CN113138249B - 基于微孔阵列芯片的微量样本代谢组、蛋白质组和磷酸化蛋白质组多组学分析方法 - Google Patents

基于微孔阵列芯片的微量样本代谢组、蛋白质组和磷酸化蛋白质组多组学分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了基于微孔阵列芯片的微量样本代谢组、蛋白质组和磷酸化蛋白质组多组学分析方法。本发明包括如下步骤：(1)提供微孔阵列芯片，亲水修饰；(2)将待测细胞样本置于微孔中，加入有机溶剂萃取代谢物；分析萃取液，鉴定代谢物；(3)构建仅包含蛋白质组谱和同时包含蛋白质组和磷酸化蛋白质组谱的质谱谱图数据库；(4)在萃取代谢物后的微孔中加入蛋白酶，收集消化液；对消化液进行液相色谱‑质谱分析；搜索仅包含蛋白质组谱数据库，鉴定肽段及相应蛋白质；搜索同时包含蛋白质组和磷酸化蛋白质组谱数据库，鉴定磷酸肽及相应磷酸化蛋白质。本发明利用HILIC分离原理实现代谢物和蛋白质的串联提取，建立了无需富集的磷酸化蛋白质组分析方法。

Description

基于微孔阵列芯片的微量样本代谢组、蛋白质组和磷酸化蛋 白质组多组学分析方法
技术领域
本发明属于生物分析技术领域，尤其涉及一种基于微孔阵列芯片的微量样本代谢组、蛋白质组和磷酸化蛋白质组多组学分析方法。
背景技术
作为构成生物体系的基本单位，细胞在多细胞生物组织中具有不同的分子和功能特性，以及差异化的表型特征。细胞异质性是生物系统的基本特质，基因的差异化表达决定了细胞亚群间差异，而同一细胞亚型对微环境刺激的不同响应也影响着个体细胞的不同表达。解析细胞异质性对于表征细胞亚群特征与功能，以及探索微环境对复杂细胞体系的影响都至关重要。经典组学技术通过分析大量细胞(>106)的生物学特征来从整体水平揭示生命的功能特性，而这种混合细胞的平均化检测可能导致重要信息的稀释或丢失。相反，单细胞技术可通过细胞逐一检测来表征细胞间的个体差异，并且也适用于数量稀少的样本分析，这在神经科学、发育生物学、肿瘤学和干细胞生物学等研究中具有重要价值。
目前，RNA扩增和测序技术的进步使转录组技术已成功应用于单细胞水平研究，但是核酸层面的单一组学研究无法全面的解析驱动细胞生长、凋亡、感知和响应环境的动态分子过程以及生物体的发病机理、胁迫机制等。采用多组学整合技术，开展多维度分析逐渐成为系统生物学的发展趋势。作为细胞生理功能的主要执行者，基因编码的蛋白质具有复杂的翻译后修饰(如PTM)、转运定位、降解、分子间相互作用等过程，在催化代谢反应、调节信号转导等方面发挥着关键作用。代谢分子作为以上生命活动的最终产物，更准确直接地反映生理病理变化或环境改变给机体带来的影响，是重要的疾病标志物。这些都难以在基因组和转录组层面予以有效阐述。更重要的是，作为调控细胞通路的三个关键因素，蛋白质、修饰与代谢物相互影响，形成了复杂的调控网络：转录因子可通过调控代谢酶的表达影响代谢物的合成；代谢物也可通过酶促或非酶促等不同途径修饰多种蛋白质并直接改变其功能活性。因此，迫切需要直接和集成的多组学分析技术，以全面了解蛋白质组学，代谢组学和修饰水平的细胞异质性，以系统解析生物分子功能和调控机制、打通表型与机制。但是，除核酸以外的生物分子，由于缺乏的有效扩增方法，单细胞水平的超微量多组学分析仍然是一个严峻的挑战。
生物质谱技术，作为一种高灵敏度、高精确度、高分辨率的定性定量方法已广泛应用于生命科学领域，尤其是在组学研究方面发挥了不可替代的作用。在蛋白质、翻译后修饰以及代谢分子表达与功能研究，以及细胞活动生理机制阐述等方面发挥着重要作用。由于无法使用分子扩增方法，因此减少样本损失是质谱单细胞组学的关键。目前，基于液滴和基于毛细管柱的蛋白质组样品处理平台(例如nanoPOTS8，OAD11，iPAD12和ISPEC13等)已被证明在微量/单个细胞的分析中可有效提高检测灵敏度和蛋白质组学覆盖率。此外，通过引入“载体细胞”和同量异位标记，SCoPE-MS方法既减少了样品损失，又增强了质谱信号。对于单细胞代谢组学，通过联合毛细管显微操作与ESI-MS或MALDI-TOF-MS，可鉴定数百种代谢分子。
近年来，虽然质谱仪和样品处理技术的快速发展大力推动了单细胞组学分析，但是蛋白质组、翻译后修饰蛋白质组以及代谢组的分析仍落后于转录组。针对微量或单个细胞的多组学分析，一方面存在着样本量微小的挑战，另一个方面不同种类生物分子通常需要独特的样品预处理方法而这些方法很难兼容。目前，尚未出现有效的方法能够同时分析来自同一样本的蛋白质组、代谢组和翻译后修饰蛋白质组。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种基于微孔阵列芯片的微量样本代谢组、蛋白质组和磷酸化蛋白质组多组学分析方法。
本发明的第一个目的是提供一种基于微孔阵列芯片的微量样本代谢组、蛋白质组和磷酸化蛋白质组多组学分析方法。
本发明提供的是提供一种微量样本的代谢组、蛋白质组和磷酸化蛋白质组多组学分析方法，包括如下步骤：
(1)提供微孔阵列芯片，所述微孔阵列芯片包括基底和基底上的若干微孔构成的微孔阵列，所述微孔的内壁经亲水性修饰；
(2)将待测的微量样本置于所述微孔中，加入有机溶剂萃取代谢物，收集萃取液；对所述萃取液进行分析，鉴定代谢物，即可实现所述代谢组的分析；所述微量样本为单细胞样本、微量细胞样本或微量组织样本；
(3)构建仅包含蛋白质组谱和同时包含蛋白质组和磷酸化蛋白质组谱的质谱谱图数据库；
(4)在萃取所述代谢物后的微孔中加入蛋白酶消化蛋白质，收集消化液；对所述消化液进行液相色谱-质谱分析；
搜索所述仅包含蛋白质组谱的数据库，搜库参数与构建所述仅包含蛋白质组谱的质谱谱图数据库的参数一致，鉴定肽段及相应的蛋白质，即可实现所述蛋白组的分析；
搜索同时包含蛋白质组和磷酸化蛋白质组谱的数据库且设定磷酸化为可变修饰，搜库参数与构建同时包含蛋白质组和磷酸化蛋白质组谱的质谱谱图数据库所使用的参数一致，鉴定磷酸肽及相应的磷酸化蛋白质，即可实现所述磷酸化蛋白组的分析。
上述的制备方法中，步骤(1)中，所述微孔阵列芯片中每个微孔可容纳的样本体积为500nL～2μL，如500nL。具体地，每个微孔的容积可为600nL。
所述基底可为硅片。
所述亲水性修饰可为使用硅烷衍生物进行共价修饰。
所述硅烷衍生物可为2-[甲氧基(聚乙烯氧基)丙基]三甲氧基硅烷。
所述共价修饰的温度可为15～30℃(如25℃)，时间可为20～40min(如30min)。
所述共价修饰的步骤如下：将所述微孔阵列芯片置于所述硅烷衍生物中，浸渍完毕，即可实现所述共价修饰。所述共价修饰在所述浸渍之前还可包括对所述微孔阵列芯片活化的步骤。
上述的制备方法中，步骤(2)中，所述单细胞样本具体可采用薄壁玻璃微量移液器结合口吹法获取。所述方法在添加所述单细胞样本之后还包括对其进行液氮淬灭及真空干燥处理的步骤。
所述微量细胞样本中的细胞数量可由微孔阵列芯片中的微孔的大小而定，如细胞数量为2～200个的细胞样本，再如细胞数量为50个的细胞样本。所述微量细胞样本以细胞悬浮液的形式进行添加，并在添加后进行液氮淬灭及真空干燥处理。所述细胞悬浮液的细胞浓度可为100细胞/μL。
所述有机溶剂可为乙腈；所述有机溶剂可以水溶液的形式进行添加；所述有机溶剂的水溶液中，有机溶剂的体积分数可为50％～100％，具体可为80％；所述萃取的时间可为5～30s，具体可为10s。
步骤(4)中，所述蛋白酶可为胰蛋白酶；所述蛋白酶与蛋白质的质量比可为1：(1～3)，具体可为1：1；所述蛋白酶可以蛋白酶水溶液的形式添加；所述蛋白酶水溶液中蛋白酶的浓度可为0.5～1μg/μL，具体可为1μg/μL；所述消化的温度可为37℃，时间可为2～6h，如4h，pH值可为7～8。
上述的制备方法中，步骤(2)中，所述分析可为质谱分析；所述质谱分析可为电喷雾电离质谱分析；所述质谱分析中，数据库搜索可使用Progenesis QI软件。
步骤(3)中，所述构建质谱谱图数据库的步骤中，采用数据依赖扫描模式。
步骤(4)中，质谱分析中，可采用数据非依赖扫描模式；所述搜索仅包含蛋白质组谱的数据库和所述搜索同时包含蛋白质组和磷酸化蛋白质组谱的数据库的步骤中，可使用PEAKS Studio X+软件。
所述肽段的鉴定中，在肽段水平和蛋白质评分(-10lgP)≥20时，设置蛋白质的假阳性率(FDR)为1％。
所述磷酸肽的鉴定中，通过将假阳性磷酸肽的数量除以FDR 1％阈值下所有磷酸肽的数量来评估磷酸肽亚群的假阳性率，对于高可信的磷酸位点的定位，要求Ascore≥20。
本发明的第二个目的是提供一种用于实现微量样本的代谢组、蛋白质组和磷酸化蛋白质组多组学分析的系统。
本发明提供的一种用于实现微量样本的代谢组、蛋白质组和磷酸化蛋白质组多组学分析的系统，它包括设备、试剂和可读性载体；
所述设备包括所述可读性载体中涉及的各设备；
所述试剂包括所述可读性载体中涉及的各试剂；
所述可读性载体上记载了如下对微量样本的代谢组、蛋白质组和磷酸化蛋白质组进行多组学分析的步骤：
(1)提供微孔阵列芯片，所述微孔阵列芯片包括基底和基底上的若干微孔构成的微孔阵列，所述微孔的内壁经亲水性修饰；
(2)将待测的微量样本置于所述微孔中，加入有机溶剂萃取代谢物，收集萃取液；对所述萃取液进行分析，鉴定代谢物，即可实现所述代谢组的分析；所述微量样本为单细胞样本、微量细胞样本或微量组织样本；
(3)构建仅包含蛋白质组谱和同时包含蛋白质组和磷酸化蛋白质组谱的质谱谱图数据库；
(4)在萃取所述代谢物后的微孔中加入蛋白酶消化蛋白质，收集消化液；对所述消化液进行液相色谱-质谱分析；
搜索所述仅包含蛋白质组谱的数据库，搜库参数与构建所述仅包含蛋白质组谱的质谱谱图数据库的参数一致，鉴定肽段及相应的蛋白质，即可实现所述蛋白组的分析；
搜索同时包含蛋白质组和磷酸化蛋白质组谱的数据库且设定磷酸化为可变修饰，搜库参数与构建同时包含蛋白质组和磷酸化蛋白质组谱的质谱谱图数据库所使用的参数一致，鉴定磷酸肽及相应的磷酸化蛋白质，即可实现所述磷酸化蛋白组的分析。
上述的系统中，步骤(1)中，所述微孔阵列芯片中每个微孔可容纳的样本的体积为500nL～2μL，如500nL。具体地，每个微孔的容积可为600nL。
所述基底为硅片。
所述亲水性修饰可为使用硅烷衍生物进行共价修饰。
所述硅烷衍生物可为2-[甲氧基(聚乙烯氧基)丙基]三甲氧基硅烷。
所述共价修饰的温度可为15～30℃(如25℃)，时间可为20～40min(如30min)。
所述共价修饰的步骤如下：将所述微孔阵列芯片置于所述硅烷衍生物中，浸渍完毕，即可实现所述共价修饰。所述共价修饰在所述浸渍之前还可包括对所述微孔阵列芯片活化的步骤。
上述的系统中，步骤(2)中，所述单细胞样本具体可采用薄壁玻璃微量移液器结合口吹法获取。所述方法在添加所述单细胞样本之后还包括对其进行液氮淬灭及真空干燥处理的步骤。
所述微量细胞样本中的细胞数量可由微孔阵列芯片中的微孔的大小而定，如细胞数量为2～200个的细胞样本，再如细胞数量为50个的细胞样本。所述微量细胞样本以细胞悬浮液的形式进行添加，并在添加后进行液氮淬灭及真空干燥处理。所述细胞悬浮液的细胞浓度可为100细胞/μL。
所述有机溶剂可为乙腈；所述有机溶剂可以水溶液的形式进行添加；所述有机溶剂的水溶液中，有机溶剂的体积分数可为50％～100％，具体可为80％；所述萃取的时间可为5～30s，具体可为10s。
步骤(4)中，所述蛋白酶可为胰蛋白酶；所述蛋白酶与蛋白质的质量比可为1：(1～3)，具体可为1：1；所述蛋白酶可以蛋白酶水溶液的形式添加；所述蛋白酶水溶液中蛋白酶的浓度可为0.5～1μg/μL，具体可为1μg/μL；所述消化的温度可为37℃，时间可为2～6h，如4h，pH值可为7～8。
上述的系统中，步骤(2)中，所述分析可为质谱分析；所述质谱分析可为电喷雾电离质谱分析；所述质谱分析中，数据库搜索可使用Progenesis QI软件。
步骤(3)中，所述构建质谱谱图数据库的步骤中，采用数据依赖扫描模式。
步骤(4)中，质谱分析中，可采用数据非依赖扫描模式；所述搜索仅包含蛋白质组谱的数据库和所述搜索同时包含蛋白质组和磷酸化蛋白质组谱的数据库的步骤中，可使用PEAKS Studio X+软件。
所述肽段的鉴定中，在肽段水平和蛋白质评分(-10lgP)≥20时，设置蛋白质的假阳性率(FDR)为1％。
所述磷酸肽的鉴定中，通过将假阳性磷酸肽的数量除以FDR 1％阈值下所有磷酸肽的数量来评估磷酸肽亚群的假阳性率，对于高可信的磷酸位点的定位，要求Ascore≥20。
上述的系统中，所述可读性载体可为说明书，所述对微量样本的代谢组、蛋白质组和磷酸化蛋白质组进行多组学分析的步骤印刷在卡片上；
所述可读性载体可为计算机可读性载体。
所述系统可为试剂盒。
本发明的第三个目的是提供上述用于实现微量样本的代谢组、蛋白质组和磷酸化蛋白质组多组学分析的系统的应用。
本发明提供了上述用于实现微量样本的代谢组、蛋白质组和磷酸化蛋白质组多组学分析的系统在制备如下A1-A4中的至少一种的药物分析产品中的应用：
A1、干扰细胞蛋白质合成的药物；
A2、干扰细胞代谢的药物；
A3、干扰微管聚合的药物；
A4、长春新碱(Vincristine)、秋水酰胺(Colcemid)或诺考达唑(Nocodazole)。
所述分析可为药物作用机制分析。
所述产品可为试剂盒。
本发明的第四个目的是提供一种串联提取微量样本中代谢物和蛋白质的方法。
本发明提供的一种串联提取微量样本中代谢物和蛋白质的方法，包括如下步骤：
(1)提供微孔阵列芯片，所述微孔阵列芯片包括基底和基底上的若干微孔构成的微孔阵列，所述微孔的内壁经亲水性修饰；
(2)将待测的微量样本置于所述微孔中，加入有机溶剂萃取代谢物，收集萃取液，即可实现所述代谢物的提取；所述微量样本为单细胞样本、微量细胞样本或微量组织样本；
(3)在萃取代谢物后的微孔中加入蛋白酶，对蛋白质进行酶切，收集酶切液，即可实现所述蛋白质的提取。
上述的提取方法中，步骤(1)中，所述微孔阵列芯片中每个微孔可容纳的样本的体积为500nL～2μL，如500nL。具体地，每个微孔的容积可为600nL。
所述基底为硅片。
所述亲水性修饰可为使用硅烷衍生物进行共价修饰。
所述硅烷衍生物可为2-[甲氧基(聚乙烯氧基)丙基]三甲氧基硅烷。
所述共价修饰的温度可为15～30℃(如25℃)，时间可为20～40min(如30min)。
所述共价修饰的步骤如下：将所述微孔阵列芯片置于所述硅烷衍生物中，浸渍完毕，即可实现所述共价修饰。所述共价修饰在所述浸渍之前还可包括对所述微孔阵列芯片活化的步骤。
上述的制备方法中，步骤(2)中，所述单细胞样本具体可采用薄壁玻璃微量移液器结合口吹法获取。所述方法在添加所述单细胞样本之后还包括对其进行液氮淬灭及真空干燥处理的步骤。
所述微量细胞样本中的细胞数量可由微孔阵列芯片中的微孔的大小而定，如细胞数量为2～200个的细胞样本，再如细胞数量为50个的细胞样本。所述微量细胞样本以细胞悬浮液的形式进行添加，并在添加后进行液氮淬灭及真空干燥处理。所述细胞悬浮液的细胞浓度可为100细胞/μL。
所述有机溶剂可为乙腈；所述有机溶剂可以水溶液的形式进行添加；所述有机溶剂的水溶液中，有机溶剂的体积分数可为50％～100％，具体可为80％；所述萃取的时间可为5～30s，具体可为10s。
步骤(3)中，所述蛋白酶可为胰蛋白酶；所述蛋白酶与蛋白质的质量比可为1：(1～3)，具体可为1：1；所述蛋白酶可以蛋白酶水溶液的形式添加；所述蛋白酶水溶液中蛋白酶的浓度可为0.5～1μg/μL，具体可为1μg/μL；所述消化的温度可为37℃，时间可为2～6h，如4h，pH值可为7～8。
本发明的第五个目的是提供一种串联提取微量样本中代谢物和蛋白质的系统。
本发明提供的串联提取微量样本中代谢物和蛋白质的系统，它包括设备、试剂和可读性载体；
所述设备包括所述可读性载体中涉及的各设备；
所述试剂包括所述可读性载体中涉及的各试剂；
所述可读性载体上记载了如下串联提取微量样本中代谢物和蛋白质的步骤：
(1)提供微孔阵列芯片，所述微孔阵列芯片包括基底和基底上的若干微孔构成的微孔阵列，所述微孔的内壁经亲水性修饰；
(2)将待测的微量样本置于所述微孔中，加入有机溶剂萃取代谢物，收集萃取液，即可实现所述代谢物的提取；所述微量样本为单细胞样本、微量细胞样本或微量组织样本；
(3)在萃取代谢物后的微孔中加入蛋白酶，对蛋白质进行酶切，收集酶切液，即可实现所述蛋白质的提取。
上述的系统中，所述设备可包括微孔阵列芯片；所述微孔阵列芯片中每个微孔可容纳的体积为500nL～2μL，如500nL。具体地，每个微孔的容积可为600nL。
所述基底可为硅片。
所述亲水性修饰可为使用硅烷衍生物进行共价修饰。
所述硅烷衍生物可为2-[甲氧基(聚乙烯氧基)丙基]三甲氧基硅烷。
所述共价修饰的温度可为15～30℃(如25℃)，时间可为20～40min(如30min)。
所述共价修饰的步骤如下：将所述微孔阵列芯片置于所述硅烷衍生物中，浸渍完毕，即可实现所述共价修饰。所述共价修饰在所述浸渍之前还可包括对所述微孔阵列芯片活化的步骤。
所述试剂可包括有机溶剂和蛋白酶。
所述有机溶剂可为乙腈。所述有机溶剂可以水溶液的形式进行存在；所述有机溶剂的水溶液中，有机溶剂的体积分数为50％～100％，具体可为80％。
所述蛋白酶可为胰蛋白酶；所述蛋白酶与蛋白质的质量比可为(1～3)，具体可为1：1；所述蛋白酶以蛋白酶水溶液的形式存在；所述蛋白酶水溶液中蛋白酶的浓度可为0.5～1μg/μL，具体可为1μg/μL。
所述可读性载体记载的步骤中，步骤(2)中，所述萃取的时间可为5～30s，具体可为10s。
步骤(3)中，所述消化的温度可为37℃，时间可为2～6h如4h，pH值可为7～8。
上述的系统中，所述可读性载体可为说明书，所述串联提取微量样本中代谢物和蛋白质的步骤印刷在卡片上；
所述可读性载体可为计算机可读性载体。
所述系统可为试剂盒。
本发明的最后一个目的是提供一种微孔阵列芯片，它包括基底和基底上的若干微孔构成的微孔阵列，所述微孔的内壁经亲水性修饰。
上述的微孔阵列芯片中，所述微孔阵列芯片中每个微孔可容纳的样本体积为500nL～2μL，如500nL。具体地，每个微孔的容积可为600nL。
所述基底为硅片。
所述亲水性修饰可为使用硅烷衍生物进行共价修饰。
所述硅烷衍生物可为2-[甲氧基(聚乙烯氧基)丙基]三甲氧基硅烷。
所述共价修饰的温度可为15～30℃(如25℃)，时间可为20～40min(如30min)。
所述共价修饰的步骤如下：将所述微孔阵列芯片置于所述硅烷衍生物中，浸渍完毕，即可实现所述共价修饰。所述共价修饰在所述浸渍之前还可包括对所述微孔阵列芯片活化的步骤。
本发明微孔阵列芯片可用于实现微量样本的代谢组、蛋白质组和磷酸化蛋白质组多组学分析或用于串联提取微量样本中代谢物和蛋白质。
本发明具有如下有益效果：
(1)本发明多组分分析方法中，以微孔阵列芯片取代常用的离心管作为样品预处理的容器，芯片中亲水性内表面修饰的微孔不仅支持纳升级缓冲液交换，以实现从同一单细胞串联提取代谢产物和蛋白质，而且还提供了较小内表面积的样品容器。从而减少了生物分子非特异性吸附造成的样本损失，这很难实现通过其他方法实现。
(2)本发明建立了无需富集的磷酸化蛋白质组分析方法。通过构建包含蛋白质组和磷酸化蛋白质组质谱图谱的数据库，采用DIA质谱数据采集模式从未经富集的单细胞样品中直接鉴定磷酸肽，避免了在单细胞水平上富集磷酸肽的巨大挑战。
(3)本发明多组分分析方法可在单细胞水平上同时鉴定上千种蛋白质，数百种磷酸肽和代谢产物，实现了基于质谱的单细胞多组学分析。具体而言，在单细胞(HeLa)层面达到了3200个肽段，归属于1240个蛋白的水平，同时鉴定出360个磷酸肽和250个高可信度的磷酸位点，首次采用“从下至上”的蛋白质组分析技术实现了组学规模的单细胞磷酸化修饰研究。同时，采用电喷雾电离质谱分析方法，从单个HeLa细胞中鉴定超过200种代谢分子，为基于质谱的单细胞多组学研究提供了有力工具。
附图说明
图1为本发明单细胞或微量细胞的蛋白质组、磷酸化蛋白质组、和代谢组的多组学分析方法的流程图。
图2为实施例1中所鉴定蛋白质和肽段的定量相关性示意图，其中，图2(a)为蛋白质定量相关性示意图，图2(b)为肽段的定量相关性示意图，实验1、实验2、实验3表示三次重复试验。
图3为在细胞中加入Nocodazole(溶于DMSO)处理和仅加入DMSO的50个HT22细胞中的蛋白组非监督层次聚类分析(PCA)图(a)或单个HT22细胞蛋白组PCA图(b)，以及单个细胞的磷酸肽PCA图(c)。
图4为在细胞中加入Nocodazole(溶于DMSO)处理和仅加入DMSO的50个HT22细胞所鉴定的蛋白质的差异火山图(a)、差异表达蛋白的GO分析和通路分析图(b)。
图5为在细胞中加入Nocodazole(溶于DMSO)处理和仅加入DMSO的单细胞代谢物的PCA图(a)和S-plot分析图(b)。
具体实施方式
对此，本发明提供的是提供一种微量样本的代谢组、蛋白质组和磷酸化蛋白质组多组学分析方法，包括如下步骤：(1)提供微孔阵列芯片，微孔阵列芯片包括基底和基底上的若干微孔构成的微孔阵列，微孔的内壁经亲水性修饰；(2)将待测的单细胞样本或微量细胞样本置于微孔中，加入有机溶剂萃取代谢物，收集萃取液；对萃取液进行分析，鉴定代谢物，即可实现代谢组的分析；(3)构建仅包含蛋白质组谱和同时包含蛋白质组和磷酸化蛋白质组谱的质谱谱图数据库；(4)在萃取代谢物后的微孔中加入蛋白酶消化蛋白质，收集消化液；对消化液进行液相色谱-质谱分析；搜索仅包含蛋白质组谱的数据库，搜库参数与构建仅包含蛋白质组谱的质谱谱图数据库的参数一致，鉴定肽段及相应的蛋白质，即可实现蛋白组的分析；搜索同时包含蛋白质组和磷酸化蛋白质组谱的数据库且设定磷酸化为可变修饰，搜库参数与构建同时包含蛋白质组和磷酸化蛋白质组谱的质谱谱图数据库所使用的参数一致，鉴定磷酸肽及相应的磷酸化蛋白质，即可实现磷酸化蛋白组的分析。
本发明方法的原理如下：首先针对单细胞水平的样品预处理，降低容器非特异性吸附引起的样品损失是提高检测效率的关键。这要求在减少样品处理步骤的同时缩小样本处理容器的内表面积。因此，本发明设计了以单晶硅为基底的一维多孔微阵列芯片，以取代常用的离心管作为微量/单个细胞预处理的容器。微孔芯片的内表面积相较于普通离心管缩小10倍，可有效减少生物分子非特异性吸附。其次，为了避免复杂处理过程带来的样本损失，本发明建立了基于HILIC分离的同一微孔中代谢物和蛋白质的串联提取方法。采用Oligo-EG修饰微孔的内壁以提供亲水性表面，从而在有机溶剂萃取细胞代谢分子的同时将蛋白质通过HILIC相互作用保留于微孔内表面。将有机溶剂及其所萃取的代谢物移出微孔后，再加入高浓度胰蛋白酶水溶液溶解并快速水解吸附在微孔内壁的蛋白。本发明比较了胰蛋白酶消化2h和6h获得的肽段产物，发现其覆盖的蛋白质分子量范围高度相似，且达到传统酶解方法的蛋白质序列覆盖水平。在微孔中使用的胰蛋白酶浓度(1μg/1μL)是批量样本消化中常用浓度(0.02μg/1μL)的50倍，其有助于实现蛋白质的快速酶解。再者，为提高低丰度肽段的检测和鉴定，本发明建立数据非依赖信号采集(Data independentacquisition,DIA)质谱分析方法。数据依赖型采集(Data dependent acquisition,DDA)的随机性通常会导致低丰度肽段的二级碎裂信息缺失，而大量的缺失肽段会最终损害单细胞分析的数据完整性。本发明通过DDA分析细胞样本，建立一个包含二级谱图和保留时间信息的谱图库，再通过DIA分析微量/单个细胞鉴定肽段和蛋白。最后，为解析蛋白质磷酸化，本发明提出一种非富集的磷酸肽鉴定方法：通过构建同时包含表达谱肽段和二氧化钛富集后的磷酸化肽段的DDA质谱谱图库，进而采用DIA质谱分析未经富集的单细胞蛋白质组样品，并使用上述DDA谱图库且设定磷酸化为可变修饰进行数据库搜索，来实现无需富集的单细胞磷酸化蛋白组鉴定。
本发明以微孔阵列芯片取代常用的离心管作为样品预处理的容器，芯片中亲水性内表面修饰的微孔不仅支持纳升级缓冲液交换，以实现从同一单细胞串联提取代谢产物和蛋白质，而且还提供了较小内表面积的样品容器。从而减少了生物分子非特异性吸附造成的样本损失，这很难实现通过其他方法实现。本发明通过构建包含蛋白质组和磷酸化蛋白质组质谱图谱的数据库，采用DIA质谱数据采集模式从未经富集的单细胞样品中直接鉴定磷酸肽，避免了在单细胞水平上富集磷酸肽的巨大挑战，建立了无需富集的磷酸化蛋白质组分析方法。
下面分别以单细胞样本和微量细胞样本为例，对本发明多组学分析方法进行详细说明，但本发明同样适用于微量组织样本；以Nocodazole为例，对其在药物分析中的应用，进行详细说明。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所用的一维微孔阵列芯片，包括基底和基底上的若干微孔构成的微孔阵列；通过如下步骤制作得到：以单晶硅片为基底，通过光刻、硅深反应离子刻蚀和激光显微切割微机电技术(MEMS)制备微孔芯片。其中，光刻工艺先采用六甲基二硅氨烷(Hexamethyldisilazane)修饰硅片，再经过涂胶、曝光和显影对硅片进行预处理，所得硅片采用深硅刻蚀出深度200μm，直径1955μm，容积600nL的微孔，根据实验需求将芯片切割为3cm×2cm小片供实验使用，得到一维微孔阵列芯片，每片微孔阵列芯片约含100个微孔左右。
下述实施例中ESI-MS质谱仪为Vion IMS QTof(沃特世科技有限公司)，软件分析系统为Progenesis QI。ESI-MS条件如下：离子源喷射电压为3kV,离子源温度为100℃，脱溶剂气温度为300℃,脱溶剂气流速为600L/h；进样锥气体流速为50L/h,ESI扫描范围为m/z50-1000，扫描方式为High Definition MSe，低能碎裂能量为6ev,高能碎裂能量为20-40ev。
LC-MS质谱仪为Q Exactive HFX(赛默飞世尔科技有限公司)，软件分析系统为PEAKS Studio X+。色谱条件如下：流动相A为0.1％甲酸(v/v)的水溶液；流动相B为含0.1％甲酸的80％乙腈溶液。C18预柱(20mm×100μm)；C18反相分析柱(1.9μm C18,120mm×150μm)；以600nL/min的流速进行梯度洗脱，梯度洗脱为：0-10min，6％B；10-15min,6-10％B；15-70min，10-30％B；70-80min，30-40％B；80-80.1min,40-95％B；85min,95％B。质谱条件如下：分离的样本经ESI离子源进入质谱分析，电压为2.3kV，离子传输管的温度为320℃。在数据非依赖模式下(DIA)模式下进行质谱数据的采集，设置一级质谱全扫描范围为m/z 300-1000，扫描分辨率为120,000，二级质谱扫描窗口为35个，分离窗口为20，二级的分辨率设置为15,000，离子注入时间为30ms，碰撞能量为27％。
实施例1、微量细胞的代谢组、蛋白质组和磷酸化蛋白质组多组学分析
按照图1所示流程图对微量样本进行多组学分析，具体步骤如下：
(1)将一维微孔阵列芯片浸入H2O:H2O2:HCl(v/v/v)＝5:1:1溶液活化芯片10-15min，用去离子水洗涤芯片并在氮气中干燥，在室温下将活化的芯片浸入硅烷衍生物2-[甲氧基(聚乙烯氧基)丙基]三甲氧基硅烷(CAS NO.:65994-07-2，Gelest，货号65994-07-2)中反应30min进行Oligo-EG修饰，所得芯片用去离子水洗涤并在氮气中干燥，改性后的芯片可在常温保存至8周。
(2)通过有限稀释获取50个Hela细胞(购自泽叶生物科技有限公司，货号为ZY-H066)，并将其转移至微孔中。具体而言，将细胞悬浮于PBS缓冲液中并计数以获得细胞浓度。再通过PBS连续稀释调节细胞浓度，直至达到100细胞/μL。将0.5μL细胞溶液沉积在显微镜载玻片上，并在显微镜下观察以进行实际细胞计数。将0.5μL的相同细胞溶液转移至Oligo-EG修饰的微孔中，并进行液氮淬灭及真空干燥处理。
在微孔中加入0.5μL体积分数为80％乙腈的水溶液反应10s进行代谢物的萃取，收集萃取液即乙腈萃取的代谢物进行ESI-MS分析，数据库搜索使用Progenesis QI软件，鉴定代谢物，实现代谢组的分析。
(3)用数据依赖扫描采集信号(DDA)分析采集大样本细胞的肽段和富集磷酸肽的数据，构建仅包含蛋白质组谱和同时包含蛋白质组和磷酸化蛋白质组谱的数据库。该数据库为包含二级谱图和保留时间的谱图库。
按照文献，Zhao,X.Y.,et.al.,A fast sample processing strategy forlarge-scale profiling of human urine phosphoproteome by mass spectrometry,Talanta 2018,185,166-173.中的方法构建数据库。
(4)在微孔中加入质量比约为1：1(酶/蛋白质)的0.5μL浓度为1μg/μL的胰蛋白酶溶液，以消化内表面结合的蛋白质。将芯片放置在加湿室中，以最大程度地减少样品溶液的蒸发，然后将其在37℃下温育4个小时，pH为7-8)以消化微孔内表面结合的蛋白质，收集消化液。将消化液(收集所得的肽)进行LC-MS分析，用数据非依赖扫描采集信号(DIA)分析；使用PEAKS Studio X+搜索仅包含蛋白质组谱的数据库，鉴定肽段及相应的蛋白质，即可实现蛋白组的分析；设定磷酸化为可变修饰，使用PEAKS Studio X+搜索同时包含蛋白质组和磷酸化蛋白质组谱的数据库，鉴定磷酸肽及相应的磷酸化蛋白质，即可实现磷酸化蛋白组的分析。
搜库参数与构建谱图数据库所使用参数一致。
肽段的鉴定中，在肽段水平和蛋白质评分(-10lgP)≥20时，设置蛋白质的假阳性率(FDR)为1％。
磷酸肽的鉴定中，通过将假阳性磷酸肽的数量除以FDR 1％阈值下所有磷酸肽的数量来评估磷酸肽亚群的假阳性率，对于高可信的磷酸位点的定位，要求Ascore≥20。
实验结果：针对代谢组，从50个Hela细胞中鉴定到258种代谢物，包括核苷酸，氨基酸，碳水化合物，脂肪酰基，甘油脂等。通过KEGG通路分析，鉴定代谢物高度参与的代谢通路包括嘌呤代谢，丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代谢，乙醛酸和二羧酸酯代谢，甘油磷脂代谢，和类固醇激素生物合成等。
针对蛋白质组，从51±3个细胞(n＝3)中平均鉴定出15824±920个肽段，归属于3461±90个蛋白(Unique peptide>1)。三次重复试验的相关性分析如图2所示，蛋白质的Pearson相关系数为0.98至1.0(图2(a))，而肽段的Pearson相关系数为0.93至0.97(图2(b))，表明该策略的高重现性。
针对磷酸化蛋白质组，从50个HT22细胞中鉴定到1567±63个磷酸肽和740个高度可信磷酸位点(Ascore>20)。
实施例2、单细胞的代谢组、蛋白质组和磷酸化蛋白质组多组学分析
(1)同实施例1中步骤(1)。
(2)在立体显微镜下，使用安装在吸管上的薄壁玻璃微量移液器进行单细胞(Hela细胞)采样，薄壁玻璃微量移液器开口为12-15μm。结合口吹法挑选单个细胞，并立即转移到Oligo-EG修饰的微孔中，进行液氮淬灭以及真空干燥处理。
在微孔中加入0.5μL 80％乙腈的水溶液反应10s进行代谢物的萃取，收集萃取液即乙腈萃取的代谢物进行ESI-MS分析，数据库搜索使用Progenesis QI软件，鉴定代谢物，实现代谢组的分析。
(3)同实施例1中步骤(3)。
(4)同实施例1中步骤(4)。
实验结果：从单个Hela细胞中鉴定201种代谢物，3164±336个肽段，归属于1237±74个蛋白(Unique peptide>1)，同时鉴定出359±32个磷酸肽和254个高可信度磷酸位点(Ascore>20)。
实施例3、微量样本多组学分析方法在药物分析方面的应用
通过nocodazole处理HT22细胞，并在芯片微孔中进行细胞的代谢物萃取和蛋白质酶解等过程，再通过质谱表征代谢组和蛋白组的信息。Nocodazole是一种抗肿瘤药物，它会干扰微管的聚合并使有丝分裂期的细胞停滞发育。具体步骤如下：
(1)同实施例1步骤(1)。
(2)将HT22细胞(购自上海泽叶生物科技有限公司，货号为DC339)在含10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素的DMEM培养基(Gibco，英国)中培养。将细胞在含5％CO2的加湿培养箱中于37℃培养，使用100nM nocodazole(nocodazole购自Sigma-Aldrich，产品名称为诺考达唑，CAS号为31430-18-9)培养12小时。通过PBS稀释法获取50个细胞或采用薄壁玻璃微量移液器结合口吹法获取单个细胞，转移至Oligo-EG修饰的微孔中，并进行液氮淬灭以及真空干燥。
在微孔中加入0.5μL 80％乙腈的水溶液反应10s进行代谢物的萃取，收集萃取液即乙腈萃取的代谢物进行ESI-MS分析，数据库搜索使用Progenesis QI软件，鉴定代谢物，实现代谢组的分析。
(3)同实施例1步骤(3)。
(4)同实施例1中步骤(4)。
所得结果如图3所示，蛋白质热图分布显示，细胞在Nocodazole处理前后的蛋白表达有明显差异。同时，PCA分析显示单个细胞以Nocodazole处理前后为标准自动聚类，并且从同类单细胞中鉴定出的磷酸肽表现出相似的行为，体现出多组学分析传递的综合信息。根据50个HT22细胞的火山图分析(图4)，我们发现161种蛋白质的丰度在Nocodazole处理后显著变化(fold change>4，p<0.01)，其包括钙调蛋白，有丝分裂纺锤体组织蛋白，类固醇受体RNA激活剂，极光激酶A等。对上述差异表达蛋白的功能注释研究表明，它们大多数与微管组织，细丝束组装，有丝分裂细胞周期的调节，GTPase活性调节，和肌动蛋白聚合有关，这与Nocodazole的分子功能一致。GO分析也显示了类似的结果，即161种蛋白质主要覆盖了Nocodazole调节相关类别的通路，例如肌动蛋白细胞骨架组织的调节，GTPase介导的信号转导，膜组织和有丝分裂纺锤体组织的调节等。代谢组是衡量细胞应激反应和表型变化的最直接、最动态的指标。我们从单细胞提取的代谢物PCA分析如图5(a)所示，细胞根据Nocodazole处理前后呈簇状聚类，表明本发明方法能够在单细胞水平以代谢组表达来区分不同细胞状态。为了鉴定差异表达的代谢物，本发明基于OPLS-DA分析构建了S分布图，显著上调或下调的代谢物种类以红色标记，如图5(b)所示，其可潜在用于检测单细胞水平的特定细胞表型。

Claims (10)

1.一种微量样本的代谢组、蛋白质组和磷酸化蛋白质组多组学分析方法，包括如下步骤：
(1)提供微孔阵列芯片，所述微孔阵列芯片包括基底和基底上的若干微孔构成的微孔阵列，所述微孔的内壁经亲水性修饰；
(2)将待测的微量样本置于所述微孔中，加入有机溶剂萃取代谢物，收集萃取液；对所述萃取液进行分析，鉴定代谢物，即可实现所述代谢组的分析；所述微量样本为单细胞样本、微量细胞样本或微量组织样本；
(3)构建仅包含蛋白质组谱和同时包含蛋白质组和磷酸化蛋白质组谱的质谱谱图数据库；
(4)在萃取所述代谢物后的微孔中加入蛋白酶消化蛋白质，收集消化液；对所述消化液进行液相色谱-质谱分析；
搜索所述仅包含蛋白质组谱的数据库，搜库参数与构建所述仅包含蛋白质组谱的质谱谱图数据库的参数一致，鉴定肽段及相应的蛋白质，即可实现所述蛋白质组的分析；
搜索同时包含蛋白质组和磷酸化蛋白质组谱的数据库且设定磷酸化为可变修饰，搜库参数与构建同时包含蛋白质组和磷酸化蛋白质组谱的质谱谱图数据库所使用的参数一致，鉴定磷酸肽及相应的磷酸化蛋白质，即可实现所述磷酸化蛋白质组的分析。
2.根据权利要求1所述的多组学分析方法，其特征在于：步骤(1)中，所述微孔阵列芯片中每个微孔可容纳的样本体积为500nL～2μL；和/或，
步骤(1)中，所述基底为硅片；所述亲水性修饰为使用硅烷衍生物进行共价修饰；所述硅烷衍生物为2-[甲氧基(聚乙烯氧基)丙基]三甲氧基硅烷；和/或，
步骤(2)中，所述有机溶剂为乙腈；所述有机溶剂以水溶液的形式进行添加；所述有机溶剂的水溶液中，有机溶剂的体积分数为50％～100％；所述萃取的时间为5～30s；和/或，
步骤(4)中，所述蛋白酶为胰蛋白酶；所述蛋白酶与蛋白质的质量比为1：(1～3)；所述蛋白酶以蛋白酶水溶液的形式添加；所述蛋白酶水溶液中蛋白酶的浓度为0.5～1μg/μL；所述消化的温度为37℃，时间为2～6h，pH值为7～8；和/或，
步骤(2)中，所述分析为质谱分析；所述质谱分析为电喷雾电离质谱分析；所述质谱分析中，数据库搜索使用Progenesis QI软件；和/或，
步骤(3)中，所述构建质谱谱图数据库的步骤中，采用数据依赖扫描模式；和/或，
步骤(4)中，质谱分析中，采用数据非依赖扫描模式；所述搜索仅包含蛋白质组谱的数据库和所述搜索同时包含蛋白质组和磷酸化蛋白质组谱的数据库的步骤中，使用PEAKSStudio X+软件。
3.一种用于实现微量样本的代谢组、蛋白质组和磷酸化蛋白质组多组学分析的系统，它包括设备、试剂和可读性载体；
所述设备包括所述可读性载体中涉及的各设备；
所述试剂包括所述可读性载体中涉及的各试剂；
所述可读性载体上记载了如下对微量样本的代谢组、蛋白质组和磷酸化蛋白质组进行多组学分析的步骤：
(1)提供微孔阵列芯片，所述微孔阵列芯片包括基底和基底上的若干微孔构成的微孔阵列，所述微孔的内壁经亲水性修饰；
(2)将待测的微量样本置于所述微孔中，加入有机溶剂萃取代谢物，收集萃取液；对所述萃取液进行分析，鉴定代谢物，即可实现所述代谢组的分析；所述微量样本为单细胞样本、微量细胞样本或微量组织样本；
(3)构建仅包含蛋白质组谱和同时包含蛋白质组和磷酸化蛋白质组谱的质谱谱图数据库；
(4)在萃取所述代谢物后的微孔中加入蛋白酶消化蛋白质，收集消化液；对所述消化液进行液相色谱-质谱分析；
搜索所述仅包含蛋白质组谱的数据库，搜库参数与构建所述仅包含蛋白质组谱的质谱谱图数据库的参数一致，鉴定肽段及相应的蛋白质，即可实现所述蛋白质组的分析；
搜索同时包含蛋白质组和磷酸化蛋白质组谱的数据库且设定磷酸化为可变修饰，搜库参数与构建同时包含蛋白质组和磷酸化蛋白质组谱的质谱谱图数据库所使用的参数一致，鉴定磷酸肽及相应的磷酸化蛋白质，即可实现所述磷酸化蛋白质组的分析。
4.根据权利要求3所述的系统，其特征在于：步骤(1)中，所述微孔阵列芯片中每个微孔可容纳的样本体积为500nL～2μL；和/或，
步骤(1)中，所述基底为硅片；所述亲水性修饰为使用硅烷衍生物进行共价修饰；所述硅烷衍生物为2-[甲氧基(聚乙烯氧基)丙基]三甲氧基硅烷；和/或，
步骤(2)中，所述有机溶剂为乙腈；所述有机溶剂以水溶液的形式进行添加；所述有机溶剂的水溶液中，有机溶剂的体积分数为50％～100％；所述萃取的时间为5～30s；和/或，
步骤(4)中，所述蛋白酶为胰蛋白酶；所述蛋白酶与蛋白质的质量比为1：(1～3)；所述蛋白酶以蛋白酶水溶液的形式添加；所述蛋白酶水溶液中蛋白酶的浓度为0.5～1μg/μL；所述消化的温度为37℃，时间为2～6h，pH值为7～8；和/或，
步骤(2)中，所述分析为质谱分析；所述质谱分析为电喷雾电离质谱分析；所述质谱分析中，数据库搜索使用Progenesis QI软件；和/或，
步骤(3)中，所述构建质谱谱图数据库的步骤中，采用数据依赖扫描模式；和/或，
步骤(4)中，质谱分析中，采用数据非依赖扫描模式；所述搜索仅包含蛋白质组谱的数据库和所述搜索同时包含蛋白质组和磷酸化蛋白质组谱的数据库的步骤中，使用PEAKSStudio X+软件。
5.权利要求3或4所述的用于实现微量样本的代谢组、蛋白质组和磷酸化蛋白质组多组学分析的系统在制备如下A1-A3中的至少一种的药物分析产品中的应用：
A1、干扰细胞蛋白质合成的药物；
A2、干扰细胞代谢的药物；
A3、干扰微管聚合的药物。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述药物为长春新碱、秋水酰胺或诺考达唑。
7.一种串联提取微量样本中代谢物和蛋白质的方法，包括如下步骤：
(1)提供微孔阵列芯片，所述微孔阵列芯片包括基底和基底上的若干微孔构成的微孔阵列，所述微孔的内壁经亲水性修饰；
(2)将待测的微量样本置于所述微孔中，加入有机溶剂萃取代谢物，收集萃取液，即可实现所述代谢物的提取；所述微量样本为单细胞样本、微量细胞样本或微量组织样本；
(3)在萃取代谢物后的微孔中加入蛋白酶，对蛋白质进行酶切，收集酶切液，即可实现所述蛋白质的提取。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述微孔阵列芯片中每个微孔可容纳的体积为500nL～2μL；和/或，
步骤(1)中，所述基底为硅片；所述亲水性修饰为使用硅烷衍生物进行共价修饰；所述硅烷衍生物为2-[甲氧基(聚乙烯氧基)丙基]三甲氧基硅烷；和/或，
步骤(2)中，所述有机溶剂为乙腈；所述有机溶剂以水溶液的形式进行添加；所述有机溶剂的水溶液中，有机溶剂的体积分数为50％～100％；所述萃取的时间为5～30s；和/或，
步骤(3)中，所述蛋白酶为胰蛋白酶；所述蛋白酶与蛋白质的质量比为(1～3)；所述蛋白酶以蛋白酶水溶液的形式添加；所述蛋白酶水溶液中蛋白酶的浓度为0.5～1μg/μL；所述酶切的温度为37℃，时间为2～6h，pH值为7～8。
9.一种串联提取微量样本中代谢物和蛋白质的系统，它包括设备、试剂和可读性载体；
所述设备包括所述可读性载体中涉及的各设备；
所述试剂包括所述可读性载体中涉及的各试剂；
所述可读性载体上记载了如下串联提取微量样本中代谢物和蛋白质的步骤：
(1)提供微孔阵列芯片，所述微孔阵列芯片包括基底和基底上的若干微孔构成的微孔阵列，所述微孔的内壁经亲水性修饰；
(2)将待测的微量样本置于所述微孔中，加入有机溶剂萃取代谢物，收集萃取液，即可实现所述代谢物的提取；所述微量样本为单细胞样本、微量细胞样本或微量组织样本；
(3)在萃取代谢物后的微孔中加入蛋白酶，对蛋白质进行酶切，收集酶切液，即可实现所述蛋白质的提取。
10.根据权利要求9所述的系统，其特征在于：所述设备包括微孔阵列芯片；所述微孔阵列芯片中每个微孔可容纳的体积为500nL～2μL；和/或，
所述基底为硅片；所述亲水性修饰为使用硅烷衍生物进行共价修饰；所述硅烷衍生物为2-[甲氧基(聚乙烯氧基)丙基]三甲氧基硅烷；和/或，
所述试剂包括有机溶剂和蛋白酶；
所述有机溶剂为乙腈；所述有机溶剂以水溶液的形式进行添加；所述有机溶剂的水溶液中，有机溶剂的体积分数为50％～100％；和/或，
所述蛋白酶为胰蛋白酶；所述蛋白酶与蛋白质的质量比为(1～3)；所述蛋白酶以蛋白酶水溶液的形式添加；所述蛋白酶水溶液中蛋白酶的浓度为0.5～1μg/μL；和/或，
所述可读性载体记载的步骤中，步骤(2)中，所述萃取的时间为5～30s；和/或，步骤(3)中，所述酶切的温度为37℃，时间为2～6h，pH值为7～8。
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