清后高温加热除腥，同时加热促进水分清除随后也促进成胶。
在本发明一个或多个实施例中，高温加热是为了去除海肠胶的腥味，具体步骤为：将上清液于60℃烘箱中浓缩48-72h，待胶液呈现红褐色且散发焦香味后取出铺平，自然风干12h得到海肠胶体，切胶晾胶至完全干燥后得到成品。
加热使得酶解液中水含量降低，增加了相关物质如胶原蛋白的浓度；同时，加热使得苦味氨基酸等变性，还促进了腥味相关醛类等的挥发排出，达到脱腥，成胶的效果。
本发明第二方面，提供一种海肠胶的制备方法制备得到的海肠胶。
本发明第三方面，提供一种海肠胶在制备促进巨噬细胞增殖药物和/或医疗保健行业中的应用。
优选地，所述巨噬细胞为RAW264.7细胞；
优选地，所述海肠胶在制备保健食品中的应用。
本发明第四方面，提供一种促进巨噬细胞增殖药物，包括海肠胶。
优选地，所述巨噬细胞为RAW264.7细胞。
以不加额外成分的细胞培养基为标准对照品，海肠胶对巨噬细胞的促增殖作用具有显著性(浓度400μg/mL,800μg/mL)，且随着浓度的升高而增加。
本发明海肠胶具有一定程度促细胞增殖作用，说明可以将海肠胶用于医疗保健行业中，以开发出具有保健功能的海洋活性物质。
下面结合具体的实施例，对本发明做进一步的详细说明，应该指出，所述具体实施例是对本发明的解释而不是限定。
实施例1：海肠胶酶解条件研究：
(1)水解酶选定：研究分为三组，分别使用中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶。
(2)海肠预处理：取新鲜海肠2kg，用自来水冲洗干净并取出内脏等，留下体壁肌待用。随后自来水和蒸馏水反复淘洗至不再产生泡沫，控干海肠内的水分以后称重。
(3)酶解：研究分为采用匀浆机进行匀浆，加入海肠质量的1倍的磷酸盐缓冲液(pH7.0)，随后分别加入3％中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶，待搅拌均匀后加入海肠，于50℃恒温环境水浴4h，整个过程中不断搅拌，得酶解液。随后将水浴温度调整为80℃，处理作用4min使酶灭活而停止反应。而后将酶解液迅速冷却到30℃以下，放置30min。
(4)酶解效果表征：中性蛋白酶水解后残余组织较多，酶解液颜色较浅且不浑浊；木瓜蛋白酶水解后残余组织较多，酶解液颜色最浅且较澄清；而菠萝蛋白酶水解后海肠组织基本水解，残余量较少，酶解液颜色较深且较浓稠。故选定使用菠萝蛋白酶。
(5)酶解条件优化：针对不同酶浓度(2％、3％和4％)，酶解温度(40℃、50℃和60℃)和时间(4h、5h和6h)设立正交实验，优化酶解效果。
(6)酶解效果如表所示，影响海肠酶解的显著性因素顺序为：处理温度＞处理时间＞酶浓度，综合考虑，酶解的最优条件为酶浓度3％，处理温度40℃，处理时间5h。
Figure BDA0003082639940000061
Figure BDA0003082639940000071
实施例2
(1)海肠预处理：取新鲜海肠2kg，用自来水冲洗干净并取出内脏等，留下体壁肌待用。随后用自来水和蒸馏水反复淘洗至不再产生泡沫，控干海肠内的水分以后称重。
(2)酶解：采用匀浆机进行匀浆，加入海肠质量的1倍的磷酸盐缓冲液(pH7.0)，随后加入3％菠萝蛋白酶，搅拌均匀后加入海肠，40℃恒温水浴5h，整个过程中不断搅拌，得酶解液。随后将水浴温度调整为80℃，作用4min使酶灭活而停止反应。而后将酶解液迅速冷却到30℃以下，放置30min。
(3)除腥：将海肠水解液室温离心(1000rpm，20min)，保留上清并至于烘箱中去除腥味。
(4)成胶：用烘箱于60℃加热干燥海肠胶液72h，待胶液呈现红褐色且散发焦香味后取出铺平，自然风干12h得到海肠胶体，切胶晾胶至完全干燥后得到成品175.2g。
实施例3
(1)海肠预处理：取新鲜海肠1.5kg，用自来水冲洗干净并取出内脏等，留下体壁肌待用。随后用自来水和蒸馏水反复淘洗至不再产生泡沫，控干海肠内的水分以后称重。
(2)酶解：采用匀浆机进行匀浆，加入海肠质量的1倍的磷酸盐缓冲液(pH7.0)，随后加入3％菠萝蛋白酶，搅拌均匀后加入海肠，于40℃恒温环境水浴4h，整个过程中不断搅拌，得酶解液。随后将水浴温度调整为85℃，处理作用5min使酶灭活而停止反应。而后将酶解液迅速冷却到30℃以下，放置30min。
(3)除腥：将海肠水解液室温离心(1000rpm，20min)，保留上清并至于烘箱中去除腥味。
(4)成胶：用烘箱于60℃加热干燥海肠胶液60h，待胶液呈现红褐色且散发焦香味后取出铺平，自然风干10h得到海肠胶体，切胶晾胶至完全干燥后得到成品125.8g。
实施例4
(1)海肠预处理：取新鲜海肠2.2kg，用自来水冲洗干净并取出内脏等，留下体壁肌待用。随后用自来水和蒸馏水反复淘洗至不再产生泡沫，控干海肠内的水分以后称重。
(2)酶解：采用匀浆机进行匀浆，加入海肠质量的1倍的磷酸盐缓冲液(pH7.0)，随后加入4％菠萝蛋白酶，搅拌均匀后加入海肠，于40℃恒温环境水浴5h，整个过程中不断搅拌，得酶解液。随后将水浴温度调整为85℃，处理作用5min使酶灭活而停止反应。而后将酶解液迅速冷却到30℃以下，放置30min。
(3)除腥：将海肠水解液室温离心(1000rpm，20min)，保留上清并至于烘箱中去除腥味。
(4)成胶：用烘箱于60℃加热干燥海肠胶液72h，待胶液呈现红褐色且散发焦香味后取出铺平，自然风干16h得到海肠胶体，切胶晾胶至完全干燥后得到成品190.5g。
实施例5：海肠胶促细胞增殖活性测定实验：
1、PBS的配制
NaCl 8.0g，KCl 0.2g,Na2HPO4 1.44g,KH2PO4 0.24g，双蒸水稀释定容至1000ml，随后加盐酸调节pH7.2～7.4后，用0.22um滤膜进行过滤除菌备用。
2、细胞培养基的配制
取DMEM高糖培养基，加入血清至10％，随后加入1％的青链霉素和HEPES，混合均匀后用0.22um滤膜进行过滤除菌，随后待用。
3、MTT溶液的配制
精密称取50mg MTT，用PBS(pH7.2～7.4)配制成为0.5％的MTT溶液：即称取50mgL-Dopa加入PBS得到10ml的溶液，避光配制。0.22μm微孔滤膜过滤后，-20℃避光保存。
4、MTT法检测促细胞增殖作用
取处于对数生长期的RAW264.7细胞并使用10％FBS DMEM高糖培养基制成细胞悬液，以每孔5×103个细胞接种于96孔板中，其余孔用无菌PBS填满，随后置于5％CO2细胞培养箱中37℃继续培养24h后加入海肠胶，使其终浓度分别为200μg/ml，400μg/ml，800μg/ml，每组设6个复孔，同时设立空白对照组，继续培养48h。随后于避光条件下每孔加入10μL MTT溶液，37℃孵育4h后弃去上清液，每孔加入100μL DMSO试剂并震荡10min。最终使用酶标仪，设定检测波长为570nm，参比波长为630nm，测量每孔吸光值，然后计算细胞的存活率。
海肠胶液的细胞增殖分析：向RAW264.7细胞中加入不同浓度实施例2制备的海肠胶液处理48h，***表示具有统计学差异(P＜0.001)。
如图1所示，以不加额外成分的细胞培养基为标准对照品，海肠胶对巨噬细胞的促增殖作用具有显著性(浓度400μg/mL,800μg/mL)，且在0-800μg/mL范围内随着浓度的升高而增加。综上所述，海肠胶具有一定程度促细胞增殖作用，说明可以将海肠胶用于医疗保健行业中，以开发出具有保健功能的海洋活性物质。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (11)

1.一种海肠胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将海肠与缓冲液、蛋白酶混合酶解得到酶解液，高温加热后干燥，即得；
酶解的最优条件为酶浓度3％，处理温度40℃，处理时间5h；
所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液；
所述蛋白酶为菠萝蛋白酶；
所述磷酸盐缓冲液的pH至6.8～7.2；
所述磷酸盐缓冲液添加量为海肠质量的0.8～1.2倍。
2.根据权利要求1所述的海肠胶的制备方法，其特征在于，所述海肠与缓冲液、蛋白酶混合前还包括预处理的步骤；
所述海肠为新鲜海肠或冻海肠；
所述预处理步骤具体包括：将海肠用自来水和双蒸水先后冲洗干净，剪碎，用双蒸水浸泡0.4～1h，除水；
所述冻海肠预处理步骤还包括解冻。
3.根据权利要求1所述的海肠胶的制备方法，其特征在于，
所述磷酸盐缓冲液的pH至7.0；
所述磷酸盐缓冲液添加量为海肠质量的1倍。
4.根据权利要求1所述的海肠胶的制备方法，其特征在于，所述酶解结束后采用高温灭活方式停止酶解反应；
所述高温灭活方式包括：灭活温度70～90℃，灭活时间为3～5min；而后将酶解液迅速冷却到30℃以下，放置20～40min彻底停止反应的进行。
5.根据权利要求1所述的海肠胶的制备方法，其特征在于，所述酶解结束后采用高温灭活方式停止酶解反应；所述高温灭活方式还包括：灭活温度为80℃，灭活时间为4min；而后将酶解液迅速冷却到30℃以下，放置30min彻底停止反应的进行。
6.根据权利要求4所述的海肠胶的制备方法，其特征在于，所述酶解反应停止后还包括离心分离，所述离心速率为1000rpm，离心时间为10～30min；
高温加热过程中加热温度为50～80℃，时间为48h～72h。
7.根据权利要求4所述的海肠胶的制备方法，其特征在于，离心时间为20min；加热温度为60℃，时间为72h。
8.权利要求1至7中任一项所述的海肠胶的制备方法制备得到的海肠胶。
9.权利要求8所述海肠胶在制备促进巨噬细胞增殖药物的应用；
所述巨噬细胞为RAW264.7细胞。
10.权利要求8所述海肠胶在制备保健食品中的应用。
11.一种促进巨噬细胞增殖药物，其特征在于，包括海肠胶，所述海肠胶为权利要求8所述的海肠胶；
所述巨噬细胞为RAW264.7细胞。
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