CN113588856B - 一种高通量大规模筛选组蛋白修饰结合蛋白质的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于表观遗传生物学技术领域，公开了一种高通量大规模筛选组蛋白修饰结合蛋白质的方法，所述高通量大规模筛选组蛋白修饰结合蛋白质的方法包括：进行组蛋白修饰结合蛋白质筛选前的预处理工作；对组蛋白进行快速提取及翻译处理；进行组蛋白修饰芯片的制备；进行组蛋白修饰与蛋白质结合复合物的制备；进行组蛋白修饰结合蛋白质的筛选。本发明操作方法清晰，设定了明确的用酸法组蛋白提取方法，保证了在后续的操作中组蛋白的操作不会受其他分子的影响，提高了组蛋白的通过的规模以及筛选的准确率，使用LS‑MS检测方法检测蛋白质复合物中的蛋白质种类，使得在后续的修饰操作中有更明确的修饰目标以及提高整体方法的效果。

Description

一种高通量大规模筛选组蛋白修饰结合蛋白质的方法
技术领域
本发明属于表观遗传生物学技术领域，尤其涉及一种高通量大规模筛选组蛋白修饰结合蛋白质的方法。
背景技术
目前，组蛋白修饰是指组蛋白在相关酶作用下发生甲基化、乙酰化、磷酸化、腺苷酸化、泛素化、ADP核糖基化等修饰的过程，在哺乳动物基因组中，组蛋白则可以有很多修饰形式。一个核小体由两个H2A，两个H2B，两个H3，两个H4组成的八聚体和147bp缠绕在外面的DNA组成。组成核小体的组蛋白的核心部分状态大致是均一的，游离在外的N-端则可以受到各种各样的修饰，包括组蛋白末端的乙酰化，甲基化，磷酸化，泛素化，ADP核糖基化等等，这些修饰都会影响基因的转录活性，现有的一种高通量大规模筛选组蛋白修饰结合蛋白质的方法，筛选方法包括制备一种固定有溶胶凝胶材料与组蛋白质修饰多肽混合物的位点的组蛋白修饰芯片，然后将待筛选蛋白质混合物与组蛋白修饰芯片上固定的多肽发生反应，再通过LC-MS/MS液质联用方式分析确定能与特定组蛋白修饰结合的蛋白质种类。根据本发明，组蛋白修饰芯片可以用溶胶凝胶材料在任意大小的孔板、尼龙膜、硝酸纤维素膜、醋酸纤维素膜、玻璃板或硅板上制备，再使用LC-MS/MS液质联用方式高通量大规模鉴定与组蛋白修饰结合的蛋白质，可以发现现有的方法对于组蛋白并没有完整的提取方式，会导致在后续的组蛋白修饰步骤中出现误差，后续的组蛋白筛选也会受影响。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有方法没有在合成载体之前进行组蛋白提取，会产生组蛋白周围的环境影响而导致后续的修饰；同时，现有方法中的蛋白质混合物没有指明其是否均由蛋白质组成，若含有其他的物质，会影响LS-MS的检测结果。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种高通量大规模筛选组蛋白修饰结合蛋白质的方法。
本发明是这样实现的，一种高通量大规模筛选组蛋白修饰结合蛋白质的方法，所述高通量大规模筛选组蛋白修饰结合蛋白质的方法包括如下步骤：
步骤一，进行组蛋白修饰结合蛋白质筛选前的预处理工作：准备显微镜，并利用75％的医用酒精对显微镜进行消毒处理；获取进行组蛋白提取的蛋白质水溶液；将蛋白质水溶液进行预处理，除去冷冻保存的蛋白质中的甘油，并将蛋白质水溶液用低盐缓冲液透析，除去高盐，备用；
步骤二，对组蛋白进行快速提取及翻译处理：将蛋白质水溶液接种到6孔板中，静置后收蛋白，用1*PBS将细胞洗两次，每次吸尽上清；用细胞刮对细胞进行处理，并对细胞进行离心处理；离心后再次吸尽上清，加入0.2M HCl100ul，冰水裂解30min；再次离心，加入20ul的1M Tris Ph＝8.0中和酸性，即可提取得到组蛋白，并对组蛋白进行翻译处理，得到组蛋白修饰多肽，备用；
步骤三，进行组蛋白修饰芯片的制备：将氟化钙晶片用溶剂擦洗干净；采用可拆卸的氟化钙样品池进样，将组蛋白修饰多肽直接涂布在氟化钙晶片上，置于室温下自然挥发；待蛋白溶液在氟化钙晶体表面形成透明的薄层固体膜，置于固定装置中进行固定，即可制备得到组蛋白修饰芯片，备用；
步骤四，进行组蛋白修饰与蛋白质结合复合物的制备：准备待筛选的蛋白质混合物；将蛋白质混合物与组蛋白修饰芯片上的多肽进行结合反应，得到结合物；对结合物中组蛋白修饰与蛋白质结合的复合物进行提取，制备得到组蛋白修饰与蛋白质结合的复合物，备用；
步骤五，进行组蛋白修饰结合蛋白质的筛选：使用任意数量位点的组蛋白修饰芯片并结合LS-MS的检测方法对制备得到的组蛋白修饰与蛋白质结合的复合物进行鉴定，确定蛋白质复合物中的各类蛋白质种类，筛选得到组蛋白修饰结合蛋白质。
进一步，步骤一中，所述蛋白质水溶液是由蛋白质和水组成的溶液，或者是由蛋白质和缓冲液组成的溶液。
进一步，步骤二中，所述进行离心处理的方法为：设置离心功率为80～500W，离心处理时间为10～30min，通过倾析式离心机对细胞进行差速离心处理。
进一步，步骤二中，所述蛋白质水溶液的浓度为0.5～25mg/ml，接种的厚度为5～55μm。
进一步，步骤三中，所述可拆卸的氟化钙样品池，包括一片氟化钙晶片、两片垫片和固定装置，所述垫片、氟化钙晶片和垫片按顺序叠加。
进一步，步骤三中，所述氟化钙晶片还可以替换为孔板、尼龙膜、硝酸纤维素膜、醋酸纤维素膜、玻璃板或硅板中任一种。
进一步，步骤三中，所述组蛋白修饰芯片是使用任意数量位点的组蛋白修饰芯片并结合LS-MS/MS使得可以同时处理大规模的组蛋白。
进一步，步骤三中，所述组蛋白修饰芯片上固定有包含溶胶-凝胶材料与组蛋白修饰多肽混合物的位点。
进一步，步骤四中，所述组蛋白修饰与蛋白质结合的复合物为多种蛋白质进行混合产生的产物。
进一步，步骤五中，所述LS-MS检测方法为：对蛋白质复合物的提取物进行小分子的观察，观察内部的微小差异，从而确定内部所组成的蛋白质成分。
结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明提供的高通量大规模筛选组蛋白修饰结合蛋白质的方法，操作方法清晰，设定了明确的用酸法组蛋白提取方法，保证了在后续的操作中组蛋白的操作不会受其他分子的影响，提高了组蛋白的通过的规模以及筛选的准确率，使用LS-MS检测方法检测蛋白质复合物中的蛋白质种类，使得在后续的修饰操作中有更明确的修饰目标以及提高整体方法的效果。
附图说明
图1是本发明实施例提供的高通量大规模筛选组蛋白修饰结合蛋白质的方法流程示意图。
图2是本发明实施例提供的进行组蛋白修饰结合蛋白质筛选前的预处理工作的方法流程图。
图3是本发明实施例提供的对组蛋白进行快速提取及翻译处理的方法流程图。
图4是本发明实施例提供的进行组蛋白修饰芯片的制备方法流程图。
图5是本发明实施例提供的进行组蛋白修饰与蛋白质结合复合物的制备方法流程图。
图6是本发明实施例提供的高通量大规模筛选组蛋白修饰结合蛋白质的方法中6孔板示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种高通量大规模筛选组蛋白修饰结合蛋白质的方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
如图1所示，本发明实施例提供的高通量大规模筛选组蛋白修饰结合蛋白质的方法包括以下步骤：
S101，进行组蛋白修饰结合蛋白质筛选前的预处理工作；
S102，对组蛋白进行快速提取及翻译处理；
S103，进行组蛋白修饰芯片的制备；
S104，进行组蛋白修饰与蛋白质结合复合物的制备；
S105，进行组蛋白修饰结合蛋白质的筛选。
如图2所示，本发明实施例提供的步骤S101中，所述进行组蛋白修饰结合蛋白质筛选前的预处理工作，包括：
S201，准备显微镜，并利用75％的医用酒精对显微镜进行消毒处理；
S202，获取进行组蛋白提取的蛋白质水溶液；
S203，将蛋白质水溶液进行预处理，除去冷冻保存的蛋白质中的甘油，并将蛋白质水溶液用低盐缓冲液透析，除去高盐。
本发明实施例提供的蛋白质水溶液是由蛋白质和水组成的溶液，或者是由蛋白质和缓冲液组成的溶液。
如图3所示，本发明实施例提供的步骤S102中，所述对组蛋白进行快速提取及翻译处理，包括：
S301，将蛋白质水溶液接种到6孔板中，静置后收蛋白，用1*PBS将细胞洗两次，每次吸尽上清；
S302，用细胞刮对细胞进行处理，并对细胞进行离心处理；离心后再次吸尽上清，加入0.2MHCL 100ul，冰水裂解30min；
S303，再次离心，加入20ul的1M Tris pH＝8.0中和酸性，即可提取得到组蛋白，并对组蛋白进行翻译，得到组蛋白修饰多肽。
本发明实施例提供的进行离心处理的方法为：设置离心功率为80～500W，离心处理时间为10～30min，通过倾析式离心机对细胞进行差速离心处理。
本发明实施例提供的蛋白质水溶液的浓度为0.5～25mg/ml，接种的厚度为5～55μm。
如图4所示，本发明实施例提供的步骤S103中，所述进行组蛋白修饰芯片的制备，包括：
S401，将氟化钙晶片用溶剂擦洗干净；
S402，采用可拆卸的氟化钙样品池进样，将组蛋白修饰多肽直接涂布在氟化钙晶片上，置于室温下自然挥发；
S403，待蛋白溶液在氟化钙晶体表面形成透明的薄层固体膜，置于固定装置中进行固定，即可制备得到组蛋白修饰芯片。
本发明实施例提供的可拆卸的氟化钙样品池，包括一片氟化钙晶片、两片垫片和固定装置，所述垫片、氟化钙晶片和垫片按顺序叠加。
本发明实施例提供的氟化钙晶片还可以替换为孔板、尼龙膜、硝酸纤维素膜、醋酸纤维素膜、玻璃板或硅板中任一种。
本发明实施例提供的组蛋白修饰芯片是使用任意数量位点的组蛋白修饰芯片并结合LS-MS/MS使得可以同时处理大规模的组蛋白。
本发明实施例提供的组蛋白修饰芯片上固定有包含溶胶-凝胶材料与组蛋白修饰多肽混合物的位点。
如图5所示，本发明实施例提供的步骤S104中，所述进行组蛋白修饰与蛋白质结合复合物的制备，包括：
S501，准备待筛选的蛋白质混合物；
S502，将蛋白质混合物与组蛋白修饰芯片上的多肽进行结合反应，得到结合物；
S503，对结合物中组蛋白修饰与蛋白质结合的复合物进行提取，制备得到组蛋白修饰与蛋白质结合的复合物。
本发明实施例提供的组蛋白修饰与蛋白质结合的复合物为多种蛋白质进行混合产生的产物。
本发明实施例提供的步骤S105中，所述进行组蛋白修饰结合蛋白质的筛选，包括：使用任意数量位点的组蛋白修饰芯片并结合LS-MS的检测方法对制备得到的组蛋白修饰与蛋白质结合的复合物进行鉴定，确定蛋白质复合物中的各类蛋白质种类，筛选得到组蛋白修饰结合蛋白质。
本发明实施例提供的LS-MS检测方法为：对蛋白质复合物的提取物进行小分子的观察，观察内部的微小差异，从而确定内部所组成的蛋白质成分。
本发明实施例提供的高通量大规模筛选组蛋白修饰结合蛋白质的方法中6孔板示意图如图6所示。
下面结合工作原理对本发明的技术方案作进一步描述。
本发明的工作原理部分：
采用组蛋白提取，并对其进行翻译，翻译的原理是先对氨基酸活化，形成氨酰tRNA，核糖体的大小亚基、tRNA和mRNA在多种起始因子的协助下组成起始复合物，由于核糖体大小亚基的结合，核糖体产生了供氨基酰tRNA结合的A位点和P位点，在肽基转移酶的催化下，甲硫氨酸与A位的氨基酸形成肽键，并转移至A位，卸载的tRNA转移到E位进而被释放，随后肽酰tRNA转移到P位点，空出A位点，核糖体沿mRNA移动3个碱基的距离，使下一个密码子处以A位，当核糖体遇到3种终止密码，在蛋白质释放因子作用下肽链被释放，随之tRNA、mRNA、核糖体亚基解离，完成翻译。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种高通量大规模筛选组蛋白修饰结合蛋白质的方法，其特征在于，所述高通量大规模筛选组蛋白修饰结合蛋白质的方法包括如下步骤：
步骤一，进行组蛋白修饰结合蛋白质筛选前的预处理工作：准备显微镜，并利用75％的医用酒精对显微镜进行消毒处理；获取进行组蛋白提取的蛋白质水溶液；将蛋白质水溶液进行预处理，除去冷冻保存的蛋白质中的甘油，并将蛋白质水溶液用低盐缓冲液透析，除去高盐，备用；
步骤二，对组蛋白进行快速提取及翻译处理：将蛋白质水溶液接种到6孔板中，静置后收蛋白，用1*PBS将细胞洗两次，每次吸尽上清；用细胞刮对细胞进行处理，并对细胞进行离心处理；离心后再次吸尽上清，加入0.2MHCL 100ul，冰水裂解30min；再次离心，加入20ul的1M Tris pH＝8.0中和酸性，即可提取得到组蛋白，并对组蛋白进行翻译处理，得到组蛋白修饰多肽，备用；
步骤三，进行组蛋白修饰芯片的制备：将氟化钙晶片用溶剂擦洗干净；采用可拆卸的氟化钙样品池进样，将组蛋白修饰多肽直接涂布在氟化钙晶片上，置于室温下自然挥发；待蛋白溶液在氟化钙晶体表面形成透明的薄层固体膜，置于固定装置中进行固定，即可制备得到组蛋白修饰芯片，备用；所述可拆卸的氟化钙样品池，包括一片氟化钙晶片、两片垫片和固定装置，所述垫片、氟化钙晶片和垫片按顺序叠加；所述组蛋白修饰芯片是使用任意数量位点的组蛋白修饰芯片并结合液相色谱-串联质谱LS-MS/MS使得能够同时处理大规模的组蛋白；
步骤四，进行组蛋白修饰与蛋白质结合复合物的制备：准备待筛选的蛋白质混合物；将蛋白质混合物与组蛋白修饰芯片上的多肽进行结合反应，得到结合物；对结合物中组蛋白修饰与蛋白质结合的复合物进行提取，制备得到组蛋白修饰与蛋白质结合的复合物，备用；
步骤五，进行组蛋白修饰结合蛋白质的筛选：使用任意数量位点的组蛋白修饰芯片并结合LS-MS的检测方法对制备得到的组蛋白修饰与蛋白质结合的复合物进行鉴定，确定蛋白质复合物中的各类蛋白质种类，筛选得到组蛋白修饰结合蛋白质。
2.如权利要求1所述的高通量大规模筛选组蛋白修饰结合蛋白质的方法，其特征在于，步骤一中，所述蛋白质水溶液是由蛋白质和水组成的溶液，或者是由蛋白质和缓冲液组成的溶液。
3.如权利要求1所述的高通量大规模筛选组蛋白修饰结合蛋白质的方法，其特征在于，步骤二中，所述进行离心处理的方法为：设置离心功率为80～500W，离心处理时间为10～30min，通过倾析式离心机对细胞进行差速离心处理。
4.如权利要求1所述的高通量大规模筛选组蛋白修饰结合蛋白质的方法，其特征在于，步骤二中，所述蛋白质水溶液的浓度为0.5～25mg/ml，接种的厚度为5～55μm。
5.如权利要求1所述的高通量大规模筛选组蛋白修饰结合蛋白质的方法，其特征在于，步骤三中，所述氟化钙晶片替换为孔板、尼龙膜、硝酸纤维素膜、醋酸纤维素膜、玻璃板或硅板中任一种。
6.如权利要求1所述的高通量大规模筛选组蛋白修饰结合蛋白质的方法，其特征在于，步骤三中，所述组蛋白修饰芯片上固定有包含溶胶-凝胶材料与组蛋白修饰多肽混合物的位点。
7.如权利要求1所述的高通量大规模筛选组蛋白修饰结合蛋白质的方法，其特征在于，步骤四中，所述组蛋白修饰与蛋白质结合的复合物为多种蛋白质进行混合产生的产物。
8.如权利要求1所述的高通量大规模筛选组蛋白修饰结合蛋白质的方法，其特征在于，步骤五中，所述LS-MS检测方法为：对蛋白质复合物的提取物进行小分子的观察，观察内部的微小差异，从而确定内部所组成的蛋白质成分。
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