CN107586817A - 一种基于固定化酶的蛋白质酶解方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于固定化酶的蛋白质酶解方法，其是以温敏性微球为固定化酶载体，通过温度调节温敏固定化酶微球的亲疏水性质，进而控制蛋白质酶解过程，即在酶解温度高于温敏固定化酶微球的临界相转变温度时，微球呈疏水性，能够富集待测蛋白质样品的同时对其进行酶解，在酶解温度低于温敏固定化酶微球的临界相转变温度时，停止酶解并释放肽段，从而提高酶解效率和样品肽段的检出率。本发明所提供的蛋白质酶解方法具有步骤简单、操作方便等特点，有助于蛋白质组学等相关领域的研究。
Description
技术领域
本发明涉及属于生物化工领域，具体涉及一种蛋白质酶解方法，尤其涉及一种基于固定化酶的蛋白质酶解方法。
背景技术
蛋白质组学是一门后基因组学时代兴起的学科，涉及从蛋白质水平上对基因和细胞进行大规模直观的鉴定，其广泛应用于癌症的识别与治疗、疾病的预测等。蛋白质的酶解是蛋白质组学研究中蛋白质分析鉴定的关键步骤。传统的酶解过程是基于溶液酶解法，通常是将酶与待测样品以质量比1:50的比例混合后，在37℃下反应12-24h。这种方法存在酶解时间较长、容易产生酶的自身酶解、酶无法回收利用等问题。近年来，固定化酶技术以其快速、高效、可回收等特点在蛋白质酶解中得到广泛应用。众多固定化酶载体材料(如磁性颗粒、聚合物膜、介孔材料、二氧化硅等)均可以显著缩短酶解所需要的时间，加快酶解反应过程。然而，受到基体材料自身亲疏水性质的限制，亲水性载体材料在酶解过程中难以对待测蛋白质样品进行富集，而疏水性载体材料易对蛋白质及其酶解产物产生非特异性吸附，从而影响酶解的效率以及后续蛋白质鉴定的准确度。因此采用智能亲疏水载体材料进行蛋白质酶解和鉴定，可以在提高酶解效率的同时，增强蛋白质样品肽段的检出率。
发明内容
鉴于现有技术中存在的上述问题，本发明提供了一种基于固定化酶的蛋白质酶解方法，本发明利用温敏性微球为固定化酶载体，通过温度调节就可以对固定化酶微球的亲疏水性进行控制，即在较高温度下实现对蛋白质的高效富集和酶解，在较低温度下实现酶解后肽段的有效释放，采用该方法可以同时提升酶解效率和质谱鉴定的样品肽段的检出率。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供了一种蛋白质酶解的方法，其包括：利用温敏固定化酶微球对蛋白质进行酶解。
本发明是以温敏性微球为固定化酶载体，通过温度来调节温敏固定化酶微球的亲疏水性质，进而控制蛋白质酶解过程。
本发明采用将温敏固定化酶微球用于蛋白质酶解，即本发明提供了关于温敏固定化酶微球在蛋白质酶解中的用途。
本发明利用温度调节温敏固定化酶微球亲疏水性的原理为：在酶解温度高于温敏固定化酶微球的临界相转变温度时，微球呈疏水性，能够富集待测蛋白质样品的同时对其进行酶解；在酶解温度低于温敏固定化酶微球的临界相转变温度时，停止酶解并释放肽段，从而提高酶解效率和样品肽段的检出率。
本发明采用温敏性微球，相比纳米级别载体，其具有更快的沉降速率，无需使用纳米载体体系在分离过程中所要求的高转速、长时间等苛刻的分离条件，可避免由于长时间离心时，离心机发热对固定化酶活性的影响；相比采用其它载体，例如磁性颗粒、聚合物膜、介孔材料、二氧化硅、氧化石墨烯材料等，其可以实现通过温度来调节温敏固定化酶微球的亲疏水性质，从而大大提高酶解的效率以及后续蛋白质鉴定的准确度，提高样品肽段的检出率。
根据本发明，所述蛋白质酶解的方法，其包括以下步骤：
(1)将待酶解的蛋白质样品进行热变性处理；
(2)采用温敏固定化酶微球对步骤(1)得到的溶液进行酶解处理；
(3)酶解1-60min后，终止酶解反应，分离温敏固定化酶微球与酶解产物溶液，收集酶解产物溶液。
本发明中可将收集到的酶解产物直接进行质谱鉴定，从得到样品肽段的条数来判定待测样品，进而实现蛋白质的鉴定。
根据本发明，在蛋白质酶解中用到的温敏固定化酶微球，其载体材料是由N-异丙基丙烯酰胺与丙烯酸或甲基丙烯酸通过共聚反应形成的，优选由N-异丙基丙烯酰胺与丙烯酸通过共聚反应形成。
本发明中所用到的载体材料可以采用本领域公知的技术进行制备，例如可以采用无皂乳液聚合法、分散聚合法、沉淀聚合法、快速膜乳化法或微流控技术等，具体地，例如可以采用如下方法来进行制备。
第一种：
1.1实验试剂
N-异丙基丙烯酰胺，用正己烷-丙酮(体积比50/50)混合溶剂重结晶3次，共聚单体为丙烯酸，用5％的NaOH溶液除去阻聚剂，引发剂为过硫酸钾，交联剂为N,N′-亚甲基双丙烯酰胺。
1.2微球的制备
采用无皂乳液聚合反应制备共聚微球：将单体N-异丙基丙烯酰胺，丙烯酸和交联剂溶解于200mL去离子水后放入250mL的四颈烧瓶中，N-异丙基丙烯酰胺、交联剂、去离子水的质量比为100:0.1-1:20000，通入氮气并进行机械搅拌，稳定15min后加入引发剂，将温度升高到80℃，继续反应4-6h。反应结束后将温度降至室温，将样品装入截留分子量为20000-50000的透析袋中在室温下纯水透析48-72h。最后，将样品冻干，室温下密封保存。
第二种：
1.1实验试剂
N-异丙基丙烯酰胺，用正己烷-丙酮(体积比50/50)混合溶剂重结晶3次，共聚单体为甲基丙烯酸，引发剂为偶氮二异丁腈，交联剂为N,N′-亚甲基双丙烯酰胺，稳定剂为聚乙烯吡咯烷酮。
1.2微球的制备
采用分散聚合反应制备共聚微球：将0.5-5g稳定剂加入50mL水中搅拌均匀，将甲基丙烯酸、N-异丙基丙烯酰胺、交联剂加入其中并通入氮气。N-异丙基丙烯酰胺、交联剂、去离子水的质量比为1:0.2-1.0:80。30min后将体系温度升至60℃，稳定15min后加入0.25-0.5g引发剂，反应6-12h。反应结束后将温度降至室温，将样品装入截留分子量为20000-50000的透析袋中在室温下纯水透析48-72h。最后，将样品冻干，室温下密封保存。
第三种：
1.1实验试剂
N-异丙基丙烯酰胺，用正己烷-丙酮(体积比50/50)混合溶剂重结晶3次，共聚单体丙烯酸，用5％的NaOH溶液除去阻聚剂，引发剂为过硫酸铵，交联剂为N,N′-亚甲基双丙烯酰胺。
1.2微球的制备
采用沉淀聚合法制备微球：将丙烯酸、N-异丙基丙烯酰胺、引发剂、交联剂溶剂溶解于80mL水溶液中，N-异丙基丙烯酰胺的浓度为7-10g/L；溶液中N-异丙基丙烯酰胺、引发剂、交联剂的质量比为10:0.25-1:0.5-1.5；向溶液中通氮气30min，然后在油浴或水浴条件下将上述溶液加热至70℃，反应8-12h；反应结束后将反应溶液温度降至室温，将样品装入截留分子量为20000-50000的透析袋中在室温下纯水透析48-72h。最后，将样品冻干，室温下密封保存。
第四种：
1.1实验试剂
N-异丙基丙烯酰胺，用正己烷-丙酮(体积比50/50)混合溶剂重结晶3次，共聚剂丙烯酸，用5％的NaOH溶液除去阻聚剂，引发剂为过硫酸铵，交联剂为N,N′-亚甲基双丙烯酰胺，加速剂为四甲基乙二胺。
1.2配制水相
将丙烯酸、N-异丙基丙烯酰胺、引发剂、交联剂加入去离子水中，N-异丙基丙烯酰胺、引发剂、交联剂、去离子水的质量比为10:0.2-0.8:0.2-1.5:500，搅拌至固体完全溶解，配制成水相；
1.3配制油相
将司班-80、环己烷按质量比为1:25混合，室温搅拌至司班-80完全溶解，配制成油相；
1.4微球的制备
采用快速膜乳化法制备共聚微球：将油相与水相按体积比为1:5-20混合，140r/min的转速下搅拌15min得到混合液；将混合液在一定氮气压力下压过微孔玻璃膜(孔径为0.5-50μm)，得到油包水乳液。油包水乳液加入150mL四颈烧瓶中，低速搅拌并通入氮气。1h之后向乳液中加入加速剂，在25℃下反应4-6h。反应结束后停止搅拌，利用丙酮和去离子水分别清洗微球3次。最后将清洗得到的微球分散于去离子水中保存待用。
第五种：
1.1实验试剂
N-异丙基丙烯酰胺，用正己烷-丙酮(体积比50/50)混合溶剂重结晶3次，共聚剂丙烯酸，用5％的NaOH溶液除去阻聚剂，引发剂为过硫酸铵，交联剂为N,N′-亚甲基双丙烯酰胺，加速剂为四甲基乙二胺。
1.2配制水相
将丙烯酸、N-异丙基丙烯酰胺、引发剂、交联剂加入去离子水中，N-异丙基丙烯酰胺、引发剂、交联剂、去离子水的质量比为10:0.6:1.5:100，搅拌至固体完全溶解，配制成水相。
1.3配制油相
将司盘-80、癸醇按质量比为1:10混合，室温搅拌至司班-80完全溶解，配制成油相。
1.4微球的制备
将水相溶液从微流控装置芯片内的注射管(内径为400μm)内通过；将注射管导入油相液面以下。在液滴形成过程中，可通过控制液滴产生的速度(30-500μL/h)，控制液滴的大小及其均一性。液滴在通道内尽量保持一定距离可避免液滴的不稳定而融合，将水相溶液都通入到油相溶液后即可得到油包水乳液。油包水乳液加入150mL四颈烧瓶中，低速搅拌并通入氮气。1h之后向乳液中加入加速剂，在25℃下反应4-6h。反应结束后停止搅拌，利用丙酮和去离子水分别清洗微球3次。最后将清洗得到的微球分散于去离子水中保存待用。
从制备尺寸均一，粒径可控的微米级别颗粒的角度出发，本发明优选的制备方法为快速膜乳化法。分散聚合、沉淀聚合和无皂乳液聚合制备得到的微球多为纳米级别，且粒径不易控制。微流控技术虽然可以制备粒径均一的微球，但其制备过程通量较小，产量底，严重限制了后续的工艺放大，因此也不作为优选方案。
本发明通过调节N-异丙基丙烯酰胺与丙烯酸或甲基丙烯酸的质量比，能制备得到具有较好温度敏感性以及不同临界相转变温度的水凝胶微球，例如可将N-异丙基丙烯酰胺与丙烯酸或甲基丙烯酸的质量比限定为20:1-1:1，优选为10:1-4:1。在此质量比范围内，有助于保持温敏材料的微球的温度敏感性，使其临界相转变温度达到30-45℃。
根据本发明，在蛋白质酶解中用到的温敏固定化酶微球，其固定化酶为固定化胰蛋白酶或固定化糜蛋白酶，优选为固定化胰蛋白酶。
本发明中所用到的温敏固定化酶微球可以采用本领域公知的技术进行制备，具体地，例如可以采用如下方法来进行制备。
第一种：
采用物理吸附法制备固定化酶：将胰蛋白酶溶解于磷酸缓冲溶液中(缓冲液离子浓度为10mmol/L，pH＝7.2～7.4)，配置成1mg/mL的胰蛋白酶溶液。取出微球并加入胰蛋白酶溶液中，微球与胰蛋白酶的质量比为2:1～1:2，混合液在4℃进行12h的吸附反应。反应结束后，将固定化胰蛋白酶微球与未参与吸附反应的胰蛋白酶分离，取出固定化胰蛋白酶微球分散于磷酸缓冲溶液中，4℃下保存备用。
第二种：
采用化学共价固定法制备固定化酶。将胰蛋白酶溶解于磷酸缓冲溶液中(缓冲液离子浓度为10mmol/L，pH＝7.2～7.4)，配置成1mg/mL的胰蛋白酶溶液。另一方面，将微球取出溶解于缓冲溶液中，将加速剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐溶解于1mL的pH＝4.0的盐酸溶液中，加速剂的摩尔数与微球所含的羧基基团的摩尔数一致，将加速剂溶液与微球溶液混合，并将该混合液放置于25℃下进行2h的羧基活化反应。反应结束后用去离子水洗涤微球3～5遍，除去杂质并将微球重新分散于磷酸缓冲液中。将微球溶液与胰蛋白酶溶液混合，溶液中微球与胰蛋白酶的质量比为2:1-1:2，4℃下反应12h后，将固定化酶微球与未参与反应的胰蛋白酶分离。所得到的固定化胰蛋白酶微球分散于磷酸缓冲溶液中，4℃下保存备用。
第三种：
采用物理吸附与化学共价固定结合的方法制备固定化酶。
1.1吸附反应
将胰蛋白酶溶解于磷酸缓冲溶液中(缓冲液离子浓度为10mmol/L，pH＝7.2～7.4)，配置成1mg/mL的胰蛋白酶溶液。取出微球并加入胰蛋白酶溶液中，微球与胰蛋白酶的质量比为1:1-1:2，混合液在4℃进行2h的吸附反应。
1.2共价固定
将加速剂加入1mL的pH＝4.0的盐酸溶液中，待完全溶解后加入含有微球与胰蛋白酶的溶液中，加速剂的摩尔数与微球所含的羧基基团的摩尔数一致，将该混合液放置于25℃下进行2h的共价反应，接着在4℃下继续反应10h。反应结束，将固定化酶微球与未参与反应的活化剂、胰蛋白酶分离。所得到的固定化胰蛋白酶微球分散于磷酸缓冲溶液中，4℃下保存备用。
本发明中制备温敏固定化酶微球的方法优选为物理吸附与化学共价固定结合的方法。这是由于在物理吸法制备得到的固定化酶微球中，酶仅靠静电相互作用吸附于微球表面，静电相互作用不稳定易受外界条件影响，容易造成酶的脱落。在共价固定方法制备得到的固定化酶中，虽然酶与微球之间结合较稳固，但直接用共价键结合会导致酶构象的转变，造成酶活性的大量损失。而采用物理吸附与化学共价固定结合的方法制备固定化酶微球时，首先使酶与微球在一个较弱的离子间相互作用下相互靠近，当微球附近的酶量达到平衡后，再利用共价反应将酶分子固定，这样有利于减小酶的构象转变程度，最大程度保持酶活性。
本发明中采用由N-异丙基丙烯酰胺与丙烯酸或甲基丙烯酸通过共聚反应形成的载体材料来固定化胰蛋白酶或糜蛋白酶，提高了酶解效率和样品肽段的检出率。
根据本发明，所述温敏固定化酶微球的粒径为1-200μm，例如可以是1μm、5μm、10μm、20μm、50μm、100μm、120μm、150μm、180μm或200μm，优选为1-100μm，更优选为1-50μm。
本发明将温敏固定化酶微球的粒径控制在1-200μm，该粒径下的温敏固定化酶微球，其具有的优势主要在于：微球尺寸越小，温敏性越强，表现在：小尺寸的微球临界相转变温度低，同时在达到临界相转变温度时，亲水性的微球会迅速变成具有疏水性质的微球。疏水微球会通过疏水间相互作用在短时间内发生大量聚集，影响酶解；微球过大会导致温敏性较弱，难以在短时间内完成亲疏水转变，也会影响酶解效果。
根据本发明，所述温敏固定化酶微球的临界相转变温度(LCST)为30-45℃，例如可以是30℃、32℃、35℃、38℃、40℃、42℃、43℃或45℃，优选为32-43℃，更优选为35-42℃。
本发明中典型的温敏固定化酶微球的共聚焦显微镜图及固定化酶微球的悬浮液的吸光度值随温度的变化曲线其温度敏感性曲线图如图2-3所示。图2中荧光区域代表酶分子所在区域，从图2可以看到，微球粒径均一，分散性好，而且酶分子分布于靠近微球表面的区域。从图3的曲线中可以看到，在37℃附近，悬浮液的透光度值迅速变小，表明微球在37℃附近发生了相转变行为，由亲水性转变为疏水性，在相转变过程中，微球将其内部水分排出，结构变得更为致密，由此造成微球悬浮液透光度的下降。
本发明将温敏固定化酶微球的临界相转变温度控制在30-45℃，这一温度范围与常用胰蛋白酶和糜蛋白酶的最适催化温度相近。在酶解过程中，当温度为酶的最适催化温度，同时温敏微球呈现出疏水性质，那么可通过疏水间相互作用将待测蛋白富集至固定化酶微球周围，从而加大酶与蛋白的接触几率，提高酶解效率。
本发明采用N-异丙基丙烯酰胺和丙烯酸或甲基丙烯酸的共聚物微球作为胰蛋白酶固定化的载体，通过调节外界温度来控制载体的亲疏水性，改善蛋白质的酶解和鉴定效果。在酶解反应阶段，将温度调节至LCST以上，使载体呈现疏水性能，有效富集待测蛋白质样品，提高酶解效率；降低温度至LCST以下，使载体转变为亲水性，终止酶解反应，并释放出酶解后的肽段，从而提高样品肽段的检出率。
根据本发明，步骤(1)所述热变性处理前还包括：将待酶解的蛋白质样品溶解于碱性溶液中，具体地，所述碱性溶液例如可以是碳酸氢铵缓冲液，Tris-HCl缓冲液或尿素溶液等，在此不做特殊限定；对于碱性溶液的浓度，选取摩尔浓度在20-100mmol/L的碱性溶液，优选为20-30mmol/L。
传统热变性过程中，需要加入还原试剂以及烷基化试剂促进蛋白质分子打开二硫键，以便后续蛋白质水解酶对其进行有效酶解。而本发明中待测样品的热变性过程则不需要加入还原试剂和烷基化试剂，变性后得到的蛋白样品能被温敏固定化酶有效的酶解。因此，本发明免去了还原试剂以及烷基化试剂清除过程，避免这两类试剂对后续分析仪器的干扰，同时由于简化了操作步骤也使变性的效率得到提高。
根据本发明，步骤(1)所述热变性处理的温度为60-100℃，例如可以是60℃、65℃、70℃、72℃、75℃、80℃、82℃、85℃、91℃、95℃或100℃，优选为65-95℃，更优选为75-95℃。
根据本发明，步骤(1)所述热变性处理的时间为10-30min，例如可以是10min、12min、15min、18min、20min、22min、25min、28min或30min，优选为10-25min，更优选为12-25min。
本发明中的步骤(1)可以采用以下操作:
首先需将待酶解的蛋白质样品溶解于摩尔浓度为20-100mmol/L的碱性溶液中，再进行热变性处理，热变性处理的温度为60-100℃，处理时间为10-30min。
步骤(1)也可以采用不将酶解的蛋白质样品溶解于碱性溶液中的操作，而是直接将待酶解的蛋白质样品进行热变性处理，其处理的温度和时间同上所述。
根据本发明，步骤(2)所述的采用温敏固定化酶微球对步骤(1)得到的溶液进行酶解处理，其酶解处理的温度为37-55℃，例如可以是37℃、38℃、40℃、41℃、43℃、45℃、50℃、51℃、53℃或55℃，优选为37-45℃。
本发明通过采用37-55℃的酶解处理温度，使得酶解温度高于温敏固定化酶微球的临界相转变温度(LCST)，在该温度下，温敏微球表现出疏水性质，有助于提高固定化酶对待测蛋白样品的亲和力，并且疏水微球通过疏水间相互作用，能有效富集待测蛋白分子，从而提高酶解效率。
本发明中，酶解温度不能高于55℃，若高于此温度，将在一定程度上影响固定化酶的活性，降低酶解效率。
根据本发明，步骤(2)所述酶解处理中酶与待测蛋白质样品的质量比为1:1-1:45，例如可以是1:1、1:3、1:5、1:6、1:9、1:10、1:12、1:15、1:18、1:22、1:30、1:35、1:40、1:42或1:45，优选为1:1-1:30。
根据本发明，步骤(2)所述酶解处理中蛋白底物的浓度为10ng/mL-5mg/mL，例如可以是10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、1μg/mL、10μg/mL、100μg/mL或1mg/mL，优选为0.1μg/mL-1mg/mL。
在传统溶液酶解法中，为降低酶的自酶解，通常采用较低的酶浓度(酶与底物质量比为1:50)进行酶解反应。在这一条件下为了达到充分酶解的目的，会采用较长酶解时间，因而难以解决酶的自酶解带来背景峰的问题。固定化之后，酶的稳定性得到了很大提升，酶分子相遇发生自消化的几率降低。因此在酶解过程中，通过适当加大酶的浓度来提高酶解效率并且不会引入背景峰干扰后续鉴定。酶解过程中所选择的蛋白底物浓度较低，酶解处理过程中所选择的处理温度高于温敏固定化酶微球的LCST，此时固定化酶微球会表现出疏水性质，通过疏水相互作用可以将蛋白分子富集于固定化酶微球周围，因此能有效的酶解低浓度蛋白质。
根据本发明，步骤(3)所述酶解的时间为1-30min，例如可以是1min、2min、5min、8min、10min、12min、15min、18min、20min、25min、28min或30min，优选为1-20min，更优选为1-10min。
本发明所用的酶解时间少于传统溶液酶解法(一般为12-24h)，这是由于在高于固定化酶微球的LCST的温度时，疏水的微球能够有效富集底物，加大酶解效率；同时由于酶与底物质量比较高，酶量的增加直接加快了酶解速率，因此与自由酶相比可以缩短酶解时间。
根据本发明，酶解一段时间后，需将温度降至5-25℃，终止酶解反应，分离温敏固定化酶微球与酶解产物溶液，收集产物溶液后直接进行质谱鉴定。
本发明中，酶解反应后，通过将温度降至微球的LCST值以下即可终止酶解反应。这是由于温度低于LCST时，微球表现亲水性质，与蛋白样品之间的疏水相互作用减弱，直接减少了酶与蛋白的接触机会；同时温度下降也直接导致酶的活性下降。基于上述原因，通过降低温度即可迅速终止酶解反应。终止过程不需要外加强酸物质对反应进行终止，有效避免了外源试剂对样品的干扰，同时保护了酶的活性，有助于固定化酶的再次利用。另外，降低温度使微球表现出亲水性质的另一优势是，微球在亲水的状态下，对蛋白及产物的非特异性吸附降低，能有效的将反应产物释放，提高后续质谱分析的肽段检出率。酶解反应结束后，先通过离心将固定化酶与酶解产物分离，再收集上清溶液进行超滤装置的二次离心，去除杂质和未酶解完全的蛋白底物，实现肽段的收集。由于体系中盐浓度较低，因此收集得到的滤液无需脱盐处理，可直接进行液相色谱-质谱的分析和鉴定。
本发明所述蛋白质酶解方法可以采用如下步骤来进行:
(1)将待酶解的蛋白质样品在60-100℃下进行热变性处理10-30min；
(2)采用温敏固定化酶微球对步骤(1)得到溶液进行酶解处理，处理的温度为37-55℃，所述酶解处理中酶与待测蛋白质样品的质量比为1:1-1:45；
(3)酶解1-60min后，将温度降至5-25℃，终止酶解反应，分离温敏固定化酶微球与酶解产物溶液，收集酶解产物溶液。
本发明还提供了如前所述的温敏固定化酶微球在蛋白质酶解中的用途，其中，所述温敏固定化酶微球的载体材料是由N-异丙基丙烯酰胺与丙烯酸或甲基丙烯酸通过共聚反应形成的；所述温敏固定化酶微球的固定化酶为固定化胰蛋白酶或固定化糜蛋白酶。
本发明中的温敏固定化酶微球在蛋白质酶解中应用时，其具体方法同如前所述的蛋白质酶解方法，在此不做赘述。
本发明利用温敏微球的亲疏水性质，实现通过调控温度来调节固定化胰蛋白酶的酶解效率，可有效避免因载体自身性质而造成的酶解效率低，酶解后产物释放不完全造成样品肽段检出率低等缺点，同时更好的解决了酶在使用后无法回收的问题。
与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果:
(1)本发明可以通过温度对蛋白质酶解过程进行控制，在37-55℃进行蛋白质酶解反应，在5-25℃下终止蛋白质酶解反应，提高了酶解效率和样品肽段的检出率；
(2)与常规酶解温度37℃相比，本发明可有效拓宽酶解温度范围至55℃，并实现较高温度下的蛋白质酶解，在保持蛋白质结构稳定的前提下，提高了蛋白质酶解效率；
(3)本发明在进行蛋白质酶解反应时，疏水的环境可以更好的富集蛋白质，有利于酶与待测蛋白质样品的充分接触，在较低的蛋白底物浓度下能进行快速酶解，因而适用于微量样品的处理；
(4)本发明在完成蛋白质酶解时，亲水的环境可以显著降低对蛋白质及其酶解产物的非特异性吸附，从而增强蛋白质鉴定的精确度；
(5)与常规酶解时间12-24h相比，本发明完成蛋白质酶解的时间较短，最短时间仅需1min，显著减少了时间的消耗；
(6)本发明可以实现亲、疏水固定化蛋白酶的快速转换，具有较高的酶解效率和完全性，同时固定化酶可回收利用，这有利于复杂蛋白质混合物的研究。
附图说明
图1是本发明的方法流程图；
图2是温敏微球固定化胰蛋白酶的激光共聚焦显微镜照片；
图3是温敏固定化胰蛋白酶微球的悬浮液的透光度随温度的变化曲线；
图4是实施例1中使用温敏固定化酶微球酶解牛血清白蛋白所获得产物的总离子流图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
一种基于固定化酶的蛋白质酶解方法，其具体的操作步骤如下：
(1)温敏固定化胰蛋白酶微球的制备
(a)载体材料的制备
载体材料由N-异丙基丙烯酰胺与丙烯酸按9:1的质量比进行共聚所形成，其具体的制备方法为：
采用快速膜乳化法制备共聚微球：将丙烯酸、N-异丙基丙烯酰胺、引发剂、交联剂加入去离子水中，N-异丙基丙烯酰胺、引发剂、交联剂和去离子水的质量比为10:0.2:1.5:500，搅拌至固体完全溶解，配制成水相；将司班-80和环己烷按质量比为1:20混合，室温搅拌至司班-80完全溶解，配制成油相；将油相与水相按体积比为1:5混合，低转速下搅拌15min得到混合液；将混合液在一定氮气压力下过微孔玻璃膜(孔径为12μm)，得到油包水乳液。油包水乳液加入150mL四颈烧瓶中，140r/min转速下搅拌并通入氮气。1h之后向乳液中加入加速剂，在25℃下反应4h。反应结束后停止搅拌，利用丙酮和去离子水分别清洗微球3次。最后将清洗得到的微球分散于去离子水中保存待用。
(b)温敏固定化胰蛋白酶微球的制备
采用物理吸附法制备温敏固定化胰蛋白酶微球：将胰蛋白酶溶解于磷酸缓冲溶液中(缓冲液离子浓度为10mmol/L，pH＝7.2)，配置成1mg/mL的胰蛋白酶溶液。取出微球并加入胰蛋白酶溶液中，微球与胰蛋白酶的质量比为1:2，混合液在4℃进行12h的吸附反应。反应结束后，将固定化胰蛋白酶微球与未参与吸附反应的胰蛋白酶分离，最终得到粒径为15.0μm的温敏固定化胰蛋白酶微球，所固定的酶量比微球的质量为160mg/g，其LCST值为37℃。固定化胰蛋白酶微球分散于磷酸缓冲溶液中，4℃下保存备用。
(2)将待酶解的牛血清白蛋白(BSA)样品溶解于20mM Tri-Hcl溶液中，在90℃下进行热变性处理，处理时间为15min，处理结束后将变性的BSA样品冷却至室温。
(3)在42℃下，采用温敏微球固定化胰蛋白酶对所得的变性BSA样品进行酶解处理，酶的质量与BSA样品的质量比为1:1，BSA样品的浓度为100ng/mL，酶解时间为30min。
(4)酶解完成后，将温度降至25℃同时在3000r/min下离心20min，对酶解反应进行终止，分别收集固定化酶微球和上清溶液。将上清溶液加入50kDa超滤离心管中，9000r/min下离心10min，收集滤液，然后进行后续液相色谱-质谱串联的仪器进行分析。首先使用液相色谱对样品进行分离(Agilent 1100色谱系统)，Thermo scientific Snycronis-C18柱(4.6×250mm，5μm)；流动相：A，H2O(0.1％TFA)；B，ACN(0.1％TFA)；梯度洗脱条件：0-70min，5％-70％B；流速：0.75mL/min；进样量50μL。然后进行串联质谱分析，质谱条件：LCQDECAXP离子阱质谱，离子源(ESI)喷雾电压为4.5kV；毛细管温度为300℃；鞘气(N2)60个单位；正离子方式检测，采用全扫描一级质谱检测，一级质谱扫描范围m/z 300-2000，精确质量数扫描(Zoom scan)和二级质谱(MS/MS)扫描均为数据依赖型扫描(Data Dependent Scan)；动态排除次数1；动态排除时间0.5min；二级质谱碰撞能量为35％。将质谱得到的原始数据采用Turbosequenst软件进行搜索。
图4为使用温敏固定化酶对BSA样品进行酶解所获得产物的总离子流图，图中存在一些酶解肽段对应分子的离子峰。通过对图中离子的二级碎片的信息进行数据库的搜索和比对，即可得到相应的匹配肽段数目。
自由酶和固定化酶酶解BSA样品后所得到的匹配肽段结果如表1所示。在酶解温度为37℃时，自由酶酶解BSA样品12h后，检测到的匹配肽段数仅为4条，当酶解时间进一步缩短为30min，酶解温度为45℃时，检测到的匹配肽段数为1条，表明自由酶无法在30分钟内对BSA进行有效酶解。而在相同的温度下，固定化酶酶解BSA 30min后，其产物溶液中检测到的肽段条数为10条，说明该方法能够大大缩短酶解时间并且有效提高肽段检出率。
表1
| 样品 | 温度 | 时间 | 匹配肽段数 |
| 自由酶 | 37℃ | 12h | 4 |
| 自由酶 | 40℃ | 30min | 1 |
| 固定化酶 | 40℃ | 30min | 10 |
实施例2
一种基于固定化酶的蛋白质酶解方法，其具体的操作步骤如下:
(1)温敏固定化胰蛋白酶微球的制备
(a)载体材料的制备
载体材料由N-异丙基丙烯酰胺与甲基丙烯酸按1:1的质量比进行共聚所形成，其具体的制备方法为：
采用无皂乳液聚合反应制备共聚微球：将单体N-异丙基丙烯酰胺，甲基丙烯酸和交联剂溶解于200mL去离子水后放入250mL的四颈烧瓶中，N-异丙基丙烯酰胺、交联剂和去离子水的质量比为100:0.1:20000，通入氮气并进行机械搅拌，稳定15min后加入引发剂，将温度升高到80℃，继续反应6h。反应结束后将温度降至室温，将样品装入截留分子量为20000-50000的透析袋中在室温下纯水透析48-72h。最后，将样品冻干，室温下密封保存。
(b)温敏固定化胰蛋白酶微球的制备
采用化学共价法制备温敏固定化胰蛋白酶微球：将胰蛋白酶溶解于磷酸缓冲溶液中(缓冲液离子浓度为10mmol/L，pH＝7.4)，配置成1mg/mL的胰蛋白酶溶液。另一方面，将微球取出溶解于缓冲溶液中，将加速剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐溶解于1mL的pH＝4.0的盐酸溶液中，加速剂的摩尔数与微球所含的羧基基团的摩尔数一致，将加速剂溶液与微球溶液混合，并将该混合液放置于25℃下进行2h的羧基活化反应。反应结束后用去离子水洗涤微球3～5遍，除去杂质并将微球重新分散于磷酸缓冲液中。将微球溶液与胰蛋白酶溶液混合，溶液中微球与胰蛋白酶的质量比为2:1，4℃下反应12h后，将固定化酶微球与未参与反应的胰蛋白酶分离。最终得到粒径为5.0μm的温敏固定化胰蛋白酶微球，所固定的酶量比微球的质量为330mg/g，其LCST值为40℃。所得到的固定化胰蛋白酶微球分散于磷酸缓冲溶液中，4℃下保存备用。
(2)将待酶解的BSA样品溶解于100mM NH4HCO3溶液中，在95℃下进行热变性处理，处理时间为10min，处理结束后将变性的BSA样品冷却至室温。
(3)在45℃下，采用温敏微球固定化胰蛋白酶对所得的变性BSA样品进行酶解处理，BSA样品的浓度为500μg/mL，酶与BSA样品的质量比为1:45，酶解时间为60min。
(4)酶解完成后，将温度降至5℃同时在5000r/min下离心15min，对酶解反应进行终止，分别收集固定化酶微球和上清溶液。将上清溶液加入50kDa超滤离心管中，10000r/min下离心8min，收集滤液，然后进行后续液相色谱-质谱串联的仪器进行分析。液相色谱-质谱串联仪器分析的相应参数同实施例1。产物溶液中检测到的肽段条数为13条。
实施例3
一种基于固定化酶的蛋白质酶解方法，其具体的操作步骤如下:
(1)温敏固定化糜蛋白酶微球的制备
(a)载体材料的制备
载体材料由N-异丙基丙烯酰胺与丙烯酸按20:1的质量比进行共聚所形成，其具体的制备方法为：
采用沉淀聚合法制备共聚微球：将丙烯酸、N-异丙基丙烯酰胺、引发剂和交联剂溶剂溶解于80mL水溶液中，N-异丙基丙烯酰胺的浓度为7g/L；溶液中N-异丙基丙烯酰胺、引发剂和交联剂的质量比为10:1:0.5；向溶液中通氮气30min，然后在油浴或水浴条件下将上述溶液加热至70℃，反应8h；反应结束后将反应溶液温度降至室温，将样品装入截留分子量为20000-50000的透析袋中在室温下纯水透析48-72h。最后，将样品冻干，室温下密封保存。
(b)温敏固定化糜蛋白酶微球的制备
采用物理吸附与化学共价固定结合的方法制备温敏固定化糜蛋白酶微球：
1.1吸附反应
将糜蛋白酶溶解于磷酸缓冲溶液中(缓冲液离子浓度为10mmol/L，pH＝7.2～7.4)，配置成1mg/mL的糜蛋白酶溶液。取出微球并加入糜蛋白酶溶液中，微球与糜蛋白酶的质量比为1:2，混合液在4℃进行2h的吸附反应。
1.2共价固定
将加速剂加入1mL的pH＝4.0的盐酸溶液中，待完全溶解后加入含有微球与糜蛋白酶的溶液中，加速剂的摩尔数与微球所含的羧基基团的摩尔数一致，将该混合液放置于25℃下进行2h的共价反应，接着在4℃下继续反应10h。反应结束，将固定化酶微球与未参与反应的活化剂、糜蛋白酶分离。最终得到粒径为1.0μm的温敏固定化糜蛋白酶微球，所固定的酶量比微球的质量为180mg/g，其LCST值为32℃。所得到的固定化糜蛋白酶微球分散于磷酸缓冲溶液中，4℃下保存备用。
(2)将待酶解的细胞色素C样品溶解于20mM尿素溶液中，在95℃下进行热变性处理，处理时间为12min，处理结束后将变性的细胞色素C样品冷却至室温。
(3)在37℃下，采用温敏微球固定化胰蛋白酶对所得的变性细胞色素C样品进行酶解处理，细胞色素C的浓度为5mg/mL，酶与细胞色素C的质量比为1:30，酶解时间为1min。
(4)酶解完成后，将温度降至20℃的同时在9000r/min下离心15min，对酶解反应进行终止，分别收集固定化酶微球和上清溶液。将上清溶液加入10kDa超滤离心管中，10000r/min下离心15min，收集滤液，然后进行后续液相色谱-质谱串联的仪器进行分析。收集上清产物溶液进行后续液相色谱-质谱串联的仪器进行分析。液相色谱-质谱串联仪器分析的相应参数同实施例1。其产物溶液中检测到的肽段条数为3条。
实施例4
(1)温敏固定化糜蛋白酶微球的制备
(a)载体材料的制备
载体材料由N-异丙基丙烯酰胺与甲基丙烯酸按5:1的质量比进行共聚所形成，采用微流控技术制备共聚微球：将甲基丙烯酸、N-异丙基丙烯酰胺和引发剂、交联剂加入去离子水中，N-异丙基丙烯酰胺、引发剂、交联剂和去离子水的质量比为10:0.6:1.5:100，搅拌至固体完全溶解，配制成水相；将司盘-80、癸醇按质量比为1:10混合，室温搅拌至司班-80完全溶解，配制成油相；水相溶液以一定速度(100μL/h)从微流控装置芯片内的注射管(内径为400μm)内通过；将注射管导入油相液面以下，水相溶液完全通入到油相溶液后即可得到油包水乳液。油包水乳液加入150mL四颈烧瓶中，低速搅拌并通入氮气。1h之后向乳液中加入加速剂，在25℃下反应4h。反应结束后停止搅拌，利用丙酮和去离子水分别清洗微球3次。最后将清洗得到的微球分散于去离子水中保存待用。
(b)温敏固定化糜蛋白酶微球的制备
采用化学共价固定法制备温敏固定化糜蛋白酶微球：将糜蛋白酶溶解于磷酸缓冲溶液中(缓冲液离子浓度为10mmol/L，pH＝7.2～7.4)，配置成1mg/mL的糜蛋白酶溶液。另一方面，将微球取出溶解于缓冲溶液中，将加速剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐溶解于1mL的pH＝4.0的盐酸溶液中，加速剂的摩尔数与微球所含的羧基基团的摩尔数一致，将加速剂溶液与微球溶液混合，并将该混合液放置于25℃下进行2h的羧基活化反应。反应结束后用去离子水洗涤微球3～5遍，除去杂质并将微球重新分散于磷酸缓冲液中。将微球溶液与糜蛋白酶溶液混合，溶液中微球与糜蛋白酶的质量比为1:1，4℃下反应12h后，将固定化酶微球与未参与反应的糜蛋白酶分离。最终得到粒径为200μm的温敏固定化糜蛋白酶微球，所固定的酶量比微球的质量为400mg/g，其LCST值为45℃。所得到的固定化糜蛋白酶微球分散于磷酸缓冲溶液中，4℃下保存备用。
(2)将待酶解的细胞色素C样品溶解于50mM碳酸氢铵缓冲溶液中，在65℃下进行热变性处理，处理时间为30min，处理结束后将变性的细胞色素C样品冷却至室温。
(3)在55℃下，采用温敏微球固定化糜蛋白酶对所得的变性细胞色素C样品进行酶解处理，细胞色素C样品的浓度为10ng/mL，酶与细胞色素C的质量比为1:5，酶解时间为30min。
(4)酶解完成后，将温度降至15℃的同时在2500rpm下离心6min，对酶解反应进行终止，分别收集固定化酶微球和上清溶液。将上清溶液加入10kDa超滤离心管中，8000r/min下离心15min，收集滤液，然后进行后续液相色谱-质谱串联的仪器进行分析。液相色谱-质谱串联仪器分析的相应参数同实施例1。其产物溶液中检测到的肽段条数为8条。
实施例5
(1)温敏固定化胰蛋白酶微球的制备
(a)载体材料的制备
载体材料由N-异丙基丙烯酰胺与丙烯酸按15:1的质量比进行共聚所形成，采用快速膜乳化法制备共聚微球：将丙烯酸、N-异丙基丙烯酰胺、引发剂、交联剂加入去离子水中，N-异丙基丙烯酰胺、引发剂、交联剂、去离子水的质量比为10:0.4:0.4:500，搅拌至固体完全溶解，配制成水相；将司班-80、环己烷按质量比为1:20混合，室温搅拌至司班-80完全溶解，配制成油相；将油相与水相按体积比为1:5混合，低转速下搅拌15min得到混合液；将混合液在一定氮气压力下压过微孔玻璃膜(孔径为20μm)，得到油包水乳液。油包水乳液加入150mL四颈烧瓶中，140r/min转速下搅拌并通入氮气。1h之后向乳液中加入加速剂，在25℃下反应6h。反应结束后停止搅拌，利用丙酮和去离子水分别清洗微球3次。最后将清洗得到的微球分散于去离子水中保存待用。
(b)温敏固定化胰蛋白酶微球的制备
采用物理吸附法制备温敏固定化胰蛋白酶微球：将胰蛋白酶溶解于磷酸缓冲溶液中(缓冲液离子浓度为10mmol/L，pH＝7.2)，配置成1mg/mL的胰蛋白酶溶液。取出微球并加入胰蛋白酶溶液中，微球与胰蛋白酶的质量比为1:1，混合液在4℃进行12h的吸附反应。反应结束后，将固定化胰蛋白酶微球与未参与吸附反应的胰蛋白酶分离，最终得到粒径为25μm的温敏固定化胰蛋白酶微球，所固定的酶量比微球的质量为140mg/g，其LCST值为36℃。所得到的固定化胰蛋白酶微球分散于磷酸缓冲溶液中，4℃下保存备用。
(2)将待酶解的马肌红蛋白样品溶解于30mM尿素溶液中，在85℃下进行热变性处理，处理时间为20min，处理结束后将变性的马肌红蛋白样品冷却至室温。
(3)在42℃下，采用温敏微球固定化胰蛋白酶对所得的变性马肌红蛋白样品进行酶解处理，马肌红蛋白样品的浓度为3μg/mL，酶与马肌红蛋白的质量比为1:10，酶解时间为10min。
(4)酶解完成后，将温度降至10℃的同时在3000rpm下离心12min，对酶解反应进行终止，分别收集固定化酶微球和上清溶液。将上清溶液加入10kDa超滤离心管中，5000r/min下离心20min，收集滤液，然后进行后续液相色谱-质谱串联的仪器进行分析。收集上清产物溶液进行后续液相色谱-质谱串联的仪器进行分析。液相色谱-质谱串联仪器分析的相应参数同实施例1，其产物溶液中检测到的肽段条数为3条。
实施例6
(1)温敏固定化胰蛋白酶微球的制备
(a)载体材料的制备
载体材料由N-异丙基丙烯酰胺与丙烯酸按7:1的质量比进行共聚所形成，采用微流控技术制备微球：将丙烯酸、N-异丙基丙烯酰胺、引发剂、交联剂加入去离子水中，N-异丙基丙烯酰胺、引发剂、交联剂、去离子水的质量比为10:0.6:1.5:100，搅拌至固体完全溶解，配制成水相；将司盘-80、癸醇按质量比为1:10混合，室温搅拌至司班-80完全溶解，配制成油相；水相溶液以一定速度(400μL/h)从微流控装置芯片内的注射管(内径为400μm)内通过；将注射管导入油相液面以下，水相溶液完全通入到油相溶液后即可得到油包水乳液。油包水乳液加入150mL四颈烧瓶中，低速搅拌并通入氮气。1h之后向乳液中加入加速剂，在25℃下反应5h。反应结束后停止搅拌，利用丙酮和去离子水分别清洗微球3次。最后将清洗得到的微球分散于去离子水中保存待用。
(b)温敏固定化胰蛋白酶微球的制备
采用物理吸附与化学共价固定结合的方法制备温敏固定化胰蛋白酶微球：
1.1吸附反应
将胰蛋白酶溶解于磷酸缓冲溶液中(缓冲液离子浓度为10mmol/L，pH＝7.2～7.4)，配置成1mg/mL的胰蛋白酶溶液。取出微球并加入胰蛋白酶溶液中，微球与胰蛋白酶的质量比为1:1.5，混合液在4℃进行2h的吸附反应。
1.2共价固定
将加速剂加入1mL的pH＝4.0的盐酸溶液中，待完全溶解后加入含有微球与胰蛋白酶的溶液中，加速剂的摩尔数与微球所含的羧基基团的摩尔数一致，将该混合液放置于25℃下进行2h的共价反应，接着在4℃下继续反应10h。反应结束，将固定化酶微球与未参与反应的活化剂、胰蛋白酶分离。最终得到粒径为50μm的温敏固定化糜蛋白酶微球，所固定的酶量比微球的质量为290mg/g，其LCST值为39℃。所得到的固定化胰蛋白酶微球分散于磷酸缓冲溶液中，4℃下保存备用。
(2)将待酶解的马肌红蛋白样品溶解于30mM碳酸氢铵溶液中，在75℃下进行热变性处理，处理时间为25min，处理结束后将变性的马肌红蛋白样品冷却至室温。
(3)在50℃下，采用温敏微球固定化胰蛋白酶对所得的变性马肌红蛋白样品进行酶解处理，马肌红蛋白样品的浓度为500ng/mL，酶与马肌红蛋白的质量比为1:2，酶解时间为5min。
(4)酶解完成后，将温度降至5℃的同时在3000rpm下离心6min，对酶解反应进行终止，分别收集固定化酶微球和上清溶液。将上清溶液加入10kDa超滤离心管中，7000r/min下离心10min，收集滤液，然后进行后续液相色谱-质谱串联的仪器进行分析。液相色谱-质谱串联仪器分析的相应参数同实施例1，其产物溶液中检测到的肽段条数为5条。
实施例7
(1)与实施例1相比，温敏固定化胰蛋白酶微球的制备步骤中除载体材料中N-异丙基丙烯酰胺与丙烯酸的质量比为3:1外，其它与实施例1相同。最终得到粒径为15.0μm的温敏固定化胰蛋白酶微球，所固定的酶量比微球的质量为220mg/g，其LCST值为40℃。
(2)后续酶解步骤与实施例1一致，酶解产物溶液中检测到的肽段条数为8条。
实施例8
(1)与实施例1相比，除载体材料中N-异丙基丙烯酰胺与丙烯酸的质量比为10:1之外，其它与实施例1相同。最终得到粒径为15.0μm的温敏固定化胰蛋白酶微球，所固定的酶量比微球的质量为190mg/g，其LCST值为38℃。
(2)后续酶解步骤与实施例1一致，酶解产物溶液中检测到的肽段条数为10条。
实施例9
(1)与实施例1相比，除载体材料具体的制备方法不同之外，其它与实施例1相同。其具体的制备方法为沉淀聚合法：将丙烯酸、N-异丙基丙烯酰胺，引发剂、交联剂溶剂溶解于80mL水溶液中，N-异丙基丙烯酰胺的浓度为7g/L；溶液中N-异丙基丙烯酰胺、引发剂、交联剂的质量比为10:0.25:1.5；向溶液中通氮气30min，然后在油浴或水浴条件下将上述溶液加热至70℃，反应12h；反应结束后将反应溶液温度降至室温，将样品装入截留分子量20000-50000的透析袋中在室温下纯水透析72h。最后，将样品冻干，室温下密封保存。制备温敏性固定化酶的方法与实施例1一致，最终得到粒径为1.5μm的温敏固定化胰蛋白酶微球，所固定的酶量比微球的质量为100mg/g，其LCST值为34℃。
(2)后续酶解步骤与实施例1一致，酶解产物溶液中检测到的肽段条数为5条。
实施例10
与实施例1相比，除载体材料具体的制备方法不同之外，其它与实施例1相同。其具体的制备方法为分散聚合法：将5g稳定剂加入50mL水中搅拌均匀，将丙烯酸、N-异丙基丙烯酰胺、交联剂加入其中并通入氮气。N-异丙基丙烯酰胺、交联剂、去离子水的质量比为1:0.2:80。30min后将体系温度升至60℃，稳定15min后加入0.5g引发剂，反应12h。反应结束后将温度降至室温，将样品装入截留分子量20000-50000的透析袋中在室温下纯水透析72h。最后，将样品冻干，室温下密封保存。制备温敏性固定化酶的方法与实施例1一致，最终得到粒径为1μm的温敏固定化胰蛋白酶微球，所固定的酶量比微球的质量为110mg/g，其LCST值为37℃。
(2)后续酶解步骤与实施例1一致，酶解产物溶液中检测到的肽段条数为6条。
实施例11
(1)与实施例1相比，除温敏固定化胰蛋白酶微球的制备方法不同之外，其它与实施例1相同。采用物理吸附与化学共价固定结合的方法制备温敏固定化胰蛋白酶微球。
1.1吸附反应
将胰蛋白酶溶解于磷酸缓冲溶液中(缓冲液离子浓度为10mmol/L，pH＝7.2～7.4)，配置成1mg/mL的胰蛋白酶溶液。取出微球并加入胰蛋白酶溶液中，微球与胰蛋白酶的质量比为1:1，混合液在4℃进行2h的吸附反应。
1.2共价固定
将加速剂加入1mL的pH＝4.0的盐酸溶液中，待完全溶解后加入含有微球与胰蛋白酶的溶液中，加速剂的摩尔数与微球所含的羧基基团的摩尔数一致，将该混合液放置于25℃下进行2h的共价反应，接着在4℃下继续反应10h。反应结束，将固定化酶微球与未参与反应的活化剂、胰蛋白酶分离。最终得到粒径为15.0μm的温敏固定化胰蛋白酶微球，所固定的酶量比微球的质量为360mg/g，其LCST值为39℃。所得到的固定化胰蛋白酶微球分散于磷酸缓冲溶液中，4℃下保存备用。
(2)后续酶解步骤与实施例1一致，酶解产物溶液中检测到的肽段条数为18条。
对比例1
与实施例1相比，除将被固定化的胰蛋白酶微球替换为胃蛋白酶之外，其它与实施例1相同。由于胃蛋白酶的等电点较低(pI＝1.8)，而温敏微球在低于等电点pH值时会发生聚集，因此无法选择合适的pH条件，使胃蛋白酶和温敏微球呈相反电荷，即吸附法无法将胃蛋白酶固定于温敏微球上。
对比例2
与实施例1相比，除将固定化酶替换为固定化木瓜蛋白酶之外，其它与实施例1相同。最终得到粒径为15.0μm的温敏固定化胰蛋白酶微球，所固定的酶量比微球的质量为180mg/g，其LCST值为40℃。后续酶解步骤与实施例1一致，酶解产物溶液中检测到的肽段条数为8条。
对比例3
与实施例1相比，除将载体材料温敏微球替换为氧化石墨烯材料之外，其它与实施例1相同。后续酶解步骤与实施例1一致，酶解产物溶液中检测到的肽段条数为4条。
对比例4
与实施例1相比，除将载体材料温敏微球替换为二氧化硅之外，其它与实施例1相同。后续酶解步骤与实施例1一致，酶解产物溶液中检测到的肽段条数为6条。
通过上述实施例可以看出，本发明提供的基于固定化酶的蛋白质酶解方法，可大大提高酶解效率和样品肽段的检出率，操作步骤简单、方便，可广泛用于蛋白质组学等相关领域的研究。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细结构特征，但本发明并不局限于上述详细结构特征，即不意味着本发明必须依赖上述详细结构特征才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用部件的等效替换以及辅助部件的增加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
Claims (10)
1.一种蛋白质酶解的方法，其特征在于，其包括：利用温敏固定化酶微球对蛋白质进行酶解。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，其包括以下步骤：
(1)将待酶解的蛋白质样品进行热变性处理；
(2)采用温敏固定化酶微球对步骤(1)得到的溶液进行酶解处理；
(3)酶解1-60min后，终止酶解反应，分离温敏固定化酶微球与酶解产物溶液，收集酶解产物溶液。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述温敏固定化酶微球的载体材料是由N-异丙基丙烯酰胺与丙烯酸或甲基丙烯酸通过共聚反应形成的，优选由N-异丙基丙烯酰胺与丙烯酸通过共聚反应形成；
优选地，所述温敏固定化酶微球的固定化酶为固定化胰蛋白酶或固定化糜蛋白酶，优选为固定化胰蛋白酶。
4.如权利要求1-3之一所述的方法，其特征在于，所述温敏固定化酶微球的粒径为1-200μm，优选为1-100μm，更优选为1-50μm；
优选地，所述温敏固定化酶微球的临界相转变温度为30-45℃，优选为32-43℃，更优选为35-42℃。
5.如权利要求2-4之一所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述热变性处理前还包括：将待酶解的蛋白质样品溶解于碱性溶液中；
优选地，所述碱性溶液选自碳酸氢铵缓冲液、Tris-HCl缓冲液或尿素溶液中的任意一种，优选为尿素溶液；
优选地，所述碱性溶液的摩尔浓度为20-100mmol/L，优选为20-30mmol/L。
6.如权利要求2-5之一所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述热变性处理的温度为60-100℃，优选为65-95℃，更优选为75-95℃；
优选地，所述热变性处理的时间为10-30min，优选为10-25min，更优选为12-25min。
7.如权利要求2-6之一所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述酶解处理的温度为37-55℃，优选为37-45℃；
优选地，所述酶解处理中酶与待测蛋白质样品的质量比为1:1-1:45，优选为1:1-1:30；
优选地，所述待测蛋白质样品的质量浓度为10ng/mL-5mg/mL，优选为0.1μg/mL-1mg/mL。
8.如权利要求2-7之一所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述酶解的时间为1-30min，优选为1-20min，更优选为1-10min；
优选地，所述终止酶解反应的温度为5-25℃，优选为5-20℃，更优选为5-10℃。
9.如权利要求1-8之一所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)将待酶解的蛋白质样品在60-100℃下进行热变性处理10-30min；
(2)采用温敏固定化酶微球对步骤(1)得到溶液进行酶解处理，处理的温度为37-55℃，所述酶解处理中酶与待测蛋白质样品的质量比为1:1-1:45；
(3)酶解1-60min后，将温度降至5-25℃，终止酶解反应，分离温敏固定化酶微球与酶解产物溶液，收集酶解产物溶液。
10.温敏固定化酶微球在蛋白质酶解中的用途，其特征在于，所述温敏固定化酶微球的载体材料是由N-异丙基丙烯酰胺与丙烯酸或甲基丙烯酸通过共聚反应形成的，优选由N-异丙基丙烯酰胺与丙烯酸通过共聚反应形成；
优选地，所述温敏固定化酶微球的固定化酶为固定化胰蛋白酶或固定化糜蛋白酶，优选为固定化胰蛋白酶。
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