CN101323874A - 一种红外线辅助蛋白快速酶解方法 - Google Patents

Abstract

本发明属蛋白质组学技术领域，具体为一种红外线辅助蛋白快速酶解方法。本发明将红外线灯泡安装在一有通气孔的箱子中，在箱的侧壁安装风扇以调节箱内温度，风扇的启动和关闭通过连有热电偶的温度控制仪控制，热电偶探头置于箱中以探测其中的温度，从而构成可控温的红外线辅助蛋白酶解装置。将蛋白质与蛋白水解酶如胰蛋白酶溶解于缓冲溶液中，于上述酶解装置中进行红外线辅助酶解，酶解时间缩短为5到10分钟，而酶解结果与传统的溶液酶解相当。本发明用红外线代替传统蛋白溶液酶解技术中使用的水浴，显著提高了酶解效率，设备简单，可用于批量蛋白样品的高通量酶解和鉴定。本发明提出在蛋白质研究、生物医学研究以及食品药品分析等领域有良好的应用前景。

Description

一种红外线辅助蛋白快速酶解方法

技术领域

本发明属蛋白质组学技术领域，具体涉及一种红外线辅助蛋白快速酶解方法。

背景技术

肽质量指纹图谱法(Peptide mass fringprint，PMF)是研究蛋白质结构信息和鉴定蛋白质的常用方法。蛋白质的酶解是蛋白质组学研究中蛋白质分析的一个关键步骤，目的是将蛋白分解成肽段，然后用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)或液相色谱电喷雾质谱(LC-ESI-MS)分析多肽混合物，获得肽质量指纹图谱。由于传统的溶液酶解方法耗时(12小时以上)，限制了蛋白质分析速度的提高，建立高效快速的新型蛋白质酶解方法具有重要意义。

目前提高酶解效率的方法主要有固定化酶技术以及微波和超声波辅助酶解技术等。固定化酶技术中研究较多的有酶微反应器和磁固定化酶技术。酶微反应器主要是将蛋白水解酶(如胰蛋白酶)通过溶胶-凝胶包埋和共价键合等技术固定在毛细管或微流芯片的微通道内表面，由于可将高浓度的蛋白水解酶固定在微小的通道内，可使酶解时间大幅缩短。而磁固定化酶技术是将蛋白水解酶通过共价键合等手段固定在磁球表面，使固定有酶的磁球与蛋白溶液反应生成多肽后，通过磁铁将磁球分离。该酶解技术需要外加热源，以促进酶解。最近采用微波辅助溶液蛋白酶解已有报道，利用该技术酶解蛋白只需要十几分钟。此外，超声波也被用于促进蛋白溶液酶解，酶解时间可缩短到数分钟。红外线是一种重要的电磁波，其波长范围在750纳米到1000微米，在医疗、电器、化工等诸多领域获得广泛应用。按其波长的不同，可分为近红外线(0.75-1.5微米)、中红外线(1.5-5.6微米)和远红外线(波长5.6-1000微米)。然而采用红外线促进蛋白质酶解尚未见文献报道。一次偶然的机会我们尝试用红外线灯泡代替水浴作为能量来源促进蛋白质酶解，意外的发现在5分钟内蛋白已经完全酶解，于是开展了深入研究，并设计了红外线辅助蛋白快速酶解装置。

本发明提出的红外线辅助蛋白酶解技术将蛋白质的酶解时间从传统溶液酶解的12小时以上大幅度降低到5到10分钟，大大节约了酶解时间，提高了工作效率。由于该技术仅用红外线代替传统蛋白溶液酶解技术中使用的水浴，设备简单，红外线对人体无害，操作安全，可用于批量蛋白样品的高通量酶解和鉴定。本发明提出的红外线辅助蛋白快速酶解技术及其装置在蛋白质研究、生物医学研究以及药品和食品分析等领域有良好的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提出一种红外线辅助蛋白快速酶解方法。

由于红外线照射物体会产生热量，而蛋白水解酶(如胰蛋白酶)的最适宜温度为37℃，且温度过高酶会失活。本发明首先设计了可控温的红外线辅助蛋白质酶解装置，其结构如附图1所示。将红外线灯泡1(功率100-500W，红外线波长范围1.72到16.66微米)安装在一有通气孔的箱子5中，在箱的侧壁安装风扇4，向箱内鼓入冷风以调节箱内温度。风扇4的启动和关闭通过连有热电偶2的温度控制仪6控制，热电偶2置于箱中以探测其中的温度。因红外线灯泡会产生热量，当箱中温度高于设定温度(如37℃)，温度控制仪6将开启风扇，而当箱中温度低于设定温度，风扇将被关闭，从而构成可控温的红外线辅助蛋白酶解装置。

将蛋白质溶解在10-100毫摩尔/升的缓冲液(如碳酸氢铵溶液)中，pH值为7.5-8.5，蛋白质在缓冲液中的浓度一般在1-500纳克/微升，于90-100℃的水浴中加热变性5-15分钟，使蛋白的酶切位点充分暴露。然后与蛋白水解酶溶液(如胰蛋白酶溶液)混合，其中蛋白质与蛋白水解酶的质量比为1∶20-1∶100，该溶液密封于对红外线透明的容器(如聚丙烯离心管等)中，也可以直接点在板上(如不锈钢质谱靶板)，然后于上述酶解装置中进行红外线辅助酶解，酶解时间控制在5到10分钟，可使溶液中蛋白酶解完全。

红外线能量较低，主要引起被照物体分子的伸缩振动、弯曲振动、扭曲振动等，并产生热量。为说明红外线促进蛋白质酶解的原理，本发明测定了所用的蛋白(如牛血清白蛋白、马心肌红蛋白等)的红外吸收光谱图，发现所用蛋白的红外线吸收光谱图的特征峰相同，所以本说明书仅给出牛血清白蛋白的红外吸收光谱图，见附图2。本发明所用的红外线灯泡发射波长为1.72到16.66微米，即波数范围为600到5800cm^-1。附图2显示，蛋白分子在波数3458.4，2960.17，1652.08，1538.69，和1396.27cm^-1处有特征红外吸收峰，分别对应于N-H键的伸缩振动、C-H键的伸缩振动、C＝O键的伸缩振动、N-H键的弯曲振动和C-N键的伸缩振动，吸收峰正好落在红外线灯泡的发射波长范围内。更重要的是这些键恰恰构成蛋白质肽链中的肽键，其中一些肽键正是蛋白水解酶的酶切位点。所以红外线引起的蛋白质分子中肽键的振动会使更多的酶切位点暴露出来，使蛋白水解酶更容易与酶切位点接近，提高酶切位点与蛋白水解酶的作用频率，从而提高酶解效率。此外，红外线引起溶液分子振动产生的热量，在动力学上对加速蛋白酶解有利。

图3显示了红外线辅助酶解时间对溶菌酶酶解结果的影响。当酶解时间为0时，蛋白质未发生酶解。红外线照2.5分钟后，有9条肽段获得鉴定，蛋白序列覆盖度为47％；而红外线照5分钟后有12条肽段获得鉴定，蛋白序列覆盖度上升到61％；继续提高红外线照时间尽管可以提高峰的绝对强度，但鉴定的肽段数目和蛋白序列覆盖度不再提高，所以一般红外线辅助蛋白酶解时间控制在5到10分钟之间。

本发明巧妙地用红外线代替传统蛋白溶液酶解中使用的水浴，显著提高了酶解效率，使用设备简单，红外线对人体无害，操作安全，可望用于批量蛋白样品的高通量酶解和鉴定，在蛋白质研究等领域中有良好的应用前景。

附图说明

图1为本发明中使用的红外线辅助蛋白快速酶解装置。

图2为本发明中使用的牛血清白蛋白的红外吸收光谱图。

图3为(A-E)使用红外线辅助酶解技术酶解密封于管中的溶菌酶溶液获得产物的MALDI-TOF质谱图和(F)酶解时间对蛋白序列覆盖度的影响。酶解时间，(A)0，(B)2.5，(C)5，(D)10，(E)20分钟；蛋白质溶液浓度200ng/μL(溶于10mmol/L NH₄HCO₃水溶液，pH8.1中)；溶菌酶和胰蛋白酶的质量比为1∶40；所有被鉴定的肽段均用“*”标出。

图4为使用红外线辅助酶解技术酶解密封于管中的牛血清白蛋白(A)和马心肌红蛋白(B)溶液获得产物的MALDI-TOF质谱图。酶解时间，5分钟；蛋白质溶液浓度200ng/μL(溶于10mmol/LNH₄HCO₃水溶液，pH8.1中)；蛋白和胰蛋白酶的质量比为1∶40；所有被鉴定的肽段均用“*”标出。

图5为使用红外线辅助质谱靶上酶解牛血清白蛋白(A)和马心细胞色素C(B)溶液获得的产物的MALDI-TOF质谱图。其中图5(A)和(B)的插图分别是为使用普通溶液酶解牛血清白蛋白和马心细胞色素C溶液获得产物的MALDI-TOF质谱图，酶解时间为5分钟；蛋白质溶液浓度200ng/μL(溶于10mmol/L NH₄HCO₃水溶液，pH8.1中)；蛋白和胰蛋白酶的质量比为1∶40；，所有被鉴定的肽段均用“*”标出。

图6为使用红外线辅助质谱靶上酶解牛血清白蛋白(A)和马心细胞色素C(B)溶液获得产物的大范围MALDI-TOF质谱图。酶解时间，5分钟；蛋白质溶液浓度200ng/μL(溶于10mmol/L NH₄HCO₃水溶液，pH 8.1中)；蛋白和胰蛋白酶的质量比为1∶40。

图中标号：1为红外线灯泡，2为热电偶，3为装有蛋白和蛋白水解酶混合溶液的透明管子，或者为点有蛋白和蛋白水解酶混合溶液液滴的质谱靶板，4为风扇，5为箱子，6为温度控制仪。

具体实施方式

下面通过实施例和附图进一步描述本发明：

1、管内红外线辅助蛋白快速酶解

本发明提出的可控温的的红外线辅助蛋白质酶解装置，其结构如附图1所示。将红外线灯泡1(功率250W，红外线波长范围1.72到16.66微米)安装在一有通气孔的铁箱5中，在箱2的侧壁安装电脑机箱风扇4(电源电压12V，功率4.2W)。风扇向箱内鼓入冷风以调节箱内温度。风扇4的启动和关闭通过连有热电偶2的温度控制仪6控制，温度控制仪6通过热电偶2检测箱内温度，然后通过电路和继电器控制风扇4的开关。因红外线灯泡1会产生热量，当箱中温度高于设定温度37℃时，风扇将开启，而当箱中温度低于设定温度，风扇将关闭，从而构成可控温的红外线辅助蛋白酶解系统。

将蛋白质溶解在50毫摩尔/升的碳酸氢铵溶液(pH 8.0)中，于95℃的水浴中加热变性10分钟，使蛋白的酶切位点充分暴露。然后与一定浓度的蛋白水解酶如胰蛋白酶溶液混合，其中蛋白质的浓度为200纳克/微升，蛋白质与蛋白水解酶的质量比为1∶40，该溶液密封于聚丙烯离心管3中，然后于上述酶解装置中进行红外线辅助酶解，酶解时间控制在5分钟。

图4为使用红外线辅助酶解技术酶解密封于聚丙烯离心管3中的牛血清白蛋白和马心肌红蛋白溶液获得产物的MALDI-TOF质谱图。可见在谱图中出现了酶解肽段的质谱峰，已用“*”标出。通过检索网上数据库，发现对于牛血清白蛋白和马心肌红蛋白分别有42和16条肽段匹配，得到鉴定的氨基酸分别有420和138个，蛋白序列覆盖度分别为69％和90％；而溶液酶解牛血清白蛋白和马心肌红蛋白产物的蛋白序列覆盖度分别为38％和69％，表明红外线辅助管内蛋白酶解在5分钟内的酶解结果与溶液酶解12小时的结果相当，说明本发明提出的红外线辅助蛋白酶解方法具有较高的酶解效率。

2、质谱靶板上红外线辅助蛋白快速酶解

对于基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)，蛋白水解溶液在分析前需要将溶液点在质谱靶板上，而蛋白质质谱靶板上直接酶解可以简化操作步骤。作为本发明实施例2，进行了质谱靶上红外线辅助快速酶解牛血清白蛋白和马心细胞色素C工作。

将蛋白质牛血清白蛋白或马心细胞色素C的变性溶液(热变性方法见实施例1)与胰蛋白酶溶液的混合，其中蛋白质的浓度为200纳克/微升，蛋白质与蛋白水解酶的质量比为1∶40，取0.5微升该溶液直接点在质谱靶板上，点样后的质谱靶板置于一底部垫有潮湿滤纸的无色透明玻璃培养皿中，潮湿滤纸可以维持培养皿中一定的湿度。然后置于上述酶解装置中进行红外线辅助靶上酶解，酶解时间控制在5分钟。

图5为使用红外线辅助质谱靶上酶解牛血清白蛋白和马心细胞色素C溶液获得产物的MALDI-TOF质谱图。可见在谱图中出现了酶解肽段的质谱峰，通过检索网上数据库，发现对于牛血清白蛋白和马心细胞色素C分别有33和10条肽段匹配，得到鉴定的氨基酸分别有339和78个，蛋白序列覆盖度分别为55％和75％，而溶液酶解牛血清白蛋白和马心细胞色素C产物的的蛋白序列覆盖度分别为37％和75％，表明红外线辅助靶上蛋白质酶解在5分钟内的酶解结果与溶液酶解12小时的结果相当，说明本发明提出的红外线辅助蛋白质靶上酶解具有良好的酶解能力。

此外，我们还测定了红外线辅助质谱靶上酶解牛血清白蛋白和马心细胞色素C的产物的大范围MALDI-TOF质谱图(见图6)。牛血清白蛋白(分子量66,200)和马心肌红蛋白(分子量12,384)的峰未在质谱图谱中出现，说明采用红外线辅助酶解方法，蛋白可在5分钟之内可以酶解完全。

Claims (3)

1、一种红外线辅助蛋白快速酶解方法，其特征在于将蛋白质与蛋白水解酶溶解于缓冲溶液中，于红外线照射下进行酶解，酶解时间为5到10分钟；其中，蛋白质在缓冲液中的浓度为1-500纳克/微升，蛋白质与蛋白水解酶的质量比为1∶20-1∶100。

2、根据权利要求1所述的红外线辅助蛋白酶解方法，其特征在于在酶解时，蛋白质与蛋白水解酶的混合溶液密封于对红外线透明的容器中，或者直接点在板上。

3、一种红外线辅助蛋白快速酶解装置，其特征在于由红外线灯泡、带有通气孔的箱子、风扇、热电偶和温度控制仪组成，其中，红外线灯泡安装在有通气孔的箱子中，风扇安装在箱子的侧壁以调节箱内温度，风扇的启动和关闭通过连有热电偶的温度控制仪控制，热电偶探头置于箱中以探测其中的温度。

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