CN108588155A - 一种酶解猪动脉血管制备弹力蛋白肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种酶解猪动脉血管制备弹力蛋白肽的方法，其特征在于采用以下步骤：A、取新鲜的猪动脉血管，清净、沥干、绞碎；B、按一定质量比依次在氢氧化钠水溶液、盐酸水溶液、乙醚中浸泡；C、使用蒸馏水反复洗涤、沥干后在乙酸水溶液浸泡3天，然后离心冷冻，得弹力蛋白粗品；D、将弹力蛋白粗品和去离子水混合后作为酶解底物，用NaOH调pH至8.0‑9.0，加入磷酸盐缓冲液，然后再加入弹力蛋白酶和基质金属蛋白酶，室温下采用超声辅助酶解，得初步酶解液；E、将所述初步酶解液，在红外线辐射下辅助酶解；灭酶后得酶解液；F、离心处理，取上清液，用超滤膜进行恒体积超滤，得超滤液；G、冷冻干燥，得弹力蛋白肽。本发明具有成本低、酶解效率高的优点。
Description
技术领域
本发明属于生物化工技术领域，特别涉及一种酶解猪动脉血管制备弹力蛋白肽的方法。
背景技术
弹力蛋白是一种结构巨大、高交叉度、复杂的、疏水性、水不溶性的蛋白，作为一种主要的细胞外基质蛋白，组成了弹性纤维的“芯”。现已发现弹力蛋白有两种形式：弹力蛋白I存在于韧带、主动脉和皮肤中，弹力蛋白II可从软骨中得到。弹力蛋白是肌肤组成的重要成分，在肌肤中仅含5%，却是激发肌肤胶原蛋白和弹性纤维生成的关键，胶原蛋白决定肌肤的柔润饱满，弹性纤维决定肌肤的紧致弹力。
弹力蛋白肽（elastin-derived peptides, EDPs）是弹力蛋白的降解产物。弹力蛋白的降解包括生物酶的降解和化学降解，前者一般称为弹力蛋白溶解，后者称为弹力蛋白肽的合成。弹力蛋白肽对纤维母细胞和单核细胞产生趋化作用，使弹性纤维与纤维母细胞的黏附力增强， 弹力蛋白肽可刺激Neu-1唾液酸酶的活性增强，Neu-1的活性增强可引起可溶性的弹力蛋白地释放，这些弹力蛋白聚集成团，或和微纤维成分相互作用，形成弹性纤维，因而可提高皮肤的弹力，对于预防、改善皱纹或松弛十分有效。
猪动脉血管来源丰富、廉价易得，含有丰富的弹力蛋白I，是获得弹力蛋白肽的优质且性价比较高的原料，但是现有技术中未见通过酶解反应方法以猪动脉血管为原料制备弹力蛋白肽的报道。目前制备弹力蛋白肽分为三种方法：化学方法、重组DNA合成、酶解弹力蛋白。通过化学方法合成的弹力蛋白肽成本一般较高，并且其副产物可能对人体有害，同时生产过程中会产生污染环境的排出物；通过重组DNA合成的弹力蛋白肽普遍为长肽，而弹力蛋白肽一般都是短肽，因此这种方法不适合制备弹力蛋白肽；酶解弹力蛋白制备弹力蛋白肽时，不仅降解所耗的时间短、操作简单安全、产品营养流失较少，而且不污染环境。
酶解反应在常规水浴中进行时，需要较长的反应时间；在酸、碱及有机溶剂等介质中进行时，易使酶蛋白变性失活，酶解效率降低。超声辅助酶解，由于热效应、机械效应、空化效应和化学效应等共同作用，细胞壁会产生位移和变形，出现纵向裂纹、吸水润胀、细纤维化等现象，这些物理变化能让酶在水解时，有效地提高其可及度，提高酶解效率。红外线辅助酶解，对反应体系进行升温并促进蛋白酶切位点的暴露，可有效增加酶切位点与酶的作用频率，从而提升酶解效率，继而显著提高蛋白水解度和肽的转化率。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种酶解猪动脉血管制备弹力蛋白肽的方法，该方便具有成本低，酶解效率高的优点。
为解决上述技术问题，本发明提供以下技术方案，一种酶解猪动脉血管制备弹力蛋白肽的方法，其特征在于采用以下步骤：
A、取新鲜的猪动脉血管，清洗干净后，沥干，用绞肉机绞碎，得碎猪动脉血管；
B、按质量比1：20称取所述碎猪动脉血管和0.1mol·L-1的氢氧化钠水溶液，所述碎猪动脉血管在所述氢氧化钠水溶液中浸泡24h，捞出后用蒸馏水洗至中性；然后用碎猪动脉血管质量20倍的0.6mol·L-1的盐酸水溶液浸泡24h，然后用蒸馏水洗至中性；最后用碎猪动脉血管质量2倍的乙醚浸泡24h，捞出后再次使用碎猪动脉血管质量2倍的乙醚浸泡24h，得预处理的猪动脉血管；
C、将所述预处理的猪动脉血管使用蒸馏水反复洗涤，沥干后用等质量的0.5mol·L-1的乙酸水溶液浸泡3天，然后采用高速冷冻离心机，在1-5℃、2500-4500r·min-1条件下离心10-30min，得弹力蛋白粗品；
D、按质量比1：20-100称取所述弹力蛋白粗品和去离子水，混合后作为酶解底物，用1mol·L-1的NaOH水溶液调节所述酶解底物pH至8.0-9.0，加入pH为8.0-9.0的磷酸盐缓冲液，然后向所述酶解底物中加入弹力蛋白酶和基质金属蛋白酶，所述弹力蛋白酶与基质金属蛋白酶的质量比为1-5：1，所述弹力蛋白酶和基质金属蛋白酶的总质量占酶解底物质量的1-5%；室温下采用超声辅助酶解，超声波功率100-400W，时间5-15min，得初步酶解液；所述基质金属蛋白酶为MMP-1型；
E、将所述初步酶解液，在功率为50-400W、波长为5-20μm的红外线辐射下继续辅助酶解3-10min；当所述初步酶解液温度升至40-60℃时，关闭红外线，酶解完毕；然后在80-100℃环境下灭酶处理5-15min，得酶解液；
F、将所述酶解液在12000r/min下离心15min，取上清液，采用截留分子量为10kDa的超滤膜，在超滤压力为0.2MPa，超滤温度40℃的条件下进行恒体积超滤，加水量为酶解液体积的3倍，得超滤液；
G、将所述超滤液在-80℃、-2Pa条件下冷冻干燥，得弹力蛋白肽。
本发明制备的弹力蛋白肽可作为抗皱活性物应用于抗皱类护肤品中。
本发明所述基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）为MMP-1型，市售产品有美国PeproTech公司的MMP-1型基质金属蛋白酶。MMP-1基质金属蛋白酶可直接作用猪动脉血管中I型弹力蛋白a1链上-Gly-Ala-间和a2链上-Gly-Leu-间使其发生断键，从而使螺旋结构降解为短肽。所述弹力蛋白酶，CAS号39445-21-1，市售产品有德国Merck公司的弹力蛋白酶。本发明通过采用弹力蛋白酶活化基质金属蛋白酶，进而加速弹力蛋白的降解，提高降解速度，提升基质金属蛋白酶的酶解效率。
以下为本发明所制备弹力蛋白肽分子量测定的说明：通过Waters 600高效液相色谱仪测量实施例1所制备弹力蛋白肽水溶液的分子量分布，色谱柱是TSK gel 2000 SWXL300mm×7.8nm。吸取2mL样品于容量瓶中，用流动相乙腈/水/三氟乙酸（45/55/0.1）定容，微孔过滤膜过滤后进样，柱温为30℃，流速为0.5mL/min，在220nm下检测。结果显示，98.6%的弹力蛋白肽分子量小于10kDa。
以下为本发明所制备弹力蛋白肽中氨基酸组成分析的说明：精确称取实施例1所制备的弹力蛋白肽，上氨基酸自动分析仪对其主要氨基酸组分进行分析，结果如表1所示。
表1 弹力蛋白肽中氨基酸组成
| 氨基酸种类 | 弹力蛋白肽中氨基酸组成 mol/1000mol |
| 苏氨酸 | 61 |
| 丝氨酸 | 34 |
| 谷氨酸 | 33 |
| 甘氨酸 | 403 |
| 丙氨酸 | 120 |
| 缬氨酸 | 60 |
| 胱氨酸 | 1 |
| 蛋氨酸 | 6 |
| 天冬氨酸 | 20 |
| 亮氨酸 | 35 |
| 异亮氨酸 | 12 |
| 酪氨酸 | 36 |
| 苯丙氨酸 | 30 |
| 组氨酸 | 3 |
| 赖氨酸 | 10 |
| 精氨酸 | 10 |
| 羟脯氨酸 | 8 |
| 脯氨酸 | 100 |
以下为本发明促进透明质酸生成实验的说明：分别以人类纤维芽细胞和人体重组模型为研究对象，使用人类纤维芽细胞和人体重组模型以及分别含有0、1、5μg/mL实施例1制备的弹力蛋白肽培养基培养24小时，使用ELISA法（透明质酸测试试剂盒）测定培养基中分泌出的透明质酸量，将不含弹力蛋白肽条件下透明质酸生成量设为100%，计算弹力蛋白肽对透明质酸生成的促进率，实验结果如图1所示。由图可知，人类纤维芽细胞以及人体重组模型试验的结果都可以看出本发明制备的弹力蛋白肽对透明质酸的生成有较好的促进作用，从而淡化皮肤皱纹、提升皮肤弹性。
以下为本发明促进细胞增殖实验的说明：人体皮肤纤维芽细胞投入含有0、0.05、0.1μg/mL实施例1制备的弹力蛋白肽培养基，培养24小时，测试生细胞数，将不含弹力蛋白肽条件下生细胞数设为100%，计算细胞增殖促进率，实验结果如图2所示。由图可知，本发明制备的弹力蛋白肽对人体皮肤纤维芽细胞有较好的促进作用，从而达到抗皱的功效。
以下为本发明抗皱人体功效实验的说明：按照自愿原则选择60名身体健康的女性志愿者，年龄在30-50岁之间，无皮肤病史及化妆品过敏史。要求受试者左脸使用实施例1所制备的含弹力蛋白肽的面霜，右脸使用未添加弹力蛋白肽的面霜作为空白对照，空白对照样品的基础配方与实施例1所述面霜相同，早晚各使用一次，使用前和使用3、6周随访一次，共计3次，随访为日间同一时间，试验期间不得使用其他相同类型产品。测试前受试者需要清洁面部，在恒温恒湿（室温22℃±2℃，相对湿度45%±5%）环境下，静坐20min之后，再利用CM825肌肤水分测试仪、MPA580皮肤弹性测试仪和PRIMOS PICO皮肤皱纹检测仪对左右脸使用前、3周、6周后皮肤水分、弹性以及皱纹情况进行测定和分析。
表2为左右脸使用不同样品不同时间后保湿功效的数据，由表可知，随着使用时间的增加，左右脸皮肤含水量均逐渐提高，左脸使用实施例1皮肤含水量高于右脸使用空白对照样品，说明弹力蛋白肽可提高皮肤角质层水分，充足的水分可使皮肤呈现光泽饱满的健康状态。
表2 左右脸不同时间水分测试数据
| 皮肤含水量 %（质量百分比） | 使用前 | 3周后 | 6周后 |
| 左脸（实施例1） | 45.5±0.81 | 62.5±0.67 | 76.3±0.61 |
| 右脸（空白对照面霜） | 43.2±0.75 | 54.4±0.69 | 61.6±0.59 |
表3为左右脸使用不同样品不同时间后皮肤弹性数据，R2是指无负压时皮肤的回弹量与有负压时的最大拉伸量之比，比值越接近1，说明皮肤弹性越好，R5是指皮肤恢复过程中的弹性部分与加负压过程的弹性部分之比，更接近1，说明皮肤弹性越好。由表中数据可知，随着使用时间的增加，左右脸的R2和R5值均增大，左脸使用实施例1后R2和R5值都高于右脸使用空白对照样品，更接近1，因此说明弹力蛋白肽可有效提高皮肤弹性。
表3 左右脸不同时间弹性测试数据
表4为左右脸使用不同样品不同时间后皮肤皱纹测试数据，左脸涂抹实施例1，右脸涂抹空白对照样品，其中Sa、Sq、Sk、SV、Wd用于表征皱纹深浅，被定义为皱纹深度因子，aWa、pWa用于表征皱纹面积，被定义为皱纹面积因子，Wv则是表征皱纹严重程度的综合参数。由表中数据可知，随着使用时间的增加，左脸表征皱纹深度因子的Sa、Sq、Sk、Wd和表征皱纹面积因子的aWa、pWa以及表征皱纹严重程度的综合参数Wv明显降低，与皱纹严重程度负相关的SV亦显著提高，而右脸各参数变化不大，皱纹测试结果表明弹力蛋白肽可有效改善皮肤皱纹情况。
表4左右脸不同时间皱纹测试数据（3D皮肤检测方法）
衰老主要表现为干燥、松弛、皱纹、色斑等，因此皮肤含水量、皮肤弹性以及皮肤皱纹改变情况可以综合评价产品的抗皱功效，结合上述测试数据，说明本发明具有显著的抗皱效果。
本发明的有益效果：1）以来源丰富、廉价易得、含丰富弹力蛋白I的猪动脉血管作为制备弹力蛋白肽的原料，不仅可降低成本，而且实现了资源的最大化利用；2）采用超声和红外线联用辅助酶解，不但可以大大缩短酶解时间，提高酶解效率，而且可显著提高弹力蛋白水解度和弹力蛋白肽的转化率；3）超滤后至少98%的弹力蛋白肽分子量小于10kDa，具有较好的品质和较高的利用价值；4）所得弹力蛋白肽可作为抗皱活性成分，按需要方便地直接添加到各剂型配方中，稳定性高、使用方便、功效显著。
附图说明
图1 弹力蛋白肽对透明质酸生成促进率的影响示意图；
图2 弹力蛋白肽对细胞增殖促进率的影响示意图。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明的技术方案作进一步说明，但本发明的保护范围并不限于此。
实施例1：一种酶解猪动脉血管制备弹力蛋白肽的方法，采用以下步骤：
A、取新鲜的猪动脉血管，清洗干净后，沥干，用绞肉机绞碎，得碎猪动脉血管；
B、按质量比1：20称取所述碎猪动脉血管和0.1mol·L-1的氢氧化钠水溶液，所述碎猪动脉血管在所述氢氧化钠水溶液中浸泡24h，捞出后用蒸馏水洗至中性；然后用碎猪动脉血管质量20倍的0.6mol·L-1的盐酸水溶液浸泡24h，然后用蒸馏水洗至中性；最后用碎猪动脉血管质量2倍的乙醚浸泡24h，捞出后再次使用碎猪动脉血管质量2倍的乙醚浸泡24h，得预处理的猪动脉血管；
C、将所述预处理的猪动脉血管使用蒸馏水反复洗涤，沥干后用等质量的0.5mol·L-1的乙酸水溶液浸泡3天，然后采用高速冷冻离心机，在5℃、4000r·min-1条件下离心30min，得弹力蛋白粗品；
D、按质量比1：50称取所述弹力蛋白粗品和去离子水，混合后作为酶解底物，用1 mol·L-1的NaOH水溶液调节所述酶解底物pH 9.0，加入pH为9.0的磷酸盐缓冲液，然后向所述酶解底物中加入弹力蛋白酶和基质金属蛋白酶，所述弹力蛋白酶与基质金属蛋白酶的质量比为3：1，所述弹力蛋白酶和基质金属蛋白酶的总质量占酶解底物质量的3%；室温下采用超声辅助酶解，超声波400W，时间10min，得初步酶解液；所述基质金属蛋白酶为MMP-1型；
E、将所述初步酶解液，在功率为200W、波长为15μm的红外线辐射下继续辅助酶解5min；当所述初步酶解液温度升至55℃时，关闭红外线，酶解完毕；然后在100℃环境下灭酶处理10min，得酶解液；
F、将所述酶解液在12000r/min下离心15min，取上清液，采用截留分子量为10kDa的超滤膜，在超滤压力为0.2MPa，超滤温度40℃的条件下进行恒体积超滤，加水量为酶解液体积的3倍，得超滤液；
G、将所述超滤液在-80℃、-2Pa条件下冷冻干燥，得弹力蛋白肽。
应用本实施例制备的弹力蛋白肽开发抗皱面霜，其配方与制备方法如下：
| 编号 | 成分 | 含量（质量比%） |
| A1 | 去离子水 | 余量 |
| A2 | 丙烯酸羟乙酯/丙烯酰二甲基牛磺酸钠共聚物 | 0.50 |
| A3 | 甘油 | 10.00 |
| A4 | 羟苯甲酯 | 0.18 |
| A5 | EDTA 二钠 | 0.10 |
| A6 | 鲸蜡硬脂醇橄榄油酸酯，山梨坦橄榄油酸酯 | 4.00 |
| B1 | 甘油硬脂酸酯，PEG-100 硬脂酸酯 | 2.50 |
| B2 | 鲸蜡硬脂醇 | 2.00 |
| B3 | 鲸蜡醇 | 2.00 |
| B4 | 硬脂酸 | 1.00 |
| B5 | 甘油硬脂酸酯 | 0.20 |
| B6 | 辛酸/癸酸甘油三酯 | 6.00 |
| B7 | 新戊二醇二庚酸酯 | 2.00 |
| B8 | 羟苯丙酯 | 0.05 |
| B9 | 聚二甲基硅氧烷 | 4.00 |
| C1 | 丙烯酸（酯）类/丙烯酰胺共聚物，矿油，聚山梨醇酯-85 | 0.50 |
| D1 | 弹力蛋白肽 | 0.50 |
| D2 | 去离子水 | 2.00 |
| E1 | DMDM 乙内酰脲 | 0.20 |
| E2 | 香精 | 0.20 |
抗皱面霜的制备方法：
1）水锅：将A相去离子水加入水锅，缓慢加入A2并搅拌均匀，再依次加入A相其他原料，搅拌加热至80℃；
2）油锅：依次加入B相原料，搅拌加热至80℃；
3）乳化锅：将水相抽入乳化锅，再抽入B相，2800rpm均质6分钟，抽真空降温；
4）加入C相，2500rpm均质5分钟，抽真空降温：
5）40℃，加入预先溶解完全的D相以及E相，搅拌均匀，2500rpm均质2分钟，即得抗皱面霜。
实施例2：一种酶解猪动脉血管制备弹力蛋白肽的方法，采用以下步骤：
A、取新鲜的猪动脉血管，清洗干净后，沥干，用绞肉机绞碎，得碎猪动脉血管；
B、按质量比1：20称取所述碎猪动脉血管和0.1mol·L-1的氢氧化钠水溶液，所述碎猪动脉血管在所述氢氧化钠水溶液中浸泡24h，捞出后用蒸馏水洗至中性；然后用碎猪动脉血管质量20倍的0.6mol·L-1的盐酸水溶液浸泡24h，然后用蒸馏水洗至中性；最后用碎猪动脉血管质量2倍的乙醚浸泡24h，捞出后再次使用碎猪动脉血管质量2倍的乙醚浸泡24h，得预处理的猪动脉血管；
C、将所述预处理的猪动脉血管使用蒸馏水反复洗涤，沥干后用等质量的0.5mol·L-1的乙酸水溶液浸泡3天，然后采用高速冷冻离心机，在3℃、3000r·min-1条件下离心30min，得弹力蛋白粗品；
D、按质量比1：80称取所述弹力蛋白粗品和去离子水，混合后作为酶解底物，用1 mol·L-1的NaOH水溶液调节所述酶解底物pH 8.0，加入pH为8.0的磷酸盐缓冲液，然后向所述酶解底物中加入弹力蛋白酶和基质金属蛋白酶，所述弹力蛋白酶与基质金属蛋白酶的质量比为1：1，所述弹力蛋白酶和基质金属蛋白酶的总质量占酶解底物质量的5%；室温下采用超声辅助酶解，超声波功率300W，时间15min，得初步酶解液；所述基质金属蛋白酶为MMP-1型；
E、将所述初步酶解液，在功率为300W、波长为20μm的红外线辐射下继续辅助酶解6min；当所述初步酶解液温度升至50℃时，关闭红外线，酶解完毕；然后在100℃环境下灭酶处理15min，得酶解液；
F、将所述酶解液在12000r/min下离心15min，取上清液，采用截留分子量为10kDa的超滤膜，在超滤压力为0.2MPa，超滤温度40℃的条件下进行恒体积超滤，加水量为酶解液体积的3倍，得超滤液；
G、将所述超滤液在-80℃、-2Pa条件下冷冻干燥，得弹力蛋白肽。
实施例3：一种酶解猪动脉血管制备弹力蛋白肽的方法，采用以下步骤：
A、取新鲜的猪动脉血管，清洗干净后，沥干，用绞肉机绞碎，得碎猪动脉血管；
B、按质量比1：20称取所述碎猪动脉血管和0.1mol·L-1的氢氧化钠水溶液，所述碎猪动脉血管在所述氢氧化钠水溶液中浸泡24h，捞出后用蒸馏水洗至中性；然后用碎猪动脉血管质量20倍的0.6mol·L-1的盐酸水溶液浸泡24h，然后用蒸馏水洗至中性；最后用碎猪动脉血管质量2倍的乙醚浸泡24h，捞出后再次使用碎猪动脉血管质量2倍的乙醚浸泡24h，得预处理的猪动脉血管；
C、将所述预处理的猪动脉血管使用蒸馏水反复洗涤，沥干后用等质量的0.5mol·L-1的乙酸水溶液浸泡3天，然后采用高速冷冻离心机，在4℃、4000r·min-1条件下离心20min，得弹力蛋白粗品；
D、按质量比1：80称取所述弹力蛋白粗品和去离子水，混合后作为酶解底物，用1 mol·L-1的NaOH水溶液调节所述酶解底物pH 8.5，加入pH为8.5的磷酸盐缓冲液，然后向所述酶解底物中加入弹力蛋白酶和基质金属蛋白酶，所述弹力蛋白酶与基质金属蛋白酶的质量比为4：1，所述弹力蛋白酶和基质金属蛋白酶的总质量占酶解底物质量的5%；室温下采用超声辅助酶解，超声波功率400W，时间15min，得初步酶解液；所述基质金属蛋白酶为MMP-1型；
E、将所述初步酶解液，在功率为400W、波长为5μm的红外线辐射下继续辅助酶解5min；当所述初步酶解液温度升至60℃时，关闭红外线，酶解完毕；然后在100℃环境下灭酶处理10min，得酶解液；
F、将所述酶解液在12000r/min下离心15min，取上清液，采用截留分子量为10kDa的超滤膜，在超滤压力为0.2MPa，超滤温度40℃的条件下进行恒体积超滤，加水量为酶解液体积的3倍，得超滤液；
G、将所述超滤液在-80℃、-2Pa条件下冷冻干燥，得弹力蛋白肽。
实施例4：一种酶解猪动脉血管制备弹力蛋白肽的方法，采用以下步骤：
A、取新鲜的猪动脉血管，清洗干净后，沥干，用绞肉机绞碎，得碎猪动脉血管；
B、按质量比1：20称取所述碎猪动脉血管和0.1mol·L-1的氢氧化钠水溶液，所述碎猪动脉血管在所述氢氧化钠水溶液中浸泡24h，捞出后用蒸馏水洗至中性；然后用碎猪动脉血管质量20倍的0.6mol·L-1的盐酸水溶液浸泡24h，然后用蒸馏水洗至中性；最后用碎猪动脉血管质量2倍的乙醚浸泡24h，捞出后再次使用碎猪动脉血管质量2倍的乙醚浸泡24h，得预处理的猪动脉血管；
C、将所述预处理的猪动脉血管使用蒸馏水反复洗涤，沥干后用等质量的0.5mol·L-1的乙酸水溶液浸泡3天，然后采用高速冷冻离心机，在5℃、4500r·min-1条件下离心15min，得弹力蛋白粗品；
D、按质量比1：40称取所述弹力蛋白粗品和去离子水，混合后作为酶解底物，用1 mol·L-1的NaOH水溶液调节所述酶解底物pH 9.0，加入pH为9.0的磷酸盐缓冲液，然后向所述酶解底物中加入弹力蛋白酶和基质金属蛋白酶，所述弹力蛋白酶与基质金属蛋白酶的质量比为3：1，所述弹力蛋白酶和基质金属蛋白酶的总质量占酶解底物质量的4%；室温下采用超声辅助酶解，超声波功率250W，时间15min，得初步酶解液；所述基质金属蛋白酶为MMP-1型；
E、将所述初步酶解液，在功率为250W、波长为10μm的红外线辐射下继续辅助酶解10min；当所述初步酶解液温度升至50℃时，关闭红外线，酶解完毕；然后在100℃环境下灭酶处理8min，得酶解液；
F、将所述酶解液在12000r/min下离心15min，取上清液，采用截留分子量为10kDa的超滤膜，在超滤压力为0.2MPa，超滤温度40℃的条件下进行恒体积超滤，加水量为酶解液体积的3倍，得超滤液；
G、将所述超滤液在-80℃、-2Pa条件下冷冻干燥，得弹力蛋白肽。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所做的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (1)
1.一种酶解猪动脉血管制备弹力蛋白肽的方法，其特征在于采用以下步骤：
A、取新鲜的猪动脉血管，清洗干净后，沥干，用绞肉机绞碎，得碎猪动脉血管；
B、按质量比1：20称取所述碎猪动脉血管和0.1mol·L-1的氢氧化钠水溶液，所述碎猪动脉血管在所述氢氧化钠水溶液中浸泡24h，捞出后用蒸馏水洗至中性；然后用碎猪动脉血管质量20倍的0.6mol·L-1的盐酸水溶液浸泡24h，然后用蒸馏水洗至中性；最后用碎猪动脉血管质量2倍的乙醚浸泡24h，捞出后再次使用碎猪动脉血管质量2倍的乙醚浸泡24h，得预处理的猪动脉血管；
C、将所述预处理的猪动脉血管使用蒸馏水反复洗涤，沥干后用等质量的0.5mol·L-1的乙酸水溶液浸泡3天，然后采用高速冷冻离心机，在1-5℃、2500-4500r·min-1条件下离心10-30min，得弹力蛋白粗品；
D、按质量比1：20-100称取所述弹力蛋白粗品和去离子水，混合后作为酶解底物，用1mol·L-1的NaOH水溶液调节所述酶解底物pH至8.0-9.0，加入pH为8.0-9.0的磷酸盐缓冲液，然后向所述酶解底物中加入弹力蛋白酶和基质金属蛋白酶，所述弹力蛋白酶与基质金属蛋白酶的质量比为1-5：1，所述弹力蛋白酶和基质金属蛋白酶的总质量占酶解底物质量的1-5%；室温下采用超声辅助酶解，超声波功率100-400W，时间5-15min，得初步酶解液；所述基质金属蛋白酶为MMP-1型；
E、将所述初步酶解液，在功率为50-400W、波长为5-20μm的红外线辐射下继续辅助酶解3-10min；当所述初步酶解液温度升至40-60℃时，关闭红外线，酶解完毕；然后在80-100℃环境下灭酶处理5-15min，得酶解液；
F、将所述酶解液在12000r/min下离心15min，取上清液，采用截留分子量为10kDa的超滤膜，在超滤压力为0.2MPa，超滤温度40℃的条件下进行恒体积超滤，加水量为酶解液体积的3倍，得超滤液；
G、将所述超滤液在-80℃、-2Pa条件下冷冻干燥，得弹力蛋白肽。
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| CN112521490A (zh) * | 2020-12-07 | 2021-03-19 | 武汉纺织大学 | 改善睡眠的弹性蛋白活性肽及其制备工艺 |
| CN114403407A (zh) * | 2022-01-10 | 2022-04-29 | 广东嘉豪食品有限公司 | 一种熬煮浓缩与复合酶解结合的浓缩汤底制备方法 |
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