CN103048471A - 一种定量检测蛋白乙酰化水平的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属生物技术领域，具体为一种定量检测蛋白乙酰化水平的方法。具体包括蛋白芯片制备，绘制标准曲线和实际样品检测。该法克服了用乙酰化抗体直接免疫沉淀富集时抗体亲和力弱而难以高效富集乙酰化蛋白的弊端，能快速，简便地定量检测蛋白乙酰化水平，使用的样品量较少，有利于不同样品之间的差异比较，同时研究乙酰化差异谱图为建立高通量蛋白质乙酰化修饰差异谱分析提供技术平台，有利于探讨乙酰化状态对肝癌转移的预测价值。
Description
技术领域
本发明属生物技术领域，具体的说，涉及一种定量检测乙酰化蛋白的方法。
背景技术
蛋白乙酰化修饰是一种重要的翻译后修饰，其参与多种细胞生物过程的调控，比如基因转录（Bioessays,1998,20(8):615-626）、细胞调亡（Molecular cell,2004.13(5):627-638）、细胞分化（The Journal of Immunology,2008,181(7): 4545）、DNA修复（Journal of Biological Chemistry,2010,285(7):4398），同时乙酰化修饰与肿瘤的发生、发展也有密切关系(Science's STKE,2000,19(6):1176)。
但在研究乙酰化翻译后修饰中，存在蛋白质乙酰化修饰较难产生亲和力强的抗体，且利用抗原-抗体相互作用免疫沉淀反应富集细胞中的乙酰化蛋白质非常困难等问题；从化学的角度讲，乙酰基相对稳定，尚未找到合适的，类似于磷酸化（Molecular & Cellular Proteomics,2007,6(9):1656-1665）和糖基化修饰（Journal of Proteome Research,2009, 8(2):662-672）基于化学键结合的富集材料。因此目前还缺乏快速、非放射定量检测蛋白乙酰化水平的实用方法。
基于以上特点，蛋白芯片具有样品处理简单，样品用量少，高通量，特异性和灵敏度高，可以定量检测的优点，目前广泛应用于检测细胞因子，凝集素等。
专利中描述了制备蛋白芯片以及利用蛋白芯片检测蛋白乙酰化水平方法，该法克服了用乙酰化抗体直接免疫沉淀富集时抗体亲和力弱而难以高效富集的弊端，为建立高通量蛋白质乙酰化修饰差异谱分析提供技术平台，有利于探讨乙酰化水平状态对肝癌转移的预测价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速简便的定量检测乙酰化蛋白的方法。
本发明利用抗原抗体相互作用原理，制备蛋白芯片，应用蛋白芯片定量检测蛋白乙酰化水平。
本发明提供的一种定量检测蛋白乙酰化水平的方法，具体步骤如下：
（1）制备蛋白芯片
利用芯片点样仪器，在三维凝胶芯片上点1-3nL蛋白抗体PBS溶液，点好后储存于4℃冰箱待用，其中所述蛋白抗体PBS溶液的质量-体积浓度为100-300μg/ml；
（2）绘制标准曲线
将上述制备好的蛋白芯片，用山羊血清PBS-T溶液封闭1-2小时, 洗涤，甩干；之后用磷酸缓冲液稀释得到的10倍稀释的肝癌病人血清作为稀释液稀释乙酰化蛋白抗原得到的不同浓度的标准乙酰化蛋白抗原溶液孵育1-2小时，洗涤，甩干；接着用生物素标记的检测抗体PBS溶液孵育1-2小时，洗涤，甩干；再用荧光标记的链霉素PBS溶液孵育0.5-1小时，洗涤，甩干；最后利用激光共聚焦芯片扫描仪扫描上述处理完毕的芯片，检测点样点的荧光强度，绘制标准曲线，得出标准乙酰化蛋白抗原溶液浓度和信号之间的线性关系；其中，所述山羊血清PBS-T溶液的体积百分比浓度为0.1%-10%，所述标准乙酰化蛋白抗原溶液的质量-体积浓度分别为0.25μg/ml、0.5μg/ml、0.75μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、6μg/ml、8μg/ml，所述生物素标记的检测抗体为生物素标记的乙酰化抗体，所述生物素标记的检测抗体PBS溶液质量-体积浓度为0.5-2.5μm/ml，所述荧光标记的链霉素PBS溶液质量-体积浓度范围为5-20μm/ml；
（3）实际样品检测
将步骤（1）中制备的蛋白芯片用山羊血清PBS-T溶液封闭后，用待测样品孵育，洗涤，甩干；接着用生物素标记的检测抗体孵育，洗涤，甩干；再用荧光标记的链霉素孵育，洗涤甩干，其中所述生物素标记的检测抗体为生物素标记的乙酰化抗体，反应具体条件同步骤（2）；芯片处理完毕后，利用激光共聚焦芯片扫描仪扫描，检测点样点的荧光强度，再根据标准曲线定量待测样品的蛋白乙酰化水平。
本发明中，步骤（1）中所述蛋白抗体为牛血清白蛋白抗体或者马肌红蛋白抗体；步骤（2）中所述标准乙酰化蛋白抗原为乙酰化牛血清白蛋白或者乙酰化马肌红蛋白。
本发明中，步骤(1)中蛋白抗体PBS溶液的质量-体积浓度为200μg/ml。
本发明中，步骤（2）中所述山羊血清PBS-T溶液的体积百分比浓度为5%，所述生物素标记的检测抗体PBS溶液的质量-体积浓度为2μg/ml；所述荧光标记的链霉素PBS溶液质量-体积浓度为10μm/ml。
本发明中，步骤（2）中，用山羊血清PBS-T溶液封闭1.5小时后，放入TBST溶液中，在摇床上摇晃洗涤5-10分钟，用无尘纸吸干芯片表面溶液，之后用磷酸缓冲液稀释得到10倍稀释的肝癌病人血清作为样品稀释液，稀释得到不同浓度的标准乙酰化牛血清白蛋白溶液孵育1.5小时，放入TBST溶液中，在摇床上摇晃洗涤5-10分钟，用无尘纸吸干芯片表面溶液；接着用生物素标记的检测抗体PBS溶液孵育1.5小时，放入TBST溶液中，在摇床上摇晃洗涤5-10分钟，用无尘纸吸干芯片表面溶液；再用荧光标记的链霉素PBS溶液孵育1小时，放入TBST溶液中，在摇床上摇晃洗涤5-10分钟，用甩干机甩干；
本发明中，乙酰化蛋白抗原的合成方法参见参考文献1。
本发明应用蛋白芯片的方法定量检测蛋白乙酰化，克服了用乙酰化抗体直接免疫沉淀富集时抗体亲和力弱而难以高效富集乙酰化蛋白的弊端，快速、简便地定量检测蛋白乙酰化水平，使用的样品量较少，有利于不同样品之间的差异比较，同时为建立研究高通量蛋白质乙酰化修饰差异谱分析提供了技术平台，有利于探讨乙酰化状态对肝癌转移的预测价值。
附图说明
图1是整个实验流程图和方案。
图2 是实施例3中样品检测的线性范围。
具体实施方式
下面的实施例是对本发明提出的利用蛋白芯片检测蛋白乙酰化并实现定量分析的方法的进一步说明。
本发明中，乙酰化牛血清白蛋白的制备方法如下：
取20mg牛血清白蛋白，溶于5ml0.1mol/L的碳酸氢铵溶液中。依次加入50μl乙酸酐和200μl吡啶，在30℃烘箱反应24小时，反应产物用快速蛋白纯化仪纯化除盐，得到乙酰化牛血清白蛋白的50mmol/mLTris溶液，经过蛋白定量技术测得浓度是500ug/mL，产物放置于-80℃保存1。
本发明中，磷酸缓冲液(PBS)的pH为7.2。
实施例1 制备蛋白芯片
利用北京博奥公司的芯片点样仪器，在三维凝胶芯片上点牛血清白蛋白抗体。蛋白抗体的浓度是200μg/ml，仪器保持50%的湿度。每张芯片总共12个矩阵，每个矩阵中的样品点数为6行8列，总共48点，每个点点样一次，其抗体体积大概1nl，点好的芯片从点样仪器取下，储存于4℃冰箱待用。
实施例2 利用不同种类蛋白检测芯片特异性
（1）用质量-体积浓度为3μg/ml的 牛血清白蛋白PBS溶液，质量-体积浓度为3μg/ml的乙酰化牛血清白蛋白PBS溶液，质量-体积浓度为3μg/ml的乙酰化马肌红蛋白PBS溶液，质量-体积浓度为3μg/ml的马肌红蛋白PBS溶液，体积百分比浓度为5%的山羊血清PBS溶液，作为下一步的样品；
（2）将实施例1制备的蛋白芯片，用20μl的体积百分比浓度为5%的山羊血清PBS-T溶液封闭1.5h，用20μl的样品孵育1.5h，用TBST溶液洗涤3次，甩干；用质量-体积浓度为2μg/ml的生物素标记的检测抗体， 即生物素标记的乙酰化抗体PBS溶液20μl孵育1.5h，用TBST洗涤3次，甩干；用质量-体积浓度为荧光标记的链霉素PBS溶液孵育1h，用TBST洗涤3次，甩干；
（3）利用激光共聚焦芯片扫描仪扫描芯片，
打开激光共聚焦芯片扫描仪LuxScanTM10K扫描仪器以及相应的荧光532通道，放入处理完毕的蛋白芯片，扫描分辨率：95%,激光强度：600。
结果如表1所示，发现只有乙酰化牛血清白蛋白才有较强的信号，这说明该芯片具有较好的灵敏度和特异性。
表1芯片特异性的检测结果
实施例3 检测乙酰化牛血清白蛋白在肝癌病人血清中的线性范围，绘制标准曲线
（1）用磷酸缓冲液稀释得到10倍稀释的肝癌病人血清作为样品稀释液，稀释乙酰化牛血清白蛋白得到不同浓度的标准乙酰化牛血清白蛋白溶液，其浓度分别为0.25μg/ml、0.5μg/ml、0.75μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、6μg/ml、8μg/ml，作为下一步样品；
（2）将实施例1制备的蛋白芯片用20μl的体积百分比浓度为5%的山羊血清PBS-T溶液封闭1.5h，之后用20μl的样品孵育1.5h，用TBST洗涤3次，甩干；用20μl的质量-体积浓度为2μg/ml生物素标记的检测抗体PBS溶液孵育1.5h，用TBST洗涤3次，甩干；用20μl的质量-体积浓度为10μg/ml荧光标记的链霉素PBS溶液孵育1h，用TBST洗涤3次，甩干；
(3)利用激光共聚焦芯片扫描仪扫描芯片，扫描分辨率：95%,激光强度：600，测试结果如图2所示。分析数据得到其最低检测限是250ng/ml，在0.75-8μg/ml浓度范围内表现出较好的线性关系。
实施例4 利用标准加入法，检测体系的精确度
利用10倍稀释的肝癌病人血清配制不同浓度的乙酰化牛血清白蛋白溶液，其质量-体积浓度为1.5μg/ml，5.0μg/ml，7.0μg/ml；根据实际信号和标准曲线的理论信号对比，得到该芯片的准确度，具体结果如表2所示，其误差分别为7.52%，-5.10%，5.46%。
表2 芯片精确度的检测结果
实施例5 利用芯片体系检测乙酰化马肌红蛋白的乙酰化水平
用马肌红蛋白抗体作为捕获抗体，同实施例1方法制备蛋白芯片，与乙酰化牛血清蛋白相同的方法制备得到乙酰化马肌红蛋白，利用实施例3的方法，用10倍稀释的肝癌病人血清配制不同浓度的乙酰化马肌红蛋白，其浓度为0.5μg/ml，1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、6μg/ml、8μg/ml，得到相应的线性关系y=512.87x+1780.78。
用质量-体积浓度分别为0.8μg /ml，5μg /ml，7μg /ml的乙酰化马肌红蛋白溶液，检测体系的精确度，其误差分别为-1.2%，5.8%，3.4%。
参考文献：
1、乙酰化蛋白的质谱鉴定研究，祝叶萍，樊惠芝，2008年，《化学学报》。
Claims (5)
1.一种定量检测蛋白乙酰化水平的方法，其特征在于：具体步骤如下：
（1）制备蛋白芯片
利用芯片点样仪器，在三维凝胶芯片上点1-3nL蛋白抗体PBS溶液，点好后储存于4℃冰箱待用，其中所述蛋白抗体PBS溶液的质量-体积浓度为100-300μg/ml；
（2）绘制标准曲线
将步骤（1）制备好的蛋白芯片，用山羊血清PBS-T溶液封闭1-2小时, 洗涤，甩干；之后用磷酸缓冲液稀释得到的10倍稀释的肝癌病人血清作为稀释液稀释乙酰化蛋白抗原得到的不同浓度的标准乙酰化蛋白抗原溶液孵育1-2小时，洗涤，甩干；接着用生物素标记的检测抗体PBS溶液孵育1-2小时，洗涤，甩干；再用荧光标记的链霉素PBS溶液孵育0.5-1小时，洗涤，甩干；最后利用激光共聚焦芯片扫描仪扫描上述处理完毕的芯片，检测点样点的荧光强度，绘制标准曲线，得出标准乙酰化蛋白抗原溶液的浓度和信号之间的线性关系；其中，所述山羊血清PBS-T溶液的体积百分比浓度为1%-10%，所述标准乙酰化蛋白抗原溶液的质量-体积浓度分别为0.25μg/ml、0.5μg/ml、0.75μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、6μg/ml、8μg/ml，所述生物素标记的检测抗体为生物素标记的乙酰化抗体，所述生物素标记的检测抗体PBS溶液质量-体积浓度为0.5-2.5μm/ml，所述荧光标记的链霉素PBS溶液质量-体积浓度范围为5-20μm/ml；
（3）实际样品检测
将步骤（1）中制备的蛋白芯片用山羊血清封闭后，用待测样品孵育，洗涤，甩干；接着用生物素标记的检测抗体孵育，洗涤，甩干；再用荧光标记的链霉素孵育，洗涤甩干，其中所述生物素标记的检测抗体为生物素标记的乙酰化抗体，反应具体条件同步骤（2）；芯片处理完毕后，利用激光共聚焦芯片扫描仪扫描，检测点样点的荧光强度，再根据标准曲线定量待测样品的蛋白乙酰化水平。
2. 根据权利要求1所述的定量检测蛋白乙酰化水平的方法，其特征在于：步骤（1）中所述蛋白抗体为牛血清白蛋白抗体或者马肌红蛋白抗体；步骤（2）中所述标准乙酰化蛋白抗原为乙酰化牛血清白蛋白或者乙酰化马肌红蛋白。
3.根据权利要求1所述的定量检测蛋白乙酰化水平的方法，其特征在于：步骤(1)中所述蛋白抗体PBS溶液的质量-体积浓度为200μg/ml。
4.根据权利要求1所述的定量检测蛋白乙酰化水平的方法，其特征在于：步骤（2）中所述山羊血清PBS-T溶液的体积百分比浓度为5%，所述生物素标记的检测抗体PBS溶液的质量-体积浓度为2μg/ml；所述荧光标记的链霉素PBS溶液质量-体积浓度为10μm/ml。
5. 根据权利要求1所述的定量检测蛋白乙酰化水平的方法，其特征在于：步骤（2）中，用山羊血清PBS-T溶液封闭1.5小时后，放入TBST溶液中，在摇床上摇晃洗涤5-10分钟，用无尘纸吸干芯片表面溶液，之后用磷酸缓冲液稀释得到10倍稀释的肝癌病人血清作为样品稀释液稀释乙酰化蛋白抗原得到的不同浓度的标准乙酰化蛋白抗原溶液孵育1.5小时，放入TBST溶液中，在摇床上摇晃洗涤5-10分钟，用无尘纸吸干芯片表面溶液；接着用生物素标记的检测抗体PBS溶液孵育1.5小时，放入TBST溶液中，在摇床上摇晃洗涤5-10分钟，用无尘纸吸干芯片表面溶液；再用荧光标记的链霉素PBS溶液孵育1小时，放入TBST溶液中，在摇床上摇晃洗涤5-10分钟，用甩干机甩干。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20130417 |