CN108690867A - 一种n-糖酰胺酶的酶活力测定方法 - Google Patents

一种n-糖酰胺酶的酶活力测定方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种N‑糖酰胺酶活力测定的方法，包括如下步骤：(1)还原糖标准曲线的制备，(2)N‑糖酰胺酶水解糖蛋白底物反应，(3)N‑糖酰胺酶水解糖蛋白产物测定；并进一步优化了显色条件。本发明所公开的方法准确度高、重复性强、操作简便、适用于大规模筛选N‑糖酰胺酶的活性。

Description

一种N-糖酰胺酶的酶活力测定方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，属于酶活性检测方法领域，更具体地，本发明涉及一种N-糖酰胺酶的酶活力测定方法。
背景技术
N-糖基化蛋白质是目前存在最为广泛、作用最为重要的糖复合物类型，要了解糖基化的作用和意义，首先要对糖链的结构进行分析，而要对糖链的结构进行分析，则要先将糖链从蛋白质分子上释放下来。化学法释放糖链由于反应条件苛刻、过程不易控制、污染严重等问题而很少被人们采用。相比较而言，酶法具有反应条件温和、专一性和可控性强、没有污染等优点而受到人们青睐。N-糖链是迄今为止研究最为深入的糖基化类型，其原因之一是很早就找到了可以将N-糖链从蛋白质分子上释放下来的酶：N-糖酰胺酶，此类酶的发现使得对N-糖链的研究远远超过其他类型的聚糖。因此，找到功能强大的N-糖酰胺酶进行N-糖链的释放是糖生物学研究领域的重要技术环节，是开展其他后续研究的前提和基础。
迄今为止，见诸文献报道的N-糖酰胺酶共有20多种。目前市售的商业化N-糖酰胺酶主要有两种，分别是从甜杏仁(Prunus dulcis)提取的N-糖酰胺酶A(PNGase A)和来源于脑膜炎脓杆菌(Flavobacterium meningosepticum)由大肠杆菌表达的重组N-糖酰胺酶 F(PNGase F)。然而这两种酶都有一定的应用局限性，因此关于新型N-糖酰胺酶的挖掘工作从未停止。自N-糖酰胺酶发现至今，缺乏一个简单、快速、精确、适合高通量筛选的活性测定方法，一直是制约N-糖酰胺酶发现和改造的瓶颈。以往的试验主要是两种底物对N-糖酰胺酶的活性和酶动力学参数进行测定。一种是放射性同位素标记的糖肽作为底物，通过纸层析或电泳对底物和酶解产物进行分离后，并使用生物可视化分析仪进行定性或定量。但14C标记糖肽需在指定的地点和专用设备进行制备，局限性大且可能对操作者存在安全隐患。另一种底物是荧光标记底物，丹黄酰氯标记糖肽类底物，通过高效液相色谱将底物脱糖基化反应产物进行分离，检测方法更为灵敏和准确，可以达到皮摩尔水平。无论是放射性同位素底物或荧光标记底物都需要复杂的制备和纯化过程，包括多步的凝胶过滤和离子交换层析。而且现有的方法采用的是糖肽而非糖蛋白作为酶解反应底物，不能反映N-糖酰胺酶对糖蛋白的动力学参数，而糖蛋白才是主要的天然底物和作用对象。由于上述局限性，已报道的N-糖酰胺酶大多缺乏重要的酶动力学参数，从而使横向比较不同研究中所发表的酶活性高低成为难题。综上所述，本领域有必要开发和改进一种简单、快速、精确、适合高通量筛选的N-糖酰胺酶活性以及酶动力学研究方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种准确度高、重复性强、操作简便、适用于大规模筛选的N-糖酰胺酶活性检测方法。
本发明所述的一种N-糖酰胺酶的酶活力测定方法，包括以下步骤：
(1)还原糖标准曲线的制备：将还原糖标准品稀释成一系列的浓度标准液，于各浓度标准液中加入三氯乙酸溶液、氢氧化钠溶液、WST-1显色溶液，混匀后40-60℃显色 50-60min，使用酶标仪在584nm处测定反应液吸光值，得到还原糖浓度与吸光度关系曲线；
(2)N-糖酰胺酶水解糖蛋白底物反应：将糖蛋白标准品用水稀释，加热变性，冷却后加入pH缓冲液和不同浓度的N-糖酰胺酶反应；
(3)N-糖酰胺酶水解糖蛋白产物测定：步骤(2)N-糖酰胺酶水解糖蛋白反应液中加入三氯乙酸溶液终止反应，离心取上清液；加入氢氧化钠溶液，再加入WST-1溶液 40-60℃显色50-60min小时，使用酶标仪在584nm处测定反应液吸光值，反应零分钟为空白对照；根据吸光值与还原糖标准曲线可得到N-糖酰胺酶酶解产物浓度，从而计算酶活性。
本发明步骤(1)所述还原糖标准品可以为任意糖链末端具有还原性的糖，如乳糖、麦芽糖、麦芽三糖、麦芽五糖、葡萄糖、果糖或半乳糖等，从节约成本的角度，可以优选成本低廉的麦芽糖。
本发明步骤(1)中所述一系列的浓度优选为10μmol/L到200μmol/L之间的任意系列浓度，更优选一系列的浓度为20μmol/L、40μmol/L、60μmol/L、80μmol/L、100μ mol/L和120μmol/L。
本发明选用40-60℃显色50-60min，可以保证标准曲线的斜率，以及较低的本底值，温度过低不显色，温度过高本底值过高。为了更好的实现本发明，步骤(1)或步骤(3) 中的显色温度优选为45-55℃，更优选50℃；显色时间优选为60min。
本发明步骤(1)或步骤(3)中的氢氧化钠溶液的浓度为4-5mol/L，低于此范围，会不显色，高于此范围，则还原糖标准曲线的本底值过高；为了更好的实现本发明，优选4mol/L。
本发明步骤(1)或步骤(3)中的三氯乙酸溶液的浓度优选为2-3mol/L，低于此范围，会不显色，高于此范围，则还原糖标准曲线的本底值过高；为了更好的实现本发明，更优选2.5mol/L。
本发明步骤(2)中的糖蛋白标准品优选为辣根过氧化物酶、核糖核酸酶、鸡卵清蛋白、牛胎球蛋白或牛转铁蛋白。
本发明步骤(2)中变性所采用的方法可以为现有技术常用的蛋白变性方法，本发明为了便于操作，选择95-100℃金属浴变性。
本发明步骤(2)的pH缓冲液优选为pH 2.6的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液。
作为一种优选的具体的N-糖酰胺酶的酶活力测定方法，包括以下步骤：
(1)标准曲线的制备：将还原糖标准品稀释成一系列的浓度标准液，取5μL还原糖标准液，分别加入5μL 2.5mol/L三氯乙酸溶液、5μL 4mol/L氢氧化钠溶液、10μL 1.69mmol/L WST-1显色溶液，混匀后50℃显色1小时，使用酶标仪在584nm处测定反应液吸光值，使用纯水作为空白对照，得到还原糖浓度与吸光度关系曲线。
(2)N-糖酰胺酶水解糖蛋白底物反应：将糖蛋白标准品用水稀释成不同浓度，取10μL置于100℃金属浴变性10分钟，冷却至室温，然后加入500mmol/L浓度的pH缓冲液3μL和不同浓度的N-糖酰胺酶17μL，37℃反应。
(3)N-糖酰胺酶水解糖蛋白产物测定：N-糖酰胺酶水解糖蛋白反应液中加入等体积的2.5mol/L三氯乙酸溶液终止反应，振荡混匀5分钟，12500rpm离心30分钟，取10μL 上清液。加入5μL 4mol/L氢氧化钠溶液，再加入10μL 1.69mmol/L WST-1溶液50℃显色1小时，使用酶标仪在584nm处测定反应液吸光值，反应零分钟为空白对照。根据吸光值与还原糖标准曲线可得到N-糖酰胺酶酶解产物浓度，从而计算酶活性。
本发明的优点在于：
1、该方法操作简单，采用水溶性四氮唑(WST-1)显色溶液，灵敏度高；使用酶标仪进行检测，可以同时对大量样本进行操作，适合于高通量检测，可以用于酶结构优化和突变体筛选。
2、该方法直接使用标准糖蛋白作为底物，无需对底物进行同位素标记和荧光标记，避免了繁琐的实验操作和对实验人员的安全隐患。
3、该方法能够快速准确的对产物进行定量分析，适合N-糖酰胺酶的酶学性质和酶动力学研究。
附图说明
图1、酶标仪测定的麦芽糖标准曲线；
图2、不同NaOH浓度对显色反应的影响；
图3、不同温度对显色反应的影响；
图4、不同显色时间对显色反应的影响；
图5、不同浓度N-糖酰胺酶H+不同反应时间测定曲线；
图6、N-糖酰胺酶H+水解不同浓度辣根过氧化物酶的速率和底物浓度关系图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做更具体的说明，但本发明的技术范围不受这些实施例的限制。下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
(1)麦芽糖糖标准溶液的配制：配制10mmol/L麦芽糖标准液，称取3.423g麦芽糖溶于去离子水，使用容量瓶定容到1L。使用去离子水稀释，将10mmol/L麦芽糖标准液稀释为20μmol/L、40μmol/L、60μmol/L、80μmol/L、100μmol/L、120μmol/L。
(2)辣根过氧化物酶标准溶液的配制：准确称取10mg辣根过氧化物酶标准品，溶于1mL去离子水，振荡摇匀，制成10μg/μL的辣根过氧化物酶母液，再用去离子水稀释成不同浓度(25μmol/L，50μmol/L，100μmol/L，200μmol/L，400μmol/L，600μ mol/L，800μmol/L，1000μmol/L)。
(3)标准曲线的测定：384孔酶标板，分别加入5μL步骤(1)配置的麦芽糖标准液(20μmol/L、40μmol/L、60μmol/L、80μmol/L、100μmol/L、120μmol/L)，再加入5μL 2.5mol/L三氯乙酸溶液、5μL 4mol/L氢氧化钠溶液、10μL 1.69mmol/L WST-1 显色溶液，混匀后50℃显色1小时，使用酶标仪在584nm处测定反应液吸光值，使用纯水作为空白对照，得到还原糖浓度与吸光度关系曲线如图1所示。
(4)N-糖酰胺酶糖链释放反应：取10μL不同浓度辣根过氧化物酶置于100℃金属浴变性10分钟，冷却至室温，然后加入500mmol/L浓度的pH2.6磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液3μL和不同浓度的N-糖酰胺酶H+17μL，37℃反应，加入30μL 2.5mol/L三氯乙酸溶液终止反应，振荡混匀5分钟，12500rpm离心30分钟，小心吸取10μL上清液，转入384孔酶标板，加入5μL4mol/L氢氧化钠溶液，再加入10μL 1.69mmol/L WST-1溶液50℃显色1小时，使用酶标仪在584nm处测定反应液吸光值，以反应零分钟为空白对照。根据吸光值与还原糖标准曲线可得到N-糖酰胺酶H+酶解产物浓度，计算酶反应速率、酶活性和酶动力学参数。如图5所示，在0到24小时内不同浓度的N-糖酰胺酶H+反应产物生成量与时间成正比，表明该酶促反应的不存在产物抑制。以辣根过氧化物酶浓度为横坐标，N-糖酰胺酶H+的催化速率为纵坐标，可以计算得到N-糖酰胺酶H+对底物辣根过氧化物酶的Km值为72.67μmol/L，最大反应速率为91.97fmol/s，如图6所示。
实施例2-4
参照实施例1的标准曲线测定方法，其中，实施例2选用的NaOH浓度为3mol/L，实施例3选用的NaOH浓度为5mol/L，实施例4选用的NaOH浓度为7.5mol/L。
与实施例1所选用的4mol/L对比，实验结果如图2，可以看出，当NaOH浓度低于4mol/L，如为3mol/L时，不同浓度的麦芽糖标准品的吸光值差异不大；当高于5mol/L时，如为7.5mol/L时，还原糖标准曲线的本底值过高。而选用本发明所述的NaOH浓度 4-5mol/L时，麦芽糖标准品的浓度和对应吸光值具有线性关系，且具有最大斜率，特别是当NaOH浓度为4mol/L时，本底值即水的吸光值最小，且具有最大斜率。
实施例5-6
参照实施例1的标准曲线测定方法，其中，实施例5选用的显色温度为40℃，实施例6选用的显色温度为60℃。
与实施例1所选用的50℃对比，实验结果如图3所示，可以看出，使用40℃、50℃和60℃进行显色，麦芽糖标准品的浓度和对应吸光值均具有线性关系，均可很好的实现本发明，其中60℃的麦芽糖标准曲线具有最大斜率，但具有较高的本底值即水的吸光值，显色温度50℃为最优条件，可以兼顾曲线斜率和本底值。
实施例7
参照实施例1的标准曲线测定方法，分别在显色10min、20min、30min、40min、50min和60min测定120μmol/L麦芽糖标准品的OD值。
实验结果如图4所示，可以看出吸光值随显色时间增加而升高，选用本发明所述的显色50-60min时，120μmol/L麦芽糖标准品的吸光值达到1.0至1.2之间，符合酶标仪的最佳测定范围。

Claims (8)

1.一种N-糖酰胺酶的酶活力测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)还原糖标准曲线的制备：将还原糖标准品稀释成一系列的浓度标准液，于各浓度标准液中加入三氯乙酸溶液、氢氧化钠溶液、WST-1显色溶液，混匀后40-60℃显色50-60min，使用酶标仪在584nm处测定反应液吸光值，得到还原糖浓度与吸光度关系曲线；
(2)N-糖酰胺酶水解糖蛋白底物反应：将糖蛋白标准品用水稀释，加热变性，冷却后加入pH缓冲液和不同浓度的N-糖酰胺酶反应；
(3)N-糖酰胺酶水解糖蛋白产物测定：步骤(2)N-糖酰胺酶水解糖蛋白反应液中加入三氯乙酸溶液终止反应，离心取上清液；加入氢氧化钠溶液，再加入WST-1溶液40-60℃显色50-60min小时，使用酶标仪在584nm处测定反应液吸光值，反应零分钟为空白对照；根据吸光值与还原糖标准曲线可得到N-糖酰胺酶酶解产物浓度，从而计算酶活性。
2.根据权利要求1所述的N-糖酰胺酶的酶活力测定方法，其特征在于，步骤(1)所述还原糖标准品为糖链末端具有还原性的糖。
3.根据权利要求1所述的N-糖酰胺酶的酶活力测定方法，其特征在于，步骤(1)所述一系列的浓度为10μmol/L到200μmol/L之间的任意系列浓度。
4.根据权利要求1所述的N-糖酰胺酶的酶活力测定方法，其特征在于，步骤(1)或步骤(3)中的显色温度为45-55℃，显色时间为60min。
5.根据权利要求1所述的N-糖酰胺酶的酶活力测定方法，其特征在于，步骤(1)或步骤(3)中的氢氧化钠溶液的浓度为4-5mol/L，优选4mol/L。
6.根据权利要求1所述的N-糖酰胺酶的酶活力测定方法，其特征在于，步骤(1)或步骤(3)中的三氯乙酸溶液的浓度为2-3mol/L，优选2.5mol/L。
7.根据权利要求1所述的N-糖酰胺酶的酶活力测定方法，其特征在于，步骤(2)中的糖蛋白标准品为辣根过氧化物酶、核糖核酸酶、鸡卵清蛋白、牛胎球蛋白或牛转铁蛋白。
8.根据权利要求1所述的N-糖酰胺酶的酶活力测定方法，其特征在于，步骤(2)中的pH缓冲液为pH 2.6的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液。
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