JPH09500450A

JPH09500450A - 電気化学的測定のための方法及び装置

Info

Publication number: JPH09500450A
Application number: JP7516030A
Authority: JP
Inventors: バーチ、ブライアン・ジェフリー; モーリス、ニコラス・アンドリュー; ボンナフー、バンサン
Original assignee: ユニリーバー・ナームローゼ・ベンノートシャープ
Priority date: 1993-12-08
Filing date: 1994-12-05
Publication date: 1997-01-14
Also published as: CA2178626A1; ZA949754B; US5645709A; GB9325189D0; EP0734520A1; AU1116795A; HUT76409A; WO1995016198A1; CN1142867A; PL314911A1; TR28318A; HU9601575D0; SK71596A3; BR9408250A

Abstract

(57)【要約】薄層電気化学的測定装置、好ましくはキャピラリー充填装置における水溶液中の還元糖含量の電気化学的定量の方法であり、この装置の内部表面が溶解性酸化還元媒体で被覆されており、装置内にアルカリ環境を生成する手段を含有する方法である。好ましい方法では、酸化還元媒体は飽和溶液中にフェリシアン化イオンを供するフェリシアン化カリウム及び１乃至３モルの過剰量の水酸化物イオンを供する水酸化リチウムを含有する。又、本発明は参照電極及び作用電極の間に保護電極を有するキャピラリー充填装置をも与える。

Description

【発明の詳細な説明】電気化学的測定のための方法及び装置発明の分野本発明は電気化学的測定を行うための方法及び装置に関し、一つの観点においては水溶液の還元糖含量、特に、しかし適用を限定するわけではないが、農場サイレージ酒の還元糖含量の電気化学的測定に関する。発明の背景サイレージは冬の試料供給のためにその栄養分含量を維持するために可能な限り特別な状況下において取り扱われ貯蔵されなければならないことがよく知られている。貯蔵の間、多くの化学的変化が起こるため、例えばサイレージを使用する用意ができる時を決定するのを容易にするために、いくつかのサイレージの栄養要素を知ることは重要である。最も重要な要素の一つは還元糖含量である。一般に、人や動物が消費する食物及び飲物の製造及び他の生物的溶液において還元糖含量が容易に評価可能であることが重要であるという多くの例が存在する。サイレージサンプルを圧搾して得られた酒の、遊離砂糖含量を含めた様々な栄養要素を決定することが可能な分析システムがすでに知られている。しかし、このシステムは比較的高価で複雑であり、湿式化学（wet chemistry）に依存する。このようなシステムは英国特許ＧＢ２２０２６３７Ａに開示されている。バイオセンサーの分野では、欧州特許ＥＰ０１７０３７５Ａによりキャピラリー充填装置（ＣＦＤ）が知られている。通常の形では、これは毛管作用により液体が引き込まれるのに十分細い隙間により分離された二つの板を含む。板の内部表面は印刷電極を備え、例えば、スクリーン印刷によって配置された試薬層、も又備え得る。この試薬層は特定のテストを実施するときに引き込まれる溶液によって選択される。欧州特許０２５５２９１Ａには検出される特定の糖のために特異的な酸化酵素、例えば、液体中、例えば、血液サンプル中のブドウ糖の濃度を測定するためにグルコース酸化酵素を含有するＣＦＤが開示されている。そのため、この装置は特定の糖に特異的であるため、一度にある一つの特定の糖のみを試験し得る。糖の還元性（例えば、フェリシアン化イオンのフェロシアン化イオンへの還元を含む）を利用することにより溶液の糖濃度を測定することも又知られている。そして、得られたフェロシアン化イオンは、例えば分光光度的方法、又は可能な電気化学的方法により検出されるが、分光光度的方法が一般に好まれている（例えば、フェロシアン化イオン系を使用したときは、溶液の黄色の減少を測定することによる）。従来、これはアルカリ性のｐＨ、例えばｐＨ９〜１２において、触媒（例えばＮｉ²⁺，Ｃｏ²⁺）の存在下で温溶液において行われる。このような技術は通常、使用者に結果をもたらすのにおよそ３０分かかる。糖の還元性を利用した糖の定量的測定は酸性のｐＨにおいても又行われている。しかし、この場合、検出される生成物は、糖の加水分解という異なる経路により生成される。還元糖の総量の測定は生成した還元形反応化合物の濃度（例えば、フェロシアン化イオンの濃度）を通常は分光光度法、又は場合により電位差法により測定することにより行われる。従来の分光光度技術を使用した溶液の還元糖含量の測定は施設及び訓練された実験室員を必要としてきた。又、溶液の総糖含量の測定に従来使用された方法及び技術は、しばしば、時間がかかり労力を要した。公知の他の糖測定技術にはパルス電流検出があり、例えば、“Triple-Pulse A mperometric detection of Carbohydrates after Chromatographic separation ”，Hughes and Johnson，Analytica Chimica Acta,149(1983),1-10に記載されているような技術である。この技術はサンプル中の糖を直接、作用電極で酸化することを含有する。この技術は一般的に単糖（クロマトグラフィーのカラムからサンプルを溶出した時に分析される例のような）の検出に最も適しており、比較的少量（ナノモルオーダー）の糖にのみ適している。又、この技術は試験装置にいくつかの異なる電位の適用を必要とし、そのためこの方法がいくつかの異なる段階を用いて実行されることを要するという短所も持つ。この方法は又、分析実験室において実行するのにのみ適しており、高価な装置と熟練したオペレーターの使用を必要とする。サイレージ酒の試験だけではなく、食品及び飲物製品に関する様々な水溶液の試験において、溶液中の特定の一つの糖の存在に依存せず、さらにとりわけ溶液の総還元糖の測定を行う目的で、水溶液の糖含量を現場で測定する簡単な方法及び装置を供することは非常に有利である。発明の要約本発明は一つの面において、水溶液中の還元糖含量の測定方法を供し、アルカリ環境下において、溶解性酸化還元媒体の存在の下、試験溶液の薄い層を形成し、酸化還元媒体の還元生成物の量を電気化学的に測定することを含む。酸化還元媒体は特定の糖に特異的ではなく、本発明の装置で生じる反応は非酵素的であることを注目すべきである。しかし、酸化還元剤の存在下では、アルカリ環境は糖の加水分解を避けるために必要である。これは、例えば媒体における溶解性アルカリ生成物質（例えば、溶解性水酸化物）を含有させることにより達成され得る。又、アルカリ環境を国際公開ＷＯ９４／１５２０７に開示された技術によってもその場で発生させ得る。本方法はＣＦＤのような薄層電気化学的測定装置において簡便に実施される。その装置の内面は少なくとも一つの溶解性酸化還元媒体の被覆を含有し、これはアルカリ金属の水酸化物のような溶解性アルカリ生成物質を含む。薄層電気化学的測定装置による測定は電位差的又は電量的に実行され得、どちらの測定技術も本発明の実施に使用され得る。これらの技術は両方とも電気化学的バイオセンサーの分野においてはよく知られており、今この点の詳細を記述することはしない。電位差測定技術は参照電極に関する作用電極の電位の変化を測定するのに対し、電量分析技術は作用電極で受容する電荷又は電流を測定する。どちらの測定技術を使用しても、測定の正確さは作用電極に対するイオンの拡散により悪影響を受けることがわかっている。測定の正確さは作用電極に近接した溶液の体積中に生成したイオンの計数に依存する。効果を得るためには、還元されたイオンが作用電極において再び酸化され、放出された電子の総量が所望の測定値となる。問題の体積の外部から還元されたイオンがその体積中に拡散し、測定に組み込まれた場合、その測定は誤った値を与える。従って、本発明の他の面においては、作用電極及び参照電極を内部溶液受容表面にもつ電気化学的測定装置を供し、この装置においては、作用電極と同じ電位に実質上維持された保護電極が、作用電極と参照電極の間に設けられる。使用の際、保護電極は測定を行う作用電極に近接した溶液体積への還元されたイオンの拡散を防ぐように作用する。そのため、本発明の第一の面に関し、酸化還元媒体の酸化還元対の還元されたイオンが作用電極に移動する傾向にある場合、これらのイオンは保護電極に到達した時に酸化され、保護電極は作用電極とは異なる回路に接続され、そのためイオンが測定された電圧及び電流へ間違って加算されるのを防いでいる。しかし、本発明の第二の面における保護電極は、本発明の第一の面による方法においてとりわけ便利であるが、その方法に限定して用いられるものでなく、他の方法及び応用に使用される薄層電気化学的測定に適用し得る。本発明の第一の面は、特に、例えば、薄層電気化学的センサーを使用した、サイレージ酒のような水溶液中の還元糖含量の測定に関する。好ましい薄層電気化学的センサーはキャピラリー充填装置（ＣＦＤ）である。ＣＦＤは、例えばセラミクス、ガラス又はプラスチック材料の２枚の板からなり、小さい隙間が開けられている。一枚の板の内部表面には参照電極が置かれ、そこから離れた板の表面に作用電極がある。作用電極は比較的高い電位を保っている。他方の板の内部表面には溶液サンプル中の試験される物質に適した試薬層をスクリーン印刷され得る。電極上に例えば炭素のような接点パッドが設けられ、これによって、装置を使用しているときに、電気的測定回路に接続したプローブが、参照電極を考慮した作用電極における電圧又は電流を検出する測定を可能にする。このような型のＣＦＤは例えば欧州特許ＥＰ１７０３７５Ａに開示されているように当業者に知られており、様々な目的、例えば、ｐＨ値の測定、血液及び血漿サンプル中のグルコース含量の測定、乳酸の測定及びリン酸又は硝酸の測定に使用されている。血液サンプル中のグルコース含量の測定において、測定の基礎になる化学作用は、グルコースと大過剰に存在するフェリシアン化物との反応であり、グルコースオキシダーゼにより触媒される。反応により生成したフェロシアン化物は計数器及び作用電極間の電流を監視することにより測定する。上記の全ての例において、実施される検出は比較的簡単なサンプルにおける一種の糖に関するものであり、検出される種に特異的な試薬、通常は酵素を用いる。これに対して、本発明はアルカリ環境下において、複数の糖を含有する水溶液中の総還元糖含量を測定する目的で、酸化還元媒体の形の試薬を使用するものである。サイレージ酒を例にすると、通常グルコース及び果糖を主として含有するが、キシロースやアラビノースのような他の糖も又含有し得る。本発明の酸化還元媒体は多くの基準を満たすことを要するが、これらの最も重要なのは酵素系における酸化還元媒体の従来の使用から一般的によく知られている。ＣＦＤの場合、及び本発明の実施のために、酸化還元媒体に必要な条件としては、例えば、迅速に溶解すること、分析物と素早く反応すること、及びＣＦＤにおける実際の使用に適した作用電極と迅速かつ可逆的な電気化学性を持つ酸化還元対を生成すること等がある。ヘキサンルテニウムのような酸化還元媒体も使用可能であるが、フェリシアン化イオンはそれ程高価ではなく、血液サンプルを試験するためのＣＦＤにおいて使用され得ることが実証されている。本発明の好ましい実施例として、酸化還元試薬はフェリシアン化イオンであり、好ましくは溶解したときに実質的に飽和溶液（約１モル）を生成する量で存在し、好ましいアルカリ生成物質は水酸化リチウムであり、１乃至３モル、好ましくは約２．５モルで使用し、水酸化ナトリウムのような他の金属水酸化物も又使用できる。適当であれば、適したバインダーを酸化還元試薬とアルカリ生成物質に組み込むこともできる。ここにおいて、ビーカースケールで、フェリシアン化イオンと水酸化ナトリウムを試薬とする酸化還元反応を使用し、水溶液の糖含量を測定することは公知であることを明らかにしておくべきである。しかし、必要な反応は上昇した温度、典型的には約８０℃で促進される必要があり、その場合でも測定の実施におよそ３０分かかる。分析は生成したフェロシアン化物の量を検出することにより行われる。これは、通常、分光光度技術により行われる。注目すべきことに、本発明において、ＣＦＤにおける方法は室温で実施され、一般的に測定は約１分以内、常に２分未満で完成する。生じる通常の反応は果糖の触媒的酸化、例えば、フェリシアン化物とともにアルカリ条件下において行われる。これは次の式で表わされる。ＣＨ₂ＯＨ−ＣＨＯＨ−（ＣＨＯＨ）₂−ＣＯ−ＣＨ₂ＯＨ→ ＣＨ₂ＯＨ−ＣＯ−（ＣＨＯＨ）₂−ＣＯ−ＣＨ₂ＯＨ＋２Ｈ⁺＋２電子生じている機構は十分には分かっていないが、薄層電気化学センサーを使用する本発明の方法では、必要な反応は室温で迅速に起こるのみでなく、予想以上の多量の電子を放出する。ＣＦＤの制限された空間において、大過剰又は高濃度のフェリシアン化イオン及びアルカリは、薄層サンプルの迅速な運動と共に、生じる反応を促進する原因となることが明らかである。実験より、高濃度の糖が存在するとき、従ってまた、比較的低い濃度のフェリシアン化及び水酸化イオンが存在するとき、反応速度はかなり低下することが明らかにされている。そのため、この方法は含有糖濃度０乃至２５ｍＭの溶液に最も適しているようである。このレベルの濃度はサイレージ酒及び多くの他の生物学的溶液において典型的に見受けられる。本発明の方法の付加的なそして予期しなかった利点は、試験サンプル中の還元糖の濃度に依存して、還元糖の定量的検出のための本電気化学的反応の感度を“ 調整”することが可能であることである。例えば、比較的大量の還元糖が試験サンプル中に存在する場合、測定は比較的低いアルカリ生成物質濃度において実行し得る。サンプル中の還元糖がかなり高い濃度の場合、薄層測定装置に使用するアルカリ生成物質の濃度は１モル未満でも可能である。逆に、サンプル中の還元糖濃度が比較的低いと考えられる場合、測定は比較的高いアルカリ生成物質濃度（例えば、４乃至５モル）で実行することが可能であり、そのため、サンプル中の与えられた還元糖の量に対し、比較的大きい電流を生じる。ここで、比較的大量の糖の測定において、電気的に測定される値は“目盛り切れ”になることがない。その代わり、測定はより低いアルカリ生成物質の濃度において実行され得る。そのため、本発明の利点は従来可能であったよりも広範囲の還元糖濃度を含むサンプルの分析に使用することが可能である点である。本方法の更なる利点は、既知の方法により試験溶液を処理し、サンプル中の非還元糖を還元糖に転換すると、水溶液の総糖量を測定するのに使用できることである。便利なことに、この転換は前処理として実行し得る。適した前処理は、例えば、適当な酵素を用いて非還元糖を還元糖に転換することを含み得る。このような技術は当業者には容易に理解され得るであろう。そのため、サンプル中の還元糖の量は上述のように測定することができる。装置中の液体サンプルの薄層の厚さは臨界的ではないが、上述の反応はＣＦＤの板の間の空間が１ｍｍ未満、好ましくは０．５ｍｍ未満、最も好ましくは０．１乃至０．２ｍｍの範囲であるときに促進されるようである。ＣＦＤにおいて、反応系の反応速度は、どのように迅速であっても、液体層の厚さを減少することによりさらに改良される。薄層電気化学的装置の電極物質の選択も又ある程度重要である。参照電極に第一に要求されるのは分析物と可能な限り反応しないことである。本発明において、参照電極は好ましくは銀／塩化銀である。一方、作用電極は酸化還元対を元に戻すために分析物に高度に反応する必要がある。本発明において、炭素または金参照電極の使用が好ましく、最も好ましいのは金である。保護電極が使用されるとき、これは作用電極と同じ物質が好ましい。上記のＣＦＤは多くの還元糖含有水溶液について本発明の方法を実行することに成功裡に使用された。しかし、異なる型の糖に対する装置の反応は、正確な定量評価が要求されるとき、ある程度変化を必要とすることが分かっている。モノ −サッカライド及びジ−サッカライドの両方には反応しやすいが、スクロースのようなある種の糖の反応はグルコース及び果糖のような他の還元糖の反応より定量的に低い。しかし、この方法は多くの糖含有水溶液、例えば、サイレージ酒（グルコース及び果糖が主要成分である）に正確な結果をもたらし、初めて使い捨て可能であり、短時間室温で総還元糖含量を測定することがもたされ、また、これは現場、例えば、農場の現場における使用に適しているＣＦＤを与える。さらに、センサー活性を促進させる方法が一層発展することにより、多くの他の分野で生じる水溶液の総還元糖含量の測定に十分可能な方法及び装置となるであろうことが信じられている。例えば、更に考えられる応用は、野菜及び果物の成熟の測定への応用である。これは果物又は野菜サンプルから搾り出した汁の還元糖含量の測定を含有するであろう。実施態様の説明本発明の更なる特徴を実際の方法及び装置を与えることにより、実施例によってのみ、以下の記述により明らかにする。付随の図について次に説明する。図１は、電量分析測定用に設計されたキャピラリー充填装置（ＣＦＤ）の説明図である。図２は、電量分析ＣＦＤの測定回路である。図３は、電位差測定用に設計されたＣＦＤの説明図である。図４は、電位差ＣＦＤの測定回路である。図５は、ＣＦＤにおける保護電極の使用時又は不使用時の電荷対時間を説明するグラフである。図６は、電圧走査試験ＣＦＤにおける果糖の電流対電位の電解電量応答曲線である。図７は、試験ＣＦＤ（酸化還元対を用いない）における果糖濃度対総電荷曲線である。図８は、酸化還元媒体を使用した試験ＣＦＤにおける果糖濃度を変化させたときの総電荷対時間のグラフである。図９乃至１１は異なる糖、すなわち、果糖（図９）、グルコース（図１０）及びガラクトース（図１１）の実際のＣＦＤで得られた測定結果に認められた電荷対濃度のグラフである。図１２は電荷対糖濃度のグラフであり、サイレージ酒について実際のＣＦＤで得られた結果を示している。図１３は強制対流槽（forced convection cell）の概略図である。図１４乃至１６は強制対流槽を使用して得られた種々な試験の結果を示す曲線である。発明の詳細な説明キャピラリー充填装置（ＣＦＤ）は小さい隙間、例えば約０．２ｍｍの間隙で離された２枚の板よりなり、毛管作用により板の間の空間に液体サンプルが引き込まれる。図１に示したように、セラミック物質よりなる１０ｍｍ×２０ｍｍの板１０は、測定、ここでは電量分析の方法に適合した電極の配列をその上に設けている。第１の電極である外部電極１２は銀／塩化銀の参照電極であり、第二の電極である内部電極１４は金（代わりに炭素も使用し得る）の作用電極であり、第三の電極である中間の電極１６は作用電極と同じ物質であることが好ましい保護電極である。電極は全て８μｍの厚さで従来のスクリーン印刷技術を使用してコーティングした。電極１４及び１６は約１５０μｍの隙間で離されている。誘電層２０を通して延長している導線１８は電極を各々接点又はターミナルパッド２２に接続している。そのため、図２に示した電気測定回路の部分を形成するプローブは作用電極１４を通過する電荷又は電流を検出することができる。図２に示した電量分析測定回路は自明と考えられるので、詳細については記載しない。簡単に述べると、電量分析測定回路は参照電極において安定な参照電位を与え、維持し、作用電極を通じ流れる電流を集め、それをアナログ測定信号に変換し、保護電極から測定信号への電流の漏れを防ぎ、作用電極と同じ電位に保護電極を維持する。最終的な測定信号はＡ／Ｄ変換器に受信され、Ａ／Ｄ変換器はデジタル情報をソフトウエアにより制御されている処理装置に送り、決められた期間作用電極に流れた総電流を計算する。結果はＬＣＤに表示することが可能である。図３は簡便な電位差測定用に設計されたＣＦＤを示す。塩化銀参照電極は２４に示されており、炭素又は金の酸化還元作用電極は２６である。誘電層２０は電極上に設けられる。保護電極は示していない。しかし、本発明の実施には保護電極は好ましく、図１に示したものと同様な電極をセラミック板に備えることができる。図４に電位差測定回路を示す。これは所定時間、作用電極で生じた総電位変化を測定する電位フォロアー（follower）として作用する。図１乃至４の配列は保護電極を供した以外は従来のものであり、保護電極は本発明の第２の重要な面を構成し、後に再び説明する。とりわけ、図１に示した型の電極配列の場合、円形同心電極を方形の物のかわりに使用できる。試薬層２８は、図１及び図３の両方の配列の場合、ＣＦＤの他方の板３０（ガラス又はポリカーボネート）にスクリーン印刷されている。本発明において、試薬層はアルカリ生成物質を組み込んだ酸化還元媒体であり、例えば、アルカリ金属の水酸化物、とりわけ水酸化リチウムであり、他のアルカリ金属水酸化物又は他の一般的な金属水酸化物も代わりに使用され得る。実際の目的では、スクリーン印刷インクを構成するために、酸化還元媒体はＰＶＣ、アセテート又はセルロースのようなポリマー溶液により担持される。これは図示のように反対側の板に設ける代わりに、電極板に備え付けることができるし、両方の板の部分に設けることもできる。酸化還元媒体はＣＦＤに感知される酸化／還元反応の観点から選択され、作用電極が金の場合、酸化還元対の可逆性も又考慮する。そのため本発明において、好ましい酸化還元電極は糖含有水溶液に迅速に溶解し、溶液中の還元糖により容易に還元されることが可能であり、金電極で容易に可逆反応をする物質である。そのため、選択された酸化還元媒体はフェリシアン化カリウムの形のフェリシアン化イオンである。試薬層は、サンプル溶液が板の間の隙間に毛管作用により引き込まれた時、可能な限り大量のフェリシアン化及び水酸化物イオンが迅速にその系に取り込まれるような広さ及び厚みの上に設けられている。過量の水酸化リチウムはフェリシアン化物の溶解性に有害な作用を及ぼすことがあり、そのため、好ましい試薬層は２．５Ｍ水酸化リチウム及び１Ｍフェリシアン化カリウムを含有する。水酸化物イオンの量の実質的減少は系の反応性に不利に作用し、従って、水酸化イオン及びフェリシアン化イオンの量的なバランスをとることは必要な折衷策である。ＣＦＤの保護電極の重要性について次に説明する。第一に、作用電量分析ＣＦＤにおいて、例えば還元糖含有サンプルについて、酸化還元媒体としてフェリシアン化イオンを使用したときに、総電流測定は、フェロシアン化イオン（糖により還元された）が再酸化されたとき、作用電極における電子の放出の結果生じることを理解すべきである。測定される総電流は作用電極と同じ広がりのサンプル溶液の量に起因する。ＣＦＤのような薄層電気化学的測定装置の性質により、フェリシアン化イオンからフェロシアン化イオンへの還元及び結果として起こるそれらの再酸化は比較的迅速に起きることが分かり、そのため、比較的短の時間後に電流対時間のプロットは電流のプラトーとなる。しかし、保護電極を使用せずに測定が電量測定技術により行われた場合、作用電極と同じ広がりの体積へのこの量の外部からの還元されたイオンの拡散が生じるので、このプラトーは実現されない。そのため、所望の測定は事実と異なる可能性がある。しかし、保護電極を導入した場合、還元されたイオンの外部から前記の体積への拡散は作用電極へ到達する前に再酸化され、そのため電流対時間のグラフで予想された総電流プラトーが実現される。図５には電量測定ＣＦＤにおける保護電極の導入の効果を示し、点線は保護電極非使用時のセンサーの応答を示し、実線は保護電極使用時のセンサーの応答を示している。曲線はグルコース酸化酵素試薬、フェリシアン化カリウム、リン酸緩衝液（ｐＨ７）とともに、１５ｍＭグルコース溶液を使用したときのグルコースセンサーより得られたものである。同様な効果が電位差ＣＦＤにおいても得られる。十分に調製されたＣＦＤよりも、試薬層のないＣＦＤで繰り返し実験を行う方がより簡単であり、この方法で多くの実験が行われたが、必要に応じ糖含有サンプルとともにＣＦＤにフェリシアン化イオン及び水酸化物イオンの両方を、ピペット又はそのような物で添加した。これらの実験は、異なるフェリシアン化及び水酸化物イオンの濃度、異なる水素化物源、異なる糖及び異なる糖濃度、作用電極における異なる作用電位のような、系に関係するパラメータを種々変更したときの影響を試験した。続いて、調製された実際のＣＦＤが試験され、得られた結果は空のＣＦＤ実験の間、得られた最良の結果と比較された。これらの実験の顕著な結果を簡単に述べる。理論的に、酸化還元電位の変化により測定される応答は、ネルンストの式により示される。Ｅ＝Ｅ°＋ＲＴ／ｎＦｌｎ［Ｍｏｘ］／［Ｍｒｅｄ］この式において、Ｅは反応電位、Ｅ°は基準電極電位（Ｖ）、Ｒは気体定数８．１３（ｋＪｍｏｌ^-1Ｋ^-1）、Ｔはケルヴィン温度（絶対温度）、ｎは酸化物１モルあたりに移動したモル数及びＦはファラデー定数（−９６５００Ｃｍｏｌ^-1 ）、又［Ｍｏｘ］及び［Ｍｒｅｄ］はそれぞれＭの酸化体及び還元体の濃度である。結果として、この原理に基づいて作動する装置の応答はいずれも対数である。例えば、電量検出に基づくセンサーは線形応答で与えられる。実際に、４００ｍＭの果糖及び１Ｍの水酸化ナトリウムを用い、ＣＦＤにおいて循環ボルタメトリーを使用して行われた実験の結果、金作用電極における作用電圧において、酸化は２００乃至３００ｍＶの範囲にピークが認められた。実際、おそらく金電極の結晶配向によるものと思われるが、この範囲に二つのピーク活性が見られたが、これは顕著ではない。同様の試験を１００ｍＭ乃至５Ｍの水酸化ナトリウム濃度で、又、水酸化カリウム及び水酸化リチウムについても同様に濃度を変化させ実行した。これらの実験の結果から、作用電極の好ましい作用電圧は１００ｍＶ乃至４００ｍＶの範囲、好ましくは約３００ｍＶにあると考えられた。保護電極を使用した場合、同様の電圧がこの電極に適しているようであった。図６は、これらの実験において、果糖により得られた電圧反応曲線を示している。条件は、１Ｍ硝酸ナトリウム、電圧１００ｍＶｓ^-1、硝酸飽和４００ｍＭ果糖（反応時間３０秒）である。電圧は−７００ｍＶ乃至７００ｍＶの範囲で走査した。計数器の電極は直径１．６ｍｍの金の円盤であり、銀／塩化銀の参照電極を用いた。示した曲線は１Ｍ水酸化リチウム、１Ｍ水酸化ナトリウム及び１Ｍ水酸化カリウムのものである。類似した結果が他の糖より得られた。線形性電圧試験により、作用電極の電圧ピークの位置及び大きさは、おそらく参照電極での電位への影響から、果糖の異なる濃度によって、若干程度変動し得ることがわかったが、これらの変動はその後の試験に鑑みて重要でない。第３に、作用電極における水酸化ナトリウムの存在の下、果糖の直接の酸化を試みる試験が行われたが、有益な結果は得られなかった。次に、空のＣＦＤに糖及び水酸化物イオンとともに酸化還元媒体であるフェリシアン化イオンも又添加し試験を行った。ここで、理論より予期されたように、果糖濃度に伴う総電荷の線形性応答（電量ＣＦＤにおける）が０乃至５０ｍＭの果糖濃度の範囲に得られた。電量応答に関するグラフを図７に示す。条件は１０μｌの果糖溶液に４０μｌ（１Ｍフェリシアン化カリウム）を加えたもの、２．５Ｍ水酸化リチウム、反応時間６０秒、電位３００ｍＶであった。第二の一連の実験を行ったところ、これらの実験は前述の結果、すなわち、作用電極に好ましい電位範囲が１００乃至４００ｍＶであることを裏付けた。次に、第三の一連の実験を行ない、フェリシアン化及び水酸化イオン加えた、ＣＦＤにおける果糖濃度の変化の総測定電荷に対する影響を試験した。図８のグラフは空のＣＦＤにおける果糖の電量応答即ち反応時間の効果を示している。条件は１０μｌ果糖溶液に４０μｌ（２．５Ｍ水酸化リチウム／１Ｍフェリシアン化カリウム）を加えたものであった。作用電位は３００ｍＶであった。理想的には、曲線は実質的に平坦であるべきであるが、結果では果糖濃度が約５０ｍＭ以上において、総測定電荷に影響するいくつもの効果が生じる。１００ｍＭ以上では、測定された総電荷の減少が生じ得る。生じる効果の理由を探る必要はないが、銀参照電極における果糖の吸収及びその結果生じる参照電極での電位のずれがある程度重要な理由であると信じらる。さらに重要なことに、図８の曲線はＣＦＤセンサーを使用した本発明の方法の潜在的な有用性を示している。室温において、２分を越えない非常に短時間に非常に高く、容易に測定できる、ビーカーでの化学反応の場合よりもかなり大きい、総電荷レベルが得られる。とりわけ０乃至２５ｍＭの範囲、しかも５０ｍＭまでの範囲の糖レベル、これは、サイレージ酒を含む生物学的溶液に適用された範囲のものであるが、この範囲において、糖レベルの測定を行うのにこの方法は非常に実用的である。さらに、一般に図１に示される実際的なＣＦＤでフェリシアン化及び水酸化イオンの試薬層を持つものを、一連のキャリブレーションで試験糖溶液サンプルを用いて電気化学的測定を行うことにより試験した。これについて簡単に述べる。糖、すなわち、グルコース、果糖及びガラクトースの貯蔵溶液を、９ｇの糖を１００ｍｌの水に希釈することにより調製した。貯蔵溶液の少量ずつを適当な量の水で希釈することにより、１．５、３．１２、６．２５、１２．５、２５及び５０ｍｍｏｌ／ｌの濃度のキャリブレーション溶液を調製した。２０μｌの糖溶液を新しいＣＦＤに挿入した。ＣＦＤの内部表面には、３３％の水酸化リチウム及び６７％のフェリシアン化物をＰＶＣ母材に含有する試薬層が設けられ、これは（適用した水溶液サンプルの希釈の後）フェリシアン化物に関し飽和（すなわち、約１モルの濃度）し、水酸化リチウムに関しては約３乃至５モルの溶液を与えた。溶液をＣＦＤにおいて約１分間平衡状態にさせた。次に、フェリシアン化物の濃度をＭ２７０ＥＧ＆Ｇポテンシオスタットを使用し、制御された電位電量分析により測定した。その結果を表１に示し、図９乃至１１にはそのグラフを示した。図９では電荷１．３０、濃度＋３．８３、相関９９．８であった。図１０では電荷１．６３、濃度＋３．１３、相関９９．９であった。図１１では電荷１．６７、濃度＋３．０７、相関９９．９であった。キャリブレーションの後、既知総還元糖濃度（従来技術により測定）のサイレージ酒サンプルの少量ずつを、上記と同様の実験方法により行われたキャリブレーション実験に使用したのと同じＣＦＤを用いて分析した。結果は表２に示し、そのグラフを図１２に示した。図１２では、電荷１．７８、濃度＋１７．６５、相関９５％であった。とりわけ、表２及び図１２の結果より、ＣＦＤを用いた本発明の方法は糖の混合物を含有する水溶液の還元糖含量を可成りの正確さをもって定量的に評価することが可能であることが示される。さらに、実験を図１３に示したような強制対流槽（ＦＣＣ）を使用して行ったが、これは実験室で用い得るＣＦＤに対応する装置である。槽は試験溶液５２を入れるための容器５０を含み、その中に銀／塩化銀二重連結参照電極５４及び印刷された金電極５８を持つ板５６を浸している。溶液を強制的に混合し、電極間のΔＥを測定した。この更なる作業は電量測定電流の代わりに電位差測定電流を使用して行われた。実際には、データはＧＰＩＢカードを経てロータスメジャー（lotus measure ）に連結されたＫｅｉｔｈｌｅｙエレクトロメーターにより得られた。図１４、１５及び１６は、図１３のＦＣＣを使用しフェリシアン化物及び水酸化リチウム（作用量それぞれ０．２５Ｍ及び２Ｍ）を含有する混合物に果糖を含有させた溶液を添加したときの電位差応答を示したものである。図１４及び図１５の曲線は以下に示す異なる糖濃度により与えられる。 □ ０．０１６Ｍ＋０．０３１Ｍ ◇ ０．０６２Ｍ △ ０．１２５Ｍｘ０．２５Ｍ ▽ ０．５Ｍ図１５は図１４の目盛りを拡大した曲線の一部を示している。フェリシアン化物を水酸化リチウム含有溶液に添加することにより系の電気的分極は迅速に反対になり、図１４においてはマイナス値として示されている。これらの図に示したように、果糖含有溶液の添加は電位の反転（より陽性になる）を起こす。果糖濃度が０．１２５Ｍよりも大きいとき、初めの電気分極が達成される。電位が陽性になるのは果糖濃度が０．１２５Ｍより大きい全ての濃度においてである。陰性と陽性の間での転換において、溶液の色は黄色から透明に変わるが、黄色はフェリシアン化物含有溶液（酸化型）の色であり、透明はフェロシアン化物含有溶液（還元型）の色である。この挙動はフェリシアン化物による果糖の実質的な化学量論的酸化の証明である。フェリシアン化物の還元を記載した式はよく知られており、以下のとおりである。２Ｆｅ^III（ＣＮ）_6(ox)＋ｆｒｕ_red→２Ｆｅ^II（ＣＮ）_6(red)＋ｆｒｕ_(ox) ２モルのフェリシアン化物が１モルの果糖の酸化に要求されるということは、フェリシアン化物による他の六単糖の糖であるグルコースの酸化において、同一の化学量論的な関係が存在する事実により支持される。最大濃度０．５Ｍで存在する果糖を完全に酸化するためにはフェリシアン化物は１Ｍの濃度で使用されるべきである。これはフェリシアン化物の溶解性の限界である。試験において１Ｍのフェリシアン化物を使用することが実際的ではなかったが、溶液成分を別にしておくことが要求されるため、ＣＦＤにおいて１Ｍのフェリシアン化物を使用することの意味がある。フェリシアン化物を含有する塩を印刷した乾燥した層を使用することにより、１Ｍのフェリシアン化物の濃度は、初めはインシュリン依存的糖尿病患者による血中グルコース濃度モニタリングへの使用のために開発されたグルコースＣＦＤにより機械的操作により達成された。前述の制限にもかかわらず、ネルンストの式に従った電位応答と果糖濃度の関係を示すことは可能である。図１６は図１４及び図１５に示した各試験の電位応答対果糖濃度（対数表示）を示したものである。電位は果糖添加後５０秒の各サンプルにおける電極の分極の反転前のものを測定した。図１６の傾きは約０．０６７Ｅ／ｌｏｇ．Ｍであった。水酸化カリウム、水酸化ナトリウム及び水酸化リチウム、特に最後の二つを使用した試験から明らかにされた最後の点は、水酸化リチウムは水酸化ナトリウムよりも活性が低いにもかかわらず、吸湿性が低く、例えばサイレージの糖含量をその場で測定するといった、総糖センサーの実際の使用において、水酸化リチウムの貯蔵に際しては、乾燥剤と共に密閉した条件下で貯蔵することは恐らく必須であろうが、他に比較して貯蔵の問題が少ないであろう。装置内でその場でアルカリ環境を生成すること、例えば、国際公開ＷＯ９４／１５２０７に開示された技術を使用することは、アルカリ塩の不安定性による貯蔵の問題を克服するのに有利である。

【手続補正書】【提出日】１９９６年６月４日【補正内容】請求の範囲を次のように訂正する。「請求の範囲１．水溶液中の還元糖含量を測定する非酵素的方法であり、アルカリ環境において溶解性酸化還元媒体の存在の下、かつ還元糖の反応を触媒する酸素の不存在下、試験される溶液の薄層を形成し、酸'化還元媒体の還元生成物の量を電気化学的に測定し、還元生成物の量から水溶液中の還元糖の含量を測定することを含む方法。２．酸化還元媒体にフェリシアン化物を含む、請求項１の方法。３．媒体が飽和溶液を形成する量で存在する、請求項１乃至請求項２の方法。４．薄層の厚さが約１ｍｍ未満である、請求項１、請求項２又は請求項３の方法。５．薄層の厚さが約０．５ｍｍ未満である、請求項４の方法。６．薄層の厚さが約０．２ｍｍ未満である、請求項５の方法。７．アルカリ環境が溶解性アルカリ生成物質より形成される、請求項１乃至請求項６のいずれか１請求項の方法。８．溶解性アルカリ生成物質が、アルカリ金属の水酸化物、好ましくは水酸化ナトリウム又は水酸化リチウムを含む、請求項７の方法。９．水酸化物が少なくとも約１モルの濃度で存在する、請求項８の方法。 10．水酸化物が約５モル以下の濃度で存在する、請求項９の方法。 11．水溶液がサイレージ酒のサンプルを含む、請求項１乃至請求項１０のいずれか１請求項の方法。 12．溶液中の還元糖濃度が約５０ｍＭ以下であり、好ましくは０乃至２５ｍＭの範囲である、請求項１乃至請求項１１のいずれか１請求項の方法。 13．内部表面が少なくとも一つの溶解性酸化還元媒体により被覆されている薄層電気化学測定装置であり、アルカリ環境を生成する手段を含有する装置により行われる、請求項１乃至請求項１２のいずれか１請求項の方法。 14．溶解性酸化還元媒体が溶解性アルカリ生成物質を含有する、請求項１３の方法。 15．溶解性アルカリ生成物質がアルカリ金属の水酸化物、好ましくは水酸化ナトリウム又は水酸化リチウムを含有する、請求項１４の方法。 16．薄層電気化学測定装置が少なくとも一つの作用電極及び一つの参照電極を有し、使用時に水溶液サンプルの薄層が電極をまたぐように設けられた、請求項１３乃至請求項１５のいずれか１請求項の方法。 17．内部液体受容表面に作用電極及び参照電極を有し、作用電極と参照電極との間に保護電極を有し、保護電極は実質的に作用電極と同じ電位を維持している、請求項１６の方法。 18．３つの電極が同心円上に配置されている、請求項１７の方法。 19．電気化学的測定装置が一対の実質的に平行な板を有する、請求項１３乃至請求項１８のいずれか１請求項の方法。 20．実質的に平行な板が約１ｍｍ以下の距離により隔てられている、請求項１９の方法。 21．実質的に平行な板が約０．２ｍｍ以下の距離により隔てられている、請求項２０の方法。 22．薄層電気化学的測定装置がキャピラリー充填装置を含有する、請求項１３乃至請求項２１のいずれか１請求項の方法。」

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ボンナフー、バンサンフランス国、13590 メイルーユ、シュマン・デ・リール（番地なし)

Claims

【特許請求の範囲】１．水溶液中の還元糖の含量を測定する方法であり、アルカリ環境において溶解性酸化還元媒体の存在の下、試験される溶液の薄層を形成し、酸化還元媒体の還元生成物の量を電気化学的に測定することを含む方法。２．酸化還元媒体にフェリシアン化物を含む、請求項１の方法。３．媒体が飽和溶液を形成する量で存在する、請求項１乃至請求項２の方法。４．薄層の厚さが約１ｍｍ未満である、請求項１乃至請求項３のいずれか１請求項の方法。５．薄層の厚さが約０．５ｍｍ未満である、請求項４の方法。６．薄層の厚さが約０．２ｍｍ未満である、請求項５の方法。７．アルカリ環境が溶解性アルカリ生成物質より形成される、請求項１乃至請求項６のいずれか１請求項の方法。８．溶解性アルカリ生成物質が、アルカリ金属の水酸化物、好ましくは水酸化ナトリウム又は水酸化リチウムを含む、請求項７の方法。９．水酸化物が少なくとも約１モルの濃度で存在する、請求項８の方法。 10．水酸化物が約５モル以下の濃度で存在する、請求項９の方法。 11．水溶液がサイレージ酒のサンプルを含む、請求項１乃至請求項１０のいずれか１請求項の方法。 12．溶液中の還元糖濃度が約５０ｍＭ以下であり、好ましくは０乃至２５ｍＭの範囲である、請求項１乃至請求項１１のいずれか１請求項の方法。 13．内部表面が少なくとも一つの溶解性酸化還元媒体により被覆されている薄層電気化学測定装置であり、アルカリ環境を生成する手段を含有する装置により行われる、請求項１乃至請求項１２のいずれか１請求項の方法。 14．溶解性酸化還元媒体が溶解性アルカリ生成物質を含有する、請求項１３の方法。 15．溶解性アルカリ生成物質がアルカリ金属の水酸化物、好ましくは水酸化ナトリウム又は水酸化リチウムを含有する、請求項１４の方法。 16．薄層電気化学測定装置が少なくとも一つの作用電極及び一つの参照電極を有し、使用時に水溶液サンプルの薄層が電極をまたぐように設けられた、請求項１３乃至請求項１５のいずれか１請求項の方法。 17．薄層電気化学測定装置がキャピラリー充填装置を含有する、請求項１３乃至請求項１６のいずれか１請求項の方法。 18．内部液体受容表面に作用電極及び参照電極を有し、作用電極と参照電極との間に保護電極を有し、保護電極は実質的に作用電極と同じ電位を維持している電気化学的測定装置。 19．一組の実質的に平行な板を有する液体受容手段を含有する請求項１８の電気化学的測定装置。 20．実質的に平行な板が約１ｍｍ以下の距離により隔てられている、請求項１９の電気化学的測定装置。 21．実質的に平行な板が約０．２ｍｍ以下の距離により隔てられている、請求項２０の電気化学的測定装置。 22．３つの電極が同心円上に配置されている、請求項１８乃至請求項２１のいずれか１請求項の電気化学的測定装置。 23．請求項１８乃至請求項２２のいずれか１請求項の電気化学的測定装置により行われる請求項１乃至請求項１７のいずれか１請求項の方法。