CN111505094A - 一种基于等电聚焦电泳的食品饲料种属溯源鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基于等电聚焦电泳的食品饲料种属溯源鉴定方法，对食品饲料水溶性蛋白进行IEF分离，因不同水溶性蛋白种类、等电点和含量存在差异，其IEF图谱具有特征，并且由于一些蛋白相对保守，其对应氨基酸序列、pIs及图谱保守恒定，因此，通过一次IEF，并与数据库中种属蛋白pIs及其图谱对比，实现食品饲料种属溯源鉴定。本发明具有以下优点：简洁快速与低成本；普适性，包括高度怀疑样本和未知样本；通用性，包括但不限于家畜、家禽、淡水水产、海产品和植物食品鉴定，及动物植物源饲料种属溯源分析；结合质谱和蛋白转印，本发明可用于不同置信度的种属鉴定核定。

Description

一种基于等电聚焦电泳的食品饲料种属溯源鉴定方法

技术领域

本发明属于食品饲料检测技术领域，具体涉及一种基于等电聚焦电泳的食品饲料种属溯源鉴定方法。

背景技术

家禽类、家畜、内河水产品、海鲜、乳品、豆制品等为人类提供丰富的可食用蛋白质食品[Luo,J.,Taylor,C.,Nebl,T.,Ng,K.,Bennett,L.E.,Food Chem.2018,254,292–301；Ciobanu,D.,Bastiaansen,J.,Malek,M.,Helm,J.,Woollard,J.,Plastow,G.,Rothschild,M.,Genetics.2001,159,1151–1162.]。因营养价值和养殖成本的差异，以上食品成本差异很大、价格波动很大。导致市场上各种肉类和乳品等食品掺杂掺假事件时有发生，以次充好的现象屡禁不止，成为人们日益关注的焦点[GIRISH P S,ANJANEYULU AS R,VISWAS K N.,Meat Science,2005,70(1):107-112]；并且，不同来源的肉食品长导致人的流行病。如2002年在亚洲爆发SARS源自果子狸冠状病毒(https://www.who.int/csr/sars/en/)，1981年在美国首先发现的艾滋病源自大猩猩的HIV病毒(https://en.wikipedia.org/wiki/HIV)，1918年发源于美国的西班牙大流感源自猪流感病毒(https://en.wikipedia.org/wiki/ Spanish_flu)。因此食品种属溯源显得非常重要。不仅如此，动物来源的饲料(如猪肉粉、牛肉粉、牛肉骨粉、鱼粉、鱼排骨、水解羽毛粉等)需要种属溯源，防止同类种属来源的饲料引起潜在的饲养动物的传染病感染，导致饲养动物发生瘟疫。

现阶段食品饲料种属溯源的鉴别方法众多，包括传统的感官鉴别、分子生物学、免疫方法学等。其中，感官判别受人为因素和外界环境干扰较大，远不能鉴别肉食品种类及肉类的真假，可作为辅助手段应用(崔小平.畜牧与饲料科学,2013(4)：76)。分子生物学PCR技术虽然能够准确的鉴定食品饲料的真实性。如专利CN104946790A公开了一种溯源鉴定8种动物源性成分的PCR方法，可以在一次PCR反应中同时检测山羊、绵羊、水牛、家牛、猪、鹿、骆驼和牦牛共8种动物源性成分的引物及操作过程的分子鉴定技术，以及包含上述引物的试剂盒和应用方法。但是其步骤的繁琐性、昂贵的操作费用、缺少普适性和通用性使其不能广泛的应用[Camm C.,Ddidomenico M.,Monaco F.,Food Control,2012,23(2):400-404.]。免疫学方法(如酶联免疫吸附分析，ELISA)也常用于种属鉴定。虽然灵敏性较高，但是也存在一些弊端，如特异性抗体难制备且存在交叉等[Demse M.,Smith R.,Food Techn.,1995,(2):116-119.]，尤其无法对无线索样本进行普适性种属鉴定。因此，亟待建立简便迅速、高效敏锐、普适通用的食品饲料种属溯源鉴别方法。

发明内容

本发明的目的就是为了解决上述问题而提供一种基于等电聚焦电泳的食品饲料种属溯源鉴定方法，来实现不同食品饲料种属溯源简便迅速、高效敏锐、普适通用的鉴定。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种基于等电聚焦电泳的食品饲料种属溯源鉴定方法，该鉴定方法为：

对标准食品饲料的水溶性蛋白进行等电聚焦电泳，得到其标准pIs及IEF电泳图谱，形成数据库；

对待测的食品饲料样本中的水溶性蛋白进行等电聚焦电泳，得到对应的pIs及IEF电泳图谱；

然后与数据库中的标准pIs及IEF电泳图谱比对，实现食品饲料种属溯源的鉴定分析。

本发明鉴定原理为，因不同种属来源的食品饲料的水溶性蛋白种类、含量和等电点(isoelectric points,pIs)及其图谱具有一定差异，这些蛋白进化相对保守，其对应氨基酸序列和pIs及图谱保守恒定，因此，通过一次IEF实验，并与数据库中每种物种pIs及其图谱对比，实现食品饲料种属溯源的通用鉴定分析。二种和二种以上种属的混合食品饲料，其pIs及其图谱为相应单独种属食品饲料pIs及图谱的复合。

优选地，所述水溶性蛋白包括血红蛋白、肌红蛋白、乳蛋白、大豆蛋白及细胞色素。

优选地，所述食品饲料样本为各种组织样本，包括但不限于块状肌肉组织、骨骼组织、肉糜肉圆、肉饼肉松、乳品流体、植物种子、羽毛毛发、饲料肉粉、碾碎骨粉、骨肉粉、骨排粉，样本重量为0.05-20g。

优选地，所述的水溶性蛋白采用等电聚焦电泳分离，包括但不限于整柱成像分析的微阵列IEF、柱端在线检测毛细管IEF、整柱成像分析的毛细管IEF、芯片IEF、固化pH梯度胶条IEF、基于聚丙烯酰氨凝胶IEF。

优选地，所述的水溶性蛋白采用等电聚焦电泳分离，其中的IEF进样技术包括但不限于适合于微阵列IEF、毛细管IEF和固化pH梯度IEF的整柱进样；适合于毛细管IEF、芯片IEF和聚丙烯酰氨凝胶IEF的柱端进样；适合于固定化pH梯度IEF的进样杯进样。

优选地，IEF采用递进式电场增加，即起始低电场脱盐，中间过程采用递进式电场增加，最后采用高电场形成清晰pIs区带。

优选地，所述食品饲料样本的萃取剂包括但不限于纯水、低盐水溶液、低浓度缓冲液、非变性去污剂、含蛋白增溶剂的水溶液、含蛋白解链剂的巯基乙醇，或者它们的任意混合，萃取剂的添加量为样本重量的0.5-20倍，萃取时间为10min-12h。

优选地，所述的低盐水溶液包括但不限于氯化钠、氯化钾、碘化钠、硝酸钠以及它们的混合溶液，盐含量在2％；

所述的低浓度缓冲液包括但不限于pH 5～9Tris-HCl缓冲液、PBS缓冲液、Tris-Gly缓冲液，浓度在200mM；

所述的非变性去污剂包括但不限于CHAPS，浓度在20wt％；

所述的蛋白增溶剂包括但不限于盐酸胍、硫脲、尿酸，浓度在8.0M；

所述蛋白解链剂包括但不限于beta-巯基乙醇、二硫苏糖醇、三(2-羧乙基)膦，浓度在200mM。

优选地，配置的进样溶液包括提取的1.0～5.0mg/mL蛋白、0.2～3％pH 3.0～10梯度载体两性电解质、1％无机盐、100mM缓冲液、5％非变性去污剂、8M蛋白增溶剂以及5％蛋白解链剂。

优选地，IEF分离的蛋白区带直接切除下来，经生物质谱测序和Western blotting鉴定，进一步验证IEF鉴定食品饲料品种属溯源。

与现有技术相比，本发明具有以下显著优点：

第一，与现有分子生物学技术PCR鉴定方法相比，本发明的鉴定方法具有普适性和通用性，既适合于怀疑样本鉴定，也满足未知样本鉴定。因基于DNA特征片段的拷贝放大，PCR技术具有特异性强、灵敏度高、检测通量高等优点。正因为这一点，对于未知食品饲料种属的鉴定，PCR技术存在明显的瓶颈，如在一次PCR中，不可能设计满足所有种属的PCR引物，造成假阴性。另外，由于灵敏度极高，一丁点异源种属样本污染就容易造成PCR结果的假阳性。而本发明能够有效避免这些问题，能够成为肉食品种属鉴定的普适性方法，既适合于怀疑样本的鉴定，也满足未知样本的鉴定。

第二，与传统PCR和生物质谱技术相比，本发明具有条件要求低、操作简便快速、成本低的优点。PCR技术需要专门的样本组织裂解、专门的核酸提纯、PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳分离、在线荧光成像分析等复杂操作，前后操作时间需要天左右，需要专门的生物学实验室，且试剂成本昂贵。生物质谱技术能够较好解决种属溯源鉴定，但存在仪器对环境要求高、仪器设备昂贵、蛋白酶解试剂昂贵等问题。而本发明只需提取食品饲料水溶性蛋白，包括Mb、Hb和细胞色素等，离心后直接上样、5-30分钟IEF，最后是在线整柱成像分析，前后在2小时以内。且能够实现样本提取、上样和IEF电泳的自动化、高通量及简便快速。

第三，结合生物质谱和蛋白转印鉴定，本发明即可用于食品饲料种属鉴定快速鉴定，包括但不限于一般置信度的种属鉴定和高置信度的种属鉴定。由于所述的水溶性蛋白在进化上相对保守，其对应动物种属的氨基酸序列保守恒定，对应pIs及图谱保守恒定。因此，通过一次IEF实验，并与数据库中每种食品饲料pIs及其图谱对比，建立食品饲料种属溯源的通用方法；从而通过一次IEF电泳分析，实现种属溯源的鉴定分析。如果存在怀疑，可以在IEF基础上进行生物质谱甚至蛋白转印鉴定，测定蛋白氨基酸序列和抗原性，进一步核对鉴定的结果，做到高置信度的鉴定分析。

附图说明

图1为基于水溶性蛋白(Mb和Hb species)IEF技术的家畜食品种属鉴定原理示意图；

插图A：猪肌肉组织水溶性蛋白提取样本IEF电泳pIs区带及图谱；插图B：黄牛肌肉组织水溶性蛋白提取样本IEF电泳pIs区带及图谱；插图C：水牛肌肉组织水溶性蛋白提取样本IEF电泳pIs区带及图谱；

图2为基于水溶性蛋白(Mb和Hb species)IEF技术的家畜食品种属鉴定原理示意图；

插图A：绵羊肌肉组织水溶性蛋白提取样本IEF电泳pIs区带及图谱；插图B：山羊肌肉组织水溶性蛋白提取样本IEF电泳pIs及图谱；插图C：马肌肉组织水溶性蛋白提取样本IEF电泳pIs区带及其图谱；

图3为基于水溶性蛋白(Mb和Hb species)IEF技术的家禽食品种属鉴定原理示意图；

插图A：鹅肌肉组织色素蛋白提取样本IEF电泳pIs区带及图谱；插图B：鸡肌肉组织水溶性蛋白提取样本IEF电泳pIs区带及图谱；插图C：鸭肌肉组织水溶性蛋白提取样本IEF电泳pIs区带及图谱；

图4为基于水溶性蛋白(Mb和Hb species)IEF技术的动物源饲料种属鉴定原理示意图；

插图A：进口鱼骨粉水溶性蛋白提取样本IEF电泳pIs区带及图谱；插图B：国产鱼骨粉水溶性蛋白提取样本IEF电泳pIs区带及图谱；插图C：水解羽毛粉水溶性蛋白提取样本IEF电泳pIs区带及图谱；

图5为图1-4中的各中不同种属样本水溶性蛋白的pIs及其图谱汇总；

图6为基于水溶性蛋白聚焦分离的食品饲料种属鉴定流程示意图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

一、IEF样本前处理

实施例1-1

新鲜肌肉组织水溶性蛋白提取(与微阵列、毛细管和芯片IEF兼容)

与微阵列、毛细管和芯片IEF兼容的肌肉组织样本水溶性蛋白的提取方法，其样本前处理包括但不限于如下操作：

(1)从冰箱取出-20℃冷冻保存的肌肉组织，称取0.2克，碾碎，加入1毫升Eppendorf离心管，加纯水500微升，冰水浴中放置10分钟；

(2)提取的离心管放置离心机中，在7500g和4℃条件下离心15分钟；

(3)离心后，用移液枪从离心管中吸取淡红色的上清液，即为新鲜肌肉组织样本水溶性蛋白的提取液；

(4)上清液置于4℃冰箱中备用，最好三天内用于IEF分离；或置于-80℃超低温冰箱中长期保存备用。

实施例1-2

水解羽毛粉水溶性蛋白提取(与微阵列、毛细管和芯片IEF兼容)

与微阵列、毛细管和芯片IEF兼容的牛骨粉水溶性蛋白的提取方法，其样本前处理包括但不限于如下操作：

(1)从冰箱取出-20℃冷冻保存的水解羽毛粉组织，取20克，在榨汁机中打碎10分钟，之后在130℃烘箱中烘烤至不失重为止，记录失重量；

(2)从烘烤后的样本中称取0.5克，加入2毫升Eppendorf离心管，7M尿素的水溶液1000微升，室温放置180分钟；

(3)提取的离心管放置离心机中，在7500g和4°条件下离心15分钟；

(4)离心后，用移液枪从离心管中吸取淡红色的上清液，即为水解羽毛粉样本水溶性蛋白的提取液；

(5)上清液置于4℃冰箱中备用，最好三天内用于IEF分离；或置于-80℃超低温冰箱中长期保存备用。

实施例1-3

鱼骨粉水溶性蛋白提取(与微阵列、毛细管和芯片IEF兼容)

与微阵列、毛细管和芯片IEF兼容的鱼骨粉水溶性蛋白的提取方法，其样本前处理包括但不限于如下操作：

(1)从冰箱取出-20℃冷冻保存的鱼骨粉组织，取20克，在榨汁机中打碎10分钟，之后在130℃烘箱中烘烤至不失重为止，记录失重量；

(2)从烘烤后的样本中称取0.5克，加入2毫升Eppendorf离心管，7M尿素的水溶液1000微升，室温放置180分钟；

(3)提取的离心管放置离心机中，在7500g和4°条件下离心15分钟；

(4)离心后，用移液枪从离心管中吸取淡红色的上清液，即为鱼骨粉组织样本水溶性蛋白的提取液；

(5)上清液置于4℃冰箱中备用，最好三天内用于IEF分离；或置于-80℃超低温冰箱中长期保存备用。

实施例1-4

豆奶或牛奶水溶性蛋白提取(与微阵列、毛细管和芯片IEF兼容)

与微阵列、毛细管和芯片IEF兼容的豆奶或牛奶水溶性蛋白的提取方法，其样本前处理包括但不限于如下操作：

(1)取100微升豆奶或牛奶，加入1毫升Eppendorf离心管，加500微升乙醇，在-20℃冰箱中过夜，沉淀蛋白；

(2)提取的离心管放置离心机中，在18000g和4°条件下离心20分钟；

(3)离心后，用移液枪从离心管中分离掉上清液，沉淀用低浓度碳酸铵盐水溶解，即为豆奶或牛奶样本水溶性蛋白的提取液；

(4)上清液置于4℃冰箱中备用，最好三天内用于IEF分离；或置于-80℃超低温冰箱中长期保存备用。

实施例1-5

新鲜肌肉组织水溶性蛋白提取(与传统IEF兼容)

与传统IEF兼容的肌肉组织样本水溶性蛋白的提取方法，其样本前处理包括但不限于如下操作：

(1)从冰箱取出-20℃冷冻保存的肌肉组织，称取2克，加入15毫升离心管，加纯水2000微升，在离心管中碾碎15分钟；

(2)之后将离心管放置与冰浴中萃取水溶性蛋白，自然沉淀肌肉纤维；

(3)提取的离心管放置离心机中，在8500g和4℃条件下离心60分钟；

(4)上清液转入另一个2毫升的Eppendorf离心管，在21000g和4°条件下离心30分钟；

(5)离心后，用移液枪从离心管中吸取淡红色的上清液，即为新鲜肌肉组织样本水溶性蛋白的提取液；

(6)上清液置于4℃冰箱中备用，最好三天内用于传统IEF分离；或置于-80℃超低温冰箱中长期保存备用。

二、IEF进样模式

实施例2-1

微阵列IEF的水化进样方法

基于微阵列IEF的种属溯源的鉴定方法，其进样包括但不限于如下操作：

(1)从冰箱取出-20℃冷冻保存的微阵列IEF(15mm×600μm×50μm，pH梯度4～9)胶条，于室温放置10分钟；

(2)对于微阵列IEF胶条的水化液，总体积为15μL，其中包含1–5微升提取蛋白溶液，甘油2.5微升(30％v/v)，40％pH4–9载体两性电解质(CA)0.187微升(0.5％v/v)，7–11微升超纯水；

(3)混合样本，将混匀的样品溶液均匀的加入到阵列进样盘中，在室温(37℃)按顺序放置微阵列胶条样品，水化25分钟，进行水化上样。

实施例2-2

传统等电聚焦电泳胶条的进样方法

基于传统IEF的种属溯源的鉴定方法，其进样包括但不限于如下操作：

(1)从冰箱取出-20℃冷冻保存的pH4-9IEF(70mm×3mm×0.1mm)胶条，于室温放置10分钟；

(2)沿着水化盘中槽的边缘从左至右线性加上样液，在槽两端各1cm左右，不要加样，中间的样品溶液连贯；

(3)每个IEF胶条水化进样液包含：25微升(20％，v/v)甘油、50微升水溶性蛋白样品液，1.6微升40％pH4-9载体两性电解质(0.5％，v/v)，补充超纯水到总体积125微升；

(4)混匀样本液，吸取100微升样本，均匀地添加到水化进样槽中间部分；

(5)用镊子去除胶条上薄的、不带“+”符号的保护层，将胶条胶面朝下放置于水化盘中样品溶液上，注意正负极，保证胶条下面没有气泡产生，盖上盖子放置10分钟，缓慢加入适量矿物油覆盖胶条，室温保持12小时水化上样。

实施例2-3

毛细管或芯片IEF的进样方法

基于毛细管或芯片IEF的种属溯源鉴定方法，其进样包括但不限于如下步骤：

(1)从冰箱取出4℃冷藏保存的40％pH4-9的载体两性电解质，于室温放置30分钟平衡；

(2)对于毛细管和芯片IEF进样，总体积为30微升，其中包含2–10微升提取水溶性蛋白，甘油5.0微升(30％v/v)，40％pH4–9载体两性电解质(CA)1.5微升(2.0％v/v)，最后加超纯水至总体积30微升；

(3)将样品溶液混匀，加入毛细管IEF样本盘中，设置仪器自动压力和时间进样，开启电压，进样直到电流达到最大值，即完成了毛细管或芯片IEF整柱进样。

三、等电聚焦电泳

实施例3-1

微阵列IEF电泳过程

基于微阵列IEF的种属溯源的鉴定方法，其聚焦过程包括但不限于如下步骤：

(1)等电聚焦胶条水化处理后，将微阵列胶条放入阵列IEF芯片中，盖上齿状压框，并加入3mL冷却液；

(2)然后将芯片放置在微阵列IEF仪器中，使阴极和阳极的末端分别连接到电源的阴极和阳极；

(3)按照正确的顺序放置芯片后，施加电场：25V10分钟低压除盐，50V10分钟高压除盐，100V5分钟IEF分离，200V5分钟在IEF分离，400V5分钟再IEF分离，最后600V持续8分钟；

(4)除盐运行20分钟及IEF分离运行16分钟后，启动仪器的自动在线成像分析系统，对每根IEF微阵列胶条实现自动成像检测；

(5)根据IEF图谱，检测待分析样品混合物中各蛋白pIs及其图谱。

实施例3-2

毛细管IEF电泳过程

基于毛细管IEF的种属溯源鉴定方法，其聚焦过程包括但不限于如下步骤：

(1)选取毛细管(内径50微米，总长23厘米，有效长度18厘米)，设置检测器：紫外光280nm(用于无色蛋白)或可见420nm(用于色素蛋白)，设定20℃下进行聚焦分离；

(2)对毛细管进行活化，涂布控制电渗流，打开毛细管电泳仪检测器，并将以上准备好的样本进行电泳进样或压力进样；

(3)设定预聚焦电压0.7kV持续10分钟除盐，5kV持续4分钟IEF分离，聚焦电压10kV持续6min，采用压力迁移溶液pH梯度，检测器记录得到IEF图谱；

(4)根据IEF图谱，检测待分析样品混合物中各蛋白pIs及其图谱。

实施例3-3

传统等电聚焦电泳过程

基于传统IEF的种属溯源的鉴定方法，电泳过程包括但不限于如下步骤：

(1)IEF胶条水化进样处理后，转移到带有12个通道的聚焦托盘，之后每个通道添加3mL冷却油；

(2)设置IEF条件：冷却温度为10℃，设置程序在75V除盐40分钟，150V聚焦20分钟，300V电压下运行30分钟，然后在在60分钟内以100V为电压间隔，从300V到4000V逐步提高电压梯度，并持续60分钟；

(3)移出IEF胶条，用滤纸吸取冷却液，对胶条上的蛋白区带进行3-4小时的固定、染色和脱色，得到IEF的水溶性蛋白的分离图谱；

(4)扫描IEF水溶性蛋白的图谱，并与标准IEF图谱库对比，实现对待测样本的种属溯源性鉴定。

四、等电点pI测定

实施例4-1

内标法测定pIs值(适合于简单的待测样本)

基于IEF的种属溯源的鉴定方法，其内标法测定pIs包括但不限于如下步骤：

(1)在进行IEF进样前，添加pI标准品于进样样本中，与待测样本一并进行IEF分离，并得到IEF图谱；

(2)从图谱中确定pIs标准品的位置，以多点标准品pIs定位pH与阳极的距离建立pH-区带阳极距离的线性关系；

(3)确定IEF分离后待测样品的蛋白位置，从标准图谱上读出各个蛋白区带的pIs值，以及形成的pIs图谱。

实施例4-2

外标法测定pIs值(适合于复杂的待测样本)

(1)在进行IEF进样前，添加pI标准品于独立的IEF分离胶条中进行进样，添加上述的待测样本水溶性蛋白进样液于另一根独立IEF胶条进行进样；

(2)进样完成后进行上述的IEF电泳运行，在线检测得到IEF图谱；

(3)从图谱中确定pIs标准品的位置，以多点标准品pIs定位pH与阳极的距离建立pH-区带阳极距离的线性关系；

(4)在另一根IEF胶条中确定分离后待测样品的蛋白位置，从标准图谱上读出各个蛋白区带的pIs值，以及形成的pIs图谱。

图1-5为不同种属样本水溶性蛋白的pIs及其图谱汇总，用于样品测试的比对。

五、水溶性蛋白IEF分离后鉴定

实施例5-1

IEF电泳pIs及其图谱鉴定法

基于IEF的食品饲料种属溯源的鉴定方法，其操作包括但不限于如下步骤：

(1)按照以上操作步骤基于IEF分离得到待测样品(如标准鸡肉)水溶性蛋白pIs及其图谱，保存于数据库；

(2)按照以上相同的方式基于相同条件的IEF分离得到待测样本(如待测鸡肉)水溶性蛋白pIs及其图谱；

(3)与标准数据库包括pIs(如6.8、7.04、7.09和7.13)及其含量数据对比，确定判断待测样本的种属溯源，数据库越多越大，判断越全面越准确。

实施例5-2

生物质谱鉴定法

基于IEF的种属溯源的鉴定方法，其操作包括但不限于如下步骤：

(1)切取待测肉类样品的肌肉部分，加入超纯水，研磨后放冰水上静置，离心，吸取上层清液备用；

(2)按照以上相同的方式基于相同条件的IEF分离得到待测样本(如待测鸡肉)水溶性蛋白pIs及其图谱；

(3)在IEF聚焦完成后，进行各个pIs区带切胶酶解，之后送入质谱分析仪中进行生物质谱鉴定，测定水溶性蛋白氨基酸序列，进一步核对种属鉴定的结果，做到高置信度的鉴定分析。

实施例5-3

蛋白转印鉴定法

基于IEF的种属溯源的鉴定方法，参照图6，其操作包括但不限于如下步骤：

(1)切取待测肉类样品的肌肉部分，加入超纯水，研磨后放冰水上静置，离心，吸取上层清液备用；

(2)将步骤(1)中的上层清液根据IEF胶条操作要求进行上样，然后同时进行不少于2根胶条的IEF电泳分离；

(3)IEF分离完成后，将IEF胶条浸泡在度为10％SDS溶液中，浸泡温度为100℃，浸泡时间为10分钟；将浸泡后的IPG胶条粘贴到PVDF膜上，置于滤纸上，吸收IPG凝胶中的溶液，吸收时间为60分钟；

(4)采用电转移将IEF胶条中的聚焦条带转移至PVDF膜上，电转移电流强度为200mA，电转移时间为20min；

(5)用磷酸盐缓冲盐-吐温20将PVDF膜封闭洗涤，封闭时间为60分钟，将PVDF膜在BSA(牛血清蛋白)和PBST(磷酸盐吐温缓冲液)中与Hbβ的初级单克隆抗体或Mb抗体富余孵育，BSA浓度为5％，温度为室温，时间为120分钟，之后洗涤次数为三次，每次洗涤时间为20分钟；

(6)加入二抗IgG-HRP到步骤(b)中得到的PVDF膜上，并将PVDF膜在该溶液中在温育，用PBS-T再次洗涤PVDF膜，使用Odyssey试剂盒进行显色，使用全自动发光/分析系统进行成像；

(7)以鸡肉水溶性蛋白为例，得到抗Mb的WB条带为pIs6.8和pH7.04，得到抗Hb的WB条带为pIs6.8、7.04、7.09和7.13条带；

(8)与标准鸡肉水溶性蛋白IEF标准图谱对比，做出种属溯源鉴定。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于等电聚焦电泳的食品饲料种属溯源鉴定方法，其特征在于，该鉴定方法为，

对标准食品饲料的水溶性蛋白进行等电聚焦电泳，得到其标准pIs及IEF电泳图谱，形成数据库；

对待测的食品饲料样本中的水溶性蛋白进行等电聚焦电泳，得到对应的pIs及IEF电泳图谱；

然后与数据库中的标准pIs及IEF电泳图谱比对，实现食品饲料种属溯源的鉴定分析。

2.根据权利要求1所述的一种基于等电聚焦电泳的食品饲料种属溯源鉴定方法，其特征在于，所述水溶性蛋白包括血红蛋白、肌红蛋白、乳蛋白、大豆蛋白及细胞色素。

3.根据权利要求1所述的一种基于等电聚焦电泳的食品饲料种属溯源鉴定方法，其特征在于，所述食品饲料样本为各种组织样本，包括但不限于块状肌肉组织、骨骼组织、肉糜肉圆、肉饼肉松、乳品流体、植物种子、羽毛毛发、饲料肉粉、碾碎骨粉、骨肉粉、骨排粉，样本重量为0.05-20.0克。

4.根据权利要求1所述的一种基于等电聚焦电泳的食品饲料种属溯源鉴定方法，其特征在于，所述的水溶性蛋白采用等电聚焦电泳分离，包括但不限于整柱成像分析的微阵列IEF、柱端在线检测毛细管IEF、整柱成像分析的毛细管IEF、芯片IEF、固化pH梯度胶条IEF、基于聚丙烯酰氨凝胶IEF。

5.根据权利要求4所述的一种基于等电聚焦电泳的食品饲料种属溯源鉴定方法，其特征在于，所述的水溶性蛋白采用等电聚焦电泳分离，其中的IEF进样技术包括但不限于适合于微阵列IEF、毛细管IEF和固化pH梯度IEF的整柱进样；适合于毛细管IEF、芯片IEF和聚丙烯酰氨凝胶IEF的柱端进样；适合于固定化pH梯度IEF的进样杯进样。

6.根据权利要求5所述的一种基于等电聚焦电泳的食品饲料种属溯源鉴定方法，其特征在于，IEF采用递进式电场增加，即起始低电场脱盐，中间过程采用递进式电场增加，最后采用高电场形成清晰pIs区带。

7.根据权利要求5所述的一种基于等电聚焦电泳的食品饲料种属溯源鉴定方法，其特征在于，所述食品饲料样本的萃取剂包括但不限于纯水、低盐水溶液、低浓度缓冲液、非变性去污剂、含蛋白增溶剂的水溶液、含蛋白解链剂的巯基乙醇，或者它们的任意混合，萃取剂的添加量为样本重量的0.5-20倍，萃取时间为10分钟-12小时。

8.根据权利要求7所述的一种基于等电聚焦电泳的食品饲料种属溯源鉴定方法，其特征在于，所述的低盐水溶液包括但不限于氯化钠、氯化钾、碘化钠、硝酸钠以及它们的混合溶液，盐含量在2％以下；

所述的低浓度缓冲液包括但不限于pH 5～9Tris-HCl缓冲液、PBS缓冲液、Tris-Gly缓冲液，浓度在200mM；

所述的非变性去污剂包括但不限于CHAPS，浓度在20wt％；

所述的蛋白增溶剂包括但不限于盐酸胍、硫脲、尿酸，浓度在8.0M；

所述蛋白解链剂包括但不限于beta-巯基乙醇、二硫苏糖醇、三(2-羧乙基)膦，浓度在200mM。

9.根据权利要求8所述的一种基于等电聚焦电泳的食品饲料种属溯源鉴定方法，其特征在于，配置的进样溶液包括提取的1.0～5.0mg/mL蛋白、0.2～3％pH3.0～10梯度载体两性电解质、1％无机盐、100mM缓冲液、5％非变性去污剂、8M蛋白增溶剂以及5％蛋白解链剂。

10.根据权利要求1所述的一种基于等电聚焦电泳的食品饲料种属溯源鉴定方法，其特征在于，IEF分离的蛋白区带直接切除下来，经生物质谱测序和Western blotting鉴定，进一步验证IEF鉴定食品饲料品种属溯源。

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