CN112534549A - 用于微流体系统与质谱联用的软件 - Google Patents

Abstract

描述了用于改善电喷雾电离质谱(ESI‑MS)数据质量的方法、装置和系统，以及用于实现化学分离数据和质谱数据之间的改善的相关性的方法、装置和系统。

Description

用于微流体系统与质谱联用的软件

交叉引用

本申请要求于2018年5月31日提交的美国临时申请号62/678,265和于2018年6月12日提交的美国临时申请号62/684,090的权益，所述申请两者均通过引用并入本文。

背景技术

本公开内容涉及化学分析领域，尤其涉及分离混合物中的分析物以及随后通过质谱(MS)对其进行分析。基于分析物的内在质量从较复杂的分析物混合物中分离分析物组分，并提供富含该质量状态的级分组，是分析化学的关键部分。以这种方式对复杂混合物进行简化降低了下游分析的复杂性。然而，当尝试将已知的富集方法和/或装置与分析装备和/或技术相结合时，可能产生复杂情况。

例如，已经使用多种方法来将蛋白质样品制备技术与下游检测系统如质谱仪相结合。一种常用方法是使用液相色谱制备样品并收集用于质谱的级分(LC-MS)。这种方法具有需要将蛋白质样品消化成肽片段的缺点，产生必须进行分析的大量样品级分以及运行后的复杂数据重建。尽管某些形式的液相色谱如肽图反相色谱可以与质谱仪耦合，但这些已知技术局限于使用肽片段而不是完整蛋白质，这限制了其实用性。

将样品引入质谱仪的另一种方法是电喷雾电离(ESI)。在ESI中，通过在毛细管尖端或发射器尖端与质谱仪源板之间施加电场，从包括电喷雾特征(如发射器尖端或孔口)的毛细管或微流体装置远端处发射样品和溶液的小液滴。液滴在此感应电场中拉伸和扩展，以形成锥形发射(即“泰勒锥”)，其包括越来越小的液滴，这些越来越小的液滴蒸发并产生气相离子，该气相离子然后被引入质谱仪中，以进行进一步分离和检测。通常，发射器尖端由毛细管形成，这为ESI提供了方便的液滴体积。然而，毛细管限于不允许多步样品处理的线性流动路径。ESI还取决于ESI尖端处的电压，以在整个分析过程中保持恒定，这在许多测定中可能是挑战，其中内部流体阻力可以随时间变化，从而改变电路不同部分的电压降，并从而改变ESI尖端的电压。

微流体装置已被用于进行其他工作。微流体装置可通过各种已知技术生产并且提供限定尺寸的流体通道，该流体通道可构成被设计用于进行不同流体操作的通道网络。这些装置提供比毛细管更高的控制水平和复杂性，使其成为样品制备的更好选择。但是，像毛细管一样，这些工具在引入质谱仪(如果有)之前通常对分离出的分析物级分进行有限的表征。而且，具有毛细管或微流体装置的系统通常不提供用于在操作期间校准系统以重新建立泰勒锥的工具。

描述了用于改进电喷雾电离质谱(ESI-MS)数据质量的方法、装置、系统和软件，以及用于在化学分离数据和质谱数据之间实现更多定量表征和改进相关性的方法、装置、系统和软件。

发明内容

本文公开了用于在进行分离反应时将电喷雾电离(ESI)尖端相对于接地保持在恒定电压的方法，所述方法包括：a)向分离通道的近端施加第一电压，其中所述分离通道的远端与所述ESI尖端流体连通和电连通；b)向辅助流体通道的近端施加第二电压，其中所述辅助流体通道的远端与所述分离通道的所述远端流体连通和电连通；c)进行所述分离反应，以分离分析物的混合物，其中所述分离反应在所述分离通道内进行；以及d)在反馈回路中监测所述分离通道的电阻变化或所述ESI尖端处的电压变化，所述反馈回调整所述第一电压和所述第二电压以保持跨所述分离通道的恒定电压降和所述ESI尖端处的恒定电压。在一些实施方式中，所述分离通道是毛细管的内腔。在一些实施方式中，所述毛细管包括微瓶喷雾尖端(microvial spray tip)。在一些实施方式中，所述分离通道是微流体装置内的流体通道。在一些实施方式中，所述分离反应包括等电聚焦反应。在一些实施方式中，所述分离反应包括电泳分离反应。在一些实施方式中，将所述第一电压施加在阴极，并且将所述第二电压施加在阳极。在一些实施方式中，将所述ESI尖端处的所述电压保持为接地。在一些实施方式中，将所述ESI尖端处的所述电压保持在所述第二电压。在一些实施方式中，对所述第一电压和所述第二电压的所述调整包括从所述第一电压和所述第二电压减去在所述ESI尖端处测得的瞬态电压变化。在一些实施方式中，使用提供所述第一电压或所述第二电压的电源来测量所述ESI尖端处的所述电压。在一些实施方式中，所述反馈回路以至少0.1Hz的频率操作。在一些实施方式中，所述反馈回路以至少10Hz的频率操作。在一些实施方式中，所述反馈回路将所述ESI尖端处的所述电压保持在预设值的±10％以内。在一些实施方式中，所述反馈回路将所述ESI尖端处的所述电压保持在预设值的±1％以内。在一些实施方式中，所述反馈回路将跨所述分离通道的所述电压降保持在预设值的±10％以内。在一些实施方式中，所述反馈回路将跨所述分离通道的所述电压降保持在预设值的±1％以内。

本文还公开了包括以下的方法：a)提供包括两种或更多种分析物的混合物的样品；b)在含有所述样品的流体通道内进行分离，以从两种或更多种分析物的所述混合物中分辨(resolve)各个分析物峰；c)在所述流体通道的内容物向流体通道出口迁移时计算分析物峰的速度；以及d)使用所述分析物峰的所述速度来确定所述分析物峰到达所述流体通道出口的时间。在一些实施方式中，所述流体通道是毛细管的内腔。在一些实施方式中，所述流体通道是微流体装置的一部分。在一些实施方式中，所述分离基于等电聚焦(IEF)、毛细管区带电泳(CZE)、毛细管凝胶电泳(CGE)、毛细管等速电泳(CITP)或胶束电动色谱(MEKC)。在一些实施方式中，根据所述分析物峰从第一位置移动至第二位置所需的时间间隔来计算所述分析物峰的所述速度。在一些实施方式中，所述第一位置、第二位置和时间间隔是根据所述流体通道的一系列两个或更多个图像确定的。在一些实施方式中，所述一系列两个或更多个图像包括紫外光吸光度图像、可见光吸光度图像或荧光图像。在一些实施方式中，所述流体通道出口包括与质谱仪对接的电喷雾接口。在一些实施方式中，所述分析物峰到达所述流体通道出口的所述时间用于将质谱仪数据与所述分析物峰相关联。在一些实施方式中，所述流体通道内容物的所述迁移包括使用电渗迁移技术、化学迁移技术、流体动力学迁移技术或其任何组合。在一些实施方式中，所述两种或更多种分析物包括蛋白质、蛋白质-药物缀合物、肽、核酸分子、碳水化合物分子、脂质分子、代谢物分子、小的有机化合物或其任何组合。在一些实施方式中，对为生物候选药物和参考药物的样品收集的质谱仪数据进行的比较用于确定生物相似性。在一些实施方式中，在反馈回路中使用所述分析物峰的所述速度来调整所述分析物峰的所述分离或迁移的控制参数。在一些实施方式中，所述控制参数是电压。在一些实施方式中，所述反馈回路以至少0.1Hz的频率操作。

本文公开的方法包括：a)提供包括两种或更多种分析物的混合物的样品；b)在含有所述样品的流体通道内进行分离，以从两种或更多种分析物的所述混合物中分辨各个分析物峰；以及c)收集通过与质谱仪对接的电喷雾接口从所述流体通道发射的所述两个或更多个各个分析物峰的质谱仪数据；其中用于所述质谱仪的数据收集模式在高质量扫描和低质量扫描之间交替进行。在一些实施方式中，所述质谱仪以至少0.5Hz的频率在所述高质量扫描和低质量扫描数据收集模式之间切换。在一些实施方式中，所述流体通道是毛细管的内腔。在一些实施方式中，所述流体通道是微流体装置的一部分。在一些实施方式中，所述分离基于等电聚焦(IEF)、毛细管区带电泳(CZE)、毛细管凝胶电泳(CGE)、毛细管等速电泳(CITP)或胶束电动色谱(MEKC)。在一些实施方式中，所述高质量扫描捕获生物大分子的质谱数据。在一些实施方式中，所述生物大分子包括蛋白质、蛋白质-药物缀合物、核酸分子、还原蛋白、融合蛋白、蛋白质复合物或其任何组合。在一些实施方式中，所述高质量扫描的m/z比在1500至6000的范围内。在一些实施方式中，所述低质量扫描捕获用于进行等电聚焦分离的溶液相两性电解质的质谱数据。在一些实施方式中，所述低质量扫描的m/z比在150至1500的范围内。在一些实施方式中，一种或多种溶液相两性电解质的所述质谱用于校准在所述高质量扫描中识别的生物大分子的等电点(pI)。

本文公开的方法包括：a)在含有样品的流体通道内进行分离，其中所述样品包括两种或更多种分析物的混合物，并且其中所述分离从两种或更多种分析物的所述混合物中分辨各个分析物峰；b)使所述流体通道的内容物向流体通道出口迁移，其中所述流体通道出口包括与质谱仪对接的电喷雾接口；以及c)对以下进行同时或交替成像：(i)所述流体通道的至少一部分，以监测在(a)和(b)期间分析物峰的位置，以及(ii)存在于所述流体通道出口和所述质谱仪的入口之间的泰勒锥，以监测电喷雾性能。在一些实施方式中，所述流体通道的至少一部分的两个或更多个图像中的所述分析物峰的所述位置用于计算所述分析物峰的速度。在一些实施方式中，所述分析物峰的所述速度用于确定所述分析物峰将到达所述流体通道出口的时间。在一些实施方式中，所述分析物峰到达所述流体通道出口的所述时间用于将质谱仪数据与所述分析物峰相关联。在一些实施方式中，从所述泰勒锥的所述成像导出的数据被用在反馈回路中，以调整电喷雾性能。在一些实施方式中，所述反馈回路以至少0.1Hz的频率操作。在一些实施方式中，所述流体通道是毛细管的内腔。在一些实施方式中，所述流体通道是微流体装置的一部分。在一些实施方式中，所述分离基于等电聚焦(IEF)、毛细管区带电泳(CZE)、毛细管凝胶电泳(CGE)、毛细管等速电泳(CITP)或胶束电动色谱(MEKC)。在一些实施方式中，所述成像包括紫外光吸光度成像、可见光吸光度成像或荧光成像。在一些实施方式中，所述流体通道内容物的所述迁移包括使用电渗迁移技术、化学迁移技术、流体动力学迁移技术或其任何组合。在一些实施方式中，所述两种或更多种分析物包括蛋白质、蛋白质-药物缀合物、肽、核酸分子、碳水化合物分子、脂质分子、代谢物分子、小的有机化合物或其任何组合。

本文公开了用于在进行分离反应时将电喷雾电离(ESI)尖端相对于接地保持在恒定电压的计算机实现的方法，所述方法包括：a)使用处理器接收所述ESI尖端处的电压的第一测量值，其中所述分离通道的远端与所述ESI尖端流体连通和电连通；b)使用所述处理器接收所述ESI尖端的所述电压的第二测量值；c)使用所述处理器，将所述第二测量值与所述第一测量值进行比较，其中如果所述第二测量值与所述第一测量值不同，则所述处理器使得对所述分离通道的近端处的电压，以及在包括与所述分离通道的所述远端流体连通和电连通的远端的辅助流体通道的近端处的电压得以调整，以使得在所述ESI尖端处的所述电压返回到所述第一测量值；以及d)以指定的频率重复步骤(a)至(c)。在一些实施方式中，所述分离通道包括毛细管的内腔或微流体装置内的流体通道。在一些实施方式中，所述分离反应包括等电聚焦反应。在一些实施方式中，所述分离反应包括电泳分离反应。在一些实施方式中，将所述ESI尖端处的所述电压保持为接地。在一些实施方式中，所述指定的频率是至少1Hz。在一些实施方式中，将所述ESI尖端处的所述电压保持在指定值的±5％以内。

本文还公开了计算机实现的方法，所述方法包括：a)使用处理器接收图像数据，所述图像数据包括使用检测器获取的两个或更多个图像，所述检测器被配置为对毛细管或微流体装置中的全部或部分分离通道进行成像；b)使用相同或不同的处理器处理所述图像数据，以在所述两个或更多个图像中确定所述分离通道内的分析物峰的位置；c)使用相同或不同的处理器，基于所述两个或更多个图像中所述分析物峰的所述位置，以及所述两个或更多个图像的获取之间的已知时间间隔来计算所述分析物峰的速度；以及d)使用相同或不同的处理器确定所述分析物峰将到达分离通道出口的时间。在一些实施方式中，在所述分离通道内进行的分离反应包括等电聚焦(IEF)、毛细管区带电泳(CZE)、毛细管凝胶电泳(CGE)、毛细管等速电泳(CITP)或胶束电动色谱(MEKC)。在一些实施方式中，所述两个或更多个图像包括紫外光吸光度图像、可见光吸光度图像或荧光图像。在一些实施方式中，所述分离通道出口和与质谱仪对接的电喷雾接口流体连通或包括与质谱仪对接的电喷雾接口。在一些实施方式中，所述分析物峰到达所述分离通道出口的所述时间用于将质谱仪数据与所述分析物峰相关联。在一些实施方式中，所述分析物从混合物分离并且包括蛋白质、蛋白质-药物缀合物、肽、核酸分子、碳水化合物分子、脂质分子、代谢物分子或小的有机化合物。在一些实施方式中，对为生物候选药物和参考药物的样品收集的质谱仪数据进行的比较用于确定生物相似性。在一些实施方式中，在反馈回路中使用所述分析物峰的所述速度来调整在所述分离通道中进行的分离反应的控制参数。在一些实施方式中，所述控制参数是电压。在一些实施方式中，所述反馈回路以至少0.1Hz的频率操作。

援引并入

在本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用以其整体并入本文，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请被特别地和单独地指出通过引用以其整体并入。在本文中的术语与并入的参考文献中的术语之间发生冲突的情况下，以本文中的术语为准。

附图说明

本发明的新颖特征在所附的权利要求书中具体阐述。通过参考以下对其中利用了本发明的原理的说明性实施方式加以阐述的详细说明及其附图，可以更好地理解本发明的特征和优点，在附图中：

图1提供了根据本公开内容的一个实施方式的用于自动加载的样品的等电聚焦(IEF)和电喷雾电离(ESI)的装置的示意图。

图2提供了用于计算分离分析物带的等电点的计算机实现的方法的示例流程图。

图3提供了用于确定一个或多个分离的分析物带的速度并计算离开时间的计算机实现的方法的另一示例流程图。

图4提供了用于实现基于成像的反馈和控制ESI-MS分析系统一个或多个操作参数的计算机实现的方法的另一示例流程图。

图5提供了所公开系统的一个实施方式的硬件部件的示意性框图。

图6提供了所公开系统的一个实施方式的软件部件的示意性框图。

图7A-图7B示出了用于本发明的一些实施方式中的微流体装置。图7A提供了示例性微流体装置的流体通道网络的示意图。图7B提供了组装的微流体装置的计算机辅助设计(CAD)图。图7A所示的流体通道层夹在两个透明层之间，以密封流体通道。

图8提供了泰勒锥和电喷雾电离(ESI)羽流在分离样品迁移过程期间的图像。

图9A-图9F提供了在使用等电聚焦分离分析物混合物中的分析物之后样品迁移数据的非限制性示例。图9A示出了在t＝0分钟时的吸光度迹线(等电聚焦的完成)。图9B示出了在t＝1分钟时的吸光度迹线。图9C示出了在t＝2分钟时的吸光度迹线。图9D示出了在t＝3分钟时的吸光度迹线。图9E示出了在t＝4分钟时的吸光度迹线。图9F示出了在t＝5分钟时的吸光度迹线。

图10A-图10B提供了被设计用于进行等电聚焦以分离分析物并随后迁移分离的分析物混合物的微流体装置的代表性电路图。图10A提供了在ESI尖端将保持接地或接近接地的情况下在等电聚焦期间，图7A所示的微流体装置的代表性电路图。图10B示出了在分离的分析物混合物的化学迁移期间，图7A所示的微流体装置的代表性电路图。在该示例中，假设通道114(如图7A所示)的电阻可忽略不计。

图11A-图11B提供了在将ESI尖端保持在0V时迁移的代表性数据。图11A示出了电压作为时间的函数的曲线图。图11B示出了电流作为时间的函数的曲线图。

图12提供了电压反馈回路的示例流程图，其中ESI尖端保持在+3000V。

图13A-图13E提供了本公开内容的微流体装置的代表性电路图的示例。图13A提供了在化学迁移期间，图7A所示的微流体装置的代表性电路图，其中ESI尖端将保持在正电压，使用附加电阻器将电流吸收到地。图13B示出了在化学迁移期间，图7A所示的微流体装置的代表性电路图，其中ESI尖端将保持在正电压，使用附加电阻器将电流吸收到第三电源。图13C示出了在化学迁移期间，图7A所示的微流体装置的代表性电路图，其中ESI尖端将保持在正电压，使用场效应晶体管(FET)吸收电流。图13D示出了在化学迁移期间，图7A所示的微流体装置的代表性电路图，其中ESI尖端将保持在正电压，使用双极结型晶体管(BJT)吸收电流。图13E提供了在分离的分析物混合物的化学迁移期间，图7A所示的微流体装置的代表性电路图，其中ESI尖端将保持接地或接近接地。

图14A提供了毛细管接合喷雾器的代表图。图14B示出了图14A中毛细管接合喷雾器图的代表性电阻器电路图。

图15提供了计算机控制的电压反馈回路的示例性流程图，其中ESI尖端保持在0V。

图16A-图16E提供了分析物分离数据和分离的分析物物种的相应质谱数据的示例。图16A示出了分离的分析物混合物的电泳图。图16B示出了分离的物种的酸性峰的质谱。图16C示出了在图16A的电泳图中存在的主峰的质谱。图16D和图16E示出了图16A中所示的电泳图的两个碱性峰的质谱。

具体实施方式

本文描述的一些实施方式涉及创新的软件和系统，该软件和系统用于分析来自集成有质谱分析检测的基于毛细管和基于微流体的分离系统的数据并指导其操作。在一些实施方式中，在毛细管或微流体装置上的分离过程中对分析物进行成像，并且在分离后在质谱仪中测量分子量或质荷比。所公开的方法、装置、系统和软件提供了分离的分析物峰的更准确的表征，并实现了化学分离数据和质谱(MS)数据之间的改善的相关性。还公开了用于改善电喷雾电离质谱(ESI-MS)数据的质量的方法、装置、系统和软件。所公开的方法、装置、系统和软件在各种领域中具有潜在的应用，包括但不限于，蛋白质组学研究、药物发现和开发以及临床诊断。例如，在一些实施方式中，所公开的方法、装置、系统和软件可以用于在开发和/或制造期间表征生物和生物类似药物，下文将更详细地讨论。生物制剂和生物仿制药是如下的一类药物，包括例如重组蛋白、抗体、活病毒疫苗、来源于人血浆的蛋白质、基于细胞的药物、天然来源的蛋白质、抗体-药物缀合物、蛋白质-药物缀合物和其他蛋白质药物。

描述了被设计用于进行多种化学分离技术中的任何一种并且还包括用于进行基于下游质谱分析的电喷雾电离接口的微流体装置。在优选的实施方式中，所公开的装置被设计为对蛋白质或其他生物大分子进行等电聚焦。在另一个优选实施方式中，所公开的装置被设计为与成像技术一起使用。用于将成像的微流体分离与质谱结合的装置和方法已先前在，例如，公开的PCT专利申请公开号WO 2017/095813和美国专利申请公开号US 2017/0176386中描述，其出于所有目的特此通过引用并入本文。其中，这些应用描述了结合MS分析进行成像分离的系统。这种微流体系统代表了生物制剂表征的重大进展。然而，为了使这种系统提供最大的益处，如本文所公开的，具有创新的软件和系统来辅助这些系统的操作以及成像和MS数据的下游集成将是有益的。

因此，在优选的实施方式中，所公开的微流体装置可以与成像技术结合使用，从而例如，准确测定已从分离通道中的分析物混合物中等电分离出的一种或多种分析物的等电点(pI)，以形成一系列包含基本上纯的单个分析物组分的富集级分(在本文中也称为“峰”或“带”)。对分离通道的全部或部分进行成像允许确定已与待分离样品一起注入的两种或多种pI标准物(或pI标记物)的位置，从而通过外推法确定局部pH值，允许为每个分离的分析物峰计算出更准确的pI。在一些实施方式中，在进行分离的同时，对分离通道内的分析物混合物进行成像，并且可选地，对正分离的分析物中的一种或多种进行等电点测定，并在进行分离的同时迭代更新。在一些实施方式中，在分离完成后，对已经等电聚焦的一种或多种分析物进行基于成像的等电点测定。在一些实施方式中，在分离完成后并且在分离的分析物混合物已经朝向电喷雾尖端迁移之前，对已经等电聚焦的一种或多种分析物进行基于成像的等电点测定。在一些实施方式中，本文公开的基于成像的方法可以与基于毛细管的ESI-MS系统一起使用，而不是与基于微流体装置的ESI-MS系统一起使用。在一些实施方式中，可以通过计算机实现的方法来执行对一个或多个分析物峰的等电点测定。

在另一个优选的实施方式中，所公开的微流体装置可以与成像技术结合使用，以在分离的分析物混合物迁移后，即当峰移出分离通道并向电喷雾尖端移动时，对分离的分析物峰进行成像。在一些实施方式中，成像的迁移步骤与成像的分离步骤是相同步骤，如当实施包括毛细管凝胶电泳、毛细管区带电泳、等速电泳、毛细管电动色谱、胶束电动色谱、流动平衡毛细管电泳或通过差速分离分析物混合物组分的任何其他分离技术的分离步骤时。在一些实施方式中，将分析成像的迁移步骤，以使成像的分离中的富集级分与质谱相关联。迁移的分析物峰的成像可以用于，例如，基于一系列迁移图像中一个或多个分析物峰的位置确定其速度，然后可将其用于确定分析物峰将离开分离通道或由电喷雾尖端发射的时间点，从而可以用于将质谱仪数据与特定分析物峰相关联。在一些情况下，分析物峰的速度是根据分析物峰移动特定位移值(例如，从第一位置到第二位置)所需的时间间隔来计算。在一些实施方式中，对迁移的分析物峰的成像可以允许当它们穿过流体通道并由电喷雾尖端发射时直接监测峰，因此可以用于将质谱仪数据与特定的分析物峰直接关联。在一些实施方式中，本文公开的基于成像的方法可以与基于毛细管的ESI-MS系统一起使用，而不是与基于微流体装置的ESI-MS系统一起使用。在一些实施方式中，一个或多个分析物峰的速度，其实际或预测的从分离通道离开时间和/或其电喷雾发射时间的确定可以通过计算机实现的方法进行。

在一些实施方式中，分离的分析物峰的迁移可以通过微流体装置中的电场或流动参数的改变来发起。在一些实施方式中，一个或多个将电源连接至微流体装置的电极将被连接或断开，以通过计算机实现的方法来发起迁移。在一些实施方式中，可以在迁移步骤期间使在电喷雾尖端形成的泰勒锥成像。在一些实施方式中，计算机实现的图像分析可以用于识别稳定的电喷雾操作条件。在一些实施方式中，图像分析可以由操作员执行。在一些实施方式中，图像分析可以使用自动化图像处理软件执行。在一些实施方式中，将调整已知影响电喷雾性能的一个或多个操作参数，以恢复稳定的电喷雾操作条件。可以调整的操作参数的示例包括，但不限于，电泳电压、流速、从电喷雾尖端到MS入口的距离、MS电压等。在一些实施方式中，可以使用计算机实现的方法来调整电喷雾参数。

在一些实施方式中，可以使用多于一个的电源来产生电泳电场。在一些实施方式中，可以使用具有正极性的两个电源。在一些实施方式中，一个或多个电源可以具有负极性。在一些实施方式中，可以一致地改变电源上的电压设置，以在电泳分离的分离通道中保持相同的电压梯度。在一些实施方式中，可以改变电源上的电压设置，以在电喷雾尖端处保持恒定的电压。在一些实施方式中，多个电源可以是单个多通道电源中的不同通道。在一些实施方式中，可以在分离通道中进行等电聚焦，并且通道中的电阻可以随时间增加。在一些实施方式中，可以在分离通道中进行化学迁移，并且通道中的电阻可以随时间减少。在一些实施方式中，可以进行压力驱动的迁移，并且随着新试剂被推入通道，通道中的电阻可以随时间变化。在一些实施方式中，电喷雾尖端可以保持接地。在一些实施方式中，电喷雾尖端可以相对于质谱仪保持在特定电压。在一些实施方式中，电喷雾尖端可以相对于接地保持在特定电压。在一些实施方式中，计算机实现的方法可以调整电压，以在分离通道中保持恒定电场强度(或阳极和阴极之间保持恒定电压降)以及在电喷雾尖端处保持恒定电压。在一些实施方式中，尖端处的电压可以使用伏特计来测量。在一些实施方式中，可以使用位于尖端处或尖端内部的电极来测量尖端处的电压。在一些实施方式中，可以使用电流控制将附加电源设置为0μA，并用作伏特计以读取尖端电压。在一些实施方式中，计算机实现的方法将读取尖端处的电压值，并调整电压以在分离通道中保持恒定的电场强度(或在阳极和阴极之间保持恒定电压降)，并在尖端处保持恒定的电压。在一些实施方式中，计算机实现的方法将基于流过分离电场电路的电流计算ESI尖端处的电压。在一些实施方式中，将调整横跨分离通道的电压降，使得在分离通道中施加恒定功率或最大功率，其中将在分离通道中施加的功率计算为：

功率＝跨分离通道的电压×分离通道中的电流其中，在分离过程中可以连续或周期性地测量电流，并且电流测量可以用于调整分离通道的电压。控制分离通道中的功率的这种方法对于管理分离通道中的温度效应可以是有用的。

在一些实施方式中，分离路径将是一段线性涂覆或未涂覆的毛细管、管或管线，其中入口被插入到装有酸性阳极电解液和正电极或碱性阴极电解液和负电极的小瓶中。在一些实施方式中，分离路径的出口将被插入接合喷雾器中。在一些实施方式中，接合喷雾器容纳用于辅助管、管线或毛细管的T形件，其可以将另一种导电补充溶液引入毛细管出口，从而提供液-液电接触；和液流，其用于支持电喷雾和将从分离通道涌出的分析物输送至尖端，以通过电喷雾电离引入质谱仪。在一些实施方式中，该系统可以在分离路径入口处配置有阳极电解液和正电极，并且可以在即将聚焦之前在分离路径的接合处或远端部分装有阴极电解液。聚焦完成后，可以通过流体动力或电渗力将具有竞争阴离子的迁移剂引入接合处。在一些实施方式中，分离路径入口可被浸入具有阴极电解液和负电极的小瓶中，并且毛细管的接合处或远端部分可以在即将聚焦之前装有阳极电解液。聚焦完成后，可通过流体动力或电渗力将具有竞争阳离子的迁移剂引入接合处。在一些实施方式中，分离通道将是一段线性毛细管，其一端插入到将毛细管连接到正电极的阳极电解液容器中，另一端插入到将毛细管连接到负电极的阴极电解液容器中，以进行等电聚焦。在一些实施方式中，在聚焦后，毛细管的阴极电解液端将从阴极电解液中移出，并插入到质谱仪附近的接合喷雾器(例如，微瓶喷雾器)中，如图14A所示。在一些实施方式中，接合喷雾器可以提供一定量的迁移剂以对ESI中的分析物充电并迁移聚焦的分析物。在一些实施方式中，接合喷雾器可以提供电连接以完成迁移电路。在一些实施方式中，将调整阳极电解液和接合喷雾器的电压，以使阳极电解液和接合喷雾器之间的电压(ΔV)或电场的变化保持恒定，并且ESI尖端处的电压保持恒定。

在一些实施方式中，分离通道(例如，毛细管)包括微瓶，其可以促进将迁移的流出物转移至ESI。微瓶可以是毛细管的一部分，或者可以附加和/或融合到分离通道。微瓶可以是ESI尖端的一部分。在一些情况下，微瓶可以包括或是接合喷雾器的一部分。微瓶可以在通道的一部分中或在ESI尖端处提供流体流动路径(例如，用于鞘液)。

在一些实施方式中，一个电源可以连接到电阻器以产生电流吸收器。在一些实施方式中，电阻器可以通过将电泳电路接地来吸收电流。在一些实施方式中，电阻器是场效应晶体管(FET)可调电阻器。在一些实施方式中，电阻器可以是精密可变电阻器、中继电阻器网络、电阻梯或任何其他能够提供吸收电流路径的电阻元件。在一些实施方式中，电流吸收器可以是FET，其中控制FET以使其提供流过FET的恒定电流，或者可以将其控制以在需要时用作开路或短路。在一些实施方式中，双极结型晶体管(BJT)可以用于电流吸收器功能。在一些实施方式中，电阻器可以通过将电泳电路连接到电流吸收电源来吸收电流。在一些实施方式中，将随着分离通道中的电阻随时间变化而调整电流吸收电源的电压设置。在一些实施方式中，将调整电流吸收电源上的电压，以维持电阻器上的恒定电流。在一些实施方式中，电阻器或一组电阻器、电阻电路等可以用作电流吸收器。

在一些实施方式中，可以在迁移/ESI步骤期间改变被扫描的质荷(m/z)范围。在一些实施方式中，计算机实现的方法可以用于在高m/z范围和低m/z范围之间切换。在一些实施方式中，可以将一个m/z范围内的质谱用于分离不同质量范围内的分析物的内标。该质谱可以包括用于游离溶液等电梯度两性电解质的数据，其可以用作等电点(pI)的标准，或者该质谱可以包括用于电泳迁移率的标准数据，其可以用作电泳(例如，毛细管区带电泳)的标准。在一些情况下，该质谱可以包括用于在分离步骤中例如，通过pI、荷质比、通过凝胶的可信度(reputation)、电泳迁移率等可分辨的任何分子的数据，其与感兴趣的分析物在不同的质量范围内。

本公开内容的系统可以包括以下中的一项或多项：(i)毛细管或微流体装置，其被设计为进行分析物分离(例如，基于等电聚焦的分离)，其提供与质谱仪对接的电喷雾接口，(ii)质谱仪，(iii)成像装置或系统，(iv)处理器或计算机，(v)用于协调基于毛细管或微流体装置的分析物分离的操作与图像采集的软件，(vi)在进行分离时、完成分离后或pI标准物和分析物峰向电喷雾尖端迁移后，用于处理图像并确定一种或多种pI标准物或分析物峰在分离通道中的位置的软件；(vii)用于处理图像并确定一种或多种pI标准物或分析物峰的速度、离开时间和/或电喷雾发射时间的软件，(viii)用于同时或交替获取分离通道图像的软件，以监测分析物峰的位置和存在于电喷雾尖端与质谱仪入口之间的泰勒锥的位置，以监测电喷雾性能；(ix)用于处理泰勒锥的图像并调整电喷雾尖端相对于质谱仪入口的位置、流过电喷雾尖端的流体、电喷雾尖端与质谱仪之间的电压、或其任何组合的软件，以影响质谱仪数据质量的变化；(x)用于控制从电喷雾接口发射的各个分析物峰的质谱仪数据收集的软件，其中质谱仪的数据收集模式在高质量扫描和低质量扫描之间交替；(xi)用于读取电喷雾尖端处的电压并调整分离通道电压的软件，以在通道中保持恒定的场强(或在阳极和阴极之间保持恒定压降)，同时在尖端处保持恒定的电压；或其任何组合。在一些实施方式中，该系统可以包括集成系统，其中将这些功能部件的选择被封装为固定配置。在一些实施方式中，该系统可以包括模块化系统，其中可以改变功能部件的选择，从而为新应用重新配置系统。在一些实施方式中，这些功能系统部件中的一些，例如，毛细管或微流体装置，是可替换的或一次性部件。

应当理解，前面的总体概述和下面的描述都仅仅是示例性和解释性的，并且不限制本文所述的方法和装置。

定义：除非另有定义，否则本文中使用的所有技术术语具有与本公开内容所属领域的本领域普通技术人员通常所理解的相同含义。

如本说明书和所附权利要求书中所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式的“一个”、“一种”和“所述”包括复数个指称物。除非另有说明，否则本文中对“或”的任何引用旨在涵盖“和/或”。类似地，短语“包含”和“包括”不意图是限制性的。

如本文所用，术语“约”某一数值是指该数值加上或减去该数值的10％。在上下文中使用“约”某一范围是指该范围减去其最小值的10％和加上其最大值的10％。

分析物：如上所述，所公开的方法、装置、系统和软件能够更准确地表征分离的分析物峰，并改善化学分离数据和质谱数据之间的相关性。在一些情况下，这些分析物可以是，例如，释放的聚糖、碳水化合物、脂质或其衍生物(例如，细胞外囊泡、脂质体等)、DNA、RNA、完整蛋白质、经消化的蛋白质、蛋白质复合物、抗体-药物缀合物、蛋白质-药物缀合物、肽、代谢物、有机化合物或其他生物相关分子，或其任何组合。在一些情况下，这些分析物可以是小分子药物。在一些情况下，这些分析物可以是蛋白质混合物中的蛋白质分子，如生物蛋白药物和/或从分离自培养物或体内的细胞收集的裂解物。

样品：所公开的方法、装置、系统和软件可用于分离和表征从各种生物或非生物样品中的任何一种中获得的分析物。示例包括但不限于组织样品、细胞培养样品、全血样品(例如静脉血、动脉血或毛细血管血样品)、血浆、血清、唾液、组织液、尿液、汗液、眼泪、来自工业酶或生物药物生产过程的蛋白质样品、环境样品(例如空气样品、水样品、土壤样品、表面擦拭样品)等。在一些实施方式中，在使用公开的用于综合化学分离和质谱表征的方法和装置进行分析之前，可以使用本领域技术人员已知的多种技术中的任何一种来处理样品。例如，在一些实施方式中，可以对样品进行处理以提取蛋白质或核酸。可从多种来源中的任何一种或受试者中采集样品，例如细菌、病毒、植物、动物或人类。

样品体积：在所公开的方法和装置的一些实施方式中，可以通过使用微细加工技术实现的小型化使得能够处理非常小的样品体积。在一些实施方式中，用于分析的样品体积可以在约0.1μl至约1ml的范围内。在一些实施方式中，用于分析的样品体积可以是至少0.1μl、至少1μl、至少2.5μl、至少5μl、至少7.5μl、至少10μl、至少25μl、至少50μl、至少75μl、至少100μl、至少250μl、至少500μl、至少750μl或至少1ml。在一些实施方式中，用于分析的样品体积可以是至多1ml、至多750μl、至多500μl、至多250μl、至多100μl、至多75μl、至多50μl、至多25μl、至多10μl、至多7.5μl、至多5μl、至多2.5μl、至多1μl或至多0.1μl。该段落中描述的下限值和上限值中的任何一个可以组合以形成本公开内容所包括的范围，例如，在一些实施方式中，用于分析的样品体积的范围可以为约5μl至约500μl。本领域技术人员将认识到，用于分析的样品体积可以具有该范围内的任何值，例如约10μl。

分离技术：本公开内容的方法、装置、系统和软件可以利用本领域技术人员已知的多种分析物分离技术中的任何一种。例如，在一些实施方式中，成像的分离可以是可从分析物混合物中产生一种或多种分离的分析物级分的电泳分离，如等电聚焦、毛细管凝胶电泳、毛细管区带电泳、等速电泳、毛细管电动色谱、胶束电动色谱、流动平衡毛细管电泳、电场梯度聚焦电泳、动态场梯度聚焦电泳等。

毛细管等电聚焦(CIEF)：在一些实施方式中，分离技术可以包括等电聚焦(IEF)，例如，毛细管等电聚焦(CIEF)。等电聚焦(或“电聚焦”)是一种用于通过分子的等电点(pI)的差异来分离分子的技术，即在等电点处它们具有净零电荷的pH。CIEF涉及将两性电解质(两性电解质)溶液添加到包含阳极或阴极的试剂容器之间的样品通道中，以在分离通道(即，连接包含电极的孔的流体通道)内产生pH梯度，在横跨该分离通道上施加分离电压。两性电解质可以为溶液相或固定在通道壁的表面上。带负电的分子通过介质中的pH梯度向正电极迁移，而带正电的分子向负电极移动。在低于其等电点(pI)pH区域的蛋白质(或其他分子)将带正电，因此会向阴极(即带负电的电极)迁移。蛋白质的总净电荷会随着它迁移通过逐渐增加的pH梯度(例如，由于羧基或其他带负电荷的官能团的质子化)而下降，直到它达到与其pI相对应的pH区域为止，在该点它没有净电荷，因此迁移就停止了。结果，蛋白质混合物会根据它们的酸性和碱性残基的相对含量而分离，并被聚焦成尖锐的固定带，其中每种蛋白质都位于pH梯度与其pI相对应的点。该技术具有极高的分辨率，其中蛋白质的不同之处在于将单个电荷分级成单独的谱带。在一些实施方式中，等电聚焦可以在已经永久地或动态地涂覆有例如中性和亲水性聚合物涂层的分离通道中进行，以消除电渗流(EOF)。合适的涂层的示例包括，但不限于，氨基改性剂、羟丙基纤维素(HPC)和聚乙烯醇(PVA)、

(Alcor Bioseparations)、线性聚丙烯酰胺、聚丙烯酰胺、二甲基丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、甲基纤维素、羟乙基纤维素(HEC)、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、三乙胺、正丙胺(proylamine)、吗啉、二乙醇胺、三乙醇胺、二氨基丙烷、乙二胺、壳聚糖、聚乙烯亚胺、尸胺、腐胺、亚精胺、二亚乙基三胺、四乙烯五胺、纤维素、右旋糖酐、聚氧化乙烯(PEO)、醋酸纤维素、支链淀粉、甲基丙烯酸乙吡咯烷、甲基丙烯酸二甲酯、双十二烷基二甲基溴化铵、Brij 35、磺基甜菜碱、1,2-二月桂酰基sn-磷脂酰胆碱(1,2-dilauryloyl sn-phosphatidylcholine)、1,4-二癸基-1,4-二氮杂双环[2,2,2]辛烷二溴化物、琼脂糖、聚(N羟乙基丙烯酰胺)、pole-323、超支化聚氨基酯、pullalan、甘油、吸附涂层、共价涂层、动态涂层等。在一些实施方式中，可以在分离介质中使用诸如甲基纤维素、甘油、尿素、甲酰胺、表面活性剂(例如，Triton-X 100、CHAPS、洋地黄皂苷)的添加剂来进行等电聚焦(例如，在未涂覆的分离通道中)，以显著降低电渗流，允许更好的蛋白质溶解，并通过增加电解质的粘度来限制流体通道毛细管内部的扩散。

如上所述，用于毛细管等电聚焦技术的pH梯度是通过使用两性电解质(即，既包含酸性基团又包含碱性基团，并且在一定的pH范围内主要以两性离子的形式存在的两性分子)产生的。电解质溶液在分离通道的阳极侧上的部分被称为“阳极电解液”。电解质溶液在分离通道的阴极侧的部分被称为“阴极电解液”。多种电解质可用于所公开的方法和装置中，包括但不限于，磷酸、氢氧化钠、氢氧化铵、谷氨酸、赖氨酸、甲酸、二甲胺、三乙胺、乙酸、哌啶、二乙胺和/或其任何组合。电解质可以以任何合适的浓度使用，如0.0001％、0.001％、0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％等。电解质的浓度可以为至少0.0001％、0.001％、0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％。电解质的浓度可以为至多90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、1％、0.1％、0.01％、0.001％、0.0001％。可以使用一定范围的电解质浓度，例如，0.1％-2％。两性电解质可以选自任何商业或非商业载体两性电解质混合物(例如ServalytpH 4-9(Serva，Heildelberg，德国)，Beckman pH 3-10(Beckman Instruments，Fullerton，CA，美国)，Ampholine 3.5-9.5和Pharmalyte 3-10(均来自General ElectricHealthcare，Orsay，法国)，AESlytes(AES)，FLUKA两性电解质(Thomas Scientific，Swedesboro，NJ)，Biolyte(Bio-Rad，Hercules，CA)等。载体两性电解质混合物可以包含有包含多个脂族氨基和羧酸酯基团的小分子(约300-1,000Da)的混合物，其pI值间隔很近且具有良好的缓冲能力。在存在施加电场的情况下，载体两性电解质分配成平滑的线性或非线性pH梯度，该梯度从阳极到阴极逐渐增加。

各种pI标准物中的任何一种均可用于所公开的方法和装置中，以计算分离的分析物峰的等电点。例如，可以使用CIEF应用中通常使用的pI标记物，例如，蛋白质pI标记物和合成的小分子pI标记物。在一些情况下，蛋白质pI标记物可以是具有普遍接受的pI值的特定蛋白质。在一些情况下，pI标记物可以是可检测的，例如，通过成像。可以使用可商购的多种蛋白质pI标记物或合成的小分子pI标记物的或其组合，例如，可从AdvancedElectrophoresis Solutions，Ltd.(Cambridge,Ontario，加拿大)、ProteinSimple、由Shimura设计的肽库和Slais染料(Alcor Biosepartions)获得的小分子pI标记物。

迁移技术：在一些实施方式中，例如，在采用等电聚焦的情况下，可以将分离的分析物带移向的分离通道的一端，该分离通道与下游分析装置对接(例如，电喷雾电离与质谱仪对接)。在一些实施方式中，例如在那些采用毛细管凝胶电泳、毛细管区带电泳、等速电泳、毛细管电动色谱、胶束电动色谱、流动平衡毛细管电泳或通过差速分离分析物混合物组分的任何其他分离技术的情况下，分离步骤可以看作是迁移步骤。

在一些实施方式中，可通过向分离通道的一端施加流体动力学压力来实现分析物带的迁移。在一些实施方式中，可以通过将分离通道定向在垂直位置从而可以利用重力来实现分析物带的迁移。在一些实施方式中，可以使用EOF辅助的迁移来实现分析物带的迁移。在一些实施方式中，可以使用化学迁移来实现分析物带的迁移。在一些实施方式中，可以采用这些迁移技术的任何组合。

在一个实施方式中，等电聚焦分析物带的迁移步骤包括化学迁移。与基于压力的迁移相比，化学迁移的优势是通过克服因使用压力而引起的流体动力学抛物线流动曲线而显示出最小的谱带展宽。化学迁移可以通过将包含完全或部分聚焦的pH梯度的分离路径的入口或出口引入导电溶液中来实现，其中离子与水合氢或羟基竞争进行电泳，进入分离路径。这通过破坏近似零净电荷状态导致pH梯度组分的逐步电动位移。在阴极化学迁移的情况下，可以用含有竞争阴离子的迁移溶液代替羟基的供应，即阴极电解质溶液。竞争阴离子可以导致分离路径中的pH下降，在pH梯度组分上产生正电荷，从而使它们向阴极迁移。相应地，在阳极迁移中，用含有竞争阳离子的迁移溶液代替阳极电解液溶液，该竞争阳离子增加分离中的pH值，使pH梯度组分产生负电荷，从而使它们向阳极迁移。在一些实施方式中，可以使用任何合适浓度的酸性电解质如甲酸、乙酸、碳酸、磷酸等引发阴极迁移。在一些实施方式中，可以使用碱性电解质如氢氧化铵、二甲胺、二乙胺、哌啶、氢氧化钠等引发阳极迁移。在一些实施方式中，可通过将盐，如氯化钠或任何其他盐添加至阳极电解液溶液或阴极电解液溶液来引发化学迁移。

在优选的实施方式中，可以在微流体装置内启动化学迁移步骤，该微流体装置被设计为通过改变装置内的电场以将迁移电解质电泳到分离通道中而将CIEF与ESI-MS结合。在一些实施方式中，可以通过连接或断开连接到一个或多个电源的一个或多个电极来实现电场的变化，其中一个或多个电极位于装置上的试剂孔中或与装置的流体通道集成在一起。在一些实施方式中，可使用计算机实现的方法和可编程开关来控制一个或多个电极的连接或断开，以使迁移步骤的时间和持续时间与分离步骤、电喷雾电离步骤和/或质谱数据收集相协调。在一些实施方式中，可通过使用电流控制并将电流设置为0μA来实现一个或多个电极与分离电路的断开。

毛细管区带电泳(CZE)：在一些实施方式中，分离技术可包括毛细管区带电泳，这是一种在施加电场的条件下分离溶液中带电分析物的方法。带电分析物分子的净速度受分离系统显示的电渗流(EOF)迁移率μ_EOF和单个分析物的电泳迁移率μ_EP(取决于分子的大小、形状和电荷)的影响，使得表现出不同大小、形状或电荷的分析物分子表现出不同的迁移速度并分离成谱带。

毛细管凝胶电泳(CGE)：在一些实施方式中，分离技术可包括毛细管凝胶电泳，一种基于分子大小和电荷的大分子(例如DNA、RNA和蛋白质)及其片段的分离和分析方法。该方法包括使用凝胶填充的分离通道，其中在带电的分析物分子在施加的电场中进行电泳运动期间，凝胶充当反对流和/或筛分介质。凝胶的作用是抑制由施加电场引起的热对流，并且还充当阻止分子的通过的筛分介质，从而导致大小或电荷不同的分子的迁移速度不同。

毛细管等速电泳(CITP)：在一些实施方式中，分离技术可包括毛细管等速电泳，一种分离带电分析物的方法，该方法在合适尺寸的毛细管或流体通道内使用两种电解质(称为前导电解质和尾随电解质)的不连续系统。前导电解质可以包含电泳迁移率最高的离子，而尾随电解质可以包含电泳迁移率最低的离子。待分离的分析物混合物(即样品)可以被夹在这两种电解质之间，并且施加电场导致毛细管或流体通道内的带电分析物分子被分配到按电泳迁移率降低的顺序的紧密连续的区域中。所述区域在所施加的电场中以恒定的速度移动，从而使得可以利用诸如电导率检测器、光电检测器的检测器或成像装置来记录它们沿着分离通道的通过。与毛细管区带电泳不同，在使用毛细管等速电泳进行的单个分析中，同时测定或检测阴离子分析物和阳离子分析物是不可行的。

毛细管电动色谱法(CEC)：在一些实施方式中，分离技术可包括毛细管电动色谱法，一种基于液相色谱法和电泳分离法相结合的分析物混合物分离方法。CEC同时提供毛细管电泳(CE)的效率以及填充毛细管高效液相色谱(HPLC)的选择性和样品容量。由于CEC中使用的毛细管是用HPLC填充材料填充的，因此CEC中也可以使用HPLC中可用的多种分析物选择性。这些填充材料的高表面积使CEC毛细管能够容纳相对大量的样品，从而使随后洗脱的分析物的检测比其在毛细管区带电泳(CZE)中的检测更为简单。

胶束电动色谱(MEKC)：在一些实施方式中，分离技术可包括胶束电动色谱，一种基于表面活性剂胶束(伪固定相)和周围的水性缓冲溶液(移动相)的差别分配分离分析物混合物的方法。在MEKC中，缓冲溶液中所含表面活性剂的浓度可以大于临界胶束浓度(CMC)，因此表面活性剂单体与胶束相平衡。MEKC可以在开放的毛细管或流体通道中使用碱性条件进行，以产生强大的电渗流。在MEKC应用中可以使用多种表面活性剂，例如，十二烷基硫酸钠(SDS)。例如，SDS的阴离子硫酸盐基团使表面活性剂和胶束具有与强电渗流的方向相反的电泳迁移率。结果，表面活性剂单体和胶束的迁移缓慢，尽管它们的净运动仍沿电渗流的方向，即朝向阴极。在MEKC分离过程中，分析物可以分布在胶束的疏水内部和亲水缓冲溶液之间。不溶于胶束内部的亲水性分析物以电渗流速u_o迁移，并将在缓冲剂的保留时间t_M处被检测到。完全溶解在胶束中的疏水性分析物以胶束速度u_c迁移，并在最终洗脱时间t_c洗脱。

流动平衡毛细管电泳(FCCE)：在一些实施方式中，分离技术可包括流量平衡毛细管电泳，一种利用压力诱导的逆流来主动阻滞、停止或逆转分析物通过毛细管的迁移来增加毛细管电泳法的效率和分辨力的方法。通过阻滞、停止或在检测窗口中来回移动分析物，与正常分离条件相比，目标分析物可以有效地被限制在分离通道中的时间要长得多，从而提高了分离效率和分辨力。

分离时间和分离分辨率：通常，实现完全分离所需的分离时间将根据具体的分离技术和所使用的操作参数(例如，分离通道长度、微流体装置设计、缓冲剂成分、施加的电压等)而变化。在一些实施方式中，如同审的美国专利申请号16/261,382中所述，软件将基于对分析物峰的基于成像的分析来确定何时分离完成。在一些实施方式中，分离时间可以在约0.1分钟至约30分钟的范围内。在一些实施方式中，分离时间可以是至少0.1分钟、至少0.5分钟、至少1分钟、至少5分钟、至少10分钟、至少15分钟、至少20分钟、至少25分钟或至少30分钟。在一些实施方式中，分离时间为至多30分钟、至多25分钟、至多20分钟、至多15分钟、至多10分钟、至多5分钟、至多1分钟、至多0.5分钟或至多0.1分钟。该段落中描述的下限值和上限值中的任何一个可以组合以形成本公开内容中包括的范围，例如，在一些实施方式中，分离时间可以在约1分钟至约20分钟的范围内。分离时间可以具有该范围内的任何值，例如约7分钟。

类似地，使用所公开的方法和装置实现的分离效率和分辨率可以根据具体的分离技术和所使用的操作参数(例如，分离通道长度、微流体装置设计、缓冲剂成分、施加的电压等)而变化。在一些实施方式中，实现的分离效率(例如，理论板的数量)可以在约1,000至1,000,000的范围内。在一些情况下，分离效率可以为至少1,000、至少5,000、至少10,000、至少20,000、至少30,000、至少40,000、至少50,000、至少60,000、至少70,000、至少80,000、至少90,000、至少100,000、至少200,000、至少300,000、至少400,000、至少500,000、至少600,000、至少700,000、至少800,000、至少900,000或至少1,000,000。分离分辨率效率可以变化，这取决于混合物中分析物的一种或多种性质(例如，分子量、扩散率、电泳或等电迁移率等)。

微流体装置的设计和制造：在所公开的方法、装置和系统的一些实施方式中，可以使用被设计用于将一个或多个样品制备步骤(例如，过滤、预浓缩或提取步骤等)和/或分离步骤(例如，如上所述)与电喷雾电离步骤整合在一起的微流体装置来执行分析物从混合物中分离，以及任选地，使用ESI-MS对其进行随后的分析。

在一些实施方式中，所公开的微流体装置可以包括一个或多个样品或试剂端口(也称为入口、样品孔或试剂孔)；一个或多个废物端口(也称为出口)；一个或多个流体通道，所述流体通道与所述入口端口和出口端口彼此相连或与中间流体通道(例如，分离通道)相连；或其任何组合。在一些实施方式中，所公开的微流体装置还可以包括一个或多个反应室或混合室、一个或多个微制造的阀、一个或多个微制造的泵、一个或多个排气结构、一个或多个膜(例如过滤膜)、一个或多个微柱结构(例如已填充有色谱分离介质的流体通道或修改的流体通道)或其任意组合。

在优选的实施方式中，所公开的微流体装置结合有电喷雾孔口或电喷雾尖端，以提供与质谱仪的电喷雾电离接口。在同审的美国专利申请公开号U.S.2017/0176386 A1和U.S.2018/0003674 A1中描述了这种接口的一个非限制性示例。图1示出了微流体装置的一个非限制性示例，该微流体装置被设计为进行等电聚焦然后进行ESI-MS表征。图1中所示的流体通道网络使用标准光刻蚀刻技术由钠钙玻璃板制成，该钠钙玻璃板对280nm光具有非常低的透射率。分离(或富集)通道418的深度与玻璃层402的厚度相同，即富集通道418从玻璃板402的顶部贯穿至底部。装置400可以由安设在装置400的一侧上的光源进行照射并且由安设在装置400的对侧上的检测器进行成像。由于基底402是不透明的，但富集通道418限定了光学缝隙，因此基底402可以阻挡不通过富集通道418的光，从而阻挡杂散光并改善成像过程的分辨率。玻璃层402夹在对280nm光透射(例如，对其透明)的两块熔融二氧化硅板之间。顶板含有用于仪器和用户与通道网络对接的通孔，而底板是实心的。将三块板在520℃下粘合30分钟。入口和出口管材由切割的毛细管(100μm内径，Polymicro)制成，且粘合至通道网络。该装置在进行蛋白质的等电聚焦和随后的质谱表征方面的操作将在下面的实施例1中描述。

本领域技术人员已知的多种流体致动机构中的任何一种都可以被用来控制样品和试剂通过该装置的流体流动。用于所公开的方法、装置和系统中的合适的流体致动机构的示例包括但不限于对一个或多个入口端口或出口端口施加正压力或负压力、重力或离心力、电动力、电润湿力，或其任意组合。在一些实施方式中，可以例如通过使用机械致动器或活塞来直接施加正压力或负压力，所述机械致动器或活塞被耦合至入口端口和/或出口端口以致动样本或试剂流过流体通道。在一些实施方式中，机械致动器或活塞可以在用于密封入口端口和/或出口端口的柔性膜或隔膜上施加力。在一些实施方式中，可以例如通过使用与一个或多个入口端口和/或出口端口连接的加压气体管线或真空管线间接施加正压力或负压力。在一些实施方式中，可以使用与一个或多个入口端口和/或出口端口连接的泵，例如可编程注射泵、HPLC泵或蠕动泵来驱动流体流动。在一些实施方式中，可以通过使用电场来施加电动力和/或电润湿力并控制装置内的表面性质。可以通过插入一个或多个入口端口和/或出口端口中的电极或通过集成在装置内的一个或多个流体通道中的电极来施加电场。电极可以与一个或多个DC或AC电源连接，以控制装置内的电压和/或电流。

通常，所公开的微流体装置的入口端口、出口端口、流体通道或其他部件，包括装置的主体，可以使用多种材料中的任何一种来制造，所述材料包括但不限于玻璃、熔融二氧化硅、硅、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯、环烯烃共聚物(COC)或环烯烃聚合物(COP)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)或其他弹性材料。合适的制造技术通常取决于材料的选择，反之亦然。示例包括但不限于CNC加工、光刻和化学蚀刻、激光消融、注塑、热压花、模切、3D打印等。在一些实施方式中，微流体装置可包括层状结构，其中例如，包括流体通道的流体层夹在上层和/或下层之间以密封通道。上层和/或下层可包括与流体层中的流体通道对准以形成入口端口和/或出口端口等的开口。可以将两个或更多个装置层夹在一起以形成可以拆卸或永久结合的装置。合适的粘合技术通常取决于用于制造层的材料的选择。示例包括但不限于阳极粘合、热粘合、激光焊接或使用可固化的粘合剂(例如，热固化或光固化性粘合剂)。

在一些实施方式中，微流体装置内的入口端口、出口端口或流体通道的全部或一部分可包括用于改变入口端口、出口端口或流体通道壁的电渗流特性(例如，HPC或PVA涂层)和/或疏水性/亲水性特性的表面涂层(例如，聚乙二醇(PEG)涂层)。

所公开的装置的入口端口和/或出口端口可以制成各种形状和尺寸。适当的入口端口和/或出口端口几何形状包括但不限于球形、圆柱形、椭圆形、立方形、圆锥形、半球形、矩形或多面体(例如，由多个平面组成的三维几何形状，例如矩形长方体、六角柱、八角柱、倒三角椎体、倒四角椎体、倒五角椎体、倒六角椎体或倒截头椎体)或其任意组合。

入口端口和/或出口端口尺寸可以以平均直径和深度来表征。如本文所使用的，入口端口或出口端口的平均直径是指可以内切于入口端口和/或出口端口几何结构的平面横截面内的最大圆。在本公开内容的一些实施方式中，入口端口和/或出口端口的平均直径可以在约0.1mm至约10mm的范围内。在一些实施方式中，入口端口和/或出口端口的平均直径可以为至少0.5mm、至少1mm、至少2mm、至少4mm、至少8mm或至少10mm。在一些实施方式中，平均直径可以是至多10mm、至多8mm、至多6mm、至多4mm、至多2mm、至多1mm或至多0.5mm。该段落中描述的下限值和上限值中的任何一个可以组合以形成包括在本公开内容内的范围，例如，在一些实施方式中，平均直径可以在约2mm至约8mm的范围内。本领域技术人员将认识到，入口端口和/或出口端口的平均直径具有在该范围内的任何值，例如约5.5mm。

在一些实施方式中，入口端口和/或出口端口(例如，样品或试剂孔)的深度可以在约5μm至约500μm的范围内。在一些实施方式中，深度可以是至少5μm、至少10μm、至少25μm、至少50μm、至少75μm、至少100μm、至少200μm、至少300μm、至少400μm或至少500μm。在一些实施方式中，深度可以是至多500μm、至多400μm、至多300μm、至多200μm、至多100μm、至多50μm、至多25μm、至多10μm或至多5μm。该段落中描述的下限值和上限值中的任何一个可以组合以形成本公开内容中包括的范围，例如，在一些实施方式中，入口端口和/或出口端口的深度可以在约50μm至约200μm的范围内。本领域技术人员将认识到深度可以具有在该范围内的任何值，例如，约130μm。在一些实施方式中，入口端口和/或出口端口(例如，样品或试剂孔)的深度可以在约500μm至约50mm的范围内。在一些实施方式中，深度可以是至少1mm、至少5mm、至少10mm、至少15mm、至少20mm或至少50mm。在一些实施方式中，深度可以是至多50mm、至多20mm、至多15mm、至多10mm、至多5mm或至多1mm。该段落中描述的下限值和上限值中的任何一个可以组合，以形成本公开内容中所包括的范围，例如，在一些实施方式中，入口端口和/或出口端口的深度可以在约50μm至约5mm的范围内。

在一些实施方式中，所公开的装置的流体通道可具有多种横截面几何形状中的任何一种，例如正方形、矩形、圆形等。通常，流体通道的横截面几何形状将取决于用于制造它们的制造技术，反之亦然。在一些实施方式中，流体通道的横截面尺寸(例如，非矩形横截面的流体通道的高度、宽度或平均直径，其中平均直径被定义为可以内切在流体通道的横截面几何形状内的最大圆的直径)的范围可以为约5μm至约500μm。在一些实施方式中，流体通道的尺寸可以是至少5μm、至少10μm、至少25μm、至少50μm、至少75μm、至少100μm、至少200μm、至少300μm、至少400μm、至少500μm或至少1000μm。在一些实施方式中，流体通道的尺寸可以是至多1000μm、至多500μm、至多400μm、至多300μm、至多200μm、至多100μm、至多50μm、至多25μm、至多10μm或至多5μm。该段落中描述的下限值和上限值中的任何一个可以组合以形成包括在本公开内容内的范围，例如，在一些实施方式中，流体通道的尺寸可以在约75μm至约300μm的范围内。本领域技术人员将认识到，该尺寸可以具有在该范围内的任何值，例如约95μm。在一些实施方式中，流体通道的深度可以与装置的入口端口和/或出口端口的深度相等。

成像技术：在所公开的方法和装置的一些实施方式中，分析物分离步骤和/或迁移步骤的成像可以使用光学检测技术进行，如紫外(UV)光吸收、可见光吸收、荧光、傅立叶变换红外光谱、傅立叶变换近红外光谱、拉曼光谱、光学光谱等。在一些实施方式中，分离(或富集)通道的全部或部分、连接分离通道的末端和下游分析仪器或电喷雾孔口或尖端的接合或连接通道、电喷雾孔口或尖端本身，或其任何组合都可以进行成像。在一些实施方式中，分离(或富集)通道可以是毛细管的内腔。在一些实施方式中，分离(或富集)通道可以是微流体装置内的流体通道。

用于检测分离的分析物带的波长范围通常将取决于成像技术的选择以及制造装置或其一部分所用的材料。例如，在将紫外光吸光度用于对整个或部分分离通道或微流体装置的其他部分进行成像的情况下，在约220nm(由于肽键的固有吸光度)和/或在约280nm(由于芳香族氨基酸残基的固有吸光度)下检测可能使人在分离和/或迁移过程中可视化蛋白质谱带，前提是至少装置的一部分，例如分离通道对这些波长的光是透明的。在一些实施方式中，可以在分离之前用例如荧光团、化学发光标签或其他合适的标记物标记要通过ESI-MS分离和表征的分析物，以便可以使用荧光成像或其他合适的成像技术对其进行成像。在一些实施方式中，例如，其中分析物包括通过商业制造工艺生产的蛋白质，可以对蛋白质进行基因工程改造，以掺入绿色荧光蛋白(GFP)结构域或其变体，从而可以使用荧光对它们进行成像。在一些实施方式中，蛋白质可以被标签化或标记化。可以配置标记的蛋白质，以使标记不干扰或扰乱所选分离技术所基于的分析物特性。

各种成像系统部件中的任何一个都可以用于实现所公开的方法、装置和系统的目的。示例包括但不限于一种或多种光源(例如，发光二极管(LED)、二极管激光器、光纤激光器、气体激光器、卤素灯、弧光灯等)、聚光透镜、物镜、反射镜、滤光片、分束器、棱镜、图像传感器(例如CCD图像传感器或照相机、CMOS图像传感器或照相机、二极管阵列、热成像传感器、FTIR等)等，或其任意组合。取决于所使用的成像模式，光源和图像传感器可以例如定位在微流体装置的对置侧上，从而可以获取基于吸光度的图像。在一些实施方式中，光源和图像传感器可以定位于微流体装置的同一侧上，例如，从而可以获取落射荧光图像。

图像可以在分离、迁移和/或电喷雾步骤期间连续获取，或者可以随机或在指定的时间间隔获取。在一些实施方式中，连续、以随机的时间间隔或在指定的时间间隔获取一系列的一个或多个图像。在一些实施方式中，一系列的一个或多个图像可以包括视频图像。

用于在电喷雾之前测定蛋白质等电点的pI标记物的成像：在一些实施方式中，如上所述，在包括已经受CIEF的分离的分析物混合物的分离通道的图像中的两个或更多个pI标记物的位置可用于测定一个或多个单独的分析物峰(例如，蛋白质分析物峰)的等电点。在一些实施方式中，基于局部pH和沿分离通道的位置之间的假定线性关系，从两个或更多个pI标记物的位置计算一个或多个分析物峰的等电点。在一些实施方式中，一个或多个分析物峰的等电点是基于描述局部pH与沿该分离通道的位置之间的关系的非线性拟合函数(例如，非线性多项式)，从三个或多个pI标记物的位置来计算的。在一些实施方式中，基于从分离通道图像确定的2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个pI标准物的位置，计算一种或多种分析物的等电点。

在一些实施方式中，当分离分析物混合物时，获取用于确定两个或更多个pI标记物位置的图像，并且随着分离的继续，迭代更新每个分析物带的pI的计算。在一些实施方式中，在分离完成后并且在迁移步骤开始前获取用于确定两个或更多个pI标记物的位置的图像。在一些实施方式中，当分离的混合物迁移并通过电喷雾尖端或孔口排出时，获取用于确定两个或更多个pI标记物位置的图像。在一些实施方式中，在分离的混合物迁移并通过将分离通道连接至下游分析仪器的流体通道排出时，获取用于确定两个或更多个pI标记物的位置的图像。

在一些实施方式中，使用计算机实现的方法(例如，软件包)获取用于确定分离混合物中的两个或更多个pI标记物和分析物带的位置的图像。在一些实施方式中，使用包括自动图像处理的计算机实现的方法确定两个或更多个pI标记物以及分析物带的位置。在一些实施方式中，计算机实现的方法还包括基于从自动图像处理中导出的位置数据对一个或多个分析物带进行等电点的计算。

图2提供了计算机实现的方法的示例过程流程图，该方法用于获取分离通道(或微流装置的其他部分)的图像，确定图像中PI标记物和分析物带的位置(即，在分离步骤包括CIEF的情况下)，并计算分析物的分离混合物中一个或多个分析物带的pI。在一些实施方式中，计算机实现的方法可以包括控制一系列一个或多个图像的获取，然后对其进行处理，以识别pI标记物和分离的分析物带的位置。下面将更详细地讨论合适的自动图像处理算法的示例。在一些实施方式中，用于PI标记物的预测位置的预定知识，例如，从仅包括pI标记物的“对照”样品的图像确定的PI标记物的位置，可以用于区分与pI标记物对应的带和与分离的分析物对应的带。在一些实施方式中，与获取分离的分析物带图像所使用的不同，可以在不同的波长或使用不同的成像模式获取pI标记物的图像。如图2所示，如果图像处理步骤未能确定已知数量的pI标记物和/或分离的分析物带的位置，则可以指示系统获取新图像，从而可以重复图像处理步骤。一旦确定了pI标记物和分离的分析物带的位置，则可以将PI标记物位置的数据拟合至用户选择的pH梯度模型(例如，线性或非线性模型)，然后将所得到的局部pH和沿分离通道的位置之间的拟合关系用于计算一个或多个分析物带的等电点。

在一些实施方式中，计算机实现的方法可以是迭代过程，其中重复以下步骤：检测pI标记物和分析物带位置，将位置数据拟合至pH梯度模型，并计算一个或多个分析物带的等电点，以便连续更新和完善后者(例如，通过对多次测定进行平均)。在一些实施方式中，可以在足够短的时间内完成包括如下步骤的循环：图像采集和处理，检测pI标记物和分析物带位置，将pI标记物位置数据拟合至pH梯度模型，以及计算一个或多个分析物带的等电点，以使等电点的计算可以以至少0.01Hz、0.1Hz、0.2Hz、0.3Hz、0.4Hz、0.5Hz、0.6Hz、0.7Hz、0.8Hz、0.9Hz、1Hz、10Hz、100Hz或1,000Hz的速率或任何其他相关速率，例如，以至少奈奎斯特速率的速率来更新和完善。

分析物带的成像以确定速度：在一些实施方式中，如上所述，可以从分离通道(或微流体装置的其他部分)的一系列两个或更多个图像确定一个或多个分析物带的位置，以使得可以根据其在两个或更多个图像中相对位置的差异以及两个或更多个图像的采集时间之间的已知时间间隔来计算一个或多个分析物带的速度。在一些实施方式中，可以在进行分离步骤的同时获取分离通道的至少一部分的两个或更多个图像。在一些实施方式中，可以在迁移步骤期间获取两个或更多个图像。在一些实施方式中，当分离的样品通过连接分离通道一端与下游分析仪器的流体通道排出时，可以获取两个或更多个图像。在一些实施方式中，当分离的样品通过电喷雾尖端或孔口排出以形成泰勒锥时，可以获取两个或更多个图像。在一些实施方式中，对一个或多个分析物带确定的速度可用于计算给定分析物带离开分离通道的时间。在一些实施方式中，例如，当存在一个或多个将分离通道的一端与出口端口(例如，电喷雾孔口或尖端)连接的互连流体接合部或流体通道时，为一个或多个分析物带确定的速度可以用于计算给定分析物带到达出口端口并离开装置的时间。在一些实施方式中，为一个或多个分析物带确定的速度可用于计算给定分析物带离开电喷雾尖端或电喷雾孔口并进入在电喷雾尖端或孔口与质谱仪入口之间形成的泰勒锥的时间。

在一些实施方式中，可以使用计算机实现的方法(例如，软件包)获取用于确定一个或多个分析物带的速度的图像序列。在一些实施方式中，使用包括自动图像处理的计算机实现的方法确定一个或多个分析物带的速度。在一些实施方式中，计算机实现的方法还包括对给定分析物带离开分离通道的时间进行计算。在一些实施方式中，计算机实现的方法还包括对给定分析物带到达出口端口并离开装置的时间进行计算。在一些实施方式中，计算机实现的方法还包括对给定分析物带将离开电喷雾尖端或电喷雾孔口并进入在电喷雾尖端或孔口与质谱仪入口之间形成的泰勒锥的时间进行计算。在一些实施方式中，为一个或多个分析物带确定的离开时间用于将特定的分析物带与质谱数据或使用其他分析仪器收集的数据相关联。

图3提供了计算机实现的方法的另一示例过程流程图，该方法用于获取分离通道(或微流体装置的其他部分)的图像，确定一个或多个分析物带的速度，并计算给定分析物带到达装置中指定点的时间，所述指定点例如，分离通道的末端、分离通道与辅助流体通道之间的接合点、装置的出口端口或电喷雾尖端或孔口的出口。在一些实施方式中，计算机实现的方法可以包括控制一系列一个或多个图像的采集，然后对其进行处理以识别分离的分析物带的位置。下面将更详细地讨论合适的自动图像处理算法的示例。如图3所示，如果图像处理步骤未能确定分离的分析物带的位置，则可以指示系统获取新图像，从而可以重复图像处理步骤。一旦针对一系列两个或多个图像确定分离的分析物带的位置，则基于其在两个或更多个图像中的相对位置以及两个或更多个图像的采集时间之间的已知时间间隔，来对一个或多个分析物峰计算速度。在一些实施方式中，在一系列图像中从一个图像到下一图像跟踪一个或多个分析物带可用于区分多个分离的分析物带，并用于完善速度计算(例如，通过对从系列中的多对图像计算出的速度值进行平均)。在一些实施方式中，可以使用选择成像模式检测的pI标记物或其他内标可以用作“速度标准”。如此确定的分析物带速度可用于计算给定带到达装置中用户指定点的时间，所述用户指定点例如，分离通道的出口端，装置内的特定流体接合部，装置的出口端口，电喷雾电离尖端或分析物进入泰勒锥的孔口等。

在一些实施方式中，计算机实现的方法可以是迭代过程，其中重复以下步骤：检测分析物带位置，确定分析物带速度以及计算离开时间，使得不断更新离开时间的预测，并且进一步改善化学分离数据与质谱数据(或其他类型的下游分析数据)的相关性。在一些实施方式中，可以在足够短的时间内完成包括图像获取和处理、速度计算和离开时间预测的步骤的循环，使得离开时间预测可以以至少0.01Hz、0.1Hz、0.2Hz、0.3Hz、0.4Hz、0.5Hz、0.6Hz、0.7Hz、0.8Hz、0.9Hz、1Hz、10Hz、100Hz或1,000Hz的速率或任何其他相关速率，例如，以至少奈奎斯特速率的速率来更新。

分离数据与质谱数据的相关性：在一些实施方式中，上述用于对等电聚焦的分析物带进行基于成像的准确等电点确定的计算机实现的方法，使得将等电点数据与质谱数据中的特定m/z峰(或其他分析数据)相关联，从而改善数据集的信息内容(甚至对于单次运行实验)，并允许对分析物样品进行更定量的表征。

在一些实施方式中，上述用于使用图像衍生数据计算速度并预测分离的分析物带(使用多种不同分离技术中的任何一种)的离开时间的计算机实现的方法使得能够改善化学分离数据(例如保留时间、电泳迁移率、等电点等)与质谱数据中特定m/z峰(或其他分析数据)之间的时间相关性，从而改善数据集的信息内容(甚至对于单次运行实验)，并且由于能够校正分离时间的实验-实验差异或仪器-仪器差异，因此可以对不同样品运行、不同样品或在不同仪器上收集的数据进行更定量的比较。因此，所公开的方法、装置和系统对于各种代谢组学、蛋白质组学以及药物开发或制造应用可能是特别有利的。

在一些实施方式中(例如，那些包括CIEF步骤的实施方式)，本公开内容的计算机实现的方法可以进行基于成像的精确等电点的确定和基于成像的分离分析物带的速度的确定。

质谱和电喷雾电离：在一些实施方式中，本公开内容的方法、装置和系统可以被配置用于进行分离的分析物混合物的电喷雾电离并将其注入质谱仪。质谱(MS)是一种分析技术，其通过将样品中的分析物分子电离，并对所得离子根据其质荷比(m/z)进行分类来测量分析物分子的“质量”。结合前面的液相或气相样品分离系统，质谱分析提供了最有效的手段之一，可用于分析包括多种低丰度分析物的复杂样品，如在生物样品中所常见的。

所有质谱仪都要求离子在引入质量分析仪之前必须处于气相中。已经开发出多种样品电离模式，包括但不限于，基质辅助激光解吸和电离(MALDI)和电喷雾电离(ESI)。在MALDI技术中，将样品(例如，包括蛋白质混合物的生物样品)与能量吸收基质(EAM)如芥子酸或α-氰基-4-羟基肉桂酸混合，并结晶到金属板上。表面增强激光解吸和电离(SELDI)是该技术的常见变体，该技术在金属板上结合了额外的表面化学作用，以促进特定种类蛋白质的特异性结合。将该板插入真空室中，并用来自氮气激光器的光脉冲撞击基质晶体。被基质分子吸收的能量转移至蛋白质，使它们解吸、电离并产生气相的离子羽流，这些离子羽流在电场存在的情况下被加速并被吸入飞行管，在飞行管中它们漂移直到它们击中记录飞行时间的探测器。飞行时间又可以用于计算电离物质的m/z比。在所公开的装置的一些实施方式中，装置的出口端口可以包括毛细管或其他特征，用于将分离的分析物带(或其级分)沉积到MALDI板上，以准备质谱分析，例如，将特定分析物带的等电点与MALDI质谱仪数据相关联。

电喷雾电离(ESI；在本文中也简称为“电喷雾”)是另一种广泛使用的技术，这是因为其可用于将液相色谱或电动色谱分离技术与质谱仪对接的固有的兼容性。如上所述，在电喷雾电离中，通过在尖端或孔口与质谱仪源板之间施加电场，从包括电喷雾特征(例如，发射器尖端或孔口)的毛细管或微流体装置的远端发射样品和溶液的小液滴。然后，液滴在该感应电场中拉伸并扩展，以形成锥形发射(即“泰勒锥”)，该锥形发射包括越来越小的液滴，这些液滴蒸发并产生气相离子，其被引入质谱仪进行进一步分离和检测。发射器尖端可以由微流体芯片设计中内置的毛细管或拐角或ESI尖端形成，这为ESI提供了方便的液滴体积。可以使用研磨轮、锉刀、加工工具、CNC加工工具、水射流切割或其他工具或工艺对发射器尖端进行锐化处理，以提供较小的表面和液滴体积，以使ESI尖端成形以提供较小的表面体积，等等。在一些实施方式中，可以通过加热并拉伸芯片的尖端部分来拉出尖端。在一些实施方式中，然后可以将尖端切割成所需的长度或直径。在一些实施方式中，电喷雾尖端可以涂覆有疏水涂层，该疏水涂层可以最小化在尖端上形成的液滴大小。在一些实施方式中，当没有分析物从装置上洗脱时，系统可以在分离步骤期间对移动剂、阴极电解液或任何其他液体进行电喷雾。

在所公开的方法、装置和系统的一些实施方式中，使用其他电离方法，如感应耦合激光电离、快速原子轰击、软激光解吸、大气压化学电离、二次离子质谱、火花电离、热电离等。

关于电喷雾电离，在一些实施方式中，所公开的微流体装置包括被设计为促进有效的电喷雾电离以及方便地与下游质谱分析对接的特征，如图1所示。可以使用多种不同质谱仪设计中的任何一种测量从微流体装置排出并引入质谱仪的分析物(例如，生物或生物类似物)的质荷比(或“质量”)。示例包括，但不限于，飞行时间质谱、四极质谱、离子阱或轨道阱质谱、飞行距离质谱、傅立叶变换离子回旋共振、共振质量测量和纳米机械质谱。

在一些实施方式中，微流体装置的电喷雾特征可以与分离通道成直线。在一些实施方式中，微流体装置的电喷雾特征可以相对于分离通道成直角或成中间角取向。在所公开方法的一些实施方式中，来自毛细管或微流体装置中进行的最终分离或富集步骤的基本上所有分离和/或富集的分析物级分都以连续流的形式从电喷雾尖端或特征部中排出。在一些实施方式中，所述分析物混合物的一部分(例如，感兴趣的级分)可以经由被配置成与分析仪器(如质谱仪)或被配置用于分级和/或富集所述样品的至少一部分的另一装置相接的出口从微流体装置排出。所述分析物混合物的另一部分(例如，含有除所述感兴趣级分之外的级分)可以经由废物通道排出。

在一些实施方式中，使用压力、电力、电离或这些的任何组合来进行从毛细管或微流体装置的排出。在一些实施方式中，排出与如上所述的迁移步骤一致。在一些实施方式中，用于电喷雾电离的鞘液用作电泳分离的电解质。在一些实施方式中，提供雾化气体以将分析物级分减小为精细喷雾。

基于成像的电喷雾电离性能的反馈：使用毛细管或微流体装置的常规ESI-MS系统通常不提供用于校准系统以在操作过程中重建泰勒锥的工具。通过跨微流体装置或毛细管中的分离通道施加的电泳电场可使维持稳定的泰勒锥变得复杂。在两次运行之间或运行期间，试剂电导率的变化可改变与质谱仪界面处的电压电势。界面处电势的变化可对泰勒锥产生不利影响，并可导致电喷雾电离效率的损失。本文公开了改善电喷雾电离性能的方法和系统，从而改善基于毛细管或基于微流体装置的ESI-MS系统收集的质谱数据的质量。在一些实施方式中，例如，电喷雾电离装置中的泰勒锥的成像可以用在计算机实现的方法中，以提供对一个或多个操作参数的反馈控制，使得泰勒锥的形状、密度或其他特性保持在指定范围内。在一些实施方式中，可以通过这种反馈过程控制的操作参数包括，但不限于，电喷雾尖端或孔口与质谱仪入口的对准，电喷雾尖端与质谱仪入口之间的距离(例如，通过将包括集成电喷雾特征的毛细管尖端或微流体装置安装在可编程的精密XYZ平移台上)，分析物样品通过电喷雾尖端的流速(例如，通过用于排出分析物样品的调节压力、电场强度或其组合)，例如在通道近端施加的电压(例如，在电喷雾尖端或孔口和质谱仪入口之间的电压)，排出的分析物样品周围的鞘液或鞘气的体积流速，或其任何组合。

图4提供了计算机实现的方法的示例过程流程图，该方法用于：(i)获取泰勒锥的图像(使用各种图像传感器，例如，CCD图像传感器或CMOS图像传感器)，(ii)处理图像以确定泰勒锥的形状、密度或其他特性，(iii)将泰勒锥的形状、密度或其他特性与一组指定值或目标值进行比较，并且(iv)基于所述比较使用将泰勒锥的形状、密度或其他特性与一个或多个操作参数关联的数学算法，来确定对一个或多个操作参数的适当调整，以将泰勒锥恢复到指定值或目标值。在一些实施方式中，除了从泰勒锥的图像导出的数据之外，还可以使用从质谱仪获取的数据(例如，总离子流数据)来监测系统性能并对一个或多个操作参数进行调整。

在一些实施方式中，可以在足够短的时间内完成图4所示的包括以下步骤的循环过程：图像采集和处理，识别泰勒锥特性，将所述泰勒锥特性与一组目标值进行比较，以及对一个或多个ESI-MS系统操作参数所需的调整进行计算，使得一个或多个操作参数可以以至少0.01Hz、0.1Hz、0.2Hz、0.3Hz、0.4Hz、0.5Hz、0.6Hz、0.7Hz、0.8Hz、0.9Hz、1Hz、10Hz、100Hz或1,000Hz的速率或任何其他相关速率，例如，以至少奈奎斯特速率的速率来更新。

交替的高质量/低质量扫描：在所公开的方法、装置和系统的一些实施方式中，质谱仪可以被设置为在高质量扫描范围(例如，约1500-6000的m/z范围)或“高质量扫描”，以及低质量扫描范围(例如，约150-1500的m/z范围)或“低质量扫描”之间交替，使得低质量扫描可以用于识别可以在质谱数据中进行识别的低质量标记物(例如，在进行等电聚焦分离步骤的情况下的游离溶液两性电解质)，并用于关于低质量标记物所指示的特性(例如，在检测到游离溶液两性电解质的情况下的等电点范围、肽、小分子标记物)对其进行校准。相对于来自电喷雾接口的分析物样品的流出，高质量扫描和低质量扫描之间的切换以及扫描速率应该是快速的。在一些情况下，高质量扫描和低质量扫描之间的切换速率可以在约0.5Hz至约50Hz的范围内。在一些情况下，切换速率可以为至少0.5Hz、至少1Hz、至少5Hz、至少10Hz、至少20Hz、至少30Hz、至少40Hz或至少50Hz。

改变高和低分离/迁移电压以保持ESI尖端电压恒定：在一些实施方式中，质谱仪上的ESI离子源将具有能够在质谱仪上设置负电压的可调电源。在一些实施方式中，质谱仪上的ESI离子源将具有能够在质谱仪上设置正电压的可调电源。在一些实施方式中，质谱仪上的ESI离子源将保持接地。在一些实施方式中，毛细管或微流体装置上的ESI尖端将保持接地或接近接地，以在ESI尖端与质谱仪上的带电ESI离子源之间产生电场。在一些实施方式中，毛细管或微流体装置上的ESI尖端将保持在正电压或负电压，以在ESI尖端与质谱仪上接地的ESI离子源之间产生电场。

图15提供了计算机控制的反馈回路的示例性流程图，该回路用于在迁移期间将阳极和阴极之间的恒定电压降保持在3000V，同时将ESI尖端电压保持在0V。在一些实施方式中，当质谱仪ESI离子源被设置为相对于接地的正或负电压(例如，-3500V)时，可以实现该反馈回路。在该示例中，通过首先将图7A中的阳极电解液端口110设置为+3000V并且将迁移剂端口104设置为0V，将阳极电解液端口110和迁移剂端口104之间的ΔV保持在3000V。在一些实施方式中，可以通过将阳极电解液端口110设置为不同的值来设置不同的ΔV。在一些实施方式中，可以使用阳极迁移，并且端口110可以是阴极电解液端口，其设置为，例如，-3000V。在图15概述的示例中，在迁移期间，由于分离中的分析物和两性电解质重新获得电荷，分离通道112中的电阻下降。根据等式1，这将导致跨通道112的电压降下降，从而导致ESI尖端116处的电压升高：

V₁₁₆＝(ΔV_110-104)*(R₁₀₅)/(R₁₀₉+R₁₁₂+R₁₀₅)

然而，通过测量或计算ESI尖端电压116，可以调节阳极电解液端口110和迁移剂端口104处的电压设置。通过从阳极电解液端口110和迁移剂端口104设置中减去ESI尖端电压116，ΔV_110-104保持为3000V，因此迁移不受影响，但根据等式2，将ESI尖端116电压设置为0：

V₁₁₆＝(ΔV_110-104)*(R₁₀₅)/(R₁₀₉+R₁₁₂+R₁₀₅)+V₁₀₄

该反馈回路继续操作，直到迁移完成，以常规频率(例如，奈奎斯特速率或约0.2Hz)将ESI尖端116的电压调整至0。在一些情况下，可以以至少0.01Hz、0.1Hz、0.2Hz、0.3Hz、0.4Hz、0.5Hz、0.6Hz、0.7Hz、0.8Hz、0.9Hz、1Hz、10Hz、100Hz或1,000Hz的速率将ESI尖端116处的电压调整至0。在ESI尖端116保持恒定的稳定电压对于在迁移过程中保持稳定的电喷雾至关重要。

在一些情况下，反馈回路操作以将ESI尖端处的电压保持在预设值的指定百分比之内。例如，在一些情况下，反馈回路操作以将ESI尖端处电压保持在预设值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％之内。在一些情况下，反馈回路操作以将ESI尖端电压保持在预设值的1000V、500V、100V、75V、50V、25V、10V、5V或1V内。

在一些实施方式中，质谱仪ESI离子源保持接地，并且ESI尖端116将需要保持在恒定的正或负电压，以便在ESI尖端116和质谱仪之间产生电场。在一些实施方式中，ESI尖端电压(例如，预设值)可以为约+5000V、约+4000V、约+3500V、约+3000V、约+2500V、约+2000V、约+1500V、约+1000V、约+500V、或约-5000V、约-4000V、约-3500V、约-3000V、约-2500V、约-2000V、约-1500V、约-1000V或约-500V。图12提供了计算机控制的反馈回路的示例流程图，该回路用于在迁移期间将阳极和阴极之间的恒定电压降保持在3000V，同时将ESI尖端电压保持在3000V。计算机控制的反馈回路的操作与图15中的相同，不同之处在于，阳极电解液端口110和迁移剂端口104处的电压偏移+3000V，这使ESI尖端116处的电压偏移至+3000V，仍遵循等式2。在一些实施方式中，可以使用模拟电路来实现对电场强度的控制。在一些实施方式中，可通过使用一个、两个、三个或四个或更多个独立的高压电源来提供对与基于毛细管或基于微流体装置的分离系统接触的一个或多个电极处的电压的控制。在一些情况下，例如，可以通过使用单个多路复用的高压电源来提供对与基于毛细管或基于微流体装置的分离系统接触的一个或多个电极处的电压的控制。

在一些情况下，反馈回路操作，以将分离通道内的电场强度或阳极与阴极之间的电压降保持在预设值的指定百分比内。例如，在一些情况下，反馈回路操作以将分离通道内的电场强度或阳极与阴极之间的电压降保持在预设值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％或0.01％以内。在一些情况下，反馈回路操作以将分离通道内的电场强度或阳极与阴极之间的电压降保持在预设值的1000V、500V、100V、75V、50V、25V、10V、5V或1V以内。

系统硬件：图5提供了所公开的方法、装置和系统的一个实施方式的系统硬件框图的示意图。如图所示，本公开内容的系统可以包括以下硬件部件中的一个或多个：(i)化学分离系统(例如，被设计用于进行分析物分离，例如，基于等电聚焦的分离的毛细管或微流体装置，以及一个或多个高压电源)，(ii)质谱仪的电喷雾接口，其在一些情况下，可以与分离系统直接集成(如虚线所示)，(iii)质谱仪，(iv)成像装置或系统，(v)处理器或计算机，以及(vi)计算机存储装置或其任何组合。在一些实施方式中，该系统还可以包括一个或多个毛细管或微流体装置流量控制器(例如，可编程注射泵、蠕动泵、HPLC泵等)；温度控制器，其被配置为保持全部或部分毛细管或微流体装置的指定温度；附加光传感器或图像传感器(例如，光电二极管、雪崩光电二极管、CMOS图像传感器和照相机、CCD图像传感器和照相机等)；光源(例如，发光二极管(LED)、二极管激光器、光纤激光器、气体激光器、卤素灯、弧光灯等)；其他类型的传感器(例如，温度传感器、流量传感器、pH传感器、电导率传感器等)；计算机存储装置；计算机显示装置(例如，包括图形用户界面)；数字通信装置(例如，内联网、互联网、WiFi、

或其他硬连线或无线通信硬件)等。

在一些实施方式中，该系统可以包括集成系统，在该集成系统中，功能硬件部件的选择被封装为固定配置。在一些实施方式中，该系统可以包括模块化系统，其中可以改变功能硬件部件的选择，以便为新应用重新配置系统。在一些实施方式中，这些功能系统部件中的一些，例如，毛细管或微流体装置，是可替换的或一次性部件。

如上所述，在公开的系统的不同实施方式中可以利用多种不同的质谱仪中的任何一种，包括但不限于，飞行时间质谱仪、四极质谱仪、离子阱或轨道阱质谱仪、飞行距离质谱仪、傅立叶变换离子回旋共振谱仪、共振质量测量谱仪和纳米机械质谱仪。

系统和应用软件：如图6所示，本公开内容的系统可以包括多个软件模块。例如，系统可以包括系统控制软件模块、数据采集软件模块、数据处理软件模块或其任何组合。通常，这些软件模块将被配置为在计算机处理器所掌控的操作系统或环境中运行，并且可以彼此和/或与操作系统通信和共享数据。

在一些实施方式中，系统控制软件模块可以包括用于以下的软件：(i)将基于毛细管或微流体装置的分析物分离系统的操作与通过成像系统采集的图像进行协调，(ii)将基于毛细管或微流体装置的分析物分离系统的操作与质谱仪系统的数据采集进行协调，(iii)将通过成像系统的图像采集与基于毛细管或微流体装置的分析物分离系统和/或质谱仪系统的操作进行协调，(iv)基于从分离通道和/或泰勒锥的成像获得的数据，提供对电喷雾电离装置和/或质谱仪的一个或多个操作参数的反馈控制，(v)通过质谱仪控制数据采集，同时以交替方式在高质量范围和低质量扫描范围之间切换，(vi)监测ESI尖端处的电压并调整分离电路电压，以保持恒定的分离电场强度(或阳极与阴极之间的电压降)和ESI尖端处的恒定电压，或其任何组合。

在一些实施方式中，数据采集模块可以包括用于以下的软件：(i)通过一个或多个图像传感器或成像系统控制图像采集，存储所述图像数据，并提供与系统控制和/或数据处理软件模块的软件接口，以及(ii)控制一个或多个质谱仪系统的数据采集，存储所述质谱仪数据(或其他下游分析仪器)，并提供与系统控制和/或数据处理软件的软件接口，或其任何组合。

在一些实施方式中，数据处理模块可以包括用于以下的软件：(i)处理图像并在进行分离时、完成分离后或将pI标准物和分析物峰向分离通道出口端口或电喷雾尖端迁移后，确定一种或多种pI标准物或分析物峰在分离通道中的位置，(ii)处理图像并确定一种或多种pI标准物或分析物峰的速度、离开时间和/或电喷雾发射时间，(iii)处理分离通道的图像，以监测分析物峰的位置，以及处理泰勒锥的图像，以监测电喷雾性能，其中分离通道和泰勒锥的图像是同时或交替获取的，(iv)处理泰勒锥的图像，确定泰勒锥的形状、密度或其他特性，并计算要对一个或多个操作参数(包括电喷雾尖端或孔口相对于质谱仪入口的位置(即，对准和/或分离距离)，通过电喷雾尖端或孔口的流体流速、电喷雾尖端或孔口与质谱仪之间的电压等，或其任何组合，)进行的调整，以影响质谱仪数据质量的变化；或其任何组合。

所公开的系统和应用软件可以使用本领域技术人员已知的各种或编程语言和环境中的任何一种来实现。示例包括，但不限于，C、C++、C#、PL/I、PL/S、PL/8、PL-6、SYMPL、Python、Java、LabView、Visual Basic、.NET等。

图像处理软件：如上所述，在一些实施方式中，数据处理模块可以包括图像处理软件，用于确定pI标记物或分离的分析物带的位置，用于表征泰勒锥的形状、密度或其他视觉指标等。在实现所公开的方法和系统中，本领域技术人员已知的多种图像处理算法中的任何一种都可以用于图像预处理或图像处理。示例包括但不限于Canny边缘检测法、Canny-Deriche边缘检测法、一阶梯度边缘检测法(例如Sobel算子)、二阶微分边缘检测法、相位一致(相位相干)边缘检测法、其他图像分割算法(例如强度阈值化、强度聚类方法、基于强度直方图的方法等)、特征和模式识别算法(例如用于检测任意形状的广义Hough变换、圆形Hough变换等)和数学分析算法(例如，傅立叶变换、快速傅立叶变换、小波分析、自相关、Savitzky-Golay平滑、本征分析等)，或其任意组合。

处理器和计算机系统：可以采用一个或多个处理器或计算机来实现本文公开的方法。一个或多个处理器可以包括硬件处理器，诸如中央处理单元(CPU)、图形处理单元(GPU)、通用处理单元或计算平台。一个或多个处理器可以由多种合适的集成电路(例如，专门设计用于实现深度学习网络架构的专用集成电路(ASIC)；或现场可编程门阵列(FPGA)，用于加快计算时间等，和/或便于部署)、微处理器、新兴的下一代微处理器设计(例如，基于忆阻器的处理器)、逻辑装置等中的任何一种组成。尽管参考处理器描述了本公开内容，但是其他类型的集成电路和逻辑装置也可以适用。处理器可以具有任何合适的数据操作能力。例如，处理器可以执行512位、256位、128位、64位、32位或16位数据操作。一个或多个处理器可以是单核或多核处理器，或者是被配置用于并行处理的多个处理器。

用于实现所公开的方法的一个或多个处理器或计算机可以是较大计算机系统的一部分，并且/或可以借助于通信接口可操作地耦合至计算机网络(“网络”)，以促进数据的传输和共享。网络可以是局域网、内联网和/或外联网，与Internet通信的内联网和/或外联网，或Internet。在一些情况下，网络是电信和/或数据网络。网络可以包括一个或多个计算机服务器，在一些情况下，它们可以实现分布式计算，如云计算。在一些情况下，借助计算机系统，网络可以实现对等网络，该对等网络可以使耦合至计算机系统的装置充当客户端或服务器。

计算机系统还可以包括存储器或存储器位置(例如，随机存取存储器、只读存储器、闪存、

Optane^TM技术)、电子存储单元(例如，硬盘)、用于与一个或多个其他系统进行通信的通信接口(例如，网络适配器)、以及外围装置(如缓存、其他存储器、数据存储器和/或电子显示适配器)。存储器、存储单元、接口和外围装置可以通过通信总线(例如，存在于主板上的)与一个或多个处理器，例如CPU通信。存储单元可以是用于存储数据的数据存储单元(或数据存储库)。

一个或多个处理器，例如，CPU，执行一系列机器可读指令，这些指令在程序(或软件)中实施。指令存储在存储器位置中。指令被导送到CPU，其随后对CPU进行编程或以其他方式配置CPU以实现本公开内容的方法。CPU执行的操作的示例包括获取、解码、执行和写回。CPU可以是电路，如集成电路的一部分。电路中可以包括系统的一个或多个其他部件。在一些情况下，该电路是专用集成电路(ASIC)。

存储单元存储文件，如驱动程序、库和保存的程序。存储单元存储用户数据，例如，用户指定的偏好和用户指定的程序。在一些情况下，计算机系统可以包括计算机系统外部的一个或多个附加数据存储单元，如位于通过内联网或Internet与计算机系统通信的远程服务器上。

本文所提供的方法和系统的一些方面是通过存储在计算机系统的电子存储位置(例如，存储器或电子存储单元)中的机器(例如，处理器)可执行代码来实现的。机器可执行或机器可读代码以软件形式提供。在使用期间，该代码由一个或多个处理器执行。在一些情况下，从存储单元检索代码并将其存储在存储器中，以供一个或多个处理器随时访问。在一些情况下，电子存储单元被排除，并将机器可执行指令存储在存储器中。该代码可以被预编译并配置为用于具有一个或多个适于执行代码的处理器的机器，或者可以在运行时被编译。可以以选择的编程语言提供代码，以使代码能够以预编译或实时编译的方式执行。

所公开的方法和装置的各个方面可以被认为是“产品”或“制造品”，例如，“计算机程序或软件产品”，通常以机器(或处理器)可执行代码和/或存储在某种类型的机器可读介质中的关联数据的形式，其中可执行代码包括用于在执行本文公开的一种或多种方法时控制计算机或计算机系统的多个指令。机器可执行代码可以存储在包括诸如光盘、CD-ROM、DVD或蓝光盘的光学可读介质的光学存储单元中。机器可执行代码可以存储在诸如存储器(例如，只读存储器、随机存取存储器、闪存)的电子存储单元中或存储在硬盘上。“存储”类型介质包括计算机、处理器等的任何或所有有形存储器，或其相关模块，如各种半导体存储芯片、光盘驱动器、磁带驱动器、磁盘驱动器等，其可以随时为编码本文所公开的方法和算法的软件提供非临时性存储。

软件代码的全部或部分有时可以通过Internet或各种其他电信网络进行通信。这种通信，例如，能够将软件从一台计算机或处理器加载到另一台计算机或处理器，例如，从管理服务器或主机加载到应用服务器的计算机平台。因此，用于传送软件编码指令的其他类型的介质包括光波、电波和电磁波，如在本地装置之间的物理接口上通过有线和光学陆线网络以及经由各种大气链路使用的那些介质。载送诸如有线或无线链路、光学链路等此类波的物理元件也被认为传送用于执行本文所公开的方法的软件编码指令的介质。如本文所用，除非限于非暂时性的、有形“存储”介质，否则术语如计算机或机器“可读介质”是指参与向处理器提供指令以供执行的任何介质。

计算机系统通常包括电子显示器，或可以与电子显示器通信，以提供例如，由机器视觉系统捕获的图像。该显示器通常还能够提供用户界面(UI)。UI的示例包括但不限于图形用户界面(GUI)、基于web的用户界面等。

应用：如上所述，所公开的方法、装置、系统和软件在各种领域中具有潜在的应用，包括但不限于蛋白质组学研究、药物发现和开发以及临床诊断。例如，使用所公开的方法对于分析物样品的基于分离的ESI-MS分析可以实现的改进的信息内容和数据质量对于生物制剂和生物仿制药在开发和/或制造期间的表征可能是非常有益的。其他应用可以包括，但不限于，分析环境污染物、农药、小分子、代谢产物、肽、翻译后修饰、糖型、抗体-药物缀合物、融合蛋白、病毒、过敏原、单细胞生物和其他应用。

生物制剂和生物仿制药是这样的一类药物：其包括例如重组蛋白、抗体、活病毒疫苗、来源于人血浆的蛋白质、基于细胞的药物、天然来源的蛋白质、抗体-药物缀合物、蛋白质-药物缀合物和其他蛋白质药物。FDA和其他监管机构要求使用逐步方法来证明生物相似性，其中可能包括在结构、功能、动物毒性、人类药代动力学(PK)和药效学(PD)、临床免疫原性和临床安全性以及有效性(参见“Scientific Considerations in DemonstratingBiosimilarity to a Reference Product:Guidance for Industry”，美国卫生与公共服务部，食品药品监督管理局，2015年4月)方面将提议的产品和参考产品进行比较。蛋白质产品可需要的结构表征数据的示例包括一级结构(即氨基酸序列)、二级结构(即形成α螺旋或β折叠结构的折叠程度)、三级结构(即通过折叠多肽骨架和二级结构域而产生的蛋白质的三维形状、和四级结构(例如，形成活性蛋白质复合物所需的亚基数量，或蛋白质的聚集状态)。在许多情况下，在不使用费力、费时且昂贵的技术(例如X射线晶体学)的情况下，可能无法获得此信息。因此，需要一种实验技术，其允许方便、实时和相对高通量表征蛋白质结构，以用于建立候选生物药物和参考药物之间的生物相似性。

在一些实施方式中，出于建立生物相似性的目的，所公开的方法、装置和系统可以用于提供生物候选药物(例如单克隆抗体(mAb))和参考生物药物的结构比较数据。例如，在一些情况下，候选药物和参考药物的等电点数据和/或质谱数据可提供支持生物相似性的证明的重要证据。在一些实施方式中，已经在相同反应条件下均已用位点特异性蛋白酶处理过的候选药物和参考药物的等电点数据和/或质谱数据可以提供支持生物相似性的证明的重要证据。在一些实施方式中，所公开的方法、装置和系统可用于监测生物药物生产过程，以通过分析在生产过程的不同点抽取的样品或从不同生产运行中抽取的样品来确保产品的质量和一致性。在一些实施方式中，所公开的方法、装置和系统可用于评价制剂缓冲液的稳定性。在一些实施方式中，所公开的方法、装置和系统可用于评价克隆细胞系的生物药物候选物的生产和质量。

实施例

提供这些实施例仅出于说明目的，并不限制本文提供的权利要求书的范围。

实施例1-进行质谱分析前芯片上蛋白质电荷的表征

图1中所示的微流体装置的制造在上面已经进行了描述。为了操作，将装置安装在仪器上，该仪器含有氮气源、加热器、正压泵(例如，Parker，T5-1IC-03-1EEP)、终止于两个铂-铱电极(例如，Sigma-Aldrich，357383)的电泳电源(Gamm High Voltage，MC30)、UV光源(例如，LED，qphotonics，UVTOP280)、CCD相机(例如，ThorLabs，340UV-GE)和用于将样品装载到装置上的自动进样器。电源与质谱仪共享一个共同的接地。该仪器通过软件(例如，LabView)进行控制。

将蛋白质样品与两性电解质pH梯度和pI标志物预先混合，随后置入小瓶中并装载到自动进样器上。该混合物经由入口412从自动进样器连续地装载到微流体装置400上，穿过富集通道418并且通过出口434离开装置前往废物通道430。

将鞘流体/阴极电解液流体(50％MeOH，N₄OH/H₂O)装载到两个阴极电解液孔404、436上，将阳极电解液(10mM H₃PO₄)装载到阳极电解液孔426上，并将加热氮气源附接至两个气体孔408、440。

在装载所有试剂后，通过将电极连接至阳极电解液孔426和阴极电解液孔404、436来施加从阳极电解液孔426到阴极电解液孔404、436的+600V/cm电场，从而启动等电聚焦。UV光源对准富集通道418下方，并且相机置于富集通道418上方以测量穿过富集通道418的光，从而借助聚焦蛋白的吸光度来检测聚焦蛋白。由钠钙玻璃构成的玻璃板402用于为相机阻挡任何杂散光，因此不通过富集通道418的光被阻止到达相机，提高了测量的灵敏度。

可以在IEF期间连续和/或周期性地捕获聚焦蛋白的图像。当聚焦完成时，将会从入口412施加低压，使pH梯度朝着孔口424移动。此时可以维持电场以维持高分辨率IEF分离。在ESI过程期间继续对富集通道418进行成像可用于确定每种蛋白质当从孔口424排出时的pI。

当富集的蛋白质级分从富集通道418移动至汇合处420中时，其将会与鞘流体混合，该鞘流体可以经由鞘流体/阴极电解液流体通道406、438从阴极电解液孔404、436流向汇合处420。将富集的蛋白质级分与鞘流体混合可以将该蛋白质级分放入与质谱相容的溶液中，并使聚焦蛋白质恢复电荷(IEF使蛋白质变成无电荷状态)，从而改善电离。

然后，富集的蛋白质级分继续前往孔口424，孔口424可以由玻璃板402的埋头表面422限定。富集的蛋白质级分一旦被捕获在鞘流体孔地面与质谱仪负极之间的电场中就可以产生泰勒锥。

当溶液继续从富集通道418推进泰勒锥时，流体的小液滴将会从泰勒锥排出并飞向质谱仪入口。氮气(例如，在150℃下)可以从气体孔408、440向下流过气体通道410、432并且形成在泰勒锥侧面的氮气射流，该氮气射流可以在从泰勒锥发散的液滴离开微流体装置之前将其转化成细雾，这可以有助于质谱仪中的检测。调节来自入口412的压力可以根据需要调节泰勒锥大小以改善质谱仪中的检测。

实施例2-跟踪分析物峰离开微流体芯片并进入质谱仪时的速度

对于此实施例，图7A中的微流体通道网络100是在250微米厚的不透明环状烯烃聚合物层中制造的。通道112的深度为250微米，因此一直切穿250微米的层。所有其他通道的深度均为50微米。如图7B所示，通道层被夹在环状烯烃聚合物的两个透明层之间，以制造平面微流体装置。端口102、104、106、108和110提供到通道网络的进入，用于从外部容器引入试剂并进行电接触。端口102连接至真空源，使通道103作为废物通道，从而使其他试剂通过通道网络灌注为“废物”。酸(1％甲酸)通过端口108灌注到通道109、112、114和103中，并出来到端口102。样品(4％Pharmalyte 3-10，12.5mM pI标准物3.38(纯化的肽，序列：Trp-Asp-Asp-Asp)，12.5mM pI标准物10.17(纯化的肽，序列：Trp-Tyr-Lys-Arg)，NIST单克隆抗体标准物(部件号8671，NIST))通过端口106灌注到通道107、112、114和103中，并出来到端口102。这留下含有样品分析物的通道112。碱(1％二甲胺)通过端口104灌注到通道105、114和103中，并出来端口102。迁移剂(1％甲酸，49％甲醇)通过端口110灌注到通道111、114和103中，并通过通道103出来到端口102。

通过向端口108施加4000V并将端口110接地对通道112中的分析物样品进行电泳。分析物样品中的两性电解质建立跨越通道112的pH梯度。分离的吸光度成像如下进行：使用与通道112对准的280nm光源，并使用CCD相机测量通过通道112的280光的透射率。软件通过将分离或迁移期间的光透射率与分析物运行之前在没有聚焦分析物的情况下进行的“空白”参考测量值比较来计算吸光度，然后显示通道112的整个长度上每个像素的吸光度。标准物或被聚焦的分析物所在的位置显示为峰，如图9A-图9F所示。

一旦分析物完成聚焦，则捕获最终聚焦的吸光度图像。软件将识别pI标记物的空间位置，并在标记物之间进行内插，以计算聚焦分析物级分峰的pI。此时，控制软件将触发继电器，断开端口110的接地，并将端口104接地，并在连接至端口104的迁移剂容器上设定压力，以建立迁移剂溶液的100nL/min流，其通过孔104进入通道105和114，并在孔口116处从芯片出来。孔口116位于距质谱仪ESI入口的2mm处，其中入口电压为-3500V至-4500V。

当压力驱动的流将迁移剂从端口104引导到孔口116时，迁移剂中的一些甲酸将以甲酸盐的形式从通道105电泳，通过通道112到达端口108处的阳极。甲酸盐穿过通道112时将扰乱等电pH梯度，导致两性电解质、标准物和分析物样品增加电荷，并通过电泳从通道112迁移到通道114，在此来自端口110的压力驱动的流从孔口116出来将其带入ESI喷雾。

在发生迁移时，软件继续捕获吸光度图像，并识别峰，跟踪其从成像通道112到通道114中的迁移。通过跟踪每个峰离开成像通道112的时间，其速度和在通道114中的流速，软件可以计算峰穿过通道114通过孔口116被引入质谱仪的时间，从而使原始聚焦峰与所得质谱之间具有直接相关性。

图9A-图9F提供了一系列吸光度迹线的示例，以1分钟为间隔，示出了根据分离通道的图像确定的等电点(pI)标准物的迁移。图9A示出了在迁移之前，完成五个pI标准物(峰915、920、925、930、935)的等电聚焦后，吸光度910作为通道距离905的函数的曲线图。如图9B所示，在迁移1分钟后，对应于pI＝9.99标准物的峰915位于成像系统的视野边缘。如图9C所示，在迁移2分钟后，峰915(pI＝9.99标准物)已离开正在成像的通道部分。如图9D所示，在迁移3分钟后，峰920(pI＝8.40标准物)已离开正在成像的通道部分。如图9E所示，在迁移4分钟后，峰925(pI＝7.00标准物)已离开正在成像的通道部分。如图9F所示，在迁移5分钟后，峰930(pI＝4.05标准物)已离开正在成像的通道部分。

实施例3-使用反馈来调整MS和ESI参数

在实施例3中，芯片、仪器和软件执行与实施例2中所有相同的程序。此外，如图8所示，第二CCD相机用于在ESI期间对泰勒锥成像。这些图像用于评价泰勒锥的质量和一致性。在质谱仪上评价图像和/或总数允许识别ESI泰勒锥故障并诊断原因。

ESI中泰勒圆锥的形成取决于保持进入圆锥体的输入流，该输入流与流失到蒸发和ESI的流体的速率相匹配。泰勒锥的大小取决于流速、微流体装置与MS之间的电压梯度、微流体装置与MS之间的距离以及微流体装置ESI尖端的细微变化和局部环境。

泰勒锥的成像允许诊断ESI故障的原因。例如，泰勒锥的损失表示流量不足，软件可以增加迁移剂进入微流体装置的流量。同样，日冕放电表明电压过高，软件可以降低电压。ESI云的膨胀表示电压太高，而形成液滴却不是泰勒锥则表示电压太低。这些差异，以及任何其他视觉差异，可以在图像中识别，并且软件可以自动补偿以重建泰勒锥。

实施例4-低质量扫描作为分离标记物

在实施例4中，芯片、仪器和软件执行与实施例2中所有相同的程序。此外，一旦发生迁移并且分析物峰开始迁移至MS，则将MS设置为在1500-6000和150-1500的m/z范围之间交替。1500-6000范围用于当NIST抗体分析物级分峰引入到MS中时对其进行识别。150-1500m/z范围扫描用于当游离溶液两性电解质(Pharmalytes)引入质谱仪时对其进行识别。两性电解质可以在质谱扫描中识别，并用于校准来自MS的总离子色谱分析，因为特定两性电解质的存在定义了在任何时间点在MS中分析的等电pH梯度的部分。

实施例5-改变高压和低压以保持电场强度和尖端电压恒定

对于该实施例，图7A中的微流体通道网络100是在250微米厚的不透明环状烯烃聚合物层中制造的。通道112的深度为250微米，因此一直切穿250微米的层。所有其他通道的深度均为50微米。如图7B所示，通道层被夹在环状烯烃聚合物的两个透明层之间，以制造平面微流体装置。端口102、104、106、108和110提供到通道网络的进入，用于从外部容器引入试剂并进行电接触。端口102连接至真空源，允许通道103作为废物通道，从而使其他试剂通过通道网络灌注为“废物”。酸(1％甲酸)通过端口108灌注到通道109、112、114和103中，并出来到端口102。样品(4％Pharmalyte 3-10，12.5mM pI标准物3.38(纯化的肽，序列：Trp-Asp-Asp-Asp)，12.5mM pI标准物10.17(纯化的肽，序列：Trp-Tyr-Lys-Arg)，NIST单克隆抗体标准物(部件号8671，NIST))通过端口106灌注到通道107、112、和114中，并出来到端口102。这留下含有样品分析物的通道112。碱(1％二甲胺)通过端口104灌注到通道105、114和103中，并出来到端口102。迁移剂(1％甲酸，49％甲醇)通过端口110灌注到通道110、114和103中，并通过通道102出来到端口102。将压力施加到基础容器，以产生100nL/min的流量，其通过端口104进入通道105和114，并从孔口116出来。

通过使用电源1005将2000V施加到端口108，并将端口110连接到高压电源1010并施加-2000V，来启动通道112中的分析物样品的等电聚焦。这建立了如图10A所示的电路，其包括高压电源1005和高压电源1010(在一些情况下，电源1005和电源1010可以包括单个多路高压电源的两个通道)，以在阳极和阴极之间产生4000V的电压降。通道的电阻取决于通道的尺寸和试剂的电导率。在该实施例中，对应于通道109(参见图7A)的酸通道的电阻R109为10兆欧，对应于通道112(参见图7A)的样品通道的电阻R112始于40兆欧，并且对应于通道111(参见图7A)的碱通道的电阻R111为50兆欧。孔口116(参见图7A)与质谱仪1015之间的电喷雾电离(ESI)接口的电阻R113为2千兆欧。通道109、112和111(参见图7A)上的总压降为4000V，并且由于这些通道代表三个串联的电阻，因此根据等式1计算尖端处的电压(V₁₁₆)：

V₁₁₆＝ΔV_108-110*(R₁₁₁)/(R₁₀₉+R₁₁₂+R₁₁₁)+(高压电源1010电压设置)。

在等电聚焦开始时，V₁₁₆＝0伏。孔口116(参见图7A)位于距质谱仪ESI入口2mm处，其中入口电压为-3500V至-4500V，以形成泰勒锥。图10B示出了图10A所呈现的电路的另一个实施方式，其包括通道105的电阻R105。

分析物样品中的两性电解质建立跨越通道112的pH梯度。使用与通道112对准的280nm光源，并用CCD相机测量280nm光通过通道112的透射率，进行分离的吸光度成像。软件通过将分离或迁移期间的光透射率与分析物运行之前在没有聚焦分析物的情况下进行的“空白”参考测量值进行比较来计算吸光度，然后显示通道112的整个长度上每个像素的吸光度。标准物或被聚焦的分析物的位置显示为峰，如图9A-图9F所示。

当样品聚焦时，随着两性电解质、抗体同工型和标准物到达其等电点并失去其电荷，样品通道112的电阻增加，而通道109和111中以及在ESI接口处的电阻保持不变。计算机实现的方法监测电源1005处的电流，并且可以计算通道112中任何时间点的电阻。该计算机实现的方法使用此信息来调整电源1005和1010。例如，当通道112中的电阻已攀升至140兆欧时，如果未调整电源，则孔口116处的电压将为-1000V，这将破坏泰勒锥。然而，通过将电源1005调整为+3000V，并且将电源1010调整为-1000V，尖端将保持在0V，并且跨通道109、112和111的总压降将保持在4000V。这些调整是在通道112中的电阻变化时动态进行的。

一旦分析物完成聚焦，则捕获最终聚焦的吸光度图像。软件将识别pI标记物的空间位置，并在标记物之间进行内插，以计算聚焦分析物级分峰的pI。此时，控制软件将触发继电器，断开端口110处的电源1010，并将端口104连接至电源1010，以及在连接至端口104的迁移剂容器上设定压力，以建立迁移剂溶液的100nL/min流，其通过孔104进入通道105和114，并在孔口116处从芯片出来(参见图7A中的芯片示意图和图10B中所示的电路)。孔口116位于距质谱仪ESI入口2mm处，其中入口电压为-3500V至-4500V。

当压力驱动的流将迁移剂从端口104引导到孔口116时，迁移剂中的一些甲酸将以甲酸盐的形式从通道105电泳，通过通道112到达端口108处的阳极。当甲酸盐穿过通道112时将扰乱等电pH梯度，导致两性电解质、标准物和分析物样品增加电荷，并通过电泳从通道112迁移到通道114，在此来自端口110的压力驱动的流从孔口116出来将其带入ESI喷雾。

当发生迁移时，通道112的电阻将下降。图11A-图11B示出了通道112的电压和电流数据的示例，这可以用于导出通道的电阻。图11A示出了电压作为时间的函数的曲线图。图11B示出了电流作为时间的函数的曲线图。软件监测电流的变化，并调整电源以保持阳极和阴极之间的电压降为3000V和保持尖端116处为0V，如图15所示。电压变化可以是瞬态的或稳定的。

在发生迁移时，软件继续捕获吸光度图像，并识别峰，跟踪其从成像通道112到通道114中的迁移。通过跟踪每个峰离开成像通道112的时间、其速度和在通道114中的流速，软件可以计算峰穿过通道114通过孔口116被引入质谱仪的时间，从而使原始聚焦峰与所得质谱之间具有直接相关性。

图13A提供了在化学迁移期间图7A所示的微流体装置的代表性电路图，其中使用额外的电阻器R120将ESI尖端保持在正电压，以将电流吸收到地。该电路可以包括可以基本上类似于1005的高压电源1305和可以基本上类似于1010的高压电源1310，以在阳极和阴极之间产生指定的电压降(例如4000V)。该电路还可以包括第三高压电源1307。通道的电阻取决于通道的尺寸和试剂的电导率。还集成在电路中的是对应于通道109(参见图7A)的酸通道的电阻R109，对应于通道112(参见图7A)的样品通道的电阻R112和对应于通道111(参见图7A)的碱通道的电阻R111，以及孔口116(参见图7A)与质谱仪1315(其可以基本上类似于1015)的电源之间的电喷雾电离(ESI)接口的电阻R113。电路105也可包括通道105的电阻R105。电源1307可连接至通道111(参见图7A)，并在迁移期间使用设置为0μA的电流控制。该电源可以读取尖端的电压，并用于实现计算机控制的反馈回路，以保持尖端处的恒定电压。

图13B示出了在化学迁移期间图7A所示的微流体装置的代表性电路图，其中使用电阻器R120将ESI尖端保持在正电压，以将电流吸收到电源1320。图13C示出了在化学迁移期间图7A所示的微流体装置的代表性电路图，其中使用场效应晶体管(FET)1325将ESI尖端保持在正电压，以吸收电流。电路还可以包括放大器1330、电压参考部1335和附加电阻器R200。图13D示出了在化学迁移期间图7A所示的微流体装置的代表性电路图，其中使用双极结型晶体管(BJT)1340将ESI尖端保持在正电压，以吸收电流。电源1307可以连接至通道111(参见图7A)，并使用设置为0μA的电流控制。该电源可以读取尖端处的电压，并用于实现计算机控制的反馈回路，以保持尖端处的恒定电压。图13E提供了在分离的分析物混合物的化学迁移期间图7A所示的微流体装置的代表性电路图，其中ESI尖端将被保持接地或接近接地。电源1307可以连接至通道111(参见图7A)，并使用设置为0μA的电流控制。该电源可以读取尖端处的电压，并用于实现计算机控制的反馈回路，以保持尖端处的恒定电压。

实施例6-基于测量尖端电压，改变高压和低压以保持电场强度和尖端处的恒定电压

对于该实施例，图7A中的微流体通道网络100是在250微米厚的不透明环状烯烃聚合物层中制造的。通道112的深度为250微米，因此一直切穿250微米的层。所有其他通道的深度均为50微米。如图7B所示，通道层被夹在环状烯烃聚合物的两个透明层之间，以制造平面微流体装置。端口102、104、106、108和110提供到通道网络的进入，用于从外部容器引入试剂并进行电接触。端口102连接至真空源，允许通道103作为废物通道，从而使其他试剂通过通道网络灌注为“废物”。酸(1％甲酸)通过端口108灌注到通道109、112、114和103中，并出来到端口102。样品(4％Pharmalyte 3-10，12.5mM pI标准物3.38(纯化的肽，序列：Trp-Asp-Asp-Asp)，12.5mM pI标准物10.17(纯化的肽，序列：Trp-Tyr-Lys-Arg)，NIST单克隆抗体标准物(部件号8671，NIST))通过端口106灌注到通道107、112和114中，并出来到端口102。这留下含有样品分析物的通道112。碱(1％二甲胺)通过端口104灌注到通道105、114和103中，并出来到端口102。迁移剂(1％甲酸，49％甲醇)通过端口110灌注到通道110、114和103中，并通过通道102到端口102(参见图7A的芯片示意图和图13E所示的电路)。

通过使用电源1305向端口108施加1500V并将端口110连接至电源1307(设置为0V)来启动通道112中分析物样品的电泳。5分钟后，将电源1305增加到3000V，持续3分钟以完成聚焦。

分析物样品中的两性电解质建立跨越通道112的pH梯度。使用与通道112对准的280nm光源，并用CCD相机测量280光通过通道112的透射率，进行分离的吸光度成像。软件通过将分离或迁移期间的光透射率与分析物运行之前在没有聚焦分析物的情况下进行的“空白”参考测量值比较来计算吸光度，然后显示通道112的整个长度上每个像素的吸光度。标准物或已聚焦的分析物所在的位置显示为峰，如图9A-图9F所示。

一旦分析物完成聚焦，则捕获最终聚焦的吸光度图像。软件将识别pI标记物的空间位置，并在标记物之间进行内插，以计算聚焦分析物级分峰的pI。此时，控制软件将触发继电器，将端口104连接至电源1310，以及在连接至端口104的迁移剂容器上设定压力，以建立迁移剂溶液的100nL/min流，其通过孔104进入通道105和114中，并在孔口116处从芯片出来。孔口116位于距质谱仪ESI入口1315的2mm处，其中入口电压为-3500V至-4500V。使用电流控制将电源1307设置为0μA，将电源1305设置为3000V，并且将电源1310设置为0V，并且将MS ESI离子源设置为-3500V至-4500V。

当压力驱动的流将迁移剂从端口104引导到孔口116时，迁移剂中的一些甲酸将以甲酸盐的形式从通道105电泳，通过通道112到达端口108处的阳极。甲酸盐穿过通道112时将扰乱等电pH梯度，导致两性电解质、标准物和分析物样品增加电荷，并通过电泳从通道112迁移到通道114，在此来自端口110的压力驱动的流从孔口116出来将其带入ESI喷雾。

当发生迁移时，通道112的电阻将下降。设置为0μA的电源1307将等于图13E中V116的电压，因为跨通道111的电压降现在为0(ΔV＝IR＝0*R111＝0V)。如图11A-图11B的数据所示，在聚焦完成后的8分钟(480秒)，软件监测电流变化，并调整电源，以在阳极和阴极之间保持3000V的恒定电压降并在尖端116处保持0伏，如图15所示。尖端处的电压(V116)由等式2表示：

V₁₁₆＝ΔV_108-110*(R₁₁₁)/(R₁₀₉+R₁₁₂+R₁₀₅)+(电源1310电压设置)。

在发生迁移时，软件继续捕获吸光度图像，并识别峰，跟踪其从成像通道112到通道114中的迁移。通过跟踪每个峰离开成像通道112的时间、其速度和在通道114中的流速，软件可以计算峰穿过通道114通过孔口116被引入质谱仪的时间，从而使原始聚焦峰与所得质谱之间具有直接相关性。

实施例7-基于测得的尖端电压和电阻，改变高压和低压以保持电场强度和在尖端处的恒定电压

对于该实施例，图7A中的微流体通道网络100是在250微米厚的不透明环状烯烃聚合物层中制造的。通道112的深度为250微米，因此一直切穿250微米的层。所有其他通道的深度均为50微米。如图7B所示，通道层被夹在环状烯烃聚合物的两个透明层之间，以制造平面微流体装置。端口102、104、106、108和110提供到通道网络的进入，用于从外部容器引入试剂并进行电接触。端口102连接至真空源，允许通道103作为废物通道，从而使其他试剂通过通道网络灌注为“废物”。酸(1％甲酸)通过端口108灌注到通道109、112、114和103中，并出来到端口102。样品(4％Pharmalyte 3-10，12.5mM pI标准物5.52(纯化的肽，序列：Trp-Glu-His)，12.5mM pI标准物8.4(纯化的肽，序列：Trp-Tyr-Lys)，英夫利昔单抗生物类似物单克隆抗体标准物(部件号MCA6090，Bio-rad)通过端口106灌注到通道107、112和114中，并出来到端口102。这留下含有样品分析物的通道112。碱(1％二甲胺)通过端口104灌注到通道105、114、103中，并出来到端口102。迁移剂(1％甲酸，49％甲醇)通过端口110灌注到通道110、114和103中，并通过通道102出来到端口102(参见图7A的芯片示意图和图13B所示的电路)。

通过使用电源1305向端口108施加1500V并将端口110连接至电源1307(设置为0V)来启动通道112中分析物样品的电泳。5分钟后，将电源1305增加到3000V。

分析物样品中的两性电解质建立跨越通道112的pH梯度。使用与通道112对准的280nm光源，并用CCD照相机测量280nm光通过通道112的透射率，进行分离的吸光度成像。软件通过将分离或迁移期间的光透射率与分析物运行之前在没有聚焦分析物的情况下进行的“空白”参考测量值比较来计算吸光度，然后显示通道112的整个长度上每个像素的吸光度。标准物或已被聚焦的分析物所在的位置显示为峰，如图9A-图9F所示。

一旦分析物已经完成聚焦，英夫利昔单抗的电荷变体就被分离，如图16A所示，并且捕获最终聚焦的吸光度图像。软件将识别pI标记物的空间位置，并在标记物之间进行内插，以计算聚焦分析物级分峰的pI。此时，控制软件将触发继电器，将端口104连接至电源1310，以及在连接至端口104的迁移剂容器上设定压力，以建立迁移剂溶液的100nL/min流，其通过孔104进入通道105和114，并在孔口116处从芯片出来。孔口116位于距质谱仪ESI入口1315的2mm处。使用电流控制将电源1307设置为0μA，将电源1305设置为7000V，将电源1310设置为4000V，并且将MS ESI离子源1315保持接地。附加电阻器R120连接至电源1310和通道105之间的系统(R电流吸收器)，并且电阻R120的另一端连接至电源1320，如图13B所示。为了充当电流吸收器，电源1320将被设置为至少比电源1310少4000V。电阻器R120可以替代地将电路接地(如在图13A中)，可以是如图13C所示的场效应晶体管(FET)，可以是如图13D所示的双极结型晶体管(BJT)，或任何其他可以从电源1310吸收电流以产生功能性电泳电路的电阻元件。

当压力驱动的流将迁移剂从端口104引导到孔口116时，迁移剂中的一些甲酸将以甲酸盐的形式从通道105电泳，通过通道112到达端口108处的阳极。甲酸盐穿过通道112时将扰乱等电pH梯度，导致两性电解质、标准物和分析物样品增加电荷，并通过电泳从通道112迁移到通道114，在此来自端口110的压力驱动的流从孔口116出来将其带入ESI喷雾。

当发生迁移时，通道112的电阻将下降。设置为0μA的电源1307将等于V116的电压，因为通道111两端的电压降现在为0(ΔV＝IR＝0*R111＝0V)。如图11A和图11B的数据所示，软件监测电流的变化，并调整电源，以在阳极和阴极之间保持恒定的电压降3000V，并在尖端116处保持3000伏，如图12所示。尖端处电压(V116)由等式2表示：

V₁₁₆＝ΔV_108-110*(R₁₁₁)/(R₁₀₉+R₁₁₂+R₁₀₅)+(电源1310电压设置)。

在发生迁移时，软件继续捕获吸光度图像，并识别峰，跟踪其从成像通道112到通道114中的迁移。通过跟踪每个峰离开成像通道112的时间、其速度和在通道114中的流速，软件可以计算峰穿过通道114通过孔口116被引入质谱仪的时间，从而使原始聚焦峰与所得质谱之间具有直接相关性。例如，图16B示出了电喷雾到质谱仪中的糖型质量，所述糖型包含在图16A所示的电泳图的酸性峰中。图16C示出了来自图16A的主要英夫利昔单抗峰中的糖型质量。图16D和图16E示出了图16A所示的电泳图中碱性峰的质量。

实施例8-改变高压和低压以保持电场强度和两步毛细管IEF中的恒定电压

在实施例8中，在60cm的毛细管中进行两步IEF(等电聚焦，然后迁移)，并通过接合喷雾器迁移到ESI-MS中，如图14A所概示。将分离毛细管1808浸入阳极电解液小瓶1806中。高压电源1802通过电极1804连接至阳极电解液小瓶1806。毛细管1808的另一端通过三通管接头1812连接至接合喷雾器1814。毛细管1808插入接合喷雾器1814中，因此毛细管出口紧靠ESI尖端1824。三通管接头1812的第三臂连接至浸入在加压迁移剂小瓶1818中的迁移毛细管1816。加压迁移剂小瓶1818也通过电极1817接地，因此其可以用作电流吸收器。此外，接合喷雾器1814通过电线1820连接至电源1810，电线1820连接至喷雾器1814的外部。在该实施例中，质谱仪离子源保持接地。

试剂制备如下。阳极电解液小瓶1806中充有1％的甲酸水溶液，分离毛细管1808中充有水性样品(250μg/mL NIST mAb，1.5％Pharmalyte 5-8两性电解质，1.5％Pharmalyte8-10.5，5mg/mL pI标准物7.00和10.17)，接合喷雾器腔室1826和迁移剂毛细管1816中充有1％的二乙胺水溶液，并且在加压的迁移剂小瓶1818中充有1％的甲酸、50％的乙腈和49％的水。

在该实施例中，质谱仪离子源保持接地。为了引发聚焦，将电源1802设置为+30kV，将电源1810设置为4kV。来自迁移剂小瓶1818的压力驱动流以100nL/min引发。以此方式，在接合喷雾器腔室1826中使用二乙胺来引发ESI，并且二乙胺也用作等电聚焦步骤的阴极电解液。

随着聚焦在毛细管1808中的进行，样品失去了载电荷能力并且在毛细管1808中电阻增加。由于ESI尖端电定位在毛细管1808和在腔室1826中的二乙胺之间(参见图14B)，因此ESI尖端电压(V₁₈₂₄)将根据等式3下降：

V₁₈₂₄＝ΔV_1806-1814*R₁₈₂₆/(R₁₈₀₈+R₁₈₂₆)+V₁₈₁₄

此外，随着毛细管1808中电阻的增加，通过毛细管的电流将减小，这可以在电源1802处测量。增加的电流将通过等式4与毛细管1808的电阻变化直接相关：

I₁₈₀₆＝ΔV_1806-1814/(R₁₈₀₈+R₁₈₂₆)

使用如图12中描述的计算机控制的反馈回路，系统可以计算毛细管1808中的电阻变化(并且因此，计算毛细管1808上的电压降的变化，其限定了ESI尖端1824处的电压)，系统可以调整电源1802和1810以保持ΔV为26kV，并保持ESI尖端电压为4000kV。

在聚焦完成后(～30分钟)，加压迁移剂小瓶1818中的迁移剂溶液将已替换接合喷雾器腔室1826中的二乙胺，从而引发NIST mAb蛋白同工型在毛细管1808中的迁移。以类似的方式，但与等电聚焦相反，随着迁移的进行，毛细管1808中的电阻将下降，从而影响ESI尖端1824处的电压。计算机控制的反馈回路再次将使用等式3和等式4来计算电源1802和1810的必要变化，以保持26kV的电场，同时将ESI尖端1824电压保持在4kV。

尽管本文已经示出和描述了本发明的优选实施方式，但是对于本领域技术人员显而易见的是，仅通过示例的方式提供了这样的实施方式。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员现在将想到许多变化、改变和替换。应当理解，在实践本发明时，可以以任何组合使用本文所述的本发明的实施方式的各种可替选方案。所附权利要求旨在限定本发明的范围，并且由此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同方案。

Claims (72)

1.一种用于在进行分离反应时将电喷雾电离(ESI)尖端相对于接地保持在恒定电压的方法，所述方法包括：

a)向分离通道的近端施加第一电压，其中所述分离通道的远端与所述ESI尖端流体连通和电连通；

b)向辅助流体通道的近端施加第二电压，其中所述辅助流体通道的远端与所述分离通道的所述远端流体连通和电连通；

c)进行所述分离反应以分离分析物的混合物，其中所述分离反应在所述分离通道内进行；以及

d)在反馈回路中监测所述分离通道的电阻变化或所述ESI尖端处的电压变化，所述反馈回路调整所述第一电压和所述第二电压以保持跨所述分离通道的恒定电压降和所述ESI尖端处的恒定电压。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述分离通道是毛细管的内腔。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述毛细管包括微瓶喷雾尖端。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述分离通道是微流体装置内的流体通道。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述分离反应包括等电聚焦反应。

6.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述分离反应包括电泳分离反应。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中将所述第一电压施加在阴极，并且将所述第二电压施加在阳极。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中将所述ESI尖端处的所述电压保持为接地。

9.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中将所述ESI尖端处的所述电压保持在所述第二电压。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中对所述第一电压和所述第二电压的所述调整包括从所述第一电压和所述第二电压减去在所述ESI尖端处测得的瞬态电压变化。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中使用提供所述第一电压或所述第二电压的电源来测量所述ESI尖端处的所述电压。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述反馈回路以至少0.1Hz的频率操作。

13.根据权利要求1至11中的任一项所述的方法，其中所述反馈回路以至少10Hz的频率操作。

14.根据权利要求1至13中的任一项所述的方法，其中所述反馈回路将所述ESI尖端处的所述电压保持在预设值的±10％以内。

15.根据权利要求1至13中的任一项所述的方法，其中所述反馈回路将所述ESI尖端处的所述电压保持在预设值的±1％以内。

16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述反馈回路将跨所述分离通道的所述电压降保持在预设值的±10％以内。

17.根据权利要求1至15中的任一项所述的方法，其中所述反馈回路将跨所述分离通道的所述电压降保持在预设值的±1％以内。

18.一种方法，包括：

a)提供包括两种或更多种分析物的混合物的样品；

b)在含有所述样品的流体通道内进行分离，以从两种或更多种分析物的所述混合物中分辨各个分析物峰；

c)在所述流体通道的内容物向流体通道出口迁移时，计算分析物峰的速度；以及

d)使用所述分析物峰的所述速度来确定所述分析物峰到达所述流体通道出口的时间。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述流体通道是毛细管的内腔。

20.根据权利要求18所述的方法，其中所述流体通道是微流体装置的一部分。

21.根据权利要求18至20中任一项所述的方法，其中所述分离基于等电聚焦(IEF)、毛细管区带电泳(CZE)、毛细管凝胶电泳(CGE)、毛细管等速电泳(CITP)或胶束电动色谱(MEKC)。

22.根据权利要求18至21中任一项所述的方法，其中根据所述分析物峰从第一位置移动至第二位置所需的时间间隔来计算所述分析物峰的所述速度。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述第一位置、第二位置和时间间隔是根据所述流体通道的一系列两个或更多个图像确定的。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述一系列两个或更多个图像包括紫外光吸光度图像、可见光吸光度图像或荧光图像。

25.根据权利要求18至24中任一项所述的方法，其中所述流体通道出口包括与质谱仪对接的电喷雾接口。

26.根据权利要求18至25中任一项所述的方法，其中所述分析物峰到达所述流体通道出口的所述时间用于将质谱仪数据与所述分析物峰相关联。

27.根据权利要求18至26中任一项所述的方法，其中所述流体通道内容物的所述迁移包括使用电渗迁移技术、化学迁移技术、流体动力学迁移技术或其任何组合。

28.根据权利要求18至27中任一项所述的方法，其中所述两种或更多种分析物包括蛋白质、蛋白质-药物缀合物、肽、核酸分子、碳水化合物分子、脂质分子、代谢物分子、小的有机化合物或其任何组合。

29.根据权利要求26至28中任一项所述的方法，其中对质谱仪数据进行的比较用于确定生物相似性，所述质谱仪数据是为生物候选药物和参考药物的样品所收集。

30.根据权利要求18至29中任一项所述的方法，其中在反馈回路中使用所述分析物峰的所述速度来调整所述分析物峰的所述分离或迁移的控制参数。

31.根据权利要求30所述的方法，其中所述控制参数是电压。

32.根据权利要求30或31所述的方法，其中所述反馈回路以至少0.1Hz的频率操作。

33.一种方法，包括：

a)提供包括两种或更多种分析物的混合物的样品；

b)在含有所述样品的流体通道内进行分离，以从两种或更多种分析物的所述混合物中分辨各个分析物峰；以及

c)收集质谱仪数据，所述质谱仪数据是通过与质谱仪对接的电喷雾接口从所述流体通道发射的所述两个或更多个各个分析物峰的质谱仪数据；其中用于所述质谱仪的数据收集模式在高质量扫描和低质量扫描之间交替进行。

34.根据权利要求33所述的方法，其中所述质谱仪以至少0.5Hz的频率在所述高质量扫描和低质量扫描数据收集模式之间切换。

35.根据权利要求33或34所述的方法，其中所述流体通道是毛细管的内腔。

36.根据权利要求33或34所述的方法，其中所述流体通道是微流体装置的一部分。

37.根据权利要求33至36中任一项所述的方法，其中所述分离基于等电聚焦(IEF)、毛细管区带电泳(CZE)、毛细管凝胶电泳(CGE)、毛细管等速电泳(CITP)或胶束电动色谱(MEKC)。

38.根据权利要求33至37中任一项所述的方法，其中所述高质量扫描捕获生物大分子的质谱数据。

39.根据权利要求39所述的方法，其中所述生物大分子包括蛋白质、蛋白质-药物缀合物、核酸分子、还原蛋白、融合蛋白、蛋白质复合物或其任何组合。

40.根据权利要求33至39中任一项所述的方法，其中所述高质量扫描的m/z比在1500至6000的范围内。

41.根据权利要求33至40中任一项所述的方法，其中所述低质量扫描捕获用于进行等电聚焦分离的溶液相两性电解质的质谱数据。

42.根据权利要求33至42中任一项所述的方法，其中所述低质量扫描的m/z比在150至1500的范围内。

43.根据权利要求41至42中任一项所述的方法，其中一种或多种溶液相两性电解质的所述质谱用于校准在所述高质量扫描中识别的生物大分子的等电点(pIs)。

44.一种方法，包括：

a)在含有样品的流体通道内进行分离，其中所述样品包括两种或更多种分析物的混合物，并且其中所述分离从两种或更多种分析物的所述混合物中分辨各个分析物峰；

b)使所述流体通道的内容物向流体通道出口迁移，其中所述流体通道出口包括与质谱仪对接的电喷雾接口；以及

c)对以下进行同时或交替成像：(i)所述流体通道的至少一部分，以监测在(a)和(b)期间分析物峰的位置，以及(ii)存在于所述流体通道出口和所述质谱仪的入口之间的泰勒锥，以监测电喷雾性能。

45.根据权利要求44所述的方法，其中所述流体通道的至少一部分的两个或更多个图像中的所述分析物峰的所述位置用于计算所述分析物峰的速度。

46.根据权利要求45所述的方法，其中所述分析物峰的所述速度用于确定所述分析物峰将到达所述流体通道出口的时间。

47.根据权利要求46所述的方法，其中所述分析物峰到达所述流体通道出口的所述时间用于将质谱仪数据与所述分析物峰相关联。

48.根据权利要求44至47中的任一项所述的方法，其中从所述泰勒锥的所述成像导出的数据被用在反馈回路中，以调整电喷雾性能。

49.根据权利要求48所述的方法，其中所述反馈回路以至少0.1Hz的频率操作。

50.根据权利要求44至49中任一项所述的方法，其中所述流体通道是毛细管的内腔。

51.根据权利要求44至49中任一项所述的方法，其中所述流体通道是微流体装置的一部分。

52.根据权利要求44至51中任一项所述的方法，其中所述分离基于等电聚焦(IEF)、毛细管区带电泳(CZE)、毛细管凝胶电泳(CGE)、毛细管等速电泳(CITP)或胶束电动色谱(MEKC)。

53.根据权利要求44至52中任一项所述的方法，其中所述成像包括紫外光吸光度成像、可见光吸光度成像或荧光成像。

54.根据权利要求44至53中任一项所述的方法，其中所述流体通道内容物的所述迁移包括使用电渗迁移技术、化学迁移技术、流体动力学迁移技术或其任何组合。

55.根据权利要求44至54中任一项所述的方法，其中所述两种或更多种分析物包括蛋白质、蛋白质-药物缀合物、肽、核酸分子、碳水化合物分子、脂质分子、代谢物分子、小的有机化合物或其任何组合。

56.一种用于在进行分离反应时将电喷雾电离(ESI)尖端相对于接地保持在恒定电压的计算机实现的方法，所述方法包括：

a)使用处理器接收所述ESI尖端处的电压的第一测量值，其中所述分离通道的远端与所述ESI尖端流体连通和电连通；

b)使用所述处理器接收所述ESI尖端处的所述电压的第二测量值；

c)使用所述处理器对所述第二测量值与所述第一测量值进行比较，其中如果所述第二测量值与所述第一测量值不同，则所述处理器使得对在所述分离通道的近端处的电压以及在辅助流体通道的近端处的电压进行调整，以使得在所述ESI尖端处的所述电压返回到所述第一测量值，其中所述辅助流体通道包括与所述分离通道的所述远端流体连通和电连通的远端；以及

d)以指定的频率重复步骤(a)至(c)。

57.根据权利要求56所述的计算机实现的方法，其中所述分离通道包括毛细管的内腔或微流体装置内的流体通道。

58.根据权利要求56或57所述的计算机实现的方法，其中所述分离反应包括等电聚焦反应。

59.根据权利要求56或57所述的计算机实现的方法，其中所述分离反应包括电泳分离反应。

60.根据权利要求56至59中的任一项所述的计算机实现的方法，其中将所述ESI尖端处的所述电压保持为接地。

61.根据权利要求56至60中任一项所述的计算机实现的方法，其中所述指定的频率是至少1Hz。

62.根据权利要求56至61中的任一项所述的计算机实现的方法，其中将所述ESI尖端处的所述电压保持在指定值的±5％以内。

63.一种计算机实现的方法，包括：

a)使用处理器接收图像数据，所述图像数据包括使用检测器获取的两个或更多个图像，所述检测器被配置为对毛细管或微流体装置中的全部或部分分离通道进行成像；

b)使用相同或不同的处理器处理所述图像数据，以在所述两个或更多个图像中确定所述分离通道内的分析物峰的位置；

c)使用相同或不同的处理器，基于所述两个或更多个图像中所述分析物峰的所述位置以及所述两个或更多个图像的获取之间的已知时间间隔来计算所述分析物峰的速度；以及

d)使用相同或不同的处理器确定所述分析物峰将到达分离通道出口的时间。

64.根据权利要求63所述的计算机实现的方法，其中在所述分离通道内进行的分离反应包括等电聚焦(IEF)、毛细管区带电泳(CZE)、毛细管凝胶电泳(CGE)、毛细管等速电泳(CITP)或胶束电动色谱(MEKC)。

65.根据权利要求63或权利要求64所述的计算机实现的方法，其中所述两个或更多个图像包括紫外光吸光度图像、可见光吸光度图像或荧光图像。

66.根据权利要求63至65中任一项所述的计算机实现的方法，其中所述分离通道出口和与质谱仪对接的电喷雾接口流体连通或包括与质谱仪对接的电喷雾接口。

67.根据权利要求63至66中任一项所述的计算机实现的方法，其中所述分析物峰到达所述分离通道出口的所述时间用于将质谱仪数据与所述分析物峰相关联。

68.根据权利要求63至67中任一项所述的计算机实现的方法，其中所述分析物从混合物中分离并且包括蛋白质、蛋白质-药物缀合物、肽、核酸分子、碳水化合物分子、脂质分子、代谢物分子或小的有机化合物。

69.根据权利要求63至68中任一项所述的计算机实现的方法，其中对为生物候选药物和参考药物的样品收集的质谱仪数据进行的比较用于确定生物相似性。

70.根据权利要求63至69中任一项所述的计算机实现的方法，其中在反馈回路中使用所述分析物峰的所述速度来调整在所述分离通道中进行的分离反应的控制参数。

71.根据权利要求70所述的计算机实现的方法，其中所述控制参数是电压。

72.根据权利要求70或71所述的计算机实现的方法，其中所述反馈回路以至少0.1Hz的频率操作。

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