CN103900893A - 富集乙酰化修饰的蛋白质的试剂盒及方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种富集乙酰化修饰的蛋白质的试剂盒，该试剂盒包含：泛乙酰化抗体偶联的固相支持物。本发明还公开了一种检测蛋白质乙酰化修饰的方法，包括以下步骤：用上述试剂盒富集待测样品中乙酰化修饰的蛋白质；用抗体芯片、免疫印迹、酶联免疫分析等方法，对富集到的乙酰化蛋白质进行检测，得出待测样品中确定的乙酰化蛋白质。本发明富集乙酰化蛋白的试剂盒，结合各种抗体芯片检测或免疫印迹检测或酶联免疫分析检测，可实现快捷、大规模、针对性的蛋白质乙酰化检测。

Description

富集乙酰化修饰的蛋白质的试剂盒及方法和应用

技术领域

本发明涉及生化医药技术领域，具体涉及一种富集乙酰化修饰的蛋白质的试剂盒及方法和应用。

背景技术

蛋白质翻译后修饰(PTM，post-translational modification)是调节蛋白质生物学功能的关键步骤之一，是蛋白质动态反应和相互作用的一个重要分子基础，同时，它也是细胞信号网络调控的重要靶点。目前，蛋白质翻译后修饰已经成为国际上蛋白质研究的一个极其重要的热点。其中，蛋白质乙酰化(Ac，acetylation)修饰因参与包括转录调控、信号通路调控、代谢调控、蛋白质稳定性调控乃至病原微生物感染调控等多个重要生理功能而受到广泛关注与研究。自从1963年有学者发现组蛋白可以被乙酰化修饰以来(Phillips1963)，乙酰化通过修饰组蛋白进而重构核小体来调控基因转录的机制就得到了充分的研究。同时自从p53作为第一个非组蛋白被发现是乙酰化转移酶(HAT，histone acetyltransferase)的靶标后(Gu and Roeder1997)，非组蛋白乙酰化的发现快速的发展，其中转录因子占据重要部分(Glozak，Sengupta et al.2005)。近半个世纪尤其是近20年以来，组蛋白的乙酰化以及转录因子的乙酰化研究为了解基因转录调控增添了丰富的内容。非组蛋白的乙酰化在细胞的功能如信号通路以及疾病中发挥重要的作用，影响mRNA的稳定性，蛋白的定位、相互作用、降解以及功能，与肿瘤的发生、癌细胞的增殖、免疫功能等相关(Batta，Das et al.2007；Spange，Wagner et al.2009)，能作为包括肿瘤等疾病治疗的靶点(Arif，Senapati et al.2010；Singh，Zhang et al.2010)。目前已发现乙酰化修饰的异常与炎症相关性疾病密切关联，而采用工具药干预乙酰化修饰可有效减轻炎症损伤(何菲，刘娟等2011)。最新研究表明：乙酰化广泛修饰代谢酶以及代谢相关酶，对代谢具有广泛调控功能(李阳，赵世民2011)。除此之外，乙酰化还与其它修饰形式，如泛素化、磷酸化、甲基化、SUMO化等一起相互作用，在细胞的生命活动中发挥着重要的功能(Sadoul，Boyault et al.2008；Yang and Seto2008)。

当前乙酰化的研究受检测手段的局限，主要集中于单个蛋白乙酰化的功能研究。理论上可以通过免疫印迹(IB，immunoblotting)检测靶蛋白的乙酰化水平。然而由于自然状态下目标蛋白乙酰化丰度低，这种方法很难检测到靶蛋白的乙酰化水平。2006年，美国的Zhao YM团队利用抗体富集乙酰化多肽技术结合质谱鉴定的方法，将HeLa细胞蛋白酶解后，利用乙酰化抗体免疫亲和乙酰化的多肽，然后使用质谱鉴定出包含388个乙酰化位点的多肽，最后通过比对数据库得出相应的蛋白质，第一次从鼠肝和培养的HeLa细胞内鉴定到195个被乙酰化修饰的蛋白质(Kim，Sprung et al.2006)。三年后，德国研究团队(Choudhary，Kumar et al.2009)用抗体富集乙酰化多肽结合等电聚焦分离技术与质谱鉴定，同样将样品总蛋白先酶解，然后通过乙酰化抗体免疫亲和乙酰化的多肽，再等电聚焦分离出多个组分，最后分别通过质谱鉴定与数据库比对在人白血病细胞中鉴定到超过1500个乙酰化修饰的蛋白质。同年，ZhaoYM团队又对原核生物大肠杆菌蛋白质进行了细致的乙酰化修饰鉴定，并发现有91种大肠杆菌蛋白质能够被乙酰化修饰(Zhang，Sprung et al.2009)。除此之外，复旦大学的赵世民、管坤良、赵国屏、熊跃等人领导的研究团队也进行了乙酰化修饰谱的鉴定，在人肝细胞和原核沙门氏菌中分别发现了1047种与191种蛋白质被乙酰化修饰(Wang，Zhang et al.2010；Zhao，Xuet al.2010)。尽管以上抗体富集乙酰化多肽技术结合质谱的出现为乙酰化的发现带来了快速的发展，然而这些手段是广谱的海选方法，无特定目标，重复性低，对相关仪器要求高，依赖于数据库，时间消耗长，投入经费巨大。

在目前的研究中，很多研究者侧重于信号通路、转录因子或者某些关键蛋白的乙酰化研究。而上述抗体富集乙酰化多肽结合质谱的方法是先将全长蛋白打断成几十或几百上千个多肽，再利用乙酰化抗体免疫亲和乙酰化的多肽，然后进行质谱检测，通过使用质谱鉴定出包含乙酰化位点的多肽，最后通过比对数据库得出相应的蛋白质。这是一种广谱的检测，无法真正定位到关注的蛋白质成员。因此，为了能更快捷、更具目的性、大规模的检测蛋白的乙酰化修饰以及研究乙酰化在细胞中的生物学意义，一种新型高通量蛋白乙酰化检测手段十分迫切。

发明内容

本发明要解决目前检测蛋白质的乙酰化修饰存在目标不确定、灵敏度低、耗时费钱且对仪器与数据库要求高的技术问题，提供一种富集乙酰化修饰的蛋白质的试剂盒，该试剂盒无需预先进行总蛋白的酶切和纯化，就能高效富集样品中的非加工乙酰化蛋白质，该富集的乙酰化蛋白质是全长蛋白，可以进一步结合蛋白芯片、免疫印迹、酶联免疫分析(ELISA)等方法实现快捷、大规模、针对性的蛋白质乙酰化修饰检测。

此外，还需要提供一种检测蛋白质乙酰化修饰的方法及上述富集乙酰化修饰蛋白试剂盒的应用。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：

在本发明的一个方面，提供了一种富集乙酰化修饰的蛋白质的试剂盒，所述试剂盒包含：泛乙酰化抗体偶联的固相支持物。

所述泛乙酰化抗体包括：针对不同氨基酸位点的单克隆泛乙酰化抗体或多克隆泛乙酰化抗体，所述氨基酸位点包括赖氨酸位点、丙氨酸位点、丝氨酸位点、苏氨酸位点、或甲硫氨酸位点。

所述试剂盒还包含：蛋白裂解液、去非特异性结合固相支持物、偶联缓冲液、TBS缓冲液、洗脱液、中性缓冲液、中和缓冲液、收集管和废液管。

其中，蛋白裂解液组分：0.025M Tris，0.15M NaCl，0.001M EDTA，1％NP-40，5％甘油，pH7.4；

非特异性吸附固相支持物：未进行结合活性活化的固相支持物，成分包含但不限于树脂、琼脂糖、聚丙烯、聚苯乙烯、二氧化硅等；

偶联缓冲液组分：0.01M磷酸钠，0.15M氯化钠，pH7.2；

TBS缓冲液组分：0.025M Tris，0.15M NaCl，pH7.2；

洗脱液组分：(1)100mM甘氨酸·HCl，pH2.8或(2)0.1％三氟乙酸，5％乙腈；

中性缓冲液：Tris-HCl缓冲液，pH7.5；

中和缓冲液组分：1M Tris，pH9.5。

在本发明的另一方面，还提供了一种检测蛋白质乙酰化修饰的方法，包括以下步骤：

用上述试剂盒富集待测样品中乙酰化修饰的蛋白质；

将富集到的乙酰化蛋白质进行标记，标记的基团包括生物素、荧光基团或辣根过氧化物酶；

用固着有多种特异性蛋白抗体的蛋白芯片，对标记的乙酰化蛋白质进行检测；

根据检测到发光信号的抗体，确定待测样品中的乙酰化蛋白质。

富集到的乙酰化蛋白质，也可以不进行标记采用夹心法的方法，利用另一组配对抗体，结合不同种类的已经制备的结合适当蛋白抗体的抗体芯片进行检测。这些抗体芯片可以包括但不限定于肿瘤转移研究、肿瘤代谢研究、肿瘤耐药研究、细胞凋亡研究、转录因子研究、信号通路研究等或进行广谱蛋白修饰筛选研究。

在本发明的另一方面，还提供了一种检测蛋白质乙酰化修饰的方法，包括以下步骤：

用上述试剂盒富集待测样品中乙酰化修饰的蛋白质；

用免疫印迹的方法，对富集到的乙酰化蛋白质进行检测，得出待测样品中确定的乙酰化蛋白质。

在本发明的另一方面，还提供了一种检测蛋白质乙酰化修饰的方法，包括以下步骤：

用上述试剂盒富集待测样品中乙酰化修饰的蛋白质；

用酶联免疫分析方法，对富集到的乙酰化蛋白质进行检测，得出待测样品中确定的乙酰化蛋白质。

用本发明试剂盒富集到的乙酰化蛋白质，还可以用质谱方法进行蛋白质鉴定。

在本发明的另一方面，还提供了上述试剂盒的应用，用于制备检测蛋白质乙酰化的产品。

本发明富集乙酰化修饰的蛋白质的试剂盒，由于不需要预先对总蛋白进行酶切和纯化，即可高效富集样品中的非加工乙酰化全长蛋白，为后续进一步通过蛋白芯片、免疫印迹、酶联免疫分析等步骤进行乙酰化蛋白的检测提供了必要的前提和有效保证。该乙酰化蛋白富集试剂盒结合各种抗体芯片检测或免疫印迹检测或酶联免疫分析检测，可实现快捷、大规模、针对性的蛋白质乙酰化修饰检测。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1是本发明实施例1泛乙酰化抗体质量鉴定结果图；

图2是本发明实施例3的泛乙酰化抗体夹心法广谱检测蛋白质乙酰化的抗体芯片结果图；

图3是本发明试剂盒富集乙酰化蛋白质的原理图；

图4是本发明实施例6应用蛋白芯片方法检测特定蛋白质乙酰化的结果图；

图5是本发明实施例7应用免疫印迹方法检测特定蛋白质乙酰化的结果图。

具体实施方式

下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《精编分子生物学实验指南》(F.M.奥斯伯，R.E.金斯顿，J.G.塞德曼等主编，马学军，舒跃龙等译校。北京：科学出版社，2004)中所述的方法进行。

为了研发出一种更具目的性、更高效快捷的乙酰化蛋白检测方法，本申请人根据以往在蛋白与抗体芯片方面多年的研发经验，首先提出可以在芯片片基上点制多种特异性蛋白的乙酰化抗体，实现蛋白质乙酰化的检测与鉴定，然而目前缺少大量的特异性蛋白的乙酰化抗体，导致了这种方法无法达到高通量的目的。因此，又设计了另一种类似“双抗夹心法”的乙酰化检测芯片，通过在芯片片基上点制多种特异性的抗体(捕获抗体)，将样品与芯片杂交后，然后使用泛乙酰化抗体(Pan-acetylated-lysine Antibody)检测芯片上捕获抗体特异性结合的蛋白质是否存在乙酰化修饰，最后通过荧光等方法显示结果，然而在实际应用中，存在泛乙酰化抗体与芯片上固着的捕获抗体的交叉反应(图2)，导致了该技术方案无法实现。因此，本发明从样本制备到实现检测的整个工艺流程都进行了方法上的改进，研制出了一种富集乙酰化修饰的蛋白质的试剂盒，该试剂盒包含：泛乙酰化抗体偶联的固相支持物。

本发明检测蛋白质乙酰化修饰的方法是：先用试剂盒中的‘泛乙酰化抗体偶联固相支持物’从样品蛋白提取液中富集乙酰化修饰的蛋白质，然后通过系列反应获得只含有乙酰化蛋白质的样品溶液，最后将富集到的乙酰化蛋白质，进一步用抗体芯片、免疫印迹、酶联免疫分析(ELISA)、或质谱等方法检测乙酰化蛋白质。

实施例1泛乙酰化抗体的制备

1.抗原准备

抗原为化学修饰的乙酰化BSA(Ac-BSA)。

2.免疫兔子

分四次皮下注射兔子。

(1)第一次注射：抗原溶液与完全Freund佐剂1∶1混合，注射1ml混合液于兔子皮下。其中，抗原含量200-400μg。

(2)第二次注射：一个月后，抗原溶液与不完全Freund佐剂1∶1混合，注射1ml混合液于兔子皮下。其中，抗原含量100-200μg。

(3)第三次注射：再一个月后，抗原溶液与不完全Freund佐剂1∶1混合，注射1ml混合液于兔子皮下。其中，抗原含量100-200μg。

(4)第四次注射：再一个月后，抗原溶液与不完全Freund佐剂1∶1混合，注射1ml混合液于兔子皮下。其中，抗原含量100-200μg。

3.收集血液

(1)最后一次免疫注射半个月后，处死兔子，颈动脉收集血液。

(2)37℃温箱放置收集的血液2h后，4℃过夜。

(3)第二天，4℃6,000g离心20分钟。

(4)收集上清，弃除沉淀。

4.纯化抗体

将抗体流过偶联乙酰化KLH的琼脂糖柱，最后洗脱收集抗体。

5.质量鉴定

从培养的HeLa细胞中提取蛋白，其中组1与2未处理，3与4经过去乙酰化酶抑制剂TSA(Trichostatin A，Sigma)处理，泛乙酰化抗体的Western blot结果如图1所示。由图1可见，获得的泛乙酰化抗体能够识别蛋白质的乙酰化修饰。

实施例2泛乙酰化抗体与固相支持物的偶联

1.室温平衡所需要的各种试剂。

2.取100μl固相支持物悬液，1,000g离心1min，弃除流出液。

3.加入200μl偶联缓冲液，1,000g离心1min，弃除流出液。重复一次。

4.加入25μl泛乙酰化抗体，补充超纯水与偶联缓冲液至200μl。

5.在通风厨中加入3μl氰基硼氢化钠(Sodium Cyanoborohydride)，室温旋转2h。

6.1,000g离心1min，弃除流出液。

7.加入200μl偶联缓冲液，1,000g离心1min，弃除流出液。重复一次。

8.加入200μl淬灭剂，1,000g离心1min，弃除流出液。

9.加入200μl淬灭剂，并在通风厨中加入3μl氰基硼氢化钠，室温旋转15min。

10.1,000g离心1min，弃除流出液。

11.加入200μl偶联缓冲液，1,000g离心1min，弃除流出液。重复一次。

12.加入150μl1M NaCl，1,000g离心1min，弃除流出液。重复五次。

13.加入200μl偶联缓冲液，1,000g离心1min，弃除流出液。重复一次。

加入200μl偶联缓冲液与叠氮化钠至终浓度为0.02％，4℃储存。

实施例3泛乙酰化抗体夹心法实例

“双抗夹心法”是通过在芯片片基上点制多种特异性的抗体(捕获抗体)，将样品与芯片杂交后，然后使用泛乙酰化抗体检测芯片上捕获抗体特异性结合的蛋白质是否存在乙酰化修饰，最后通过荧光等方法显示结果。在运用“双抗夹心法”前，先用泛乙酰化抗体检测芯片上的抗体是否存在乙酰化的修饰。

1.芯片检测

专用封闭液室温封闭芯片(货号PNK063，美国Full Moon公司)1h，洗涤，封闭液稀释的泛乙酰化抗体(1∶1000)与芯片室温杂交1.5h，1×TBST洗涤3次，每次5分钟，加入封闭液稀释的二抗偶联的荧光基团Cy-3(1∶200)，室温孵育1h，洗涤后扫描。

2.数据分析

通过扫描获得荧光的信号值，我们发现在未加入任何抗原的情况下，芯片上的各种抗体均检测到了很高的荧光信号，可以明显判断出这些信号的产生是由于泛乙酰化抗体与芯片上固着的捕获抗体结合所产生，这说明芯片上固着的捕获抗体存在乙酰化修饰的情况，这样这种“双抗夹心法”就不适合广泛应用。芯片部分扫描图见图2。

实施例4使用本发明试剂盒进行样品富集

本发明试剂盒富集乙酰化蛋白质的原理如图3所示，其具体使用方法如下：

1.总蛋白的提取

初始样品可以是细胞、组织、体液等，通过试剂盒提供的‘蛋白裂解液’提取总蛋白。其中裂解液中事先加入去乙酰化酶抑制剂TSA与NAM(Nicotinamide，Sigma)使其终浓度分别达到10μM，5mM。

2.总蛋白的预处理

对于1mg的总蛋白，使用80μl的‘去非特异性结合固相支持物’，以去除非特异性与固相支持物结合的蛋白质。

a.取80μl的‘去非特异性结合固相支持物’悬液，1,000g离心1min，去除储存液。

b.加入100μl‘偶联缓冲液’，1,000g离心1min，弃除流出液。

c.加入1mg的总蛋白，4℃孵育1h，温和旋转。

d.1,000g离心1min，保留流出液。

3.乙酰化蛋白质的富集

a.取100μl‘泛乙酰化抗体偶联固相支持物’悬液，1,000g离心1min，去除储存液。

b.加入200μl预冷的‘蛋白裂解液’，1,000g离心1min，弃除流出液。重复一次。

c.加入预处理后的样品，总体积300-600μl，4℃过夜，温和旋转。

d.1,000g离心1min，保留样品流出液。

e.加入200μl的‘TBS缓冲液’，1,000g离心1min，弃除流出液。重复两次。

f.加入200μl的‘中性缓冲液’，1,000g离心1min，弃除流出液。

4.乙酰化蛋白质的洗脱

分两次洗脱，第一次加入100μl的‘洗脱液’，孵育10min，1,000g离心1min，收集流出液。第二次加入新的100μl的‘洗脱液’，孵育10min，1,000g离心1min，收集流出液。结束后每管中加入8μl的‘中和缓冲液’，合并各管。

5.泛乙酰化抗体偶联固相支持物的再生

a.紧接步骤4，加入200μl的‘偶联缓冲液’，1,000g离心1min，弃除流出液。重复一次。

进入步骤3或加入200μl的‘偶联缓冲液’，4℃保存。

实施例5生物素标记

富集下来的乙酰化蛋白质样品进行蛋白质浓度测定，若浓度过低，可通过超滤进行浓缩，随后进行生物素标记。

1.每1mg生物素加入100μl DMF(N，N-Dimethylformamide)，终浓度为10μg/μl，标记为Biotin/DMF。

2.取67μl蛋白样品，每管中加入3μl Biotin/DMF进行标记，终体积为70μl；

3.混合均匀，室温下震荡反应2h。

4.加入30μl终止液，室温下震荡反应30分钟。

进入下一步的芯片检测或将样品储存在-80℃。

实施例6应用蛋白芯片的实例

1.芯片检测

使用细胞周期相关抗体芯片，芯片上固着有58种与细胞周期密切相关的蛋白质的抗体(货号ACC058，美国Full Moon公司)。使用专用封闭液室温封闭芯片1h，加入生物素标记的样品与芯片室温杂交2h，加入链亲和素(Streptavidin)偶联的荧光基团Cy-3，室温孵育30分钟，扫描结果见图4。

2.数据分析

通过扫描获得的图4发现芯片上有多种抗体检测到荧光信号值，代表该样品中含有这些抗体对应的乙酰化蛋白质，荧光信号的强弱反应了乙酰化蛋白质的含量。本次实验在样品中共检出Cdk3、Cdk1/p34cdc2、CUL-3、p19ARF等蛋白存在乙酰化修饰。

通过各组(如正常组与肿瘤组)的信号比率，即Cy-3_肿瘤/Cy-3_正常的比率就可得知各组之间的乙酰化差异，从而揭示乙酰化与肿瘤等疾病发生发展的相关机制，并应用于分析相关基因的功能活性。

实施例7应用免疫印迹的实例

1.样品制备

同一批培养的4碟细胞，分别收集提取蛋白，起始量都为1mg。其中样品1与2经过试剂盒处理，富集乙酰化蛋白质。样品3与4通过常规的蛋白裂解液提取蛋白，而后进行α-tubulin的免疫沉淀(IP)实验。

2.免疫印迹

富集后的样品1与2进行泛乙酰化抗体与α-tubulin的免疫印迹实验(图5a，b)；IP后的样品3与4也进行了泛乙酰化抗体与α-tubulin的免疫印迹实验(图5c，d)

3.结果分析

经过本发明试剂盒处理的样品，通过免疫印迹检测到了α-tubulin的乙酰化(图5b)，而常规方法尽管检测到了总α-tubulin(图5d)，但是未能检测到α-tubulin的乙酰化(图5c)。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种富集乙酰化修饰的蛋白质的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含：泛乙酰化抗体偶联的固相支持物。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述泛乙酰化抗体包括：针对不同氨基酸位点的单克隆泛乙酰化抗体或多克隆泛乙酰化抗体，所述氨基酸位点包括赖氨酸位点、丙氨酸位点、丝氨酸位点、苏氨酸位点、或甲硫氨酸位点。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含：蛋白裂解液、去非特异性结合固相支持物、偶联缓冲液、TBS缓冲液、洗脱液、中性缓冲液、中和缓冲液。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含：收集管和废液管。

5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述蛋白裂解液的组分包含：0.025M Tris，0.15M NaCl，0.001M EDTA，1％NP-40，5％甘油，该蛋白裂解液的pH为7.4。

6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述偶联缓冲液的组分包含：0.01M磷酸钠，0.15M氯化钠，该偶联缓冲液的pH为7.2。

7.一种检测蛋白质乙酰化修饰的方法，其特征在于，包括以下步骤：

用权利要求1所述试剂盒富集待测样品中乙酰化修饰的蛋白质；

将富集到的乙酰化蛋白质进行标记，标记的基团包括生物素、荧光基团或辣根过氧化物酶；

用固着有多种特异性蛋白抗体的蛋白芯片，对标记的乙酰化蛋白质进行检测；

根据检测到发光信号的抗体，确定待测样品中的乙酰化蛋白质。

8.一种检测蛋白质乙酰化修饰的方法，其特征在于，包括以下步骤：

用权利要求1所述试剂盒富集待测样品中乙酰化修饰的蛋白质；

用免疫印迹的方法，对富集到的乙酰化蛋白质进行检测，得出待测样品中确定的乙酰化蛋白质。

9.一种检测蛋白质乙酰化修饰的方法，其特征在于，包括以下步骤：

用权利要求1所述试剂盒富集待测样品中乙酰化修饰的蛋白质；

用酶联免疫分析方法，对富集到的乙酰化蛋白质进行检测，得出待测样品中确定的乙酰化蛋白质。

10.权利要求1所述试剂盒的应用，其特征在于，用于制备检测蛋白质乙酰化的产品。

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