CN104764787A - 快速测定蛋白混合物中的各组分含量的毛细管等电聚焦方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速测定蛋白混合物中的各组分含量的毛细管等电聚焦方法，包括：1）将两性载体、添加剂、等电点标记物与待分析的蛋白混合物样品进行混合，形成混合液；2）将混合液上样于毛细管柱，聚焦并检测，得到等电聚焦谱图；3）将步骤2）的等电聚焦谱图与待分析的蛋白混合物样品中的单蛋白组分等电聚焦谱图进行比对，确定步骤2）的等电聚焦谱图中不同等电点范围对应的单蛋白组分；4）根据步骤3）的比对结果和步骤2）的等电聚焦谱图信息，确定待分析的蛋白混合物样品中的各组分含量。本发明具有通用性强、分析周期短、数据处理简单等优点，而且适用于蛋白混合物的生产工艺开发和质量控制。
Description
技术领域
本发明涉及一种快速测定蛋白混合物中的各组分含量的方法，特别是涉及一种快速测定蛋白混合物中的各组分含量的毛细管等电聚焦方法。
背景技术
单克隆抗体药物在治疗肿瘤和自体免疫疾病等领域都具有显著的优势，但对于靶点较为复杂的疾病，如感染性疾病或涉及体内多个靶点的疾病则有一定的局限性。
复合抗体药物(antibody mixture or antibody cocktail)是一类由两种或多种单克隆抗体组成的药物，它由一系列确定的、充分表征的单克隆复合抗体药物组成，这些单克隆抗体在序列、靶点和结合活性上都具有充分的多样性，能够模拟人体免疫系统产生的一系列抗体，因而在治疗复杂靶点疾病上具有明显的优势。由于其组成上的复杂性，复合抗体药物的生产工艺开发和质量控制均有较大的挑战。
在复合抗体药物的质量控制中，各单克隆抗体组分的含量是保证产品的药效、安全性和批间重复性的重要指标。由于各单克隆抗体通常具有较高比例的同源序列，其分子量、分子结构和理化性质非常接近，常用的多数分析方法如体积排阻色谱、毛细管凝胶电泳等方法均无法区分这些不同的单克隆抗体组分，因而不适用于复合抗体药物的组成和含量分析这一目的。等电点是单克隆抗体的固有性质之一，不同的单克隆抗体由于氨基酸组成、序列和空间结构不同，等电点通常具有明显的差异，因而可以利用不同单克隆抗体的等电点差异对其进行分离和定量。Symphogen公司采用阳离子交换色谱法（F.Wiberg,S.Rasmussen et al.Production of target-specific recombinant human polyclonal antibodies in mammalian cells.Biotechnology and Bioengineering.Vol.94,No.2,2006；T.Frandsen,H.Naested et al.Consistentmanufacturing and quality control of a highly complex recombinant polyclonal antibody product forhuman therapeutic use.Biotechnology and Bioengineering.Vol.108,No.9,2011）和液质联用法（P.Persson,A.et al.Techniques for the identification and determination of compositionalvariability in recombinant polyclonal antibody products.Analytical Chemistry,Vol.82,No.17,2010）对几种复合抗体药物中的各组分含量进行了测定。阳离子交换色谱法利用不同等电点的抗体在特定pH值下所带正电荷数的不同对其进行分离和定量，能够反映不同样品中各组分含量的一致性，但分析时间较长，且样品中组分较多时可能出现两种组分无法分离的情况。液质联用法通过检测各单克隆抗体的轻链含量来反映各单克隆抗体组分的含量，其专属性较强，但样品需经还原、轻重链分离等处理后才能上样分析，步骤较为繁琐，且质谱分析的成本较高。因此，开发新的复合抗体药物组成分析方法是非常必要的。
毛细管等电聚焦是近年来基于平板等电聚焦和毛细管电泳技术发展而来的分析方法，它利用毛细管中灌注的一系列不同等电点的两性电解质混合物在电场下形成的pH梯度，根据蛋白质或其他待分析物等电点的差异对其进行分离，其分离精度可达到0.1个pH单位，并克服了平板等电聚焦操作复杂、无法实现自动化、无法准确测定电荷异质体含量等缺点，因而被广泛应用于单克隆抗体产品的等电点测定和电荷异质体含量分析。与离子交换色谱相比，毛细管等电聚焦具有分析时间短、样品消耗量小、通用性强等优势，其单个样品分析时间通常是离子交换色谱的1/4，单次测试样品消耗量通常是离子交换色谱的1/10左右，且对一些电荷异质性较为复杂的样品如融合蛋白样品具有更好的分离效果。
尽管毛细管等电聚焦已经被广泛应用于单克隆抗体的质量分析，但其应用于复合抗体药物的组成和含量分析还未见报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种快速测定蛋白混合物中的各组分含量的毛细管等电聚焦方法。该方法具有通用性强、分析周期短、数据处理简单等优点，而且适用于蛋白混合物（包括：复合抗体药物）的生产工艺开发和质量控制。
为解决上述技术问题，本发明的测定（快速测定）蛋白混合物中的各组分含量的毛细管等电聚焦方法，包括步骤：
1）将两性载体、添加剂、等电点标记物与待分析的蛋白混合物样品进行混合，形成混合液；
其中，添加剂包括：甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、尿素、甘油、蔗糖中的一种或多种；
2）将步骤1）的混合液上样于毛细管柱，在10～40℃、0.1～1kV/cm下聚焦2～15min，并通过毛细管等电聚焦仪或毛细管电泳仪检测，得到等电聚焦谱图；
3）将步骤2）的等电聚焦谱图与待分析的蛋白混合物样品中的单蛋白组分（各组分）等电聚焦谱图进行比对，确定步骤2）的等电聚焦谱图中不同等电点范围对应的单蛋白组分；
4）根据步骤3）的比对结果和步骤2）的等电聚焦谱图信息，确定待分析的蛋白混合物样品中的各组分含量。
所述步骤1）中，两性载体包括：Pharmalyte2.5-5、Pharmalyte3-10、Pharmalyte4-6.5、Pharmalyte4.2-4.9、Pharmalyte4.5-5.4、Pharmalyte5-6、Pharmalyte5-8、Pharmalyte6.7-7.7、Pharmalyte8-10.5、Servalyt2-4、Servalyt2-9、Servalyt2-11、Servalyt3-4、Servalyt3-5、Servalyt3-6、Servalyt3-7、Servalyt3-10、Servalyt4-5、Servalyt4-6、Servalyt4-7、Servalyt4-9、Servalyt5-6、Servalyt5-7、Servalyt5-8、Servalyt5-9、Servalyt6-7、Servalyt6-8、Servalyt6-9、Servalyt7-9、Servalyt9-11中的一种或多种；两性载体在混合液中的体积范围为1%～10%；
添加剂的浓度范围或用量范围分别为：甲基纤维素或羟丙基甲基纤维素在混合液中的体积浓度为0～50%，尿素在混合液中的浓度为0～8M（即0≤浓度≤8mol/L），甘油在混合液中的体积浓度为0～50%，蔗糖在混合液中的浓度为0～50g/100ml；例如，甲基纤维素或羟丙基甲基纤维素在混合液中的体积浓度a可为0﹤a≤50%，尿素在混合液中的浓度b可为0﹤b≤8M，甘油在混合液中的体积浓度c为0﹤c≤50%，蔗糖在混合液中的浓度d为0﹤d≤50g/100ml。
等电点标记物，包括：ProteinSimple公司提供的小分子等电点标记物、Beckman公司提供的小分子等电点标记物或蛋白等电点标记物；
其中，ProteinSimple公司提供的小分子等电点标记物（小分子标记物系列）包括：pI2.85、pI3.21、pI3.59、pI4.22、pI4.65、pI5.12、pI5.85、pI6.14、pI6.61、pI7.05、pI7.40、pI7.55、pI7.65、pI7.90、pI8.18、pI8.40、pI8.79、pI9.22、pI9.46、pI9.50、pI9.77、pI10.10或pI10.45；
Beckman公司提供的小分子等电点标记物（小分子标记物系列）包括：pI4.1、pI5.5、pI7.0、pI9.5或pI10.0；
蛋白等电点标记物包括：pI2.80的胃蛋白酶原（pepsinogen），pI3.50的淀粉葡萄糖苷酶（amylglucosidase），pI4.25的葡萄糖氧化酶（glucose oxidase），pI4.55的胰蛋白酶抑制剂（trypsin inhibitor），pI5.20的beta-乳球蛋白A（beta-lactoglobulin A），pI5.85的牛碳酸酐酶B[Carbonic anhydrase B(bovine)]，pI6.55的人碳酸酐酶B[carbonic anhydrase B(human)]，pI7.35的肌红蛋白（myoglobin），pI8.15、pI8.45和pI8.65的扁豆凝集素（lentil lectin），pI9.30的胰蛋白酶原（trypsinogen），pI9.45的核糖核酸酶A（ribonuclease A）或pI10.25的细胞色素c（cytochrome c）；
混合液中通常包含两种等电点标记物，其中，一种等电点标记物的等电点高于所有待分析蛋白，另一种等电点标记物的等电点低于所有待分析蛋白。单个小分子等电点标记物在混合液中的体积范围为0.5%～2%，单个蛋白等电点标记物在混合液中的浓度范围为0.01～0.5mg/mL；
待分析的蛋白混合物样品包括：复合抗体药物或多种蛋白的混合物；其中，待分析的蛋白混合物样品在混合液中的浓度范围为0.1～5mg/mL。
所述步骤2）中，毛细管柱包括：ProteinSimple公司的氟涂层(FC)毛细管组件或HT毛细管组件，或Beckman公司的eCAP中性毛细管，或其他带有适当涂层的毛细管。
所述步骤4）中，确定待分析的蛋白混合物样品中的各组分含量的方法，包括：采用峰面积归一化法直接确定或结合消光系数校正确定待分析的蛋白混合物样品中的各组分含量；其中，待分析的蛋白混合物样品中的各组分含量包括：相对含量或绝对含量；
待分析的蛋白混合物样品中的各组分含量为相对含量时，其确定方法为采用峰面积归一化法直接确定或结合消光系数校正确定；
待分析的蛋白混合物样品中的各组分含量为绝对含量时，其确定方法为将待分析的蛋白混合物样品的总浓度乘以各蛋白组分的相对含量，得到各蛋白组分的绝对含量。
本发明能实现以下内容：
1）通过选择合适的实验条件，使待分析的蛋白混合物样品中的各组分实现基线分离，并确定谱图中不同等电点范围对应的单组分；
2）能确定毛细管等电聚焦谱图中各组分响应值（如峰面积）与其相对含量的关联式；
3）基于毛细管等电聚焦的结果，选择合适的方式确定各组分的绝对含量等。
本发明的有益效果如下：
1）首次采用毛细管等电聚焦法对蛋白混合物（包括复合抗体药物）中各组分的相对含量进行测定，开创了新的应用领域；
2）与现有的离子交换色谱法相比，毛细管等电聚焦法的单个样品分析时间通常是离子交换色谱的1/4，单次测试样品消耗量通常是离子交换色谱的1/10左右，大大缩短了测试周期和样品消耗量，能够为蛋白混合物（包括复合抗体药物）的生产工艺开发提供有力的支持，缩短研发进程；
3）等电点是蛋白质的固有性质，毛细管等电聚焦法根据各蛋白组分的等电点差异进行分离，其分离精度可达到0.1个pH单位，因而通用性较强，经简单的方法优化和确认即适用于多种不同组成的蛋白混合物（包括复合抗体药物）的分析。
附图说明
下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细的说明：
图1是混合抗体样品毛细管等电聚焦谱图。其中，横坐标为等电点（pI），纵坐标为吸光度（absorbance）。
具体实施方式
实施例1毛细管等电聚焦法测定混合样品中两种单克隆抗体的相对含量
一、实验条件
根据表1组成配制毛细管等电聚焦上样液，置于ProteinSimple iCE280毛细管等电聚焦仪的自动进样器中，采用氟涂层毛细管组件（ProteinSimple/252701，聚焦和检测区间长度为5cm）进行分析，2000mBar上样100s，室温下1.5kV预聚焦1min，3kV聚焦8min，在280nm下进行检测，采用ChromPerfect软件对图谱进行积分，积分参数见表2。
同时，对混合蛋白样品中的单蛋白组分也进行相同条件下的等电聚焦，得到相应的等电聚焦谱图。单蛋白组分等电聚焦的用量为20μg，其余配比与表1相同。
表1毛细管等电聚焦上样液配比
表2混合抗体样品毛细管等电聚焦积分参数
| 时间 | 事项 |
| 0 | INT-（积分关） |
| 6.5 | INT+（积分开） |
| 9.3 | INT-（积分关） |
| 6.5 | HORZ+（水平基线） |
| 6.5 | COM+（共用基线） |
二、数据分析
混合蛋白样品的毛细管等电聚焦谱图，如图1所示，并通过与混合蛋白样品中的单蛋白组分的等电聚焦谱图进行比对，确定等电点6.5-7.5的峰记为mAb1（第一蛋白），等电点8.5-9.4的峰记为mAb2（第二蛋白）。
mAb1和mAb2的含量之比按照下式计算：
积分可知mAb1的峰面积百分比为47.7%，mAb2的峰面积百分比为52.2%，两者的消光系数分别为1.373和1.484，计算可知其浓度之比为并且与实际配制的浓度比1:1一致，说明本发明非常可靠，具有广泛的应用价值。
Claims (10)
1.一种测定蛋白混合物中的各组分含量的毛细管等电聚焦方法，其特征在于，包括步骤：
1）将两性载体、添加剂、等电点标记物与待分析的蛋白混合物样品进行混合，形成混合液；
其中，添加剂包括：甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、尿素、甘油、蔗糖中的一种或多种；
2）将步骤1）的混合液上样于毛细管柱，在10～40℃、0.1～1kV/cm下聚焦2～15min，并通过毛细管等电聚焦仪或毛细管电泳仪检测，得到等电聚焦谱图；
3）将步骤2）的等电聚焦谱图与待分析的蛋白混合物样品中的单蛋白组分等电聚焦谱图进行比对，确定步骤2）的等电聚焦谱图中不同等电点范围对应的单蛋白组分；
4）根据步骤3）的比对结果和步骤2）的等电聚焦谱图信息，确定待分析的蛋白混合物样品中的各组分含量。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1）中，两性载体包括：Pharmalyte2.5-5、Pharmalyte3-10、Pharmalyte4-6.5、Pharmalyte4.2-4.9、Pharmalyte4.5-5.4、Pharmalyte5-6、Pharmalyte5-8、Pharmalyte6.7-7.7、Pharmalyte8-10.5、Servalyt2-4、Servalyt2-9、Servalyt2-11、Servalyt3-4、Servalyt3-5、Servalyt3-6、Servalyt3-7、Servalyt3-10、Servalyt4-5、Servalyt4-6、Servalyt4-7、Servalyt4-9、Servalyt5-6、Servalyt5-7、Servalyt5-8、Servalyt5-9、Servalyt6-7、Servalyt6-8、Servalyt6-9、Servalyt7-9、Servalyt9-11中的一种或多种；
两性载体在混合液中的体积范围为1%～10%。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1）中，添加剂的用量为：甲基纤维素或羟丙基甲基纤维素在混合液中的体积浓度为0～50%；
尿素在混合液中的浓度为0～8M；
甘油在混合液中的体积浓度为0～50%；
蔗糖在混合液中的浓度为0～50g/100ml。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1）中，等电点标记物，包括：ProteinSimple公司提供的小分子等电点标记物、Beckman公司提供的小分子等电点标记物或蛋白等电点标记物。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述ProteinSimple公司提供的小分子等电点标记物包括：pI2.85、pI3.21、pI3.59、pI4.22、pI4.65、pI5.12、pI5.85、pI6.14、pI6.61、pI7.05、pI7.40、pI7.55、pI7.65、pI7.90、pI8.18、pI8.40、pI8.79、pI9.22、pI9.46、pI9.50、pI9.77、pI10.10或pI10.45；
Beckman公司提供的小分子等电点标记物包括：pI4.1、pI5.5、pI7.0、pI9.5或pI10.0；
蛋白等电点标记物包括：pI2.80的胃蛋白酶原，pI3.50的淀粉葡萄糖苷酶，pI4.25的葡萄糖氧化酶，pI4.55的胰蛋白酶抑制剂，pI5.20的beta-乳球蛋白A，pI5.85的牛碳酸酐酶B，pI6.55的人碳酸酐酶B，pI7.35的肌红蛋白，pI8.15、pI8.45和pI8.65的扁豆凝集素，pI9.30的胰蛋白酶原，pI9.45的核糖核酸酶A或pI10.25的细胞色素c。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述步骤1）中，混合液中包含两种等电点标记物，其中，一种等电点标记物的等电点高于所有待分析蛋白，另一种等电点标记物的等电点低于所有待分析蛋白，并且单个小分子等电点标记物在混合液中的体积范围为0.5%～2%，单个蛋白等电点标记物在混合液中的浓度范围为0.01～0.5mg/mL。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1）中，待分析的蛋白混合物样品包括：复合抗体药物或多种蛋白的混合物；
其中，待分析的蛋白混合物样品在混合液中的浓度范围为0.1～5mg/mL。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤2）中，毛细管柱包括：ProteinSimple公司的氟涂层毛细管组件或HT毛细管组件或Beckman公司的eCAP中性毛细管。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤4）中，确定待分析的蛋白混合物样品中的各组分含量的方法，包括：采用峰面积归一化法直接确定或结合消光系数校正确定待分析的蛋白混合物样品中的各组分含量；
其中，待分析的蛋白混合物样品中的各组分含量包括：相对含量或绝对含量。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于：所述待分析的蛋白混合物样品中的各组分含量为相对含量时，其确定方法为采用峰面积归一化法直接确定或结合消光系数校正确定；
待分析的蛋白混合物样品中的各组分含量为绝对含量时，其确定方法为将待分析的蛋白混合物样品的总浓度乘以各蛋白组分的相对含量，得到各蛋白组分的绝对含量。
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