CN106519020A - 一种具有美容功效的功能性肽及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有美容功效的功能性肽及其制备方法和用途，该功能性肽是弹性蛋白肽和胶原蛋白肽复合产品，其制备方法包括以下步骤：分别将弹性蛋白和胶原蛋白原料用NaCl溶液和NaOH溶液浸泡以去除油脂，然后经离心或绞碎得到弹性蛋白和胶原蛋白粗提物，将两者混合后用蛋白酶酶解，酶解液经喷雾干燥后得到具有美容功效的功能性肽。本发明方法利用生物酶解技术对弹性蛋白和胶原蛋白同时作用，在释放具有美容功效的弹性蛋白肽和胶原蛋白肽的同时，更是使两者在酶解过程更好的融合。采用本发明方法制得的弹性蛋白肽和胶原蛋白肽复合产品的保湿、抗皱功效明显，可显著提高皮肤中的含水量以及胶原蛋白含量。
Description
技术领域
本发明属于蛋白原料精深加工领域，具体涉及一种具有美容功效的功能性肽(弹性蛋白肽和胶原蛋白肽复合产品)及其制备方法和用途。
背景技术
弹性蛋白(Elastin)和胶原蛋白(Collagen)是皮肤中重要的结构蛋白，由丰富的原纤维构成。弹性蛋白和胶原蛋白都具有多个重复序列和丰富的极性氨基酸(约占总氨基酸的90％以上)。胶原蛋白含特有氨基酸——羟脯氨酸和羟赖氨酸，是由两个α链和一个β链交联形成的一个三螺旋的结构；而弹性蛋白则含有特殊的交联结构——锁链素和异锁链素，弹性蛋白的可溶性前体蛋白原弹性蛋白(Tropoelastin)通过锁链素和异锁链素交联形成致密的蛋白结构。两种蛋白都是非水溶性的蛋白，由于其致密的结构和疏水性，具有良好的延展性和弹性，并能抵抗大部分水解酶的水解，是许多器官组织(如主动脉、心脏、皮肤等)维持弹性和结构的关键蛋白。
皮肤真皮网织层中的成纤维细胞不仅能够合成分泌胶原蛋白和弹性蛋白，还能合成分泌多重细胞修复因子，具有强大的修复能力，能够维持皮肤弹性和韧性。然而随着年岁的增长，成纤维细胞出现不可逆的DNA损伤和蛋白质的氧化损伤，在氧自由基的作用下，成纤维细胞内的羟化酶活性降低，不能正常地将脯氨酸催化形成羟脯氨酸，影响细胞胶原纤维的合成。同时，在自由基的轰击下，细胞中的脂质过氧化产物MDA促使胶原纤维的交联，降低了组织通透性，影响细胞新陈代谢，使皮肤硬度增加。由于长时间的紫外线的照射和皮肤功能的衰减，基质金属蛋白酶被激活，降解皮肤中的胶原蛋白和弹性蛋白，使皮肤中的胶原纤维和弹性纤维结构改变。
此外，皮肤中的水分含量同样决定了皮肤是否维持良好的弹性和饱满度。细胞间质中由弹性蛋白和胶原蛋白形成的网络结构中粘附了多种保湿因子(如透明质酸)，能有效保持皮肤的水分。随着年龄的增长，皮肤细胞间质中的弹性蛋白和胶原蛋白发生异构化甚至解体，以及保湿因子的逐步流失使皮肤呈现干燥、暗哑的状态，最终导致皮肤松弛，产生皱纹。
随着社会经济的进步，人们越来越关注身体的健康，对皮肤衰老亦十分重视。市面上抗衰老的护肤品和保健品种类繁多，主要以补充胶原蛋白，添加抗氧化物质和高保湿效果的物质为主。这些方法虽然均能在一定程度上起到抗衰老的作用，但由于加工成本高，产品中的添加量有限，效果好的产品往往价格十分昂贵，而一般的产品对衰老的改善并不突出。因此，寻找加工成本低而抗皱功效显著、安全的抗皱保水产品已成为研究热点。
弹性蛋白主要存在于猪、马、牛、羊等哺乳动物的颈韧带、大动脉血管，鸟类的大动脉血管、鱼类的动脉球(心脏)等中。而这些富含弹性蛋白的食物也是人们餐桌上常见的佳肴，安全无毒副作用，通过生物控制酶解技术水解后，将难被人体肠胃自然消化的弹性蛋白和胶原蛋白水解成小分子肽段，使牛颈韧带和鱼皮中的活性多肽被人体吸收而发挥特殊的生理功能。
通过多种商业蛋白酶的共同作用实现对蛋白原料中弹性蛋白和胶原蛋白的生物酶解，利用现代生物控制酶解技术制取具有美容功效的活性多肽，不仅可以提高其附加值，更能拓宽其应用范围，具有良好的经济前景。
发明内容
本发明的首要目的在于提供一种具有美容功效的功能性肽(为弹性蛋白肽和胶原蛋白肽复合产品)的制备方法，该方法的要点在于采用NaCl和NaOH溶液预处理提纯原料中的弹性蛋白和胶原蛋白，结合生物酶解技术高效释放弹性蛋白和胶原蛋白中的美容活性成分。
本发明的另一目的在于提供由上述方法制得的具有美容功效的功能性肽。
本发明的再一目的在于提供上述功能性肽的用途。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种具有美容功效的功能性肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)弹性蛋白的提取：将原料洗净，绞碎，加入5％NaCl溶液在40～50℃下保温4～5小时，过200目振动筛，取截留物；采用去离子水对截留物进行多次水洗及过200目振动筛过滤；往水洗后截留物中加入0.5％NaOH溶液，85～95℃下搅拌1～2小时，采用油水分离机进行离心，取沉淀物，多次采用去离子水水洗，振动筛过滤将沉淀物水洗至中性，得到弹性蛋白粗提物；
(2)胶原蛋白的提取：取鱼皮，加入1.0％NaOH溶液在常温下浸泡2～3小时；去除上浮油脂，多次水洗至中性(pH值＝7)，沥干，过绞肉机绞成肉糜，得到胶原蛋白粗提物；
(3)复合蛋白肽的酶法制备：取弹性蛋白粗提物与胶原蛋白粗提物按质量比1:2～4混合，加入去离子水，调节体系pH值至7.0，加入蛋白酶，在50℃～60℃下保温水解5～8小时，灭酶(85～95℃，15～30min)，离心过滤，取上清液得复合蛋白肽液；
(4)将复合蛋白液浓缩至固形物35～45％，喷雾干燥得到具有美容功效的功能性肽；
步骤(1)中，采用去离子水对截留物进行多次水洗至最终截留物中的NaCl含量在0.5％以下；
步骤(1)中，所述的原料为猪、马、牛、羊等哺乳动物的颈韧带、大动脉血管，以及鸟类的大动脉血管、鱼类的动脉球(心脏)等；
步骤(3)中，所述的蛋白酶为食品级碱性蛋白酶和风味蛋白酶，优选诺维信公司的Alcalase 2.4L和Flavourzyme 500MG，以弹性蛋白和胶原蛋白粗提物总质量为计算基准，碱性蛋白酶加入量为0.5-1.0％；风味蛋白酶加入量为0.8-1.6％；
上述方法制得的功能性肽可用于制备具有美容功效的食品、保健品和护肤品；使用时，可以将其与具有抗氧化活性和抗皱作用的天然提取物复配使用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)一般的弹性蛋白原料，如猪、马、牛、羊的颈韧带，除了弹性蛋白，还含有部分的油脂，如果直接对该原料进行酶解，水解生成的杂蛋白肽会混杂于弹性蛋白肽中，降低最终弹性蛋白肽产品的纯度。另外油脂会阻碍酶解进程，且影响最终产品的风味。本发明方法采用NaCl溶液和NaOH溶液除去弹性蛋白原料中的杂蛋白和油脂，最大程度提高产品中弹性蛋白肽纯度的同时改善风味。此外，采用NaOH溶液浸泡鱼皮也是为了达到提纯胶原蛋白及去除油脂的目的。
(2)本发明方法利用生物酶解技术对弹性蛋白和胶原蛋白同时作用，在释放具有美容功效的弹性蛋白肽和胶原蛋白肽的同时，更是使两者在酶解过程更好的融合：一方面使得最终产品的美容功效产生协同增效作用；另一方面可使得两者原有风味更好柔合在一起。采用本发明方法制得的弹性蛋白肽和胶原蛋白肽复合产品的保湿、抗皱功效明显，可显著提高皮肤中的含水量以及胶原蛋白含量。
(3)本发明工艺操作简单、生产成本低、没有任何污染，所得复合肽产品(弹性蛋白肽和胶原蛋白肽复合产品)美容功效明显。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
本发明实施例中所涉及的试验指标其实验方法如下：
(1)成纤维细胞效果验证实验
(a)实验材料：
细胞：人皮肤成纤维细胞，由广州凯诺生物技术公司提供。
药品与试剂：DMEM(高糖)(gibco公司)，血清，0.25％胰酶(gibco公司)，不含EDTA的胰酶，CCK-8试剂盒，细胞周期试剂盒(北京四正柏)，细胞凋亡试剂盒(ebioscience)，谷胱甘肽过氧化物酶GSH-Px试剂盒(南京建成)，丙二醛MDA试剂盒(南京建成)，超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(南京建成)，
实验仪器：离心机(湘仪，TG16-WS台式离心机)，匀浆机(天根，1001110)，分析天平(METTLER TOLEDO，EL204)，电热恒温鼓风干燥箱(上海齐欣科学仪器有限公司DHG-9070A)，恒温水浴箱(精宏XMTD-8222)，全波长酶标仪(Thermo scientific multiskango 1510)，实时荧光定量PCR仪：CFX96(新加坡BIORAD公司)，低温离心机(Thermo(Biofuge stratos)Germany)，核酸蛋白分析仪(Bio-Rad)，FACS CantoⅡ流式细胞仪(BD公司)，培养瓶，6孔板均为Corning产品。
(b)实验方法：
取对数生长期的细胞进行实验，稀释至1×104/ml的细胞数，以100uL接种于96孔板，细胞培养24小时后，添加5mg/ml样品(功能性肽1、功能性肽2、弹性蛋白肽、胶原蛋白肽)继续培养24h，然后加入10uL CCK-8试剂，37℃孵育1小时，置于酶标仪在450nm处测得吸光度，每个时间点重复三个孔。重复三次。测试样品对人皮肤成纤维细胞的增殖影响。
(2)大鼠功效验证试验
(a)实验材料
动物：KM小鼠，SPF级，体重18～22g，由广州中医药大学实验动物中心提供。
药品与试剂：硫化钠(广州化学试剂厂)，羟脯氨酸碱水解试剂盒(南京建成生物工程研究所)，透明质酸ELISA试剂盒(武汉俊泰生物科技技术公司)，
仪器：离心机(湘仪，TG16-WS台式离心机)，匀浆机(天根，1001110)，分析天平(METTLER TOLEDO，EL204)，电热恒温鼓风干燥箱(上海齐欣科学仪器有限公司DHG-9070A)，恒温水浴箱(精宏XMTD-8222)，全波长酶标仪(Thermo scientific multiskango 1510)。
(b)实验方法：
KM小鼠，雌雄各半，随机分成正常组、阳性对照组、功能性肽组(功能性肽1和功能性肽2)、弹性蛋白肽组、胶原蛋白肽组，每组10只。样品组给药剂量均为250mg/kg。
灌胃给药28天，空白组给予同体积蒸馏水，实验前一天背部用电动剃毛刀去毛约4cm×4cm。末次给药1h后，眼眶静脉丛取血，离心(3500g，5min)取其血清，用透明质酸ELISA试剂盒检测透明质酸含量。
动物处死，取1cm×1cm皮肤，称重，置于80℃的烘箱中，12h后称取其重量，用湿重减去干重得到其含水量；另取部分皮肤，刮除皮下脂肪，用乙醚吸干，剪成碎块，称取80mg置10ml试管中，加入水解液，检测皮肤中羟脯氨酸含量，根据羟脯氨酸含量计算皮肤胶原蛋白含量(胶原蛋白含量＝羟脯氨酸含量/0.13)。取100mg的无毛皮肤进行组织匀浆，离心后取其上清液进行皮肤透明质酸含量检测。
统计学处理：所有数据均以表示，采用spss16.0统计软件处理，各组组间差异比较采用t检验方法，P<0.05为差异具有统计学意义。
实施例1
一种具有美容功效的功能性肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)洗净牛颈韧带后过绞肉机绞碎。加入牛韧带质量2倍的5％NaCl溶液在40℃下保温5小时，过200目振动筛，取截留物；多次采用去离子水清洗截留物及过200目振动筛过滤直至截留物中NaCl氯化钠含量在0.5％以下；往水洗后截留物中加入其质量1倍的0.5％NaOH溶液，95℃下搅拌1小时，采用油水分离机进行离心，取沉淀物，多次采用去离子水洗，振动筛过滤将沉淀物水洗至中性，得到弹性蛋白粗提物。
(2)往鱼皮中加入其质量5倍1.0％NaOH溶液在常温下浸泡2小时；去除上浮油脂，多次水洗至中性(pH值＝7)，沥干，过绞肉机绞成肉糜，得到胶原蛋白粗提物。
(3)取弹性蛋白粗提物与胶原蛋白粗提物按1:2质量混合，加入2倍去离子水，调节体系pH值至7.0，加入弹性蛋白和胶原蛋白粗提物质量0.5％的Alcalase 2.4L(诺维信公司)和1.6％的Flavourzyme 500MG(诺维信公司)，在50℃下保温水解8小时，灭酶(85℃，30min)，离心过滤，取上清液得复合蛋白肽液。
(4)将复合蛋白液浓缩至固形物35％，喷雾干燥得功能性肽1。
功能性肽1的对人成纤维细胞增值的影响如表1。
功能性肽1对KM小鼠皮肤含水量、胶原蛋白和血清透明质酸含量的影响如表2。
实施例2
一种具有美容功效的功能性肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)洗净牛颈韧带后过绞肉机绞碎。加入牛韧带质量1倍的5％NaCl溶液在50℃下保温4小时，过200目振动筛，取截留物；多次采用去离子水清洗截留物及过200目振动筛过滤直至截留物中NaCl氯化钠含量在0.5％以下；往水洗后截留物中加入其质量2倍的0.5％NaOH溶液，85℃下搅拌2小时，采用油水分离机进行离心，取沉淀物，多次采用去离子水洗，振动筛过滤将沉淀物水洗至中性，得到弹性蛋白粗提物。
(2)往鱼皮中加入其质量3倍1.0％NaOH溶液在常温下浸泡3小时；去除上浮油脂，多次水洗至中性(pH＝7)，沥干，过绞肉机绞成肉糜，得到胶原蛋白粗提物。
(3)取弹性蛋白粗提物与胶原蛋白粗提物按1:4质量混合，加入1倍去离子水，调节体系pH值至7.0，加入弹性蛋白和胶原蛋白粗提物质量0.5％的Alcalase 2.4L(诺维信公司)和1.6％的Flavourzyme 500MG(诺维信公司)，在60℃下保温水解5小时，灭酶(95℃，15min)，离心过滤，取上清液得复合蛋白肽液。
(4)将复合蛋白液浓缩至固形物45％，喷雾干燥得功能性肽2。
功能性肽2对人成纤维细胞增值的影响如表1。
功能性肽2对KM小鼠皮肤含水量、胶原蛋白和血清透明质酸含量的影响如表2。
对比例1
一种弹性蛋白肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)洗净牛颈韧带后过绞肉机绞碎。加入牛韧带质量2倍的5％NaCl溶液在40℃下保温5小时，过200目振动筛，取截留物；多次采用去离子水清洗截留物及过200目振动筛过滤直至截留物中NaCl氯化钠含量在0.5％以下；往水洗后截留物中加入其质量1倍的0.5％NaOH溶液，95℃下搅拌1小时，采用油水分离机进行离心，取沉淀物，多次采用去离子水洗，振动筛过滤将沉淀物水洗至中性，得到弹性蛋白粗提物。
(2)往弹性蛋白粗提物中加入2倍去离子水，调节体系pH值至7.0，加入弹性蛋白粗提物质量0.5％的Alcalase 2.4L(诺维信公司)和1.6％的Flavourzyme 500MG(诺维信公司)，在50℃下保温水解8小时，灭酶(85℃，30min)，离心过滤，取上清液得弹性蛋白肽液。
(4)将弹性蛋白液浓缩至固形物35％，喷雾干燥得弹性蛋白肽。
弹性蛋白肽对人成纤维细胞增值的影响如表1。
弹性蛋白肽对KM小鼠皮肤含水量、胶原蛋白和血清透明质酸含量的影响如表2。
对比例2
一种胶原蛋白肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)往鱼皮中加入其质量3倍1.0％NaOH溶液在常温下浸泡3小时；去除上浮油脂，多次水洗至中性(pH＝7)，沥干，过绞肉机绞成肉糜，得到胶原蛋白粗提物。
(3)往胶原蛋白粗提物中加入1倍去离子水，调节体系pH值至7.0，加入胶原蛋白粗提物质量0.5％的Alcalase 2.4L(诺维信公司)和1.6％的Flavourzyme 500MG(诺维信公司)，在60℃下保温水解5小时，灭酶(95℃，15min)，离心过滤，取上清液得胶原蛋白肽液。
(4)将胶原蛋白液浓缩至固形物45％，喷雾干燥得胶原蛋白肽。
胶原蛋白肽对人成纤维细胞增值的影响如表1。
胶原蛋白肽对KM小鼠皮肤含水量、胶原蛋白和血清透明质酸含量的影响如表2。
表1各产品对人成纤维细胞增值的影响
注：与正常组比较*p<0.05,**p<0.01
由表1可发现，对比例1中的弹性蛋白肽具有明显促进成纤维细胞增殖的作用(p<0.05)，而对比例2的胶原蛋白肽对成纤维细胞的增殖无促进作用。将功能性肽1和功能性肽2产品用于培养成纤维细胞后发现，功能性肽1和2均能显著促进成纤维细胞的增殖(p<0.05)，且较对比例中的弹性蛋白肽的增值作用更强，说明胶原蛋白肽和弹性蛋白肽之间存在协同效应，可进一步提升其对成纤维细胞的增殖作用。
表2各产品对皮肤含水量、胶原蛋白含量和血清中透明质酸的影响(x±s)
注：与正常组比较*p<0.05,**p<0.01
由于细胞功效实验是脱离动物体内进行的实验，成纤维细胞增殖实验只能作为体内效果的参考，并不能直接反映产品在体内的美容功效。因此采用KM小鼠实验进行美容功效验证实验可直接体现实施列(功能性肽1和功能性肽2)和对比例(弹性蛋白肽和胶原蛋白肽)的抗皱补水功效，结果如表2所示。
皮肤的含水量是皮肤健康、年轻的关键因素之一，而透明质酸是皮肤中重要的一类保湿因子。因此本实验通过测定皮肤含水量、胶原蛋白含量和血清透明质酸含量表征皮肤特性。
由表2可知，在给KM小鼠喂养实施例的功能性肽1和功能性肽2产品30天后，小鼠皮肤的含水量明显增加(p<0.05)。对比例中的弹性蛋白肽亦可增加小鼠皮肤中含水量，但稍差于服用功能性肽组，但对比例2的胶原蛋白对小鼠的皮肤含水量几乎无作用。
另外，实施例中的功能性肽1和功能性肽2产品可显著增加KM小鼠血清透明质酸的含量，且与比例中的弹性蛋白的功效相当(p<0.05)，但胶原蛋白肽对小鼠的血清中透明质酸含量无影响(p>0.05)。实验说明胶原蛋白肽几乎无补水作用，弹性蛋白肽具有一定的补水功效，而弹性蛋白肽与胶原蛋白肽复合物(对比例的功能性肽产品)对小鼠皮肤具有极强的补水作用；而弹性蛋白肽可显著提高小鼠血清中透明质酸含量，但胶原蛋白肽和胶原蛋白肽无协同增效作用。
皱纹的产生的关键原因之一是由于皮肤中胶原蛋白和弹性蛋白的流失，通过检测皮肤中胶原蛋白能够反应产品对小鼠皮肤的抗皱功效。
表2显示，服用对比例2的胶原蛋白肽后，KM小鼠皮肤中胶原蛋白含量仅有增加趋势(p>0.05)，服用对比例1的弹性蛋白后，能够显著增加皮肤中羟脯氨酸和胶原蛋白含量(p<0.05)。说明弹性蛋白肽抗皱功效优于胶原蛋白肽。此外，服用实施例的功能性肽1和功能性肽2，小鼠皮肤中的羟脯氨酸和胶原蛋白含量都极显著增加(p<0.01)。
综上所述，胶原蛋白肽和弹性蛋白均具有一定的美容护肤的作用，而弹性蛋白肽和胶原蛋白肽复合产品(功能性肽)具有显著的补水抗皱功效。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化等，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种具有美容功效的功能性肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)弹性蛋白的提取：将原料洗净，绞碎，加入5％NaCl溶液在40～50℃下保温4～5小时，过200目振动筛，取截留物；采用去离子水对截留物进行多次水洗及过200目振动筛过滤；往水洗后截留物中加入0.5％NaOH溶液，85～95℃下搅拌1～2小时，采用油水分离机进行离心，取沉淀物，多次采用去离子水水洗，振动筛过滤将沉淀物水洗至中性，得到弹性蛋白粗提物；
(2)胶原蛋白的提取：取鱼皮，加入1.0％NaOH溶液在常温下浸泡2～3小时；去除上浮油脂，多次水洗至中性，沥干，过绞肉机绞成肉糜，得到胶原蛋白粗提物；
(3)复合蛋白肽的酶法制备：取弹性蛋白粗提物与胶原蛋白粗提物按质量比1:2～4混合，加入去离子水，调节体系pH值至7.0，加入蛋白酶，在50～60℃下保温水解5～8小时，灭酶，离心过滤，取上清液得复合蛋白肽液；
(4)将复合蛋白液浓缩至固形物35～45％，喷雾干燥得到具有美容功效的功能性肽；
步骤(1)中，所述的原料为哺乳动物的颈韧带、大动脉血管，以及鸟类的大动脉血管、鱼类的动脉球。
2.根据权利要求1所述的具有美容功效的功能性肽的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，所述的蛋白酶为食品级碱性蛋白酶和风味蛋白酶；以弹性蛋白和胶原蛋白粗提物总质量为计算基准，碱性蛋白酶加入量为0.5-1.0％；风味蛋白酶加入量为0.8-1.6％。
3.根据权利要求1或2所述的具有美容功效的功能性肽的制备方法，其特征在于：所述的蛋白酶是诺维信公司的Alcalase 2.4L和Flavourzyme 500MG。
4.一种具有美容功效的功能性肽，其特征在于：是由权利要求1-3任一项所述的方法制得。
5.权利要求4所述的功能性肽在制备具有美容功效的食品、保健品和护肤品中的应用。
6.根据权利要求5所述的功能性肽在制备具有美容功效的食品、保健品和护肤品中的应用，其特征在于：将所述的功能性肽与具有抗氧化活性和抗皱作用的天然提取物复配使用。
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