CN117783517B - 一种表征百日咳毒素成像毛细管等电聚焦电泳方法及应用 - Google Patents
一种表征百日咳毒素成像毛细管等电聚焦电泳方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种表征百日咳毒素成像毛细管等电聚焦电泳方法及应用，其包括：（1）将百日咳毒素样品制备成上样溶液；所述上样溶液中包含：百日咳毒素、尿素、亚氨基二乙酸、精氨酸、两性电解质、等电点标记物、甲基纤维素；（2）对所述上样溶液进行等电聚焦，获得等电聚焦图谱，确定样品中百日咳毒素的等电点。本发明的方法具有样品预处理简单，检测速率高效，专属性、准确度、重复性、中间精密度及耐用性优良等优点，能够应用于百日咳毒素样品稳定性及批间一致性的评价。
Description
技术领域
本发明涉及疫苗检测技术领域，具体涉及一种百日咳毒素等电点的检测方法及其在分析样品稳定性及批间一致性中的应用。
背景技术
百日咳（Pertussis，whooping couge）是一种由百日咳杆菌（Bordetella pertussis）引起的能够严重危害婴幼儿健康的烈性呼吸系统传染病。百日咳在发病早期不易诊断，但极具感染性，具有难以控制传染源及传播途径的特点，故疫苗接种是最理想的防治手段。百日咳杆菌为革兰阴性菌，不仅产生内毒素和外毒素，而且还产生具有不同生物学活性的物质，包括百日咳毒素（Pertussis toxin、PT）、丝状血凝素（Filamentoushaemagglutinin，FHA）、百日咳黏附素（Pertactin，PRN）、百日咳菌毛蛋白(Fimbriae，FIM)、腺苷酸环化酶（Adenylate cyclase toxin，ACT）、气管毒素（Tracheal cytotoxin，TCT）、皮肤坏死毒素（Dermonecrotictoxin，DNT）和脂多糖（Lipopolysacchairide，LPS）等。其中PT、FHA、PRN作为保护性抗原成分，已成为组分无细胞百日咳疫苗（Acelluar pertussisvaccine，APV）及相关联合疫苗研发和生产过程中的主要成分。
PT是百日咳杆菌的主要致病因子，在对机体的致病及免疫等方面都起着重要的作用。PT为A-B型结构的毒素，相对分子质量为117×103，共由5个亚基分别以1：1：1：2：1组成。A原体为S1亚基，具有能够促使淋巴细胞增多、激活胰岛素细胞、增强组胺敏感性、引起CHO细胞聚集等百日咳毒素大部分生物活性。B寡聚体分别由S2-S4、S3-S4双亚基以S5亚基相连接，能够促进PT附着于呼吸道纤毛细胞，并具有介导其进入胞内的功能。
蛋白质作为两性分子，在不同pH环境中氨基酸侧链所带的电荷不同。当处于某一pH时，蛋白质分子的净电荷为零，这一pH称为该蛋白质的等电点（Isoelectric point，pI）。pI是蛋白质的理化常数，取决于蛋白质分子的氨基酸组成和构象。不同蛋白质的pI范围很宽，根据pI的不同可以进行蛋白质的鉴定、分离和表征。pI也能够反映蛋白类药物电荷异质性，可体现蛋白质药物的电荷与空间构象的均一性情况，同时可以利用不同异构体pI的差异对其进行分离和定量分析。目前，蛋白质pI的理论值可根据其氨基酸组成计算获得，而实际值主要采用电泳法测定，主要为等电聚焦技术，其中较常用的平板等电聚焦电泳（Isoelectric focusing electrophoresis，IEF）。近年来，随着毛细管电泳技术的快速发展，毛细管等电聚焦电泳（Capillary isoelectric focusing，CIEF）越来越多地被应用于蛋白质pI的检测及表征。成像毛细管等电聚焦电泳（Imaged capillary isoelectricfocusing，iCIEF）具有聚焦时间短、可实时观察样品聚焦分离情况、能够及时调整聚焦时间和样品浓度等参数及方法重现性优良等优点，故越来越广泛地应用于蛋白质类药物的表征及质量控制。
作为百日咳杆菌的主要致病因子，PT抗原在动物试验和临床试验均具有良好的免疫保护性。作为组分无细胞百日咳疫苗的重要成分，在疫苗生产制备过程中，需对其进行分离纯化及质量控制，但现有的表征方法较单一，常用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析其制备纯度及表观分子量，具有耗时长，灵敏度低，相关试剂对人体毒害性高等不足；IEF常用于测定蛋白质的pI，但具有重现性差，聚焦时间冗长及制样过程繁杂等不足。
综上，需开发一种基于成像毛细管等电聚焦电泳表征PT抗原品pI的分析方法，并进行方法学验证，以期为PT抗原的pI测定及样品的分析如样品稳定性及批间一致性等质量表征提供依据。
发明内容
为解决上述问题，本发明的目的是提供一种PT抗原表征方法。
为实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
一方面，本发明提供了一种检测百日咳毒素样品的方法，其包括：
（1）将百日咳毒素样品制备成上样溶液；所述上样溶液中包含：百日咳毒素、尿素、亚氨基二乙酸、精氨酸、两性电解质、等电点标记物、甲基纤维素；
（2）对所述上样溶液进行等电聚焦，获得等电聚焦图谱，确定样品中百日咳毒素的等电点。
根据本发明的具体实施方式，所述的百日咳毒素样品为待测PT抗原样品。PT抗原是无细胞百日咳疫苗的关键成分。在本发明中，待测PT抗原样品为由百日咳杆菌发酵后的上清液经纯化获得的用于制备无细胞百日咳疫苗的PT抗原溶液或干粉。通常情况下，纯化得到的样品为溶液时，样品中PT抗原浓度为0.5mg/ml~10mg/ml。本发明的样品也可以是干粉，用水或缓冲液溶解至0.5mg/ml~10mg/ml后可进行检测。
在本发明的实施例中，发酵、纯化的方法如下：
（1）百日咳菌株发酵培养，收获培养液上清；（2）从培养液上清中分离纯化PT抗原。
根据本发明的具体实施方式，上样溶液中，尿素的浓度为8M。
根据本发明的具体实施方式，采用毛细管电泳仪对所述上样溶液进行等电聚焦。
根据本发明的具体实施方式，检测的过程实时成像。
根据本发明的具体实施方式，所述的获得等电聚焦图谱为在荧光模式下获取等电聚焦图谱，所述的荧光模式的条件包括：检测波长为320~450nm，曝光时间为3~10s。
根据本发明的具体实施方式，曝光时间为3s。
根据本发明的具体实施方式，所述的两性电解质溶液的pH值为3-10。
根据本发明的具体实施方式，所述的两性电解质为Pharmalyte。作为一种优选的实施方式，上样溶液中，Pharmalyte的浓度为4%。
根据本发明的具体实施方式，所述的等电聚焦的条件包括：聚焦电压为3000V，聚焦时间为5.5~10 min，优选为10min。
根据本发明的具体实施方式，等电聚焦的聚焦温度为15～25℃。在本发明的具体实施例中，等电聚焦的聚焦温度为20℃。
作为一种优选的实施方式，等电聚焦前还进行预聚焦，预聚焦电压为1500V，预聚焦时间为1 min。
根据本发明的具体实施方式，上样溶液中，亚氨基二乙酸的浓度为10~15mM。作为一种优选的实施方式，上样溶液中，亚氨基二乙酸的浓度为10mM。
根据本发明的具体实施方式，上样溶液中，精氨酸的浓度为10~15mM。作为一种优选的实施方式，上样溶液中，精氨酸的浓度为10mM。
根据本发明的具体实施方式，所述的等电点标记物包括4.05 PI Marker、10.17PI Marker。
根据本发明的具体实施方式，上样溶液中，两性电解质的浓度为1%~8%，优选为4%。
根据本发明的具体实施方式，上样溶液中，等电点标记物的浓度为0.2%~2%，优选为1%。
根据本发明的具体实施方式，上样溶液中，甲基纤维素的浓度为0.2~0.5%，优选为0.35%。
根据本发明的具体实施方式，上样溶液中，百日咳毒素的浓度为60~100μg/ml，优选为100μg/ml。
根据本发明的具体实施方式，步骤（1）之前还进行百日咳毒素样品的预处理，所述的预处理的方法包括用纯化水置换百日咳毒素样品中的缓冲液、超滤浓缩，使百日咳毒素样品中百日咳毒素的浓度为1000~2000μg/ml。作为一种优选的实施方式，进行百日咳毒素样品的预处理后，将百日咳毒素样品置于4℃保存。
根据本发明的具体实施方式，所述的毛细管电泳仪为Maurice，所述的毛细管电泳仪的毛细管卡盒为Maurice CIEF毛细管卡盒。
根据本发明的具体实施方式，所述的方法具体包括如下步骤：
（1）样品前处理
将待测样品进行预处理，用纯化水置换其缓冲液，使用超滤离心管，重复超滤浓缩3~5次，收集截留液，使样品中百日咳毒素的浓度为1000~2000μg/ml。
（2）上样溶液制备
将前处理的样品、尿素、亚氨基二乙酸溶液(IDA)、精氨酸溶液（Arg）、两性电解质溶液（Pharmalyte）（pH：3-10）、4.05 PI Marker、10.17 PI Marker、1%甲基纤维素溶液（1%MC）及纯化水混合，制备上样溶液。其中，上样溶液中，百日咳毒素的浓度为60~100μg/ml，尿素终浓度为8M，IDA终浓度为10~15mM，Arg终浓度为10~15mM，PI Marker终浓度为1%，MC终浓度为0.35%，Pharmalyte终浓度为4%，纯化水体积占总体系10%。
（3）上机分析
运用Maruice毛细管电泳仪，采用预制Maurice CIEF毛细管卡盒，卡盒内的毛细管内壁为氟碳涂层，内径100μm，有效长度5cm，待测样品采用真空进样，进样时间55s，预聚焦1500V，1min；聚焦电压设置为3000V，聚焦时间依据样品分离效果调整为5.5~10min，依据聚焦过程的全柱成像，可实时检测聚焦图谱。聚焦完成后，于荧光模式下（检测波长为320nm-450nm：曝光时间3-10S）得到图谱。
有益效果：
本发明的分析方法通过对PT抗原等电点毛细管等电聚焦电泳体系中PT抗原等电聚焦时间、稳定剂种类、聚焦时间及检测模式等方面的实验研究，建立并验证了PT抗原等电点成像毛细管等电聚焦电泳检测方法。
该方法具有进样分析时间短，稳定性和重现性良好，所需样品量小，测得的PT抗原的PI值准确度高等优点；此外，该方法经过验证其专属性、准确度、精密度及耐用性良好，可为PT抗原的表征如等电点的测定、稳定性的检测及批间一致性的评价等提供方法依据。
本发明的方法检测过程实时扫描成像，能够监测PT样品等电聚焦过程，从而优化聚焦条件；本发明的方法检测模式为荧光模式，峰形具有良好的分离度与重现性。
附图说明
图1为PT抗原样品成像毛细管等电聚焦电泳结果图；
图2为对实施例1中的检测方法进行专属性验证结果图；
图3为PT抗原样品6针测定叠图；
图4为PT参考品6针测定叠图；
图5为3批PT抗原样品测定图；
图6为PT抗原样品-20℃放置0~6个月测定图；
图7为PT抗原样品37℃放置0~2周测定图；
图8为对比例1的百日咳毒素等电点检测结果图；
图9为对比例2的百日咳毒素等电点检测结果图；
图10为对比例3的百日咳毒素等电点检测结果图；
图11为对比例4的百日咳毒素等电点检测结果图；
图12为对比例5的百日咳毒素等电点检测结果图；
图13为对比例6的百日咳毒素等电点检测结果图；
图14为对比例7的百日咳毒素等电点检测结果图；
图15为对比例8的百日咳毒素等电点检测结果图。
具体实施方式
在进一步描述本发明具体实施方案之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规技术。
本实施例中所用的试剂如下：
两性电解质Pharmalyte（pH：3-10）购自Cytiva公司（美国）；尿素购自国药集团化学试剂有限公司；亚氨基二乙酸购自Sigma公司（美国）；甲基纤维素、精氨酸、pI marker（4.05、10.17）购自proteinsimple公司。
实施例1
本实施例提供了一种基于成像毛细管等电聚焦电泳分析PT抗原等电点检测及表征方法，其包括如下步骤：
1.样品前处理
将待测样品进行预处理，用纯化水置换其缓冲液，使用超滤离心管，重复超滤浓缩3次，收集截留液，使其样品浓度为1000~2000μg/ml。
待测样品为PT抗原样品，本发明中的PT抗原样品是经过百日咳杆菌发酵、纯化后得到的用于制备无细胞百日咳疫苗的PT抗原（百日咳毒素）溶液。
2.上样溶液制备
将前处理的样品、样品稳定剂、亚氨基二乙酸溶液(IDA)、精氨酸溶液（Arg）、两性电解质溶液（Pharmalyte）（pH：3-10）、4.05 PI Marker、10.17 PI Marker、1%甲基纤维素溶液（1% MC）及纯化水混合，制备上样溶液。其中，百日咳毒素在上样溶液中的浓度为100μg/ml。
样品稳定剂为尿素，尿素终浓度为8M。
IDA终浓度为10mM，Arg终浓度为10mM，PI Marker终浓度为1%，MC终浓度为0.35%，Pharmalyte终浓度4%，纯化水体积占总体系10%。
3.上机分析
运用Maruice毛细管电泳仪，采用预制Maurice CIEF毛细管卡盒，卡盒内的毛细管内壁为氟碳涂层，内径100μm，有效长度5cm，待测样品采用真空进样，进样时间55s，预聚焦1500V，1min；聚焦电压设置为3000V，聚焦时间依据样品分离效果调整为10min，依据聚焦过程的全柱成像，可实时检测聚焦图谱。聚焦完成后，于荧光模式下（检测波长为320nm-450nm：曝光时间3S）得到图谱如图1所示。
从图中可知，PT抗原稳定聚焦后共显示5个峰，第三个峰为主峰，其等电点为6.802，与PT抗原的理论等电点6.8相符。
实施例2
本实施例是对实施例1中的检测方法进行专属性、准确度、重复性、中间精密度、耐用性验证。
验证例1：专属性验证
将待测样品预处理，用纯化水置换其缓冲液，将置换后得到的滤后液作为空白对照，截留液作为待测样品进行成像毛细管等电聚焦电泳检测。
待测样品为PT抗原样品。
从图谱可知，空白对照样品在荧光模式下无光吸收峰出现，PT抗原共有6个峰，其主峰值即其PI值为6.814，表明用于测定PT抗原等电点的成像毛细管等电聚焦电泳方法的专属性良好（图2）。
验证例2：准确度验证
将PT抗原样品及PT参考品（购自中国食品药品检定研究院）分别作为待测样品，分别进行成像毛细管等电聚焦电泳，重复测定6次，计算重复测定6次主峰PI结果的平均值（mean）及相对标准偏差（Relative standard deviation，RSD）及6次结果的平均值与理论值的相对偏差。
RSD（%）= 测定结果的标准偏差／测定结果的算术平均值×100%
平均值与理论值的相对偏差=（测定结果的算术平均值-理论值）／理论值×100%。
表1 方法的准确度验证结果（pI）
分别以PT抗原样品及PT参考品为待测样品进行成像毛细管等电聚焦电泳，PT抗原测定6次结果平均值为：6.817，RSD为0.031%，测定平均值与理论值的相对偏差为0.121%；PT参考品测定6次结果平均值为：6.814，RSD为0.043%，测定平均值与理论值的相对偏差为0.104%，表明测定PT抗原等电点的成像毛细管等电聚焦电泳方法的准确度良好（表1）。
验证例3：重复性验证
分别将PT抗原样品及PT参考品作为待测样品，进行成像毛细管等电聚焦电泳，分别重复测定6次，获得各峰pI值，计算6次测定结果的RSD，以评价方法的重复性。
1.PT抗原样品重复性验证
结果见图3、表2。
表2 PT抗原样品6针测定结果（pI）
2. PT参考品重复性验证
结果见图4、表3。
表3 PT参考品6针测定结果（pI）
PT抗原样品及PT参考品进行成像毛细管等电聚焦电泳，聚焦完成均显示6个峰，分别重复测定6次峰形叠图显示重现性良好，各峰pI值的RSD均小于0.1%，表明PT抗原成像毛细管等电聚焦电泳检测方法的重复性良好。
验证例4：中间精密度验证
将PT抗原样品作为待测样品，由不同试验人员于不同日期进行成像毛细管等电聚焦电泳，重复测定6次，计算不同试验人员于不同日期测得pI值的RSD。结果见表4。
表4 不同实验人员在不同日期测得PT抗原pI值
对不同实验人员在不同日期进行PT抗原PI测定，各峰的pI值RSD分别为0.066%、0.060%、0.095%、0.024%、0.095%及0.030，表明PT抗原成像毛细管等电聚焦电泳检测方法的中间精密度良好。
验证例5：耐用性验证
1.不同毛细管卡盒
将PT抗原样品作为待测样品，使用3批不同批次卡盒进行成像毛细管等电聚焦电泳，重复测定6次，计算上述不同条件下测得pI值的RSD。结果见表5。
表5 使用不同毛细管卡盒测得PT抗原pI值
使用不同批次毛细管卡盒分别对同一批PT抗原进行成像毛细管等电聚焦电泳，各峰pI值RSD分别为：0.741%、0.635%、0.600、0.119%、0.205%及0.232%。表明使用不同批次毛细管卡盒，方法的耐用性良好。
2.预处理后样品2~8℃放置稳定性
将PT抗原样品预处理后于4℃条件下分别放置0h、6h、12h、24h后进行成像毛细管等电聚焦电泳，重复测定3次，计算上述不同放置时间下测得pI值的RSD。结果见表6。
表6 PT抗原样品4℃放置0~24h稳定性（pI）
将预处理后的PT抗原样品分别于4℃放置0h、6h、12h、24h后，检测PT抗原的pI值，不同时间各峰pI值RSD分别为0.010%、0.009%、0.009%及0.011%、0.015%及0.015%。表明PT抗原于4℃放置0~24h，PT抗原稳定性良好，方法的耐用性良好。
实施例3
本实施例是实施例1中的检测方法的应用。
应用例1： 3批PT抗原样品批间一致性检测
分别将3批PT抗原样品作为待测样品进行成像毛细管等电聚焦电泳，重复测定3次，以3批pI测定值评估不同批次间PT抗原pI值的批间一致性。结果如图5、表7所示。
表7 3批PT抗原样品批间一致性（pI）
3批PT抗原样品进行成像毛细管等电聚焦电泳，各批次抗原均有6个峰，三批间各峰pI值RSD分别为：0.614%、0.525%、0.477%、0.123%、0.108%及0.082%，表明3批PT抗原批间一致性良好。
应用例2：PT抗原样品于-20℃放置0个月、3个月、6个月稳定性检测
将PT抗原样品于-20℃条件下分别放置0个月、3个月、6个月后进行成像毛细管等电聚焦电泳，重复测定3次，计算上述不同放置时间下测得pI值的RSD。结果如图6、表8所示。
表8 PT抗原样品-20℃放置0~6个月稳定性（pI）
将PT抗原样品于-20℃分别放置0个月、3个月及6个月后，检测PT抗原的pI值，不同时间各峰pI值RSD分别为0.256%、0.237%、0.201%及0.050%、0.054%及0.072%。表明PT抗原于4℃放置20℃分别放置0~6个月，PT抗原稳定性良好。
应用例3：PT抗原样品于37℃放置0W、1W、2W
将PT抗原样品于37℃条件下分别放置0周、1周及2周后进行成像毛细管等电聚焦电泳，重复测定3次，测定不同放置时间下的pI值。
结果如图7所示。
依据成像毛细管等聚焦电泳图谱，37℃条件分别放置1周、2周，PT抗原电荷变异体增多，主峰相对0周向左偏移，酸性峰增多，且主峰的峰高逐渐降低，2周时主峰等电点为6.539，说明PT抗原在37℃条件下不稳定。
对比例1
本对比例提供一种PT抗原等电点的检测方法，该方法与实施例1相同，区别仅在于将样品稳定剂更换为甲酰胺（Formamide），本对比例测定结果如图8所示。
图8显示结果可知，与实施例1相比，本对比例等电聚焦峰形分离度较差，且两针之间的重现性较差。
对比例2
本对比例提供一种PT抗原等电点的检测方法，该方法与实施例1相同，区别仅在于将样品稳定剂更换为N,N-二甲基甲酰胺（DMF），本对比例测定结果如图9所示。
图9结果可知，与实施例1相比，本对比例峰形分布较散，没有稳定聚焦为主峰，各峰高度较低，且两针之间的重现性较差。
对比例3
本对比例提供一种PT抗原等电点的检测方法，该方法与实施例1相同，区别仅在于将样品稳定剂更换为Tween20，本对比例测定结果如图10所示。
图10结果可知，与实施例1相比，本对比例峰形分布靠右，峰形重现性较差，与PT样品的理论等电点6.8数值差别较大。
对比例4
本对比例提供一种PT抗原等电点的检测方法，该方法与实施例1相同，区别仅在于改变了样品等电聚焦电泳时间，本对比例测定结果如图11所示。
图11结果可知，与实施例1相比，缩短或延长聚焦时间会使主峰分别向左或向右偏移，与PT样品的理论等电点产生较大差异。
其中，缩短后的聚焦时间为4.5min（图11中上边的图），延长后的聚焦时间为12min（图11中下边的图）。
图11中，上边的图6.434相比于实施例1，是缩短时间得到的；下边6.926相比于实施例1是延长时间得到的。
对比例5
本对比例提供一种PT抗原等电点的检测方法，该方法与实施例1相同，区别仅在于样品体系中不添加亚氨基二乙酸溶液(IDA)及精氨酸溶液（Arg），本对比例测定结果如图12所示。
图12结果可知，与实施例1相比，本对比例中PI Marker及部分样品峰迁移出检测窗外，无法获得有效完整的等电聚焦电泳图谱。
对比例6
本对比例提供一种PT抗原等电点的检测方法，该方法与实施例1相同，区别仅在于将检测模式更换为紫外吸收模式，本对比例测定结果如图13所示。
图13结果可知，与实施例1相比，本对比例中峰形杂峰较多，重现性及分离度较差。
对比例7
本对比例提供一种PT抗原等电点的检测方法，该方法与实施例1相同，区别仅在于样品体系中不添加尿素或添加2M尿素，本对比例测定结果如图14所示。
图14结果可知，与实施例1相比，本对比例中2个条件下峰形分离度较差，重现性差，PT样品的理论等电点6.8数值差别较大。
对比例8
本对比例提供一种PT抗原等电点的检测方法，该方法与实施例1相同，区别仅在于样品体系中添加4M尿素或添加6M尿素，本对比例测定结果如图15所示。
图15结果可知，与实施例1相比，本对比例中2个不同尿素浓度条件下峰形分离度较差，重现性差，PT样品的理论等电点6.8数值差别较大。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种检测百日咳毒素样品的成像毛细管等电聚焦电泳方法，其包括：
（1）将百日咳毒素样品制备成上样溶液；所述上样溶液中包含：百日咳毒素、尿素、亚氨基二乙酸、精氨酸、两性电解质、等电点标记物、甲基纤维素；
（2）对所述上样溶液进行等电聚焦，获得等电聚焦图谱，确定样品中百日咳毒素的等电点；
上样溶液中，尿素的浓度为8M，亚氨基二乙酸的浓度为10 mM，精氨酸的浓度为10 mM，甲基纤维素的浓度为0.35%；
所述的获得等电聚焦图谱为在荧光模式下获取等电聚焦图谱，所述的荧光模式的条件包括：检测波长为320~450nm，曝光时间为3~10s；
所述的等电聚焦的条件包括：聚焦电压为3000V，聚焦时间为10min。
2.根据权利要求1所述方法，其中，采用毛细管电泳仪对所述上样溶液进行等电聚焦。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述的两性电解质为Pharmalyte。
4. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述的等电点标记物包括4.05 PI Marker、10.17 PI Marker。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，上样溶液中，两性电解质的浓度为1%~8%，等电点标记物的浓度为0.2%~2%。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其中，步骤（1）之前还进行百日咳毒素样品的预处理，所述的预处理的方法包括用纯化水置换百日咳毒素样品中的缓冲液、超滤浓缩，使百日咳毒素样品中百日咳毒素的浓度为1000~2000μg/ml。
7.根据权利要求1所述的方法，上样溶液中，百日咳毒素的浓度为60~100μg/ml。
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