JP2006170631A - バイオセンサ、及びその検査装置、ならびにその検査方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 バイオセンサ製造における品質安定化を実現させ、工程上負荷とならないバイオセンサを提供することを目的とする。
【解決手段】 メディエータもしくは酸化還元系発色色素と１種類以上の酵素とを少なくとも含む試薬層１９が、絶縁基板上に形成されたバイオセンサであって、酵素のうち少なくとも１種類は、１種類以上のヘム色素を含んでおり、ヘム色素を有する酵素の色が試薬層中のほかの組成物とは異なる色に呈していることを特徴とする。試薬層１９中、１５はフェリシアン化物カリウムの黄色結晶であり、１６はＡＤＨの赤色結晶である。
【選択図】 図１

Description

本発明は、生体試料中の測定対象物を定量するバイオセンサ、およびその検査装置、ならびにその検査方法に関するものである。より詳細には、バイオセンサの製造工程において、バイオセンサ試薬層に担持された酵素の位置や量を観察しやすくすることで、品質を高精度に管理できる技術に関する。

バイオセンサとは、微生物、酵素、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ等の生物材料の分子認識能を利用し、生物材料を分子識別素子として応用した、試料液中の基質含有量を定量するセンサである。即ち、生物材料が目的の基質を認識したときに起こる反応、例えば微生物の呼吸による酸素の消費、酵素反応、発光等、を利用して、試料液中に含まれる基質を定量するのである。そして各種バイオセンサの中でも酵素センサの実用化は進んでおり、例えば、グルコース、アルコール、乳酸、コレステロール、アミノ酸用のバイオセンサである酵素センサは医療計測や食品工業に利用されている。この酵素センサは、例えば検体である試料液に含まれる基質と酵素などとの反応により生成する電子によって電子伝達体を還元し、測定装置がその電子伝達体の還元量を電気化学的に計測することにより、検体の定量分析を行うようになっている。

このようなバイオセンサについて様々な形態のものが提案されている。従来のバイオセンサについて以下に説明する。図４はバイオセンサの分解斜視図である。ポリエチレンテレフタレート等からなる絶縁性の基板１（以下、単に「基板」とする。）の表面には、例えば金やパラジウムなどの貴金属やカーボン等の電気伝導性物質からなる導体層が、スクリーン印刷法やスパッタリング蒸着法によって形成されている。導体層は基板１全面または少なくとも一部に形成されていればよい。中央部に空気孔２が設けられた絶縁性の基板３は、切欠部４を有するスペーサ５を基板１との間に挟み込んで、基板１と一体に配置される。

基板１上には、複数のスリットによって導体層が分割されて対電極６、測定電極７及び検知電極８が形成されている。なお、各電極は基板１の少なくとも一部に形成されていればよく、また、測定装置と各電極との接続はリード線であってもよい。

スペーサ５は基板１上の対電極６、測定電極７および検知電極８を覆うように配置され、スペーサ５の前縁部中央に設けられた長方形の切欠部４によって試料供給路が形成される。また、試料供給路の先端は試料液の入口であり、入口に点着された試料液は、毛細管現象によって略水平方向に空気孔２に向かって吸引される。

試薬層９はスペーサ５の切欠部４から露出している対電極６、測定電極７および検知電極８に、酵素、電子受容体、必要であれば親水性高分子等を含有する試薬を滴下後、乾燥させることで形成される。

ここで酵素としては、グルコースオキシターゼ、アルコールオキシダーゼ、ラクテートオキシターゼ、コレステロールオキシターゼ、コレステロールエステラーゼ、ペルオキシダーゼ、ウリカーゼ、ヘキソキナーゼ、グルコキナーゼ、アスコルビン酸オキシターゼ、ビリルビンオキシターゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、ラクテートデヒドロゲナーゼのいずれかもしくはこれらを組み合わせて用いることができる。

電子受容体としては、フェリシアン化カリウムが好ましいが、フェリシアン化カリウム以外にもｐ−ベンゾキノン及びその誘導体、フェナジンメトルサルフェート、メチレンブルー、フェロセン及びその誘導体などを用いることができる。

このようなバイオセンサシステムは、とりわけ、試料液として人体の血液、また、基質として血液中に含まれるグルコース、アルコール、乳酸、コレステロールの含有量を定量することに適している。人体の体液中に含まれる基質の定量は、特定の生理的異常の診断や治療において非常に重要である。

この酸化還元酵素と電子受容体が試料供給路に吸引された試料液に溶解し、測定溶液となる。試料液中の基質との間で酵素反応が進行し電子受容体が還元される。反応後、この還元された電子受容体を電気化学的に酸化し、このとき得られる電流値から試料液中の基質濃度が測定される。このような一連の反応は、試料供給路で進行し、対電極６、測定電極７及び検知電極８によって電気化学的変化に伴う電流値が読み取られることになる。

このように構成されたバイオセンサにおける試料液の基質の定量方法について図５を参照しつつ説明する。

図５は、バイオセンサシステムを示す斜視図で、バイオセンサ１０とバイオセンサ１０を着脱自在に装着する測定装置１１である。バイオセンサ１０の先端に位置する試料点着部１２に点着された試料中に含まれる基質の量が測定装置１１によって定量されるようになっている。

測定装置１１は、例えば、バイオセンサ１０を着脱自在に装着する挿入部１３、バイオセンサ１０の試料点着部１２に点着された試料液中に含まれる基質の定量結果を表示する表示部１４を有している。

本バイオセンサシステムを用いて、試料液中の基質含有量を定量するには、まず、ユーザはバイオセンサ１０を測定装置１１に挿入後、バイオセンサ１０の電極に測定装置１１によって一定電圧が印加された状態で、試料液を試料点着部１２に供給する。点着された試料液がバイオセンサ１０の内部に吸引されて試薬層の溶解が始まる。測定装置１１は、バイオセンサ１０の電極間に生じる電気的変化を検知して定量動作を開始するようになっている。

ところで、上記従来のバイオセンサの製造工程において、最も品質に影響するのが試薬滴下の工程である。殊に試薬の量や位置のばらつきは製品性能に影響を及ぼす要因となるため、試薬滴下工程における品質管理は厳密に行う必要がある。これまでに試薬滴下工程の検査方法として、例えば滴下直後のバイオセンサ基板に光を照射し、基板と滴下液との境界部分を画像処理によって迅速に識別する方法等がある（特許文献１参照）。
特開２００２−５４９０５号公報

ところで、近年、バイオセンサの性能や測定精度に対する市場の要求が高まり、バイオセンサの品質管理もより厳しいチェックが望まれている。バイオセンサにおいて、品質に最も影響を及ぼすのは、試薬層の体積や、位置であるが、これらに加えて、殊に試薬層内の酵素量や酵素の位置を一定に保つことが極めて重要となることがわかってきた。これは近年、バイオセンサの性能において測定時間の短縮化が望まれており、そのため従来まではあまり重要視されていなかった各試薬の拡散速度がより重要となってきたためである。殊に酵素の拡散速度は、性能に最も影響する要因であり、そのため試薬層内の酵素量や酵素の位置を一定に保つことが、バイオセンサの品質に関して重要となる。

しかしながら上記従来の検査方法では試薬全体像の検査であるため、試薬内の組成物である酵素の量や、酵素の位置までは検査することができなかった。そこで製造工程内検査による新たな解決手段が望まれていた。

本発明は、前記従来の課題を解決するもので、バイオセンサの製造工程内において、試薬液乾燥後の試薬層内に形成される酵素の量および位置を確認でき、工程上の負荷をかけずに品質安定化を実現できるバイオセンサを提供することを目的とする。

従来の課題を解決するために、本発明のバイオセンサは、メディエータもしくは酸化還元系発色色素と１種類以上の酵素とを少なくとも含む試薬層が、絶縁基板上に形成されたバイオセンサであって、前記酵素のうち少なくとも１種類は、１種類以上のヘム色素を結合あるいは内包しており、前記ヘム色素を有する酵素の色が前記試薬層中のほかの組成物とは異なる色に呈していることを特徴としたものである。

本発明の検査装置は、バイオセンサのうち試薬層が形成された領域を撮像する撮像手段と、前記撮像手段からの画像に基づいて前記試薬層の面積を演算し、前記画像の中からヘム色素による呈色部分の面積を演算するか、または前記ヘム色素を有する酵素の分布を演算する演算手段とを備えることを特徴としたものである。

本発明の検査方法は、バイオセンサのうち試薬層が形成された領域の撮像画像に基づいて前記試薬層の面積を演算し、前記画像の中からヘム色素による呈色部分の面積を演算するか、または前記ヘム色素を有する酵素の分布を演算するようにしたことを特徴としたものである。

本発明のバイオセンサによれば、バイオセンサにおける試薬層内の酵素の量および位置を容易に確認でき、工程上の負荷をかけずに品質安定化を実現できるバイオセンサを提供することができる。

本発明者らは、バイオセンサの試薬層中でもほかの組成物と区別できる酵素を鋭意検討した結果、ピロロキノリンキノンとヘムＣの両方を有したキノヘモプロテインである、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ由来アルコールデヒドロゲナーゼ（以下、単に「ＡＤＨ」とする。）に着目した（Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １９９５ Ｍａｙ；１７７（９）：２４４２−５０．参照）。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａは例えば独立行政法人製品評価技術基盤機構・生物遺伝資源部門より分譲依頼することで得られる。この菌株を常法に従い培養、遠心分離を行い、例えばゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等により精製することで、ＡＤＨを得ることができる。このＡＤＨが有するヘムＣは、強い赤色色素であり、バイオセンサ内の乾燥試薬層中でも赤色を保ったまま結晶となることを見出した。

以下に、本発明のバイオセンサの実施の形態を、ＡＤＨを試薬層内に含むアルコールセンサを例として図面とともに詳細に説明する。

（実施の形態１）
図１は、本発明の一実施の形態におけるキノヘモプロテインバイオセンサの試薬担持部分を拡大した模式図を示す。図４で説明したバイオセンサのうち、基板部分の平面図であり、図中の符号は、図４と対応している。

図１に示した電極基板は、ポリエチレンテレフタレート製の基板表面にパラジウムをスパッタリング蒸着し、レーザートリミングによって電極パターンを描画したものである。
この電極基板の短手方向の幅は６．６ｍｍである。ＡＤＨ、フェリシアン化カリウム、硫酸マグネシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウムなど、試薬層を構成する組成物を溶解させた水溶液を調製し、該水溶液を電極基板上に滴下した。その後乾燥させて水分を揮発させ、試薬層を形成した。

ＡＤＨの試薬組成の割合は、画像処理装置にて他の組成物と色彩の違いを区別できる０．１％〜６０％、より好ましくは目視にて他の組成物と区別できる１．０％〜６０％である。他の組成物の割合は、フェリシアン化カリウムが２０〜８０％、より好ましくは４５〜６５％、硫酸マグネシウムが１５〜７０％、より好ましくは２５〜５５％、カルボキシメチルセルロースナトリウムが０．０１〜７．５％、より好ましくは０．０５〜３％である。また滴下する水溶液の量は０．５〜３．０マイクロリットル、より好ましくは１．０〜２．５マイクロリットルである。乾燥温度４℃〜６０℃、より好ましくは１５℃〜４０℃である。

図１において、乾燥状態の試薬層は対電極６、測定電極７および検知電極８上に担持されている。試薬層１９に含まれるＡＤＨは強い赤色色素であるヘムＣを有しているため、フェリシアン化カリウムと混在した状態であっても識別が可能となる。図１においては、試薬層の外縁部には、フェリシアン化カリウムの黄色結晶１５とは明らかに異なるＡＤＨの赤色結晶１６が集中し目視で確認することができた。

この赤色結晶１６を画像検査装置で追跡すれば、試薬層内の酵素量、酵素位置を製造工程内で非破壊的に判別することが可能となり、製品をロスすることなく検査を行うことができる。具体的には図２に示したとおり、前記バイオセンサが縦横に複数繋がったシート１７を搬送装置１８によって移動させ、前記試薬層１９が予め定められた測定位置を通過するとき、前記試薬層１９をカメラ２０にて撮影し、その画像を画像処理装置にて色彩の違いを解析し、前記試薬層全体の面積と前記ＡＤＨの赤色結晶１６の面積を演算することで、バイオセンサ一枚毎に酵素量を検査することができる。同時に前記試薬層全体の中心点を解析し、中心点から赤色結晶１６までの距離および座標を演算することで、試薬層内のＡＤＨの分布を検査することができ、前記面積と座標からバイオセンサ１枚毎に合否判別をすることができる。合否判別は、例えば面積であれば、試薬層全体に対する赤色結晶１６の面積の割合が試薬組成の割合と同等、分布であれば、赤色結晶１６の内径と外径が基準値以内、且つ内径円の内側には赤色結晶が無い等、面積と分布の片方もしくは両方に基準を設ければ良く、任意に仕様基準を設定することができる。

以上のように、本実施の形態１においてはＡＤＨをバイオセンサ上に担持することで、酵素位置，酵素量を製造工程内で検査することが可能となり、バイオセンサにおいて品質安定化を達成することができる。

なお、本実施の形態１ではＡＤＨ酵素で説明したが他のキノヘモプロテインや他のヘム色素を含む酵素でも同様な効果が期待され、本実施の形態１に限定されるものではない。

同様に、本実施の形態１ではバイオセンサ基板をポリエチレンテレフタレートで説明したが、他の合成樹脂やガラス等、絶縁性のものであればよく、本実施の形態１に限定されるものではない。

同様に、本実施の形態１ではバイオセンサ電極材料をパラジウムで説明したが、金や白金等の貴金属もしくはカーボン等の電気伝導性物質であればよく、本実施の形態１に限定されるものではない。

同様に、本実施の形態１ではバイオセンサ電極の形成方法をレーザートリミングで説明したが、電気伝導性物質を含むペーストを印刷する等の方法を用いてもよく、本実施の形態１に限定されるものではない。

同様に、本実施の形態１ではメディエータをフェリシアン化物イオンで説明したが他のＰ−ベンゾキノン及びその誘導体、フェナジンメトルサルフェート、メチレンブルー、フェロセン及びその誘導体等でも同様な効果が期待され、本実施の形態１に限定されるものではない。

また、メディエータ以外にも、電気化学的手法とは異なり光学的に分析対象物を検出する際に使用されるテトラゾリウム及びその誘導体や、Ｎ−スルホプロピルアニリン誘導体等の酸化還元系発色試薬を用いても同様に酵素の識別が可能であり、メディエータのみに限定されるものではない。

また、平面状の基板以外にも、ガーゼ、繊維綿等の含浸材でも同様な効果が期待される。図３は、ガーゼ２１に前記試薬を１分間含浸させ前記条件にて乾燥させたもので、ＡＤＨの赤色結晶２２はガーゼ内に点在してなることが示された。前記カメラと前記画像処理装置にて、ガーゼ内に占めるＡＤＨの面積と分布を割り出すことができる。

本発明にかかるバイオセンサは、バイオセンサにおける乾燥試薬層内に担持された酵素等のタンパク質の位置，量を検査装置で判定することが可能となるため、バイオセンサにおける製造工程内の品質安定化に有用である。

本発明に係るバイオセンサの平面図 本発明におけるバイオセンサの検査装置を示す構成図 本発明のバイオセンサにおける試薬層を拡大して示す模式図 従来のバイオセンサを示す分解斜視図 従来のバイオセンサおよびその測定装置を示す斜視図

符号の説明

１、３ 絶縁性の基板
２ 空気孔
４ 切欠部
５ スペーサ
６ 対電極
７ 測定電極
８ 検知電極
９、１９ 試薬層
１０ バイオセンサ
１１ 測定装置
１２ 試料点着部
１３ 挿入部
１４ 表示部
１５ フェリシアン化カリウムの黄色結晶
１６、２２ ＡＤＨの赤色結晶
１７ バイオセンサが複数繋がったシート
１８ 搬送装置
２０ カメラ
２１ ガーゼ

Claims (10)

1. メディエータもしくは酸化還元系発色色素と１種類以上の酵素とを少なくとも含む試薬層が、絶縁基板上に形成されたバイオセンサであって、前記酵素のうち少なくとも１種類は、１種類以上のヘム色素を含んでおり、前記ヘム色素を有する酵素の色が前記試薬層中のほかの組成物とは異なる色に呈していることを特徴とするバイオセンサ。
2. 前記ヘム色素を有する酵素がグルコースオキシターゼ、アルコールオキシダーゼ、ラクテートオキシターゼ、コレステロールオキシターゼ、コレステロールエステラーゼ、ペルオキシダーゼ、ウリカーゼ、ヘキソキナーゼ、グルコキナーゼ、アスコルビン酸オキシターゼ、ビリルビンオキシターゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、ラクテートデヒドロゲナーゼのいずれかであることを特徴とする請求項１に記載のバイオセンサ。
3. 請求項１または２に記載のバイオセンサであって、前記試薬層は、前記試薬層を構成する組成物の水溶液を調製し、前記絶縁基板上に前記水溶液を滴下後、乾燥させてなることを特徴とするバイオセンサ。
4. 請求項１または２に記載のバイオセンサであって、前記試薬層は、前記試薬層を構成する組成物の水溶液を調製し、含浸材に前記水溶液を含浸後、乾燥させたものを前記絶縁基板上に配置してなることを特徴とするバイオセンサ。
5. 請求項１から４のいずれかに記載のバイオセンサであって、前記試薬層は生体試料によって溶解されて測定溶液となり、前記測定溶液中で前記生体試料中の測定対象物と前記少なくとも１種類以上の酵素が反応することを特徴とするバイオセンサ。
6. 請求項５に記載のバイオセンサであって、前記測定溶液と接触する少なくとも１対の電極を備えることを特徴とするバイオセンサ。
7. 請求項１から６のいずれかに記載のバイオセンサであって、前記ヘム色素を有する酵素の前記試薬層中に占める割合が、０．１％〜６０％であることを特徴とするバイオセンサ。
8. 請求項７に記載のバイオセンサであって、前記ヘム色素を有する酵素の前記試薬層中に占める割合が、１％〜６０％であることを特徴とするバイオセンサ。
9. 請求項１から８のいずれかに記載のバイオセンサを検査するための装置であって、試薬層の形成された領域を撮像する撮像手段と、前記撮像手段からの画像に基づいて前記試薬層の面積を演算し、前記画像の中からヘム色素による呈色部分の面積を演算するか、または前記ヘム色素を有する酵素の分布を演算する演算手段とを備えることを特徴とする検査装置。
10. 請求項１から８のいずれかに記載のバイオセンサを検査するための方法であって、前記バイオセンサのうち試薬層が形成された領域の撮像画像に基づいて前記試薬層の面積を演算し、前記画像の中からヘム色素による呈色部分の面積を演算するか、または前記ヘム色素を有する酵素の分布を演算するようにしたことを特徴とする検査方法。
    

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