CN101231261A - 一种检测还原糖浓度的电化学方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种测定还原糖浓度的电化学分析方法，属生物电化学领域，具体方法是将样品溶液与铁氰化钾与氢氧化钾溶液在80℃水浴中反应1min，反应液经冷却后用电化学安培法检测。本发明方法操作简便、反应条件温和易于控制、分析灵敏度高、分析速度快、抗干扰能力强，可广泛应用于各种样品中还原糖的测定。
Description
所属领域
本发明涉及一种测定还原性单糖浓度的分析方法。
背景技术
还原糖是发酵、食品领域最基本的工业原料，还原糖快速、准确的测定对生产过程控制和食品质量检验具有重要的意义。还原糖的测定方法很多，目前工业生产中普遍采用的是费林试剂滴定法[2]。该方法要求在测定液沸腾状态下滴定，操作不便，干扰因素多，人为误差较大，给生产过程控制和产品质量检验带来不便。仪器分析方法有液相色谱法、放射测定、气质联用、紫外及红外光谱分析、核磁共振等，由于操作条件要求高，样品需经衍生或其它处理后才能测定，测定时间长，测定和维护成本较高等原因，不适于大批量样品的糖类化合物含量检测，在我国实际生产和科研领域一般不被采用。分光光度法可用于检测蜂蜜中的还原糖，但对于浑浊和有不同颜色的样品实用性则较差。国家知识产权局1997年2月12日公开了一项发明专利申请“电化学测量方法和仪器”(公开号CN 1142867A)该申请采用薄层电化学测量装置，优选毛细填充装置，进行电化学测定溶液中的还原糖含量，该发明专利方法所测定的还原糖含量在25mmol约合0.45％以下并需要制作专用的分析装置，难以推广应用；2004年5月11日公开的一项发明专利申请“一种测定还原糖浓度的方法”，该申请方法是将样品溶液与过量氯化四氮唑蓝在pH为7.5-8.5条件下反应，反应液经脱水、振荡下加入乙酸乙酯至沉淀物溶解，取上清液测定吸光度得出还原糖含量，该法测定还原糖最高为2.5μg/mL，此方法分析步骤繁多、费时长，尤其不适用于大量样品分析。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速、准确、操作简便的测定还原糖浓度的方法。
本发明所提供的测定还原糖浓度的方法，包括如下步骤：1)将样品溶液与过量铁氰化钾(K3Fe(CN)6)和氢氧化钠(NaOH)混匀80℃保温1.0min，2)反应液冷却至室温后用Ag/AgCl参比电极、玻碳工作电极和Pt片辅助电极构成三电极系统，测定还原糖与K3Fe(CN)6反应生成的还原产物亚铁氰化钾(K4Fe(CN)6)的氧化电流，据此测得还原糖含量。
技术方案
1实验原理：还原糖在碱性溶液中能将铁氰化钾(K3Fe(CN)6)还原为亚铁氰化钾(K4Fe(CN)6)，以葡萄糖为例，其反应式为：
C6H12O6+6K3Fe(CN)6+6KOH＝(CHOH)4·(COOH)2+6K4Fe(CN)6+4H2O
在反应中K3Fe(CN)6过量，还原糖含量与生成的K4Fe(CN)6的浓度呈等摩尔关系，而K4Fe(CN)6是一种电化学氧化还原活性物质，当工作电极上加一定正电位，K4Fe(CN)6能够被氧化生成K3Fe(CN)6。由于K4Fe(CN)6的氧化电流与还原糖浓度呈一定摩尔关系，因此可以根据测得的K4Fe(CN)6的氧化电流信号计算还原糖的含量。
2测定电位的选择：移取1mL 5.00mg/mL葡萄糖标准溶液于20mL具塞刻度试管中，加入K3Fe(CN)6和NaOH溶液，稀释至20mL。水浴加热反应1.0min，取出冷却至室温。将反应液置于100mL烧杯中，将Ag/AgCl参比电极、玻碳工作电极和Pt片辅助电极构成三电极系统，使用电化学分析仪的循环伏安分析程序记录工作电极在0～+0.45V间的循环伏安曲线，如图1所示。由于K3Fe(CN)6和K4Fe(CN)6是一对可逆的氧化还原物质，所以此图为溶液中过量的K3Fe(CN)6与反应生成的K4Fe(CN)6共同在玻碳工作电极上反应产生的循环伏安图。从图上看出K4Fe(CN)6从+0.1V(vs.Ag/AgCl)开始被氧化为K3Fe(CN)6，电位为+0.26V时氧化电流达到峰值。当用安培法测定K4Fe(CN)6的氧化电流时，工作电极的检测电位必须设定为高于+0.26V的正电位，综合考虑各项影响因素本研究选择+0.4V为工作电极的检测电位。
3水浴加热温度和反应时间选择：目前国家标准中“铁氰化钾滴定法”检测还原糖要求溶液在微沸状态下进行滴定，而“铁氰化钾分光光度法”也需要还原糖与铁氰化钾在沸水浴中反应20min，对反应温度和时间都有较高的要求。本实验只需保证还原糖含量与K4Fe(CN)6的氧化电流有良好的线性关系，不必使反应完全进行，可以适当降低反应温度、缩短反应时间。图2是葡萄糖标准溶液与K3Fe(CN)6在100℃水浴中反应不同时间后测得的K4Fe(CN)6的氧化电流i，可见0.5～1.0min电流大幅增加，1.0min后电流增大幅度变小。图3是葡萄糖溶液在不同温度下反应1.0min所测得的电流，由图可见60～80℃电流增加迅速，在80～100℃电流增加趋缓。通过实验发现在不同反应温度和时间条件下，葡萄糖浓度(1.00～8.00mg/20mL)与K4Fe(CN)6的氧化电流均有很好的线性关系。综上所述，本专利选择还原糖与K3Fe(CN)6反应的水浴温度为80℃，时间控制在1.0min。
有益效果：1)本发明较目前与还原糖测定相关的专利中的测定温度有较大幅度下降(从100℃沸腾降为80℃保温)，使得反应更加温和、易于控制，为采用本专利技术后续开发还原糖分析仪器打下了坚实的基础；2)提高了还原糖的分析速度，电极实际测定时间30秒，加上前处理也不超过4min尤其适用于大量样品的分析；3)本发明的方法学研究采用了三种以上的回收率测定样品，均符合化学分析要求(上述专利中均只采用了一种回收率测定样品)，表明本专利方法的抗干扰性能优于上述专利；4)本分析方法的线性范围宽，还原糖浓度40.0μg/20mL～20.0mg/20mL范围内有良好的线性关系，线性相关系数为0.9999；5)方法最低检出限为2.00μg/mL，分析灵敏度较高。
附图说明：
图1示玻碳工作电极在待测溶液中的循环伏安曲线；
图2示K4Fe(CN)6的氧化电流与不同反应时间的关系，其中：葡萄糖溶液浓度：3.00mg/20mL；反应温度：100℃；反应时间：0.5、1.0、1.5、2.0min；
图3示K4Fe(CN)6的氧化电流与不同反应温度的关系，其中：葡萄糖溶液浓度：3.00mg/20mL；反应时间：1.0min；反应温度：60、70、80、90、100℃；
图4示K4Fe(CN)6氧化反应的i-t曲线；
图5示葡萄糖标准溶液工作曲线。
具体实施方式
实施例1电化学安培法测定橙汁、马铃薯粉、味精发酵液、糖化液中还原糖含量
1仪器与试剂
CHI614c电化学分析仪(上海辰华仪器公司)，HH-S恒温水浴锅(江苏国胜实验仪器厂)，电化学三电极体系由Ag/AgCl参比电极(1mol/LKCl)、玻碳工作电极(直径4mm)和Pt片辅助电极组成。
5.00mg/mL葡萄糖标准溶液，4.00％K3Fe(CN)6溶液，10.0％NaOH溶液，所用试剂均为分析纯。
2样品溶液的配制
橙汁样液：取10.0mL橙汁饮料(市售某品牌)至50mL容量瓶，加蒸馏水定容。配制成稀释5倍的橙汁待测液。
马铃薯粉待测样液：称取某厂家的马铃薯全粉2.00g于10mL水中，搅拌溶解30min，离心后取上清液。
发酵液：取5.00mL山东济宁市菱花集团味精发酵液上清液至10mL容量瓶，加蒸馏水定容。配制成稀释2倍的发酵液待测液。
糖化液：将山东鲁洲集团提供的7份糖化液(1#～7#)离心后取上清液，分别按照1∶15、1∶15、1∶20、1∶20、1∶20、1∶30、1∶40的比例稀释，配制成待测液。
3葡萄糖标准溶液工作曲线的绘制
分别取0、0.2、0.5、1、2、3、4mL 5.00mg/mL葡萄糖标准溶液于20mL具塞刻度试管中，加入8mL 4.00％K3Fe(CN)6和2.5mL 10.0％NaOH溶液，用蒸馏水稀释至20mL，混匀。将试管置于80℃水浴中反应1.0min，取出冷却至室温。将反应液分别倒入100mL烧杯中，进行电化学安培法检测。将Ag/AgCl参比电极、玻碳工作电极和Pt片辅助电极置于盛有待测液的烧杯中，分别与CHI614c电化学分析仪对应的电极夹相连。选择仪器软件中的安培技术进行检测，恒定工作电极电位0.4V，记录K4Fe(CN)6被氧化的电流-时间(i-t)曲线，如图4所示。取30s时的稳定电流i，绘制电流-葡萄糖浓度(i-C)工作曲线。
4样品的测定
分别取1mL配制好的橙汁、发酵液、糖化液和马铃薯粉待测样液于20mL具塞刻度试管中，以下操作同标准工作曲线的绘制。将i-t曲线中30s时的稳定电流i数值代入工作曲线，从而计算出待测样液中还原糖的百分含量(以葡萄糖计)。
5线性范围及最低检出限
图5是由0～20.0mg/20mL葡萄糖标准溶液绘制的标准工作曲线，线性回归方程为：i＝1.1641+4.388C。i为K4Fe(CN)6的稳定氧化电流(μA)，C为还原糖浓度(mg/20mL)，相关系数r＝0.9999。可见此体系还原糖浓度在40.0μg/20mL～20.0mg/20mL范围内，与K4Fe(CN)6的氧化电流之间有良好的线性关系。该方法的最低检出限为2.00μg/mL。
6精密度试验
取5.00mg/mL葡萄糖标准溶液1.0mL连续测定7次，方法同“样品的测定”，由所测得的K4Fe(CN)6氧化电流i计算出对应的葡萄糖浓度，结果见表1
表1精密度试验(n＝9)
由上表计算得相对标准偏差(RSD)为0.841％，可见此方法的精密度良好。
7样品的测定及加样回收试验
按照“样品的测定”方法检测四种待测样，并在被测样品中加入已知含量的葡萄糖溶液，进行不同样品的回收试验，结果见表2。
表2加样回收试验(n＝3)
| 样品 | 样品量(mg/20mL) | 加入量(mg/20mL) | 测得量(mg/20mL) | 回收率(％) | 平均回收率(％) |
| 橙汁马铃薯粉发酵液糖化液1# | 10.08*2.02*4.47*3.98* | 9.002.005.004.00 | 8.96*1.96*5.07*4.08* | 99.698.0101.4102.0 | 100.3(RSD＝1.81％) |
*：三次测定结果的均值
结果表明，该检测方法测定不同类型样品的回收率在98.0～102.0％之间，说明此种分析方法抗干扰性能良好，能满足测定不同类型样品的需要。
8对比测定试验
对按照“样品溶液的配制”方法配制的山东鲁洲集团提供的1#～7#糖化液的稀释待测液进行电化学安培法测定，同时用常规斐林氏法进行对比，结果见表3。
表3对比试验测定结果mg/20mL(n＝3)
| 样品 | 电化学法 | 斐林氏法 |
| 糖化液1#糖化液2#糖化液3#糖化液4#糖化液5#糖化液6#糖化液7# | 3.989.6812.4412.0012.2811.0412.20 | 3.479.6412.2811.3213.1610.2611.41 |
t检验，P＞0.05表明两种分析方法无显著差异。
Claims (4)
1.一种测定还原糖浓度的方法，包括如下步骤：1)将样品溶液与过量铁氰化钾(K3Fe(CN)6)与氢氧化钾(KOH)溶液混匀后在80℃水浴中反应1min；2)反应液经冷却后置烧杯中，用Ag/AgCL参比电极、玻碳工作电极和Pt片辅助电极构成的三电极系统进行测定；
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于：步骤1)所述是将反应液加热至80℃反应1.0min；
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于步骤2)所述反应液应冷却至室温再进行测定；
4.根据权利要求1～3所述方法，其特征在于：步骤2)所述三电极测定系统中工作电极的检测电位设定为+0.45V。
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|---|---|---|---|---|
| CN103592359A (zh) * | 2013-11-29 | 2014-02-19 | 山东省科学院生物研究所 | 一种检测酱油中l-谷氨酸钠的方法 |
| CN108690867A (zh) * | 2017-04-11 | 2018-10-23 | 南京农业大学 | 一种n-糖酰胺酶的酶活力测定方法 |
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