CN104483295B

CN104483295B - 基于硼酸荧光探针的分子印迹微球检测糖蛋白的方法

Info

Publication number: CN104483295B
Application number: CN201410705830.4A
Authority: CN
Inventors: 张静; 倪艳丽; 魏静茹
Original assignee: Shaanxi Normal University
Current assignee: Shaanxi Normal University
Priority date: 2014-11-27
Filing date: 2014-11-27
Publication date: 2015-08-19
Anticipated expiration: 2034-11-27
Also published as: CN104483295A

Abstract

本发明公开了一种基于硼酸荧光探针的分子印迹微球检测糖蛋白的方法，该方法以单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球为载体，在其表面接枝硼酸荧光探针，以此硼酸荧光探针为功能单体，以指定糖蛋白为模板分子，模板分子与功能单体与聚合后形成稳定预聚物，再采用表面印迹技术制备成指定糖蛋白分子印迹微球，该分子印迹微球对指定糖蛋白有选择性识别性能，可直接采用荧光法检测糖蛋白，与传统的质谱法或色谱法检测相比，操作更简单、检测速度更快。

Description

基于硼酸荧光探针的分子印迹微球检测糖蛋白的方法

技术领域

本发明属于糖蛋白检测技术领域，具体涉及一种基于硼酸荧光探针的分子印迹聚合物微球对糖蛋白的检测方法。

背景技术

糖蛋白是一类重要的翻译后修饰蛋白，在分子识别、细胞内和细胞间信号传导和免疫响应等方面发挥着重要的作用。人体免疫系统中几乎所有参与先天免疫和适应性免疫的关键分子都是糖基化蛋白。蛋白质糖基化的异常是一些肿瘤性疾病发生、发展和转移过程的元凶，当肿瘤性疾病发生时，细胞表面的糖蛋白过量表达。而一些糖蛋白，如甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)，已经作为临床上用来检测癌症的标记物。因此，研究糖蛋白具有重要的生理学意义和临床价值，对了解生命过程具有至关重要的作用。然而在糖蛋白组学研究中，所面临的样品都是成分非常复杂的生物样品体系，如血液、唾液、尿样、组织细胞等，而大部分的糖蛋白的表达丰度都比较低，往往伴随着许多高丰度的非糖蛋白。为了研究其中的糖蛋白，需要首先对这些糖蛋白进行富集分离。另外，传统的质谱、色谱和电泳等检测方法在检测之前需对生物样品进行处理，而该过程极其容易破坏蛋白等生物分子并且耗时过长，因此，需发展一种非破坏性、高灵敏度且快速的检测方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于克服现有技术对糖蛋白检测所存在的不足，提供一种基于硼酸荧光探针，以指定糖蛋白为模板的分子印迹微球对糖蛋白的荧光检测方法。

解决上述技术问题所采用的技术方案由下述步骤组成：

1、单分散多孔交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球表面键合氨基

将单分散多孔交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球在弱酸性条件下水解，得到表面为羟基的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球，将此微球分散于无水乙醇中，加入氨水与3-氨丙基三乙氧基硅烷的体积比为1:10～20的混合液，表面为羟基的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球与3-氨丙基三乙氧基硅烷的质量-体积比为1g:20～40mL，超声分散均匀，室温搅拌12小时，得到表面键合氨基的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球。

2、单分散多孔交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球表面键合硼酸荧光探针

将步骤1得到的表面键合氨基的单分散多孔交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球分散于无水乙醇中，依次加入2-(4-二羟基硼)苯基-4-羧基喹啉、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，表面键合氨基的单分散多孔交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球与2-(4-二羟基硼)苯基-4-羧基喹啉、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1:0.8～1.2:0.8～1.2:0.4～0.6，超声分散均匀，40℃搅拌5～10小时，得到表面键合硼酸荧光探针的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球。

3、制备具有荧光特性的指定糖蛋白分子印迹微球

将步骤2得到的表面键合硼酸荧光探针的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球和指定糖蛋白加入pH值为7.5的磷酸盐缓冲液中，混合均匀，密封，室温孵育3小时，所得产物与过硫酸铵、苯胺在室温条件下搅拌1～4小时，其中表面键合硼酸荧光探针的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球和指定糖蛋白、过硫酸铵、苯胺的质量比为1:0.005～0.015:0.5～2:1～4，得到具有荧光特性的指定糖蛋白分子印迹微球。

4、荧光法检测待测样品

将步骤3得到的具有荧光特性的指定糖蛋白分子印迹微球分散于pH值为5.5～9.5的磷酸盐缓冲液中，配制成0.1mg/mL的指定糖蛋白分子印迹微球分散液，向该分散液中加入指定糖蛋白标准样品，用荧光光谱仪测量不同浓度下指定糖蛋白对应体系的荧光强度，绘制荧光强度随指定糖蛋白浓度的对数值变化的标准曲线；按照上述方法用荧光光谱仪测量待测样品的荧光强度，根据待测样品的荧光强度，结合标准曲线的线性方程即可确定待测样品中指定糖蛋白的浓度。

上述的步骤3中，优选表面键合硼酸荧光探针的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球和指定糖蛋白、过硫酸铵、苯胺的质量比为1:0.01:1:1.5。

上述的步骤4中，所述的磷酸盐缓冲液的pH值最佳为7.5。

上述的单分散多孔交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球根据公开号为CN102382273A、发明名称为“17β-雌二醇分子印迹复合微球的制备方法”的发明专利申请公开的方法制备得到；2-(4-二羟基硼)苯基-4-羧基喹啉由百灵威试剂公司(北京)提供，CAS：373384-17-9。

本发明所述的指定糖蛋白可以是任何一种糖蛋白，即只要在合成时选用测定的目标糖蛋白为模板，即可制得该糖蛋白的分子印迹荧光微球，实现对目标糖蛋白的荧光检测，具体如辣根过氧化物酶、卵清蛋白等。

本发明以单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球为载体，在其表面接枝硼酸荧光探针，以此硼酸荧光探针为功能单体，以指定糖蛋白为模板分子，模板分子与功能单体与聚合后形成稳定预聚物，再采用表面印迹技术制备分子印迹聚合物微球，用于荧光法检测糖蛋白。本发明分子印迹微球的制备方法简单，反应条件温和，制得的分子印迹微球对指定糖蛋白有选择性识别性能，且可直接采用荧光法检测糖蛋白，与传统的质谱法或色谱法检测相比，避免了繁琐的样品处理过程，简化了操作过程，大大提高了分析速率。

附图说明

图1是荧光强度随辣根过氧化物酶浓度变化的荧光光谱图。

图2是荧光强度随辣根过氧化物酶浓度的对数值变化的标准曲线。

图3是荧光强度随卵清蛋白浓度变化的荧光光谱图。

图4是荧光强度随卵清蛋白浓度的对数值变化的标准曲线。

图5是印迹微球和非印迹微球对不同浓度辣根过氧化物酶的吸附曲线。

图6是辣根过氧化物酶分子印迹微球和非印迹微球对不同蛋白的荧光响应柱状图。

图7是卵清蛋白分子印迹微球和非印迹微球对不同蛋白的荧光响应柱状图。

图8是辣根过氧化物酶分子印迹微球对不同比例的辣根过氧化物酶和牛血清白蛋白混合液的荧光响应柱状图。

图9是辣根过氧化物酶分子印迹微球对稀释不同倍数血清的荧光响应柱状图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。

实施例1

1、单分散多孔交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球表面键合氨基

将2.0g单分散多孔交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球加入到50mL 1mol/mL硫酸水溶液中，60℃水浴搅拌24小时，离心分离，除去上清液，产物用去离子水洗涤至中性，60℃真空干燥，得到表面为羟基的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球；将0.5g此微球分散于100mL无水乙醇中，加入1mL氨水和20mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷，超声分散0.5小时，室温搅拌12小时，离心分离除去上清液，沉淀用无水乙醇洗涤，60℃真空干燥，得到表面键合氨基的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球。

将0.10g步骤1得到的表面键合氨基的单分散多孔交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球分散于50mL无水乙醇中，依次加入0.10g 2-(4-二羟基硼)苯基-4-羧基喹啉、0.09g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和0.06g N-羟基琥珀酰亚胺，超声分散均匀，40℃水浴搅拌7小时，产物依次用去离子水、乙醇和乙腈洗涤，60℃真空干燥，得到表面键合硼酸荧光探针的单分散多孔交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球。

3、制备具有荧光特性的辣根过氧化物酶分子印迹微球

将0.5mg辣根过氧化物酶溶于5mL pH值为7.5的磷酸盐缓冲液中，加入50mg步骤2得到的表面键合硼酸荧光探针的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球，混合均匀，密封，室温孵育3小时，然后用pH值为7.5的磷酸盐缓冲液洗涤微球，除去过量的辣根过氧化物酶，再将此微球加入到15mL pH值为7.5的磷酸盐缓冲液中，加入50mg过硫酸铵和75mg苯胺，室温搅拌3小时，产物依次用去离子水、甲醇、体积分数为5％的乙酸水溶液，除去未反应的过硫酸铵、苯胺、辣根过氧化物酶，然后用去离子水洗涤除去乙酸，60℃真空干燥，得到具有荧光特性的辣根过氧化物酶分子印迹微球。

4、荧光法检测待测样品

将步骤3得到的具有荧光特性的辣根过氧化物酶分子印迹微球和辣根过氧化物酶分别分散于pH值为7.5的磷酸盐缓冲溶液中，配制成0.1mg/mL的辣根过氧化物酶分子印迹微球分散液和5μmol/L的辣根过氧化物酶溶液。

取1mL辣根过氧化物酶分子印迹微球分散液，加入不同体积的辣根过氧化物酶溶液，用pH值为7.5的磷酸盐缓冲液定容至5mL，混合均匀，使所得混合液中辣根过氧化物酶的浓度依次为0、0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.60、0.80、1.00μmol/L，然后采用PE LS55荧光分光光度计在最大激发波长为340nm、发射波长为430nm处测量荧光强度，激发和发射的狭缝宽度均为10nm，光电倍增管电压700V。绘制荧光强度随辣根过氧化物酶浓度变化的荧光光谱图以及在最大发射波长430nm下荧光强度随辣根过氧化物酶浓度的对数值变化的标准曲线，结果见图1～2。

由图1～2可见，在相同的检测条件下，具有荧光特性的辣根过氧化物酶分子印迹微球对模板分子辣根过氧化物酶有明显的荧光响应，在辣根过氧化物酶的浓度为0.05～1.00μmol/L时，荧光强度(F)与辣根过氧化物酶浓度的对数值(log C_HRP)呈线性关系，线性方程为：

y＝101.84x+176.28

式中y为F，x为log C_HRP，相关系数R²为0.9905，由相关系数可见，荧光强度与辣根过氧化物酶浓度的对数值的线性关系很好。经测试，该印迹微球对辣根过氧化物酶的检出限为0.020μmol/L。

按照上述方法用PE LS55荧光分光光度计测量待测样品的荧光强度，根据待测样品的荧光强度，结合标准曲线的线性方程即可确定待测样品中辣根过氧化物酶的浓度。

实施例2

按照实施例1的步骤1～2制备表面键合硼酸荧光探针的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球。在实施例1的步骤3中，所用的辣根过氧化物酶用等质量的卵清蛋白替换，得到具有荧光特性的卵清蛋白分子印迹微球。按照实施例1步骤4的方法绘制荧光强度随卵清蛋白浓度变化的荧光光谱图以及在最大发射波长430nm下荧光强度随卵清蛋白浓度的对数值变化的标准曲线，结果见图3～4。

由图3～4可见，在相同的检测条件下，具有荧光特性的卵清蛋白分子印迹微球对模板分子卵清蛋白有明显的荧光响应，在卵清蛋白的浓度为0.05～1.00μmol/L时，荧光强度(F)与卵清蛋白浓度的对数值(log C_OVA)呈线性关系，线性方程为：

y＝95.22x+174.59

式中y为F，x为log C_OVA，相关系数R²为0.9935，由相关系数可见，荧光强度与卵清蛋白浓度的对数值的线性关系很好。经测试，该印迹微球对卵清蛋白的检出限为0.0026μmol/L。

按照上述方法用PE LS55荧光分光光度计测量待测样品的荧光强度，根据待测样品的荧光强度，结合标准曲线的线性方程即可确定待测样品中卵清蛋白的浓度。

对比实施例

按照实施例1和2的步骤1～2制备表面键合硼酸荧光探针的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球。在实施例1和2的步骤3中，不添加模板分子辣根过氧化物酶和卵清蛋白，其他步骤与步骤3相同，得到非印迹微球。

为了验证本发明的有益效果，发明人进行了大量的实验室研究试验，具体试验情况如下：

1、吸附实验

采用TU-1901型紫外分光光度计分别测量实施例1制备的辣根过氧化物酶分子印迹微球(以下简称印迹微球)和对比实施例制备的非印迹微球对不同浓度辣根过氧化物酶的吸附情况，结果见图5。由图5可见，印迹微球对辣根过氧化物酶的吸附容量远远大于非印迹微球，说明印迹微球在制备过程中，表面形成与辣根过氧化物酶空间结构相匹配的印迹孔穴和结合位点，而对于非印迹微球由于其表面没有形成印迹空腔，因此对辣根过氧化物酶没有吸附。

2、选择性实验

按照实施例1步骤4的方法分别测量实施例1制备的辣根过氧化物酶分子印迹微球和实施例2制备的卵清蛋白分子印迹微球(以下均简称印迹微球)和对比实施例制备的非印迹微球对模板分子和其他蛋白的荧光响应情况，结果见图6～7。由图可以看出，印迹微球对模板分子的荧光响应均大于其他蛋白，说明印迹微球对模板分子具有一定的特异选择性，而对其他蛋白不具备识别能力。而对于非印迹微球，由于其表面没有形成印迹空腔，因此对所有的蛋白均无明显的荧光响应。

3、抗干扰实验

取1mL辣根过氧化物酶分子印迹微球分散液，加入1mL 5μmol/L的辣根过氧化物酶溶液和不同体积的牛血清白蛋白溶液，用pH值为7.5的磷酸盐缓冲液定容至5mL，混合均匀，然后采用PE LS55荧光分光光度计测量荧光强度，结果见图8。由图8可以看出，在混合样品中，不同浓度的牛血清白蛋白对印迹微球选择性识别辣根过氧化物酶均无干扰。

4、样品分析

取3份100μL血清，用pH值为7.5的磷酸盐缓冲液分别稀释50、100和200倍，与1mL辣根过氧化物酶分子印迹微球分散液混合均匀后，用pH值为7.5的磷酸盐缓冲液定容至5mL，然后采用PE LS55荧光分光光度计测量荧光强度，并以不添加血清的pH值为7.5的磷酸盐缓冲液作空白对比，结果如图9。由图可知，稀释不同倍数的血清样品的荧光强度并无明显差别，且与空白样品的荧光强度接近，说明血清中的其他物质不会对辣根过氧化物酶的荧光检测造成干扰，制备的辣根过氧化物酶分子印迹微球可以应用于检测生物样品。

在稀释100倍的血清中加入不同体积的辣根过氧化物酶溶液，与1mL辣根过氧化物酶分子印迹微球分散液混合均匀后，用pH值为7.5的磷酸盐缓冲液定容至5mL，然后采用PE LS55荧光分光光度计测量荧光强度，按照实施例1中的线性方程计算体系中辣根过氧化物酶的浓度，然后根据辣根过氧化物酶的加标量和测定值计算加标回收率，结果如表1所示。

表1加标回收率

加标量(μmol/L)	测定值(μmol/L)	加标回收率(％)	标准偏差
				0.10	0.0827	82.7	1.26
0.50	0.4462	89.2	1.33
				1.00	0.9218	92.2	1.13

由表1中可知，印迹微球对3个浓度梯度的辣根过氧化物酶加标血清的加标回收率都高于80％，而且每个浓度梯度平行3三次的标准偏差均不超过1.5，说明该方法的准确度较高、精密度较好。由此可见，本发明基于荧光硼酸探针的分子印迹微球检测糖蛋白的方法可用于检测生物样品，在生物学和临床医学领域具有潜在的应用价值。

Claims

1.一种基于硼酸荧光探针的分子印迹微球检测糖蛋白的方法，其特征在于它由下述步骤组成：

(1)单分散多孔交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球表面键合氨基

将单分散多孔交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球在弱酸性条件下水解，得到表面为羟基的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球，将此微球分散于无水乙醇中，加入氨水与3-氨丙基三乙氧基硅烷的体积比为1:10～20的混合液，表面为羟基的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球与3-氨丙基三乙氧基硅烷的质量-体积比为1g:20～40mL，超声分散均匀，室温搅拌12小时，得到表面键合氨基的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球；

(2)单分散多孔交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球表面键合硼酸荧光探针

将步骤(1)得到的表面键合氨基的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球分散于无水乙醇中，依次加入2-(4-二羟基硼)苯基-4-羧基喹啉、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，表面键合氨基的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球与2-(4-二羟基硼)苯基-4-羧基喹啉、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1:0.8～1.2:0.8～1.2:0.4～0.6，超声分散均匀，40℃搅拌5～10小时，得到表面键合硼酸荧光探针的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球；

(3)制备具有荧光特性的指定糖蛋白分子印迹微球

将步骤(2)得到的表面键合硼酸荧光探针的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球和指定糖蛋白加入pH值为7.5的磷酸盐缓冲液中，混合均匀，密封，室温孵育3小时，然后用pH值为7.5的磷酸盐缓冲液洗涤微球，除去过量的指定糖蛋白，再将此微球与过硫酸铵、苯胺在室温条件下搅拌1～4小时，其中表面键合硼酸荧光探针的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球和指定糖蛋白、过硫酸铵、苯胺的质量比为1:0.005～0.015:0.5～2:1～4，产物依次用去离子水、甲醇、体积分数为5％的乙酸水溶液，除去未反应的过硫酸铵、苯胺、指定糖蛋白，然后用去离子水洗涤除去乙酸，60℃真空干燥，得到具有荧光特性的指定糖蛋白分子印迹微球；

(4)荧光法检测待测样品

将步骤(3)得到的具有荧光特性的指定糖蛋白分子印迹微球分散于pH值为5.5～9.5的磷酸盐缓冲液中，配制成0.1mg/mL的指定糖蛋白分子印迹微球分散液，向该分散液中加入指定糖蛋白标准样品，用荧光光谱仪测量不同浓度下指定糖蛋白对应体系的荧光强度，绘制荧光强度随指定糖蛋白浓度的对数值变化的标准曲线；按照上述方法用荧光光谱仪测量待测样品的荧光强度，根据待测样品的荧光强度，结合标准曲线的线性方程即可确定待测样品中指定糖蛋白的浓度。

2.根据权利要求1所述的基于硼酸荧光探针的分子印迹微球检测糖蛋白的方法，其特征在于：所述的步骤(3)中，表面键合硼酸荧光探针的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球和指定糖蛋白、过硫酸铵、苯胺的质量比为1:0.01:1:1.5。

3.根据权利要求1所述的基于硼酸荧光探针的分子印迹微球检测糖蛋白的方法，其特征在于：所述的步骤(4)中，磷酸盐缓冲液的pH值为7.5。

4.根据权利要求1～3任意一项所述的基于硼酸荧光探针的分子印迹微球检测糖蛋白的方法，其特征在于：在步骤(3)中，所述的指定糖蛋白为辣根过氧化物酶或卵清蛋白。