CN105505906A - 一种定点突变改造的n-糖酰胺酶d及其制备方法和应用 - Google Patents

一种定点突变改造的n-糖酰胺酶d及其制备方法和应用 Download PDF

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刘丽
杜雅珉
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Abstract

本发明公开了一种定点突变改造的N-糖酰胺酶D及其制备方法和应用，该定点突变改造的N-糖酰胺酶D是由氨基酸序列为SEQ？ID？NO.1的野生型N-糖酰胺酶D在102位或236位氨基酸定点突变而产生的。突变后的酶不具有酶解N-链寡糖的能力，但其可以特异性的识别糖蛋白，从而达到分离纯化糖蛋白的目的。

Description

一种定点突变改造的N-糖酰胺酶D及其制备方法和应用
技术领域：
本发明属于生物工程领域，涉及一种定点突变改造的N-糖酰胺酶D及其制备方法和应用，具体涉及活性位点突变的N-糖酰胺酶D重组蛋白及其在分离、纯化糖蛋白中的应用。
背景技术:
糖蛋白是一类由糖类与多肽或蛋白质以共价键连接而形成的结合蛋白，是生物体内重要的一类大分子，种类繁多，分布广泛，具有多种重要功能。但天然糖蛋白一般含量较低，目前尚无成熟的、简单快捷的糖蛋白分离纯化方法。分离纯化方法的选择要根据糖蛋白的具体性质和研究目的来确定。
常用的糖蛋白分离纯化方法是：先将糖蛋白粗提取物分级处理，然后应用阴离子交换柱层析、凝胶柱层析、亲和柱层析或其他方法进行进一步分离纯化。其他用于糖蛋白分离纯化的方法还有超滤法、超离心法、区带电泳法、金属络合法等。但这些方法都存在一定的局限性，如造成样品的变性、损失或者引入其他杂质等。
因此，寻找一种简单、便捷的方法分离和纯化糖蛋白十分有必要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种定点突变改造的N-糖酰胺酶D，该重组蛋白不具有N-糖酰胺酶的酶解能力，但可以特异性的识别、结合糖蛋白，从而达到分离、纯化糖蛋白的目的。
本发明的另一目的在于提供上述定点突变改造的N-糖酰胺酶D的编码基因。
本发明的又一目的在于提供上述定点突变改造的N-糖酰胺酶D的制备方法。
本发明通过利用已经非常成熟的基因工程技术，通过基因定点突变，重组表达和生化特性研究等获得了两种新型N-糖酰胺酶。其不具有酶解N-链寡糖的能力，但可以特异性的识别结合糖蛋白，从而达到分离纯化糖蛋白的目的。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种定点突变改造的N-糖酰胺酶D，它是由氨基酸序列为SEQIDNO.1的野生型N-糖酰胺酶D在102位或236位氨基酸定点突变而产生的。
上述的定点突变改造的N-糖酰胺酶D，其中，102位氨基酸定点突变改造的N-糖酰胺酶D的氨基酸序列为SEQIDNO.2，236位氨基酸定点突变改造的N-糖酰胺酶D的氨基酸序列为SEQIDNO.3。
上述的定点突变改造的N-糖酰胺酶D的编码基因，其在于：该编码基因具有下述核苷酸序列之一：
(1)序列表中SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示的核苷酸序列，其中SEQIDNO.5为编码102位氨基酸定点突变改造的N-糖酰胺酶D的核苷酸序列，SEQIDNO.6为编码236位氨基酸定点突变改造的N-糖酰胺酶D的核苷酸序列；
(2)编码序列表中SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示氨基酸序列的多核苷酸。
含有上述的定点突变改造的N-糖酰胺酶D的编码基因的表达载体、转基因细胞系和转基因重组菌。
上述的定点突变改造的N-糖酰胺酶D的制备方法，包括以下步骤制备：
1)设计含有突变位点的特异性引物；
2)提取野生型N-糖酰胺酶D表达质粒；
3)以野生型N-糖酰胺酶D表达质粒为模板，在步骤(1)所述特异性引物的作用下进行PCR反应，获得含有定点突变的N-糖酰胺酶D重组基因的质粒；
4)使用Dpn1进行酶切，除去野生型N-糖酰胺酶D表达质粒，保留含有定点突变的N-糖酰胺酶D重组基因的质粒；
5)将步骤4)所得质粒转入大肠杆菌Top10，过夜培养，挑取阳性克隆子测序；测序正确后转入BL(DE21)，诱导其表达，得到目的蛋白。
步骤(1)中所述的含有突变位点的特异性引物为用于102位定点突变的引物或用于236位定点突变的引物：
用于102位定点突变的引物：
上游引物：CTGGTCGTCAGTACgccCGTACCGCTACCC
下游引物：GGGTAGCGGTACGggcGTACTGACGACCAG
用于236位定点突变的引物：
上游引物：TCAGGGTGGTgacgcaTTTTGGTACAC
下游引物：GTGTACCAAAAtgcgtcACCACCCTGA
上述的定点突变改造的N-糖酰胺酶D在特异性结合糖蛋白中的应用。
上述的定点突变改造的N-糖酰胺酶D在分离、纯化糖蛋白中的应用。
从保藏号为DSM-16301的菌株中提取野生型N-糖酰胺酶D表达质粒。
本发明提供的两种定点突变的N-糖酰胺酶DjD102和DjE236，由野生型N-糖酰胺酶D的氨基酸序列定点突变所得。优选的，所述重组蛋白酶由野生型N-糖酰胺酶D的102和236位氨基酸突变获得。该重组蛋白酶不具有野生型N-糖酰胺酶D的活性，但可以特异性结合糖蛋白。
本发明的有益效果：
本技术方案可以通过基因工程技术得到两种突变的N-糖酰胺酶DjD102和DjE236，其虽不具有酶解N-链寡糖的活力，但可以特异性识别、结合变性或者不变性的糖蛋白，为分离、纯化糖蛋白提供了一种新的途径。
附图说明
图1不同N-糖酰胺酶酶解辣根过氧化物酶N-链寡糖的检测
图2不同N-糖酰胺酶结合辣根过氧化物酶能力的颜色反应
具体实施方式
结合以下具体实施例，对本发明作进一步详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实例。
实验材料和试剂
1、菌株和载体：
常规菌种Dyellajaponica购自德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)，保藏号：DSM-16301。大肠杆菌Top10、BL21(DE3)级表达载体pRSF购自Novagen公司。
2、酶类及其他生化试剂：
限制性内切酶、DNAMarker、ProteinMarker购自TaKaRa公司；AxyPrep质粒提取试剂盒为Axygen公司产品。其他常规试剂为上海生工或南京寿德公司。
3、本发明中所使用的生物化学技术均为本领域中的常规技术:
在以下实施例中，除非特殊说明，所有实验操作均按照以下实验手册或文献中的部分进行，包括：[美]J.沙姆布鲁克等，分子克隆实验指南；赵永芳等，生物化学技术原理及其应用(第二版)；朱检等，生物化学实验[M]。
实施例1定点突变N-糖酰胺酶DjD102和DjE236基因的获得
1)来源于粳稻(Dyellajaponica)中的野生型N-糖酰胺酶D的菌株购自德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)，保藏号：DSM-16301。从菌株DSM-16301中提取野生型N-糖酰胺酶D的表达质粒，并以此为模板进行定点突变。
2)根据所需定点突变的位点，设计引物，具体如下表所述：
引物名称 上游引物 下游引物
DjD102 CTGGTCGTCAGTACgccCGTACCGCTACCC GGGTAGCGGTACGggcGTACTGACGACCAG
DjE236 TCAGGGTGGTgacgcaTTTTGGTACAC GTGTACCAAAAtgcgtcACCACCCTGA
3)分别使用设计的DjD102和DjE236的上游引物和下游引物进行PCR，反应体系如下：
4)PCR反应条件如下：
5)Dpn1酶切反应，37℃，反应3小时。反应体系如下：
6)转入大肠杆菌Top10细胞中，过夜培养，挑斑测序。测序结果正确，得到定点突变DjD102和DjE236。
实施例2定点突变N-糖酰胺酶DjD102和DjE236基因在BL(DE21)中的表达
将实施例1中得到的带有定点突变质粒的大肠杆菌Top10细胞中的质粒抽提出来，转化到制备好的感受态细胞BL21(DE3)中。挑取重组大肠杆菌菌株BL21(DE3)到5ml含卡纳抗生素的LB液体培养基中37℃，250rpm振荡过夜培养。按1％接种量(v/v)转接到新鲜LB(400ml)培养液中，37℃，200rpm振荡培养至OD600≈0.6-0.8，加入诱导剂IPTG至终浓度1.0mM，18℃，200rpm振荡过夜培养。
实施例3定点突变N-糖酰胺酶DjD102和DjE236的纯化
将实施例2中表达的N-糖酰胺酶的菌液4℃，4500rpm离心20min收集菌体，向菌体沉淀中加入10ml裂解缓冲液(pH7.550mM氯化钠；50mMTris-HCl；1％Triton)，100μlPMSF，使菌体重悬于裂解液中，进行超声波破碎仪中破碎细胞20min。将破碎后的细胞裂解液4℃，14000rpm离心20min收集上清。
由于设计的重组表达产物N端带有6个连续的组氨酸，可以通过亲和层析柱(Ni-NTA琼脂糖凝胶)亲和纯化。首先用平衡液平衡柱子(pH8.0100mM氯化钠50mMTris-HCl)，将粗酶液负载上柱；采用10倍体积冲洗液(pH8.0100mM氯化钠50mMTris-HCl)进行洗脱除去杂蛋白，然后用一定量的洗脱液(pH8.050mM氯化钠50mMTris-HCl300mM咪唑)收集目的蛋白，每管大约1ml。保存含有目的蛋白样品管，用于后续实验。将上清以及纯化后的蛋白做Western-blot蛋白电泳。
实施例4定点突变N-糖酰胺酶DjD102和DjE236酶活测试
本实施例将实施例3中得到的产物进行活性验证，选取标准糖蛋白辣根过氧化物酶(HRP)作为反应底物。反应体系如下：
添加野生型N-糖酰胺酶D的反应作为阳性对照，将样品置于37℃，过夜反应。
由于释放的N-链寡糖不能直接通过荧光或者紫外检测到，因而使用含有紫外或荧光基团的衍生试剂如2-AB(2-氨基苯甲酰胺)进行修饰，使之能够用高灵敏度的分析检测仪器如高效液相色谱(HPLC)分析。本实施例中通过2-AB标记酶解释放的N-链寡糖并使用HPLC进行荧光检测，达到检测酶活的目的。本实施例中使用的HPLC是岛津LC-30A型超高效液相色谱(Shimadzu，Tokyo，Japan)。该系统配备有SIL-30AC自动进样器、LC-30AD四元低压梯度泵、DGU-20A5R真空脱气机和RF-20Axs荧光检测器。
将反应结束的样品95℃加热终止反应，然后将样品旋干，将标准的2-AB试剂加到已干燥的样品中,65℃标记2小时后，加入乙腈，使其终浓度达到80％后上样。
液相色谱分离条件：
色谱柱：反相HILIC色谱柱AcquityGlycanColumn(2.1×150mm,1.7μmparticlesize；Waters,Ireland)
流动相A：50mM甲酸铵(pH4.5)缓冲液；流动相B：乙腈；
流速：0.5mL/min；
进液量：40μL；
激发、检测波长：Ex330nm，Em420nm；
柱温：60℃
洗脱方式：梯度洗脱，初始梯度比例95％(B相)如图1为不同N-糖酰胺酶酶解辣根过氧化物酶N-链寡糖的检测。结果显示：N-糖酰胺酶DjD102和DjE236不具有N-糖酰胺酶D的活性，其不能酶解糖蛋白上的N-链寡糖。
实施例5定点突变N-糖酰胺酶DjD102和DjE236分离、纯化糖蛋白的应用
由于N-糖酰胺酶DjD102和DjE236不具有N-糖酰胺酶D的活性，但可以特异性识别、结合糖蛋白，为分离、纯化糖蛋白提供了一种新的途径。因此，我们将N-糖酰胺酶DjD102和DjE236分别固定于Ni-NTA柱，并以标准糖蛋白(辣根过氧化物酶)作为待分离物，验证其分离、纯化糖蛋白的能力，具体步骤如下：
1)N-糖酰胺酶DjD102和DjE236的固定化
由于设计的重组表达产物N端带有6个连续的组氨酸，可以通过亲和层析柱(Ni-NTA琼脂糖凝胶)亲和固定。首先用平衡液平衡柱子(pH8.0100mM氯化钠50mMTris-HCl)，将粗酶液负载上柱；采用10倍体积冲洗液(pH8.0100mM氯化钠50mMTris-HCl)进行洗脱，除去除杂蛋白后备用。
2)标准糖蛋白(辣根过氧化物酶)的分离、纯化
称取1mg辣根过氧化物酶(HRP)，溶于200μL平衡液中(pH8.0100mM氯化钠50mMTris-HCl)，混匀后上柱，封闭柱子上下两端，使样品与亲和层析柱上的酶充分结合2小时。待反应2小时候后，打开柱子上下两端，再次使用平衡液(pH8.0100mM氯化钠50mMTris-HCl)冲洗柱子，洗去多余未能结合部分(约100mL)。使用洗脱液前接取少量液体，作为阴性对照，保存待用。然后用一定量的洗脱液(pH8.050mM氯化钠50mMTris-HCl500mM咪唑)收集目的蛋白，每管大约1ml。保存含有目的蛋白样品管，用于后续颜色反应实验。
3)颜色反应
在过氧化氢存在的条件下，辣根过氧化物酶(HRP)和HRP偶联物促进ABTS氧化，ABTS的氨盐转变为易发生歧化的阳离子根，使溶液的颜色改变至绿色。我们以此为原理，检测固定有N-糖酰胺酶DjD102和DjE236的亲和层析Ni-NTA柱对辣根过氧化物酶的结合能力。其反应体系如下：
结果如图2所示。从图中我们可以看出，平衡液已经完全冲去了不能结合的辣根过氧化物酶，而使用洗脱液洗脱时，反应液体再次变为绿色，证明了固定有N-糖酰胺酶DjD102和DjE236的亲和层析Ni-NTA柱对辣根过氧化物酶的结合能力，同时也为分离、纯化糖蛋白提供了一种新的途径。

Claims (8)

1.一种定点突变改造的N-糖酰胺酶D，其特征在于：它是由氨基酸序列为SEQIDNO.1的野生型N-糖酰胺酶D在102位或236位氨基酸定点突变而产生的。
2.根据权利要求1所述的定点突变改造的N-糖酰胺酶D，其特征在于：102位氨基酸定点突变改造的N-糖酰胺酶D的氨基酸序列为SEQIDNO.2，236位氨基酸定点突变改造的N-糖酰胺酶D的氨基酸序列为SEQIDNO.3。
3.权利要求1或2所述的定点突变改造的N-糖酰胺酶D的编码基因，其特征在于：该编码基因具有下述核苷酸序列之一：
(1)序列表中SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示的核苷酸序列，其中SEQIDNO.5为编码102位氨基酸定点突变改造的N-糖酰胺酶D的核苷酸序列，SEQIDNO.6为编码236位氨基酸定点突变改造的N-糖酰胺酶D的核苷酸序列；
(2)编码序列表中SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示氨基酸序列的多核苷酸。
4.含有权利要求3所述的定点突变改造的N-糖酰胺酶D的编码基因的表达载体、转基因细胞系和转基因重组菌。
5.权利要求1所述的定点突变改造的N-糖酰胺酶D的制备方法，其特征在于：包括以下步骤制备：
1)设计含有突变位点的特异性引物；
2)提取野生型N-糖酰胺酶D表达质粒；
3)以野生型N-糖酰胺酶D表达质粒为模板，在步骤(1)所述特异性引物的作用下进行PCR反应，获得含有定点突变的N-糖酰胺酶D重组基因的质粒；
4)使用Dpn1进行酶切，除去野生型N-糖酰胺酶D表达质粒，保留含有定点突变的N-糖酰胺酶D重组基因的质粒；
5)将步骤4)所得质粒转入大肠杆菌Top10，过夜培养，挑取阳性克隆子测序；测序正确后转入BL(DE21)，诱导其表达，得到目的蛋白。
6.根据权利要求5所述的定点突变改造的N-糖酰胺酶D的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的含有突变位点的特异性引物为用于102位定点突变的引物或用于236位定点突变的引物：
用于102位定点突变的引物：
上游引物：CTGGTCGTCAGTACgccCGTACCGCTACCC
下游引物：GGGTAGCGGTACGggcGTACTGACGACCAG
用于236位定点突变的引物：
上游引物：TCAGGGTGGTgacgcaTTTTGGTACAC
下游引物：GTGTACCAAAAtgcgtcACCACCCTGA。
7.权利要求1～2中任意一项所述的定点突变改造的N-糖酰胺酶D在特异性结合糖蛋白中的应用。
8.权利要求1～2中任意一项所述的定点突变改造的N-糖酰胺酶D在分离、纯化糖蛋白中的应用。
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