CN108572223A - 一种测定多肽中活性诱导物质的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种测定多肽中活性诱导物质的方法，具体涉及多肽药物检测技术领域，包括如下步骤：S1、取IPTG对照品，以50％乙腈水溶液为溶剂，配制IPTG对照品溶液，取多肽制剂，用50％乙腈水溶液溶解，得供试品溶液；S2、平行配制两份IPTG对照品溶液，经UPLC‑MS法检测，分别获得对照品溶液中IPTG的峰面积，计算峰面积与对照品溶液的浓度的比值，得IPTG的响应因子；S3、取供试品溶液经UPLC‑MS法检测，获得供试品溶液的峰面积，用响应因子计算供试品溶液中IPTG的含量。本发明具有检测时间短，准确度好，精密度高，重复性好的优点。

Description

一种测定多肽中活性诱导物质的方法
技术领域
本发明属于多肽药物检测技术领域，具体涉及一种测定多肽中活性诱导物质的方法。
背景技术
异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)是β-半乳糖苷酶的活性诱导物质，诱导效率高，同时不被菌体代谢，诱导效果稳定，而被实验室广泛应用，但因为IPTG对细胞存在毒性，使得含质粒细菌丢失质粒，因此需要控制其在药物的含量，但目前并无质量标准收录IPTG的含量测定方法。
因此，急需一种检测时间短，准确度好，精密度高，重复性好的测定多肽中活性诱导物质的方法。
发明内容
为了解决现有异丙基硫代半乳糖苷含量测定无质量标准可查的问题，本发明的目的是提供一种测定多肽中活性诱导物质的方法，具有检测时间短，准确度好，精密度高，重复性好的优点。
本发明提供了如下的技术方案：
一种测定多肽中活性诱导物质的方法，包括如下步骤：
S1、取IPTG对照品，以50％乙腈水溶液为溶剂，配制IPTG对照品溶液，取多肽制剂，用50％乙腈水溶液溶解，得供试品溶液；
S2、平行配制两份IPTG对照品溶液，经UPLC-MS法检测，分别获得对照品溶液中IPTG的峰面积，计算峰面积与对照品溶液的浓度的比值，得IPTG的响应因子；
S3、取供试品溶液经UPLC-MS法检测，获得供试品溶液的峰面积，用响应因子计算供试品溶液中IPTG的含量。
优选的，所述S2步骤和所述S3步骤中UPLC-MS法的色谱条件为：采用HILIC色谱柱，柱温为35℃，选择正离子模式，定量离子为261，以甲酸-乙腈为流动相A，甲酸-水为流动相B，流动相流速为1mL/min；梯度洗脱程序为：0～2min，流动相B的体积百分数为3％；2～3min，流动相B的体积百分数由3％至15％；3～5min，流动相B的体积百分数为15％；5～5.1min，流动相B的体积百分数由15％至3％；5.1～7min，流动相B的体积百分数为3％。
梯度洗脱程序
T(min) 0.1％HCOOH in H2O 0.1％HCOOH in ACN
0 3 97
2 3 97
3 15 85
5 15 85
5.1 3 97
7 3 97
本发明的有益效果是：
1、本发明采用UPLC-MS方法测定IPTG含量，由于化合物IPTG紫外响应极弱，并且不适合用气相色谱，因此选择液相色谱，同时采用MS检测器，可准确定位IPTG。
2、IPTG极性大，用液相普通色谱柱不能使得IPTG与其他物质有效分离，本发明采用两性离子色谱柱，可实现IPTG与其他物质基线分离。
3、采用质谱检测器，灵敏度高，可以检测样品中ppm级的IPTG。
4、采用UPLC-MS法，色谱方法时间短，不仅节省了检测时间而且大大减少了有机溶剂的使用，提高效率的同时减少了对环境的危害。
5、在本发明提供的UPLC-MS条件下，通过外标一点法测定供试品溶液中的IPTG含量，操作简单，并进行了系列的方法学验证，试验结果表明本发明的检测方法专属性强、准确度好、精密度高、重复性好，符合药物的质量标准研究的技术要求。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是实施例1对照品溶液和供试品溶液色谱图；
图2是实施例2线性范围考察的IPTG标准曲线图；
图3是实施例5专属性试验的专属性图谱。
具体实施方式
实施例1
一种测定多肽中活性诱导物质的方法，包括如下步骤：
S1、取IPTG对照品适量，加50％乙腈溶解并制成每1mL含IPTG 0.1μg的溶液，作为对照品溶液，取多肽制剂适量，加50％乙腈溶解并制成每1mL含多肽制剂1mg的溶液，作为供试品溶液；
S2、平行配制两份IPTG对照品溶液，经UPLC-MS法检测，分别获得对照品溶液中IPTG的峰面积，计算峰面积与对照品溶液的浓度的比值，得IPTG的响应因子；
S3、取供试品溶液经UPLC-MS法检测，获得供试品溶液的峰面积，用响应因子计算供试品溶液中IPTG的含量。
具体的，S2步骤和S3步骤中UPLC-MS法的色谱条件为：采用HILIC色谱柱，柱温为35℃，以甲酸-乙腈为流动相A，甲酸-水为流动相B，流动相流速为1mL/min；梯度洗脱，流速为每分钟0.3mL；进样量为2μL；检测器为质谱，离子源为ESI，正离子模式，定量离子为261；梯度洗脱程序为：0～2min，流动相B的体积百分数为3％；2～3min，流动相B的体积百分数由3％至15％；3～5min，流动相B的体积百分数为15％；5～5.1min，流动相B的体积百分数由15％至3％；5.1～7min，流动相B的体积百分数为3％。
梯度洗脱程序的试验数据如表1所示。
表1梯度洗脱程序
T(min) 0.1％HCOOH in H2O 0.1％HCOOH in ACN
0 3 97
2 3 97
3 15 85
5 15 85
5.1 3 97
7 3 97
采用实施例1中提供的梯度洗脱程序，分别对对照品溶液和供试品溶液进行UPLC-MS分析，所得色谱图如图1所示，图中标号1是对照品溶液，标号2是供试品溶液，显示IPTG的保留时间为1.465min。
实施例2
实施例1提供的测定方法的线性范围考察
取IPTG 10mg置于10mL容量瓶中，用50％乙腈溶解稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液1；精密量取100μL对照品贮备液1置于10mL容量瓶中，用15％乙腈稀释至刻度线，摇匀，作为对照品贮备液2；精密量取1000μL对照品贮备液2置于10mL容量瓶中，用15％乙腈稀释至刻度线，摇匀，作为对照品贮备液3；分别移取0.1mL、0.2mL、0.5mL、0.8mL、1mL、1.5mL、2mL对照品贮备液3分别置于10mL容量瓶中，用15％乙腈稀释至刻度，摇匀，分别标记为L-10、L-20、L-50、L-80、L-100、L-150和L-200。
按实施例1提供的测定方法，依次进样测定，以峰面积为纵坐标，对照品溶液浓度为横坐标(μg/mL)绘制标准曲线，其结果见表2，绘制的IPTG标准曲线如图2所示。
表2 IPTG标准曲线
实施例3
实施例1提供的测定方法的加样回收试验
通过加样回收的方法，对实施1提供的测定方法的准确度进行分析，取多肽制剂2mg，精密称定，平行11份，取其中2份，测定样品中的IPTG含量；取其中3份，分别用L-50稀释，定容和混匀，作为50％加标回收率溶液；取其中3份，分别用L-100稀释，定容和混匀，作为100％加标回收率溶液；取其中3份，分别用L-150稀释，定容和混匀，作为150％加标回收率溶液。按实施例1的UPLC-MS法测定，结果见表3，结果显示，IPTG回收率为109～122％，9针的回收率RSD％为4，表明实施例1提供的测定方法具有良好的准确度。
表3 IPTG回收率
试验结果表明：IPTG的回收率均在80～120％范围内，且RSD小于20％，说明实施例1提供的测定方法准确度较好。
实施例4
实施例1提供的测定方法的精密度试验
通过100％加样回收的方法，对实施例1提供的测定方法的精密度进行分析，取多肽制剂2mg，精密称定，平行8份，取其中2份，测定样品中的IPTG含量；取其中6份，分别用L-100稀释，定容和混匀，作为100％加标回收率溶液，按实施例1的UPLC-MS法测定，结果见表4，结果显示，IPTG回收率为112～122％，6针回收率RSD％为4，表明实施例1提供的测定方法具有良好的准确度。
表4重复性结果
实施例5
实施例1提供的测定方法的专属性试验
取15％乙腈作为空白溶剂，实施例1中对照品溶液和供试品溶液，实施例3中100％回收率溶液各5μL，分别注入UPLC-MS，按本实施例1的UPLC-MS法测定，记录色谱图，结果见图3，图中标号1为实施例1中的对照品溶液，标号2位实施例1中的供试品溶液，标号3为100％样品加标溶液，标号4位空白溶剂，结果表明，空白溶剂和供试品溶液对IPTG的测定无干扰。
实施例6
实施例1提供的测定方法的稳定性试验。
取实施例1中的对照品溶液和实施例3中的100％回收率溶液，在室温下，考察24h内溶液稳定性，按实施例1的UPLC-MS法，分别进样，记录IPTG的峰面积，计算对照品溶液的check回收率和100％回收率溶液的加标回收率，结果见表5～6，结果表明24h内，对照品溶液的check回收率94～102％；100％回收率溶液的回收率101～125％，说明实施例1提供的测定方法具有良好的稳定性。
表5对照品溶液稳定性结果
表6 100％回收率溶液稳定性结果
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种测定多肽中活性诱导物质的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、取IPTG对照品，以50％乙腈水溶液为溶剂，配制IPTG对照品溶液，取多肽制剂，用50％乙腈水溶液溶解，得供试品溶液；
S2、平行配制两份IPTG对照品溶液，经UPLC-MS法检测，分别获得对照品溶液中IPTG的峰面积，计算峰面积与对照品溶液的浓度的比值，得IPTG的响应因子；
S3、取供试品溶液经UPLC-MS法检测，获得供试品溶液的峰面积，用响应因子计算供试品溶液中IPTG的含量。
2.根据权利要求1所述的一种测定多肽中活性诱导物质的方法，其特征在于，所述S2步骤和所述S3步骤中UPLC-MS法的色谱条件为：采用HILIC色谱柱，柱温为35℃，选择正离子模式，定量离子为261，以甲酸-乙腈为流动相A，甲酸-水为流动相B，流动相流速为1mL/min；梯度洗脱程序为：0～2min，流动相B的体积百分数为3％；2～3min，流动相B的体积百分数由3％至15％；3～5min，流动相B的体积百分数为15％；5～5.1min，流动相B的体积百分数由15％至3％；5.1～7min，流动相B的体积百分数为3％。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115144482A (zh) * 2022-02-25 2022-10-04 南京汉欣医药科技有限公司 定量检测多肽或蛋白中异丙基-β-D-硫代半乳糖苷含量的方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102549155A (zh) * 2009-08-07 2012-07-04 国立大学法人东京农工大学 新型糖基转移酶、新型糖基转移酶基因和新型糖供体化合物
CN104245688A (zh) * 2012-04-10 2014-12-24 辉瑞大药厂 活化ampk的吲哚和吲唑类化合物
CN105505906A (zh) * 2016-01-18 2016-04-20 南京农业大学 一种定点突变改造的n-糖酰胺酶d及其制备方法和应用
CN105602923A (zh) * 2016-01-18 2016-05-25 南京农业大学 一种新型优质n-糖酰胺酶d的异源表达及其应用
CN107287266A (zh) * 2017-08-03 2017-10-24 吉林大学 火炬树果实提取物、制备方法及其在基因工程产品发酵生产中的应用
CN107502614A (zh) * 2017-03-22 2017-12-22 中国医学科学院药用植物研究所 一种参与栀子西红花苷合成的类胡萝卜素裂解双加氧酶编码基因的筛选及功能验证

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102549155A (zh) * 2009-08-07 2012-07-04 国立大学法人东京农工大学 新型糖基转移酶、新型糖基转移酶基因和新型糖供体化合物
CN104245688A (zh) * 2012-04-10 2014-12-24 辉瑞大药厂 活化ampk的吲哚和吲唑类化合物
CN105505906A (zh) * 2016-01-18 2016-04-20 南京农业大学 一种定点突变改造的n-糖酰胺酶d及其制备方法和应用
CN105602923A (zh) * 2016-01-18 2016-05-25 南京农业大学 一种新型优质n-糖酰胺酶d的异源表达及其应用
CN107502614A (zh) * 2017-03-22 2017-12-22 中国医学科学院药用植物研究所 一种参与栀子西红花苷合成的类胡萝卜素裂解双加氧酶编码基因的筛选及功能验证
CN107287266A (zh) * 2017-08-03 2017-10-24 吉林大学 火炬树果实提取物、制备方法及其在基因工程产品发酵生产中的应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ALFRED FERNA´NDEZ 等: "Development and Validation of a Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Assay for the Quantitation of IPTG in E. Coli Fed-Batch Cultures", 《ANAL. CHEM》 *
王荔 等: "反相高效液相色谱 脉冲电化学检测法测定重组人生长激素中异丙基-β-D-硫代半乳糖苷", 《色谱》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115144482A (zh) * 2022-02-25 2022-10-04 南京汉欣医药科技有限公司 定量检测多肽或蛋白中异丙基-β-D-硫代半乳糖苷含量的方法

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