JPH09234097A - 過酸化水素付加物を用いた分析方法 - Google Patents
過酸化水素付加物を用いた分析方法Info
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- JPH09234097A JPH09234097A JP8349790A JP34979096A JPH09234097A JP H09234097 A JPH09234097 A JP H09234097A JP 8349790 A JP8349790 A JP 8349790A JP 34979096 A JP34979096 A JP 34979096A JP H09234097 A JPH09234097 A JP H09234097A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】分析試薬の１成分として過酸化物を用いる分析
において、分析原理への悪影響が少なく、かつ過酸化水
素抱合能の高い安定な乾燥状態の過酸化水素付加物を用
いた分析法の提供。 【解決手段】分析試薬として、少なくとも過酸化物を用
いる分析方法において、（ａ）カルボン酸、カルボン酸
の塩、リン酸、リン酸の塩、スルホン酸およびスルホン
酸の塩からなる群より選ばれる少なくとも１成分と、
（ｂ）過酸化水素との乾燥状態の付加物に、測定時に水
系溶液を加え、過酸化物を発生させ、分析試薬として用
いることを特徴とする分析方法。
において、分析原理への悪影響が少なく、かつ過酸化水
素抱合能の高い安定な乾燥状態の過酸化水素付加物を用
いた分析法の提供。 【解決手段】分析試薬として、少なくとも過酸化物を用
いる分析方法において、（ａ）カルボン酸、カルボン酸
の塩、リン酸、リン酸の塩、スルホン酸およびスルホン
酸の塩からなる群より選ばれる少なくとも１成分と、
（ｂ）過酸化水素との乾燥状態の付加物に、測定時に水
系溶液を加え、過酸化物を発生させ、分析試薬として用
いることを特徴とする分析方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、分析試薬の一成分
として過酸化物を用いる分析方法において、過酸化水素
を、分析原理への悪影響が少なく、安定な乾燥状態の過
酸化水素付加物として使用する分析方法に関する。
として過酸化物を用いる分析方法において、過酸化水素
を、分析原理への悪影響が少なく、安定な乾燥状態の過
酸化水素付加物として使用する分析方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】分析試薬の一成分として過酸化物を用い
る分析方法の１つとして、化学発光分析法が知られてい
る。例えば、過シュウ酸エステル化学発光として知られ
る化学発光反応では、塩基性触媒存在下でシュウ酸誘導
体と過酸化水素とから高エネルギー中間体を発生させ、
さらにそのエネルギーで蛍光試薬を励起させて発光させ
る。また、ルミノール誘導体は、Ｆｅ（ＣＮ）6 3- 、マ
イクロペルオキシダーゼ、あるいは、ペルオキシダーゼ
の存在下、過酸化水素によって酸化されてアミノフタル
酸が励起状態となり、これが基底状態へ戻る際に発光す
る。アクリジニウム誘導体も過酸化水素の添加によって
発光する。このような化学発光反応は、発光化合物ある
いは発光反応の触媒（酵素など）を標識として用いて、
特異結合反応分析法などで多用されており、その場合も
発光を発生させる試薬の一成分として過酸化水素が用い
られている。このような化学発光反応は比較的高感度で
あるため、臨床検査、環境試験などの広い分野の分析に
応用されている。
る分析方法の１つとして、化学発光分析法が知られてい
る。例えば、過シュウ酸エステル化学発光として知られ
る化学発光反応では、塩基性触媒存在下でシュウ酸誘導
体と過酸化水素とから高エネルギー中間体を発生させ、
さらにそのエネルギーで蛍光試薬を励起させて発光させ
る。また、ルミノール誘導体は、Ｆｅ（ＣＮ）6 3- 、マ
イクロペルオキシダーゼ、あるいは、ペルオキシダーゼ
の存在下、過酸化水素によって酸化されてアミノフタル
酸が励起状態となり、これが基底状態へ戻る際に発光す
る。アクリジニウム誘導体も過酸化水素の添加によって
発光する。このような化学発光反応は、発光化合物ある
いは発光反応の触媒（酵素など）を標識として用いて、
特異結合反応分析法などで多用されており、その場合も
発光を発生させる試薬の一成分として過酸化水素が用い
られている。このような化学発光反応は比較的高感度で
あるため、臨床検査、環境試験などの広い分野の分析に
応用されている。
【０００３】さらに、化学発光反応に限らず、西洋ワサ
ビペルオキシダーゼ（以下、ＨＲＰＯともいう）あるい
はマイクロペルオキシダーゼなどのパーオキシダーゼ酵
素を呈色反応あるいは電気化学反応の触媒として用いる
方法がある。例えば、ＨＲＰＯを標識酵素とする酵素免
疫測定法あるいは核酸ハイブリダイゼーション法、生体
組織や細胞を特異的な標識抗体で染色する免疫組織染色
法など数多く知られており、その際、分析試薬の一成分
として、ＨＲＰＯ酵素の基質である過酸化水素が用いら
れる。また、便潜血検査においては、糞便中のヘモグロ
ビンのパーオキシダーゼ活性を発色反応で検出する方法
が知られており、その基質として過酸化水素を添加す
る。その他パーオキシダーゼ活性を有する触媒には、金
属イオン、金属キレート、ポルフィリン誘導体、触媒抗
体などが含まれ、前記した酵素などの触媒と同じく、こ
れらも過酸化物を用いる分析方法における触媒として用
いられる。
ビペルオキシダーゼ（以下、ＨＲＰＯともいう）あるい
はマイクロペルオキシダーゼなどのパーオキシダーゼ酵
素を呈色反応あるいは電気化学反応の触媒として用いる
方法がある。例えば、ＨＲＰＯを標識酵素とする酵素免
疫測定法あるいは核酸ハイブリダイゼーション法、生体
組織や細胞を特異的な標識抗体で染色する免疫組織染色
法など数多く知られており、その際、分析試薬の一成分
として、ＨＲＰＯ酵素の基質である過酸化水素が用いら
れる。また、便潜血検査においては、糞便中のヘモグロ
ビンのパーオキシダーゼ活性を発色反応で検出する方法
が知られており、その基質として過酸化水素を添加す
る。その他パーオキシダーゼ活性を有する触媒には、金
属イオン、金属キレート、ポルフィリン誘導体、触媒抗
体などが含まれ、前記した酵素などの触媒と同じく、こ
れらも過酸化物を用いる分析方法における触媒として用
いられる。
【０００４】例えば、最近、酵素などの信号物質発生体
を標識剤とし、液体試料と共にマトリクス中に展開する
ことにより、液体試料中の分析対象物と特異結合物質と
の特異結合反応によって標識剤の検出部からの距離分布
を形成させ、標識剤から発生する電子メディエータなど
の信号物質の拡散に律速された液体試料中の分析対象物
の濃度に対応する電流値を計測し、これによって分析対
象物濃度を測定する特異結合分析方法としてＭＥＤＩＡ
法(Mediator Diffusion-Controlled Immunoassay) が知
られている（特開平５−２６４５５２号公報（欧州特許
公開公報 0 525723 A2 号）、特開平７−２３４２０１
号公報参照）。この測定法においても、標識剤には高感
度な酸化還元酵素としてＨＲＰＯが使用され、その場
合、標識酵素の酵素基質として過酸化水素が用いられて
いる。
を標識剤とし、液体試料と共にマトリクス中に展開する
ことにより、液体試料中の分析対象物と特異結合物質と
の特異結合反応によって標識剤の検出部からの距離分布
を形成させ、標識剤から発生する電子メディエータなど
の信号物質の拡散に律速された液体試料中の分析対象物
の濃度に対応する電流値を計測し、これによって分析対
象物濃度を測定する特異結合分析方法としてＭＥＤＩＡ
法(Mediator Diffusion-Controlled Immunoassay) が知
られている（特開平５−２６４５５２号公報（欧州特許
公開公報 0 525723 A2 号）、特開平７−２３４２０１
号公報参照）。この測定法においても、標識剤には高感
度な酸化還元酵素としてＨＲＰＯが使用され、その場
合、標識酵素の酵素基質として過酸化水素が用いられて
いる。
【０００５】これらの数多くの分析法の原理では、過酸
化水素により分析対象物に特有な反応を起こさせ分析を
行うが、この分析原理への悪影響を有さずに、測定操作
の簡便化と分析試薬の安定性のために、過酸化水素を安
定な乾燥状態で分析に供する方法が求められている。
化水素により分析対象物に特有な反応を起こさせ分析を
行うが、この分析原理への悪影響を有さずに、測定操作
の簡便化と分析試薬の安定性のために、過酸化水素を安
定な乾燥状態で分析に供する方法が求められている。
【０００６】過酸化水素を乾燥状態で保持する供給体と
しては、尿素の過酸化水素付加物（Ｈｙｐｅｒｏｌｅ）
あるいは炭酸ナトリウムの過酸化水素付加物を乾燥した
ものが知られている。他分野では、漂白剤、洗浄剤、染
毛剤として使用されている。しかし、尿素または炭酸ナ
トリウムを用いた過酸化水素付加物は、吸湿性が強く、
不安定であり、長期保存に耐えない等の欠点がある。さ
らに、尿素は蛋白質などの変性剤として広く知られてい
る化合物であり、前記した蛋白質を分析したり試薬とし
て用いる分析法では悪影響が大きいという欠点がある。
また、炭酸ナトリウムは溶解後のｐＨが高く、分析用途
での使用には制約が大きいという欠点がある。
しては、尿素の過酸化水素付加物（Ｈｙｐｅｒｏｌｅ）
あるいは炭酸ナトリウムの過酸化水素付加物を乾燥した
ものが知られている。他分野では、漂白剤、洗浄剤、染
毛剤として使用されている。しかし、尿素または炭酸ナ
トリウムを用いた過酸化水素付加物は、吸湿性が強く、
不安定であり、長期保存に耐えない等の欠点がある。さ
らに、尿素は蛋白質などの変性剤として広く知られてい
る化合物であり、前記した蛋白質を分析したり試薬とし
て用いる分析法では悪影響が大きいという欠点がある。
また、炭酸ナトリウムは溶解後のｐＨが高く、分析用途
での使用には制約が大きいという欠点がある。
【０００７】例えば、前記したＭＥＤＩＡ法は、洗浄操
作が不要な特異結合分析法であり、液性試料を分析装置
に添加するだけで測定が行えるドライケミストリー分析
も可能であるという特長を有している。特開平７−２３
４２０１号公報に記載のＭＥＤＩＡ法分析装置において
も、過酸化水素は尿素の付加物として分析装置内に乾燥
状態で組み込まれていた。しかし、この分析装置では、
抗原抗体反応あるいは酵素反応に対する尿素の悪影響を
極力避けるために、分析装置の最下流に過酸化水素付加
物を設置し、尿素をできるだけ反応の場から遠ざけ、過
酸化水素を反応の場に自然拡散させる工夫がなされてい
るが、安定な応答が得られるまでに時間がかかり、迅速
に測定結果が得られなかった。また、分析装置の最下流
に過酸化水素付加物を設置しても、尿素も時間と共に逆
拡散して、特異的な応答を妨害するという欠点が残され
ていた。
作が不要な特異結合分析法であり、液性試料を分析装置
に添加するだけで測定が行えるドライケミストリー分析
も可能であるという特長を有している。特開平７−２３
４２０１号公報に記載のＭＥＤＩＡ法分析装置において
も、過酸化水素は尿素の付加物として分析装置内に乾燥
状態で組み込まれていた。しかし、この分析装置では、
抗原抗体反応あるいは酵素反応に対する尿素の悪影響を
極力避けるために、分析装置の最下流に過酸化水素付加
物を設置し、尿素をできるだけ反応の場から遠ざけ、過
酸化水素を反応の場に自然拡散させる工夫がなされてい
るが、安定な応答が得られるまでに時間がかかり、迅速
に測定結果が得られなかった。また、分析装置の最下流
に過酸化水素付加物を設置しても、尿素も時間と共に逆
拡散して、特異的な応答を妨害するという欠点が残され
ていた。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、分析
試薬の一成分として過酸化水素を用いる分析方法および
分析装置において、分析原理への悪影響が少なく、か
つ、過酸化水素保持能の高い安定な乾燥状態の過酸化水
素付加物を用いた分析方法を提供することにある。
試薬の一成分として過酸化水素を用いる分析方法および
分析装置において、分析原理への悪影響が少なく、か
つ、過酸化水素保持能の高い安定な乾燥状態の過酸化水
素付加物を用いた分析方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記課題
を解決すべく鋭意研究した結果、カルボン酸、カルボン
酸の塩、リン酸、リン酸の塩、スルホン酸およびスルホ
ン酸の塩からなる群より選ばれる少なくとも１成分を含
む、乾燥状態の過酸化水素付加物が、分析の際の悪影響
が小さく、かつ、高い過酸化水素保持能を有することを
見いだし、本発明を完成するに至った。また上記の酸の
代わりに、カルボキシル基、ホスホノ基、スルホ基のい
ずれも有していない、単糖、二糖、糖アルコール、およ
びそれらのポリマー、また、Ｎ−アセチル−グルコサミ
ン、アスコルビン酸、クレアチニン、ポリエチレングリ
コールも良好に用いりうることも見出した。
を解決すべく鋭意研究した結果、カルボン酸、カルボン
酸の塩、リン酸、リン酸の塩、スルホン酸およびスルホ
ン酸の塩からなる群より選ばれる少なくとも１成分を含
む、乾燥状態の過酸化水素付加物が、分析の際の悪影響
が小さく、かつ、高い過酸化水素保持能を有することを
見いだし、本発明を完成するに至った。また上記の酸の
代わりに、カルボキシル基、ホスホノ基、スルホ基のい
ずれも有していない、単糖、二糖、糖アルコール、およ
びそれらのポリマー、また、Ｎ−アセチル−グルコサミ
ン、アスコルビン酸、クレアチニン、ポリエチレングリ
コールも良好に用いりうることも見出した。
【００１０】すなわち、本発明は、分析試薬として、少
なくとも過酸化物を用いる分析方法において、（ａ）カ
ルボン酸、カルボン酸の塩、リン酸、リン酸の塩、スル
ホン酸およびスルホン酸の塩からなる群より選ばれる少
なくとも１成分と、（ｂ）過酸化水素との乾燥状態の付
加物を、測定時に水系溶液を溶解し、過酸化物を発生さ
せ、分析試薬として用いることを特徴とする分析方法を
提供するものである。
なくとも過酸化物を用いる分析方法において、（ａ）カ
ルボン酸、カルボン酸の塩、リン酸、リン酸の塩、スル
ホン酸およびスルホン酸の塩からなる群より選ばれる少
なくとも１成分と、（ｂ）過酸化水素との乾燥状態の付
加物を、測定時に水系溶液を溶解し、過酸化物を発生さ
せ、分析試薬として用いることを特徴とする分析方法を
提供するものである。
【００１１】また、本発明は、少なくとも流路と検出部
とを有する装置を用いて、分析試薬として少なくとも過
酸化物を用いる分析方法において、前記成分（ａ）と前
記成分（ｂ）との乾燥状態の付加物を、流路内のいずれ
かに配置し、測定時に水系溶液を加え、過酸化物を発生
させて、発生した過酸化物を水系溶液を介して移送し、
分析対象物を検出または検量する分析方法を提供する。
とを有する装置を用いて、分析試薬として少なくとも過
酸化物を用いる分析方法において、前記成分（ａ）と前
記成分（ｂ）との乾燥状態の付加物を、流路内のいずれ
かに配置し、測定時に水系溶液を加え、過酸化物を発生
させて、発生した過酸化物を水系溶液を介して移送し、
分析対象物を検出または検量する分析方法を提供する。
【００１２】ここで、前記分析方法がパーオキシダーゼ
活性を有する触媒を用いて分析対象物の測定を行う方法
であって、前記測定時に水系溶液を加えることにより、
触媒反応に関わる物質としての過酸化物を発生するのが
好ましい。
活性を有する触媒を用いて分析対象物の測定を行う方法
であって、前記測定時に水系溶液を加えることにより、
触媒反応に関わる物質としての過酸化物を発生するのが
好ましい。
【００１３】また、前記成分（ａ）が、下記式（１）で
表されるモノカルボン酸、ピルビン酸、および、それら
のナトリウム塩あるいはカリウム塩からなる群より選ば
れる少なくとも１成分であるのが好ましい。
表されるモノカルボン酸、ピルビン酸、および、それら
のナトリウム塩あるいはカリウム塩からなる群より選ば
れる少なくとも１成分であるのが好ましい。
【化５】
【００１４】また、前記成分（ａ）が、脂肪族ジカルボ
ン酸、芳香族ジカルボン酸、および、それらのナトリウ
ム酸あるいはカリウム塩からなる群より選ばれる少なく
とも１成分であるのが好ましい。
ン酸、芳香族ジカルボン酸、および、それらのナトリウ
ム酸あるいはカリウム塩からなる群より選ばれる少なく
とも１成分であるのが好ましい。
【００１５】また、前記成分（ａ）が、下記式（２）お
よび（３）で表されるトリカルボン酸、および、該トリ
カルボン酸のナトリウム塩あるいはカリウム塩からなる
群より選ばれる少なくとも１成分であるのが好ましい。
よび（３）で表されるトリカルボン酸、および、該トリ
カルボン酸のナトリウム塩あるいはカリウム塩からなる
群より選ばれる少なくとも１成分であるのが好ましい。
【化６】 （ただし、Ｒ4 ；Ｈ，−ＯＨ （ｐ＝１〜３，ｑ＝０〜
３，ｒ＝０〜３））
３，ｒ＝０〜３））
【化７】 （ただし、Ｒ5 ；Ｈ，−ＣＨ3 （ｓ＝１〜３））
【００１６】また、前記成分（ａ）が、下記式（４）で
表されるテトラカルボン酸、および該テトラカルボン酸
のナトリウム塩あるいはカリウム塩からなる群より選ば
れる少なくとも１成分であるのが好ましい。
表されるテトラカルボン酸、および該テトラカルボン酸
のナトリウム塩あるいはカリウム塩からなる群より選ば
れる少なくとも１成分であるのが好ましい。
【化８】 （ｔ＝０〜３，ｕ＝０〜３，ｖ＝０〜３）
【００１７】あるいは、前記成分（ａ）がウロン酸、ポ
リウロン酸、および、それらのナトリウム塩あるいはカ
リウム塩からなる群より選ばれる少なくとも１成分であ
るのが好ましい。あるいは、前記成分（ａ）がヒドロキ
シアルカンスルフォン酸、アミノアルカンスルフォン
酸、ヒドロキシベンゼンスルフォン酸、および、それら
のナトリウム塩あるいはカリウム塩からなる群より選ば
れる少なくとも１成分であるのが好ましい。あるいは、
前記成分（ａ）が、リン酸、および該リン酸のナトリウ
ム塩あるいはカリウム塩の少なくとも１成分であるのが
好ましい。
リウロン酸、および、それらのナトリウム塩あるいはカ
リウム塩からなる群より選ばれる少なくとも１成分であ
るのが好ましい。あるいは、前記成分（ａ）がヒドロキ
シアルカンスルフォン酸、アミノアルカンスルフォン
酸、ヒドロキシベンゼンスルフォン酸、および、それら
のナトリウム塩あるいはカリウム塩からなる群より選ば
れる少なくとも１成分であるのが好ましい。あるいは、
前記成分（ａ）が、リン酸、および該リン酸のナトリウ
ム塩あるいはカリウム塩の少なくとも１成分であるのが
好ましい。
【００１８】また、本発明は、分析試薬として、少なく
とも過酸化物を用いる分析方法において、（ａ）単糖、
二糖、糖アルコール、およびそれらのポリマーからなる
群より選ばれる少なくとも１成分と、（ｂ）過酸化水素
との乾燥状態の付加物に、水系溶液を加え、過酸化物を
発生させ、分析試薬として用いることを特徴とする分析
方法を提供する。
とも過酸化物を用いる分析方法において、（ａ）単糖、
二糖、糖アルコール、およびそれらのポリマーからなる
群より選ばれる少なくとも１成分と、（ｂ）過酸化水素
との乾燥状態の付加物に、水系溶液を加え、過酸化物を
発生させ、分析試薬として用いることを特徴とする分析
方法を提供する。
【００１９】さらに、本発明は、分析試薬として、少な
くとも過酸化物を用いる分析方法において、（ａ）Ｎ−
アセチル−グルコサミン、アスコルビン酸、クレアチニ
ン、およびポリエチレングリコールからなる群より選ば
れる少なくとも１成分と、（ｂ）過酸化水素との乾燥状
態の付加物に、水系溶液を加え、過酸化物を発生させ、
分析試薬として用いることを特徴とする分析方法を提供
する。
くとも過酸化物を用いる分析方法において、（ａ）Ｎ−
アセチル−グルコサミン、アスコルビン酸、クレアチニ
ン、およびポリエチレングリコールからなる群より選ば
れる少なくとも１成分と、（ｂ）過酸化水素との乾燥状
態の付加物に、水系溶液を加え、過酸化物を発生させ、
分析試薬として用いることを特徴とする分析方法を提供
する。
【００２０】また、本発明は、少なくとも流路と検出部
とを有する装置を用いて、分析試薬として少なくとも過
酸化物を用いる分析方法において、（ａ）流路中に存在
する固体物質のカルボキシル基、ホスホノ基、スルホ基
およびそれらの塩の少なくとも１成分と、（ｂ）過酸化
水素との乾燥状態の付加物に、水系溶液を加え、過酸化
物を発生させ、分析試薬として用いることを特徴とする
分析方法を提供する。
とを有する装置を用いて、分析試薬として少なくとも過
酸化物を用いる分析方法において、（ａ）流路中に存在
する固体物質のカルボキシル基、ホスホノ基、スルホ基
およびそれらの塩の少なくとも１成分と、（ｂ）過酸化
水素との乾燥状態の付加物に、水系溶液を加え、過酸化
物を発生させ、分析試薬として用いることを特徴とする
分析方法を提供する。
【００２１】
【発明の実施の形態】以下に、本発明の分析方法につい
て詳細に説明する。本発明の分析方法は、分析試薬とし
て少なくとも過酸化物、具体的には過酸化水素等を用
い、分析物を検出または検量する方法であれば特に限定
されない。このような反応の具体例は、以下のように挙
げられる。
て詳細に説明する。本発明の分析方法は、分析試薬とし
て少なくとも過酸化物、具体的には過酸化水素等を用
い、分析物を検出または検量する方法であれば特に限定
されない。このような反応の具体例は、以下のように挙
げられる。
【００２２】（１）試料中の分析対象物の触媒活性（パ
ーオキシダーゼ活性、カタラーゼ活性など）を過酸化水
素を試薬として分析する方法。例えば、便潜血分析、血
清中カタラーゼ活性分析、ルミノール試験など、試料中
の酵素活性あるいは触媒活性の分析において、過酸化水
素を使用する。 （２）標識を用い、この標識を過酸化水素を試薬として
分析する方法。発光物質あるいは触媒物質などを標識物
質として用いる、分析対象物の量または存在を標識物質
を検出することにより分析する方法で、特異結合分析、
組織染色分析、細胞染色分析、ＰＣＲなどの核酸増幅分
析、核酸ハイブリダイゼーション分析などが含まれ、標
識物質の定量あるいは所在を分析する際に過酸化水素を
試薬として用いる分析方法。
ーオキシダーゼ活性、カタラーゼ活性など）を過酸化水
素を試薬として分析する方法。例えば、便潜血分析、血
清中カタラーゼ活性分析、ルミノール試験など、試料中
の酵素活性あるいは触媒活性の分析において、過酸化水
素を使用する。 （２）標識を用い、この標識を過酸化水素を試薬として
分析する方法。発光物質あるいは触媒物質などを標識物
質として用いる、分析対象物の量または存在を標識物質
を検出することにより分析する方法で、特異結合分析、
組織染色分析、細胞染色分析、ＰＣＲなどの核酸増幅分
析、核酸ハイブリダイゼーション分析などが含まれ、標
識物質の定量あるいは所在を分析する際に過酸化水素を
試薬として用いる分析方法。
【００２３】ここで、 （ａ）分析対象物とは、具体的にはヘムなどのポルフィ
リン類やパーオキシダーゼ活性物、カタラーゼ活性物、
抗体分子や抗原として機能する各種蛋白質、ポリペプチ
ド、糖蛋白質、多糖類、複合糖脂質、各種ハプテン、核
酸、エフェクター分子、レセプター分子、酵素、インヒ
ビター等が例示される。さらに具体的には、ヘモグロビ
ン、パーオキシダーゼ、カタラーゼ； α−フェトプロ
テイン、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＡ１２５、ＣＡ１
９−９等の腫瘍マーカーや、β2 −ミクログロブリン
（β2 ｍ）、フェリチンなどの各種蛋白質； エストラ
ジオール（Ｅ2)、エストリオール（Ｅ3)、ヒト絨毛性性
腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）、黄体形成ホルモン（Ｌ
Ｈ）、ヒト胎盤ラクトゲン（ｈＰＬ）などの各種ホルモ
ン； ＨＢｓ抗原、ＨＢｓ抗体、ＨＢｅ抗原、ＨＢｅ抗
体、ＨＢｃ抗体、ＨＣＶ抗体、ＨＩＶ抗体などの各種ウ
イルス関連抗原あるいはウイルス関連抗体； 各種アレ
ルゲンおよびこれに特異的なＩｇＥ抗体； 麻薬性薬
物、医療性薬物およびこれらの代謝産物； ウイルスお
よび疾患関連ポリヌクレオチド配列の核酸等が例示され
る。 （ｂ）発光物質としては、ルミノール誘導体、シュウ酸
誘導体、アクリジニウム誘導体などが例示される。 （ｃ）触媒物質としては、金属イオンあるいはそのキレ
ート化合物、Ｆｅ（ＣＮ）6 -3、金属ポルフィリンなど
の金属錯体、ヘム、ヘミン、マイクロパーオキシダー
ゼ、パーオキシダーゼ、カタラーゼ、パーオキシダーゼ
活性あるいはカタラーゼ活性などを有する触媒抗体など
の人工酵素などが例示できる。
リン類やパーオキシダーゼ活性物、カタラーゼ活性物、
抗体分子や抗原として機能する各種蛋白質、ポリペプチ
ド、糖蛋白質、多糖類、複合糖脂質、各種ハプテン、核
酸、エフェクター分子、レセプター分子、酵素、インヒ
ビター等が例示される。さらに具体的には、ヘモグロビ
ン、パーオキシダーゼ、カタラーゼ； α−フェトプロ
テイン、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＡ１２５、ＣＡ１
９−９等の腫瘍マーカーや、β2 −ミクログロブリン
（β2 ｍ）、フェリチンなどの各種蛋白質； エストラ
ジオール（Ｅ2)、エストリオール（Ｅ3)、ヒト絨毛性性
腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）、黄体形成ホルモン（Ｌ
Ｈ）、ヒト胎盤ラクトゲン（ｈＰＬ）などの各種ホルモ
ン； ＨＢｓ抗原、ＨＢｓ抗体、ＨＢｅ抗原、ＨＢｅ抗
体、ＨＢｃ抗体、ＨＣＶ抗体、ＨＩＶ抗体などの各種ウ
イルス関連抗原あるいはウイルス関連抗体； 各種アレ
ルゲンおよびこれに特異的なＩｇＥ抗体； 麻薬性薬
物、医療性薬物およびこれらの代謝産物； ウイルスお
よび疾患関連ポリヌクレオチド配列の核酸等が例示され
る。 （ｂ）発光物質としては、ルミノール誘導体、シュウ酸
誘導体、アクリジニウム誘導体などが例示される。 （ｃ）触媒物質としては、金属イオンあるいはそのキレ
ート化合物、Ｆｅ（ＣＮ）6 -3、金属ポルフィリンなど
の金属錯体、ヘム、ヘミン、マイクロパーオキシダー
ゼ、パーオキシダーゼ、カタラーゼ、パーオキシダーゼ
活性あるいはカタラーゼ活性などを有する触媒抗体など
の人工酵素などが例示できる。
【００２４】特異結合分析は、分析対象物と、それに特
異的に結合する特異結合物質との少なくとも１つの特異
結合反応に関連して試料中の分析対象物を定性もしくは
定量する分析方法である。特異結合分析方法としては、
抗原抗体反応を応用したイムノアッセイ、受容体を用い
たレセプターアッセイ、相補的核酸配列のハイブリダイ
ゼーションを用いた核酸プローブアッセイなど多くの方
法が知られており、その特異性の高さから、臨床検査を
はじめとする広い分野で繁用されている。
異的に結合する特異結合物質との少なくとも１つの特異
結合反応に関連して試料中の分析対象物を定性もしくは
定量する分析方法である。特異結合分析方法としては、
抗原抗体反応を応用したイムノアッセイ、受容体を用い
たレセプターアッセイ、相補的核酸配列のハイブリダイ
ゼーションを用いた核酸プローブアッセイなど多くの方
法が知られており、その特異性の高さから、臨床検査を
はじめとする広い分野で繁用されている。
【００２５】特異結合物質とは、分析対象物等のある特
定の物質に特異的に結合する、すなわち、特定の物質に
特異結合反応しうる物質である。ある特定の物質とそれ
に対する特異結合物質との組合せとしては、抗原とそれ
に対する抗体、相補的核酸配列、エフェクター分子とレ
セプター分子、酵素とインヒビター、酵素と補因子、酵
素と基質、糖鎖を有する化合物とレクチン、ある抗体と
その抗体に対する抗体、レセプター分子とそれに対する
抗体等が例示される。また、これらの組合せにおいて、
どちらの物質も相手方の物質に対する特異結合物質とな
りうる。
定の物質に特異的に結合する、すなわち、特定の物質に
特異結合反応しうる物質である。ある特定の物質とそれ
に対する特異結合物質との組合せとしては、抗原とそれ
に対する抗体、相補的核酸配列、エフェクター分子とレ
セプター分子、酵素とインヒビター、酵素と補因子、酵
素と基質、糖鎖を有する化合物とレクチン、ある抗体と
その抗体に対する抗体、レセプター分子とそれに対する
抗体等が例示される。また、これらの組合せにおいて、
どちらの物質も相手方の物質に対する特異結合物質とな
りうる。
【００２６】また、特異結合物質として、特異結合活性
が消失しない程度に化学修飾されたもの、あるいは、他
の成分と結合してなる複合性物質もあげられる。このよ
うな特異結合物質とある特定の物質との組合せとして
は、ビオチンで化学修飾された抗体もしくはポリヌクレ
オチドとアビジン、アビジン共有結合抗体とビオチン等
が例示される。また、遺伝子組換え法で作成した抗体と
酵素、あるいは抗体とレセプターとの融合蛋白質なども
例示される。なお、本明細書では、特異結合分析（ＭＥ
ＤＩＡ）に本発明を用いる場合を図２に示す分析装置を
具体例として後に詳述する。その例示においては、後記
する信号物質発生体のように、その一部に特異結合物質
として働く部分を有する物質も、特異結合物質と称する
ことがある。さらに、過酸化水素付加物とは、過酸化水
素化物等や、後述の物質を過酸化水素水に溶解したの
ち、または、後述の物質の溶液に過酸化水素水を加えた
のち、析出あるいは乾燥により得られた物質である。流
路とは、水系溶液が自発的に、あるいは、強制的に流れ
る流路である。好ましくは、多孔質材、キャピラリー等
で構成され、この場合、水系溶液は自発的に浸潤する。
検出部とは、少なくとも過酸化物、具体的には過酸化水
素等を用いる分析方法で得られる発色、蛍光、発光、電
気化学反応などの信号を検出する部分である。
が消失しない程度に化学修飾されたもの、あるいは、他
の成分と結合してなる複合性物質もあげられる。このよ
うな特異結合物質とある特定の物質との組合せとして
は、ビオチンで化学修飾された抗体もしくはポリヌクレ
オチドとアビジン、アビジン共有結合抗体とビオチン等
が例示される。また、遺伝子組換え法で作成した抗体と
酵素、あるいは抗体とレセプターとの融合蛋白質なども
例示される。なお、本明細書では、特異結合分析（ＭＥ
ＤＩＡ）に本発明を用いる場合を図２に示す分析装置を
具体例として後に詳述する。その例示においては、後記
する信号物質発生体のように、その一部に特異結合物質
として働く部分を有する物質も、特異結合物質と称する
ことがある。さらに、過酸化水素付加物とは、過酸化水
素化物等や、後述の物質を過酸化水素水に溶解したの
ち、または、後述の物質の溶液に過酸化水素水を加えた
のち、析出あるいは乾燥により得られた物質である。流
路とは、水系溶液が自発的に、あるいは、強制的に流れ
る流路である。好ましくは、多孔質材、キャピラリー等
で構成され、この場合、水系溶液は自発的に浸潤する。
検出部とは、少なくとも過酸化物、具体的には過酸化水
素等を用いる分析方法で得られる発色、蛍光、発光、電
気化学反応などの信号を検出する部分である。
【００２７】本発明はこのような分析を行う際に、特定
の成分（ａ）で記載される成分と（ｂ）過酸化水素との
乾燥状態の付加物を用いることが１つの特徴である。成
分（ａ）は、カルボン酸、カルボン酸の塩、リン酸、リ
ン酸の塩、スルホン酸およびスルホン酸の塩からなる群
より選ばれる少なくとも１成分；単糖、二糖および糖ア
ルコールからなる群より選ばれる少なくとも１成分、ま
たは；Ｎ−アセチル−グルコサミン、アスコルビン酸、
クレアチニン、ポリエチレングリコールおよびデキスト
ランからなる群より選ばれる少なくとも１成分である。
の成分（ａ）で記載される成分と（ｂ）過酸化水素との
乾燥状態の付加物を用いることが１つの特徴である。成
分（ａ）は、カルボン酸、カルボン酸の塩、リン酸、リ
ン酸の塩、スルホン酸およびスルホン酸の塩からなる群
より選ばれる少なくとも１成分；単糖、二糖および糖ア
ルコールからなる群より選ばれる少なくとも１成分、ま
たは；Ｎ−アセチル−グルコサミン、アスコルビン酸、
クレアチニン、ポリエチレングリコールおよびデキスト
ランからなる群より選ばれる少なくとも１成分である。
【００２８】カルボン酸、カルボン酸の塩、リン酸、リ
ン酸の塩、スルホン酸およびスルホン酸の塩からなる群
より選ばれる少なくとも１成分としては、過酸化水素保
持能が高く、蛋白質等の分析対象物、あるいは試薬成分
の活性に影響が少ないものであればよい。カルボン酸と
しては、モノカルボン酸、ジカルボン酸、トリカルボン
酸、テトラカルボン酸、ウロン酸、ポリウロン酸等が挙
げられる。
ン酸の塩、スルホン酸およびスルホン酸の塩からなる群
より選ばれる少なくとも１成分としては、過酸化水素保
持能が高く、蛋白質等の分析対象物、あるいは試薬成分
の活性に影響が少ないものであればよい。カルボン酸と
しては、モノカルボン酸、ジカルボン酸、トリカルボン
酸、テトラカルボン酸、ウロン酸、ポリウロン酸等が挙
げられる。
【００２９】モノカルボン酸のうちの脂肪族モノカルボ
ン酸としては式（１）で表される化合物およびピルビン
酸が好ましい。式（１）で表される化合物としては、具
体的には、酢酸、グリコール酸、プロピオン酸、３−ヒ
ドロキシプロピオン酸、２，２−ビス（ヒドロキシメチ
ル）プロピオン酸、乳酸、グリセリン酸、グルコン酸、
グルコヘプトン酸、４−ヒドロキシフェニル酢酸、ヒダ
ントイン酸、シトルリン、アルビジン、セリン、アラニ
ン、スレオニン、Ｎ−アセチルグリシン等が例示される
が、このうち、酢酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、
２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピオン酸、乳
酸、グリセリン酸、グルコン酸、グルコヘプトン酸、４
−ヒドロキシフェニル酢酸、ヒダントイン酸、シトルリ
ン、アルビジン、Ｌ−セリン、Ｎ−アセチルグリシンお
よびそれらの塩が過酸化水素保持能が高く、抗原抗体反
応および酵素反応への阻害が小さいので好適に用いら
れ、特に、酢酸、乳酸、ヒダントイン酸、Ｎ−アセチル
グリシンおよびそれらの塩が、水への溶解性が良く、迅
速な測定を行えるのでより好ましい。
ン酸としては式（１）で表される化合物およびピルビン
酸が好ましい。式（１）で表される化合物としては、具
体的には、酢酸、グリコール酸、プロピオン酸、３−ヒ
ドロキシプロピオン酸、２，２−ビス（ヒドロキシメチ
ル）プロピオン酸、乳酸、グリセリン酸、グルコン酸、
グルコヘプトン酸、４−ヒドロキシフェニル酢酸、ヒダ
ントイン酸、シトルリン、アルビジン、セリン、アラニ
ン、スレオニン、Ｎ−アセチルグリシン等が例示される
が、このうち、酢酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、
２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピオン酸、乳
酸、グリセリン酸、グルコン酸、グルコヘプトン酸、４
−ヒドロキシフェニル酢酸、ヒダントイン酸、シトルリ
ン、アルビジン、Ｌ−セリン、Ｎ−アセチルグリシンお
よびそれらの塩が過酸化水素保持能が高く、抗原抗体反
応および酵素反応への阻害が小さいので好適に用いら
れ、特に、酢酸、乳酸、ヒダントイン酸、Ｎ−アセチル
グリシンおよびそれらの塩が、水への溶解性が良く、迅
速な測定を行えるのでより好ましい。
【００３０】さらに、芳香族モノカルボン酸としては、
バニリン酸、ピコリン酸等が例示される。このうち、バ
ニリン酸およびその塩が過酸化水素保持能が高く、抗原
抗体反応および酵素反応への阻害が少ないので好適に用
いられる。
バニリン酸、ピコリン酸等が例示される。このうち、バ
ニリン酸およびその塩が過酸化水素保持能が高く、抗原
抗体反応および酵素反応への阻害が少ないので好適に用
いられる。
【００３１】ジカルボン酸としては脂肪族ジカルボン
酸、芳香族ジカルボン酸が挙げられる。具体的には、シ
ュウ酸、マロン酸、メチルマロン酸、コハク酸、オキサ
ル酢酸、メチルコハク酸、２，２−ジメチルコハク酸、
マレイン酸、フマル酸、シトラコン酸、アセチレンジカ
ルボン酸、リンゴ酸、シトラマル酸、酒石酸、グルタル
酸、ジグリコール酸、２−ケトグルタル酸、３−ケトグ
ルタル酸、３−メチルグルタル酸、３−ヒドロキシ−３
−メチルグルタル酸、アジピン酸、粘液酸、ピメリン
酸、スベリン酸、１，２−シクロヘキサンジカルボン
酸、１，４−シクロヘキサンジカルボン酸、グルタミン
酸、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸、Ｏ−フタ
ル酸、イソフタル酸、テレフタル酸、４−ヒドロキシフ
タル酸、４−ヒドロキシイソフタル酸、５−ヒドロキシ
イソフタル酸等が例示される。このうちシュウ酸、マロ
ン酸、メチルマロン酸、コハク酸、メチルコハク酸、マ
レイン酸、リンゴ酸、シトラマル酸、酒石酸、グルタル
酸、ジグリコール酸、３−ヒドロキシ−３−メチルグル
タル酸、粘液酸、ピメリン酸、１，２−シクロヘキサン
ジカルボン酸、１，４−シクロヘキサンジカルボン酸、
グルタミン酸、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢
酸、ｏ−フタル酸、イソフタル酸、４−ヒドロキシフタ
ル酸、４−ヒドロキシイソフタル酸等が好適に用いら
れ、マロン酸、Ｌ−（＋）−酒石酸、ＤＬ−酒石酸、ピ
メリン酸、イソフタル酸、４−ヒドロキシイソフタル酸
等が特に好ましい。これらの酸およびその塩は過酸化水
素保持能が高く、抗原抗体反応および酵素反応への阻害
が少ないので好適に用いられ、また、水への溶解性が良
く、迅速な測定を行えるので好ましい。
酸、芳香族ジカルボン酸が挙げられる。具体的には、シ
ュウ酸、マロン酸、メチルマロン酸、コハク酸、オキサ
ル酢酸、メチルコハク酸、２，２−ジメチルコハク酸、
マレイン酸、フマル酸、シトラコン酸、アセチレンジカ
ルボン酸、リンゴ酸、シトラマル酸、酒石酸、グルタル
酸、ジグリコール酸、２−ケトグルタル酸、３−ケトグ
ルタル酸、３−メチルグルタル酸、３−ヒドロキシ−３
−メチルグルタル酸、アジピン酸、粘液酸、ピメリン
酸、スベリン酸、１，２−シクロヘキサンジカルボン
酸、１，４−シクロヘキサンジカルボン酸、グルタミン
酸、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸、Ｏ−フタ
ル酸、イソフタル酸、テレフタル酸、４−ヒドロキシフ
タル酸、４−ヒドロキシイソフタル酸、５−ヒドロキシ
イソフタル酸等が例示される。このうちシュウ酸、マロ
ン酸、メチルマロン酸、コハク酸、メチルコハク酸、マ
レイン酸、リンゴ酸、シトラマル酸、酒石酸、グルタル
酸、ジグリコール酸、３−ヒドロキシ−３−メチルグル
タル酸、粘液酸、ピメリン酸、１，２−シクロヘキサン
ジカルボン酸、１，４−シクロヘキサンジカルボン酸、
グルタミン酸、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢
酸、ｏ−フタル酸、イソフタル酸、４−ヒドロキシフタ
ル酸、４−ヒドロキシイソフタル酸等が好適に用いら
れ、マロン酸、Ｌ−（＋）−酒石酸、ＤＬ−酒石酸、ピ
メリン酸、イソフタル酸、４−ヒドロキシイソフタル酸
等が特に好ましい。これらの酸およびその塩は過酸化水
素保持能が高く、抗原抗体反応および酵素反応への阻害
が少ないので好適に用いられ、また、水への溶解性が良
く、迅速な測定を行えるので好ましい。
【００３２】トリカルボン酸としては式（２）または式
（３）で表される化合物が好適に用いられる。式（２）
および式（３）で表される化合物としてはクエン酸、ア
コニット酸、１，３，５−ペンタトリカルボン酸等が具
体的に例示される。このうち、過酸化水素保持能が高
く、抗原抗体反応および酵素反応への阻害が少なく、溶
解性、測定の迅速さにも優れているので、クエン酸およ
びその塩が好ましい。テトラカルボン酸としては式
（４）で表される化合物が好適に用いられる。具体的に
はブタン−１、２、３、４−テトラカルボン酸およびそ
の塩が過酸化水素保持能が高く、抗原抗体反応および酵
素反応への阻害が小さいので好適に用いられ、また、水
への溶解性が良く、迅速な測定を行えるので好ましい。
（３）で表される化合物が好適に用いられる。式（２）
および式（３）で表される化合物としてはクエン酸、ア
コニット酸、１，３，５−ペンタトリカルボン酸等が具
体的に例示される。このうち、過酸化水素保持能が高
く、抗原抗体反応および酵素反応への阻害が少なく、溶
解性、測定の迅速さにも優れているので、クエン酸およ
びその塩が好ましい。テトラカルボン酸としては式
（４）で表される化合物が好適に用いられる。具体的に
はブタン−１、２、３、４−テトラカルボン酸およびそ
の塩が過酸化水素保持能が高く、抗原抗体反応および酵
素反応への阻害が小さいので好適に用いられ、また、水
への溶解性が良く、迅速な測定を行えるので好ましい。
【００３３】また、過酸化水素保持ゲルあるいは保持ゾ
ルとして、あるいは、過酸化水素含浸担体自体に過酸化
水素保持能を付与できる点ではウロン酸、ポリウロン酸
およびそれらの塩が本発明の成分（ａ）として好まし
い。ウロン酸としてはグルクロン酸、グルロン酸、マン
ヌロン酸、ガラクツロン酸、イズロン酸等が好ましい。
このうち特にグルクロン酸およびその塩が過酸化水素保
持能が高く、抗原抗体反応および酵素反応への阻害が小
さいので好適に用いられ、また、水への溶解性が良く、
迅速な測定を行えるので好ましい。
ルとして、あるいは、過酸化水素含浸担体自体に過酸化
水素保持能を付与できる点ではウロン酸、ポリウロン酸
およびそれらの塩が本発明の成分（ａ）として好まし
い。ウロン酸としてはグルクロン酸、グルロン酸、マン
ヌロン酸、ガラクツロン酸、イズロン酸等が好ましい。
このうち特にグルクロン酸およびその塩が過酸化水素保
持能が高く、抗原抗体反応および酵素反応への阻害が小
さいので好適に用いられ、また、水への溶解性が良く、
迅速な測定を行えるので好ましい。
【００３４】ポリウロン酸としては、これらの前記ウロ
ン酸のホモポリマーあるいはヘテロポリマーである。ヘ
テロポリマーとしては、前記ウロン酸とアルドースとの
ヘテロポリマーであってもよい。具体的にはポリウロン
酸としては、アルギン酸、ペクチン酸が好ましい。この
うち特にアルギン酸が好ましい。
ン酸のホモポリマーあるいはヘテロポリマーである。ヘ
テロポリマーとしては、前記ウロン酸とアルドースとの
ヘテロポリマーであってもよい。具体的にはポリウロン
酸としては、アルギン酸、ペクチン酸が好ましい。この
うち特にアルギン酸が好ましい。
【００３５】スルホン酸としてはヒドロキシアルカンス
ルフォン酸、アミノアルカンスルフォン酸、ヒドロキシ
ベンゼンスルフォン酸等が好適に用いられる。具体的に
はイセチオン酸、タウリン、システイン酸、グアイアコ
ールスルフォン酸等が好ましい。特にシステイン酸およ
びその塩が好ましい。また、キレート作用等でカルボキ
シル基、ホスホノ基の存在が分析上不適当な場合には本
発明の成分（ａ）として、ヒドロキシアルカンスルフォ
ン酸およびその塩が好ましい。スルホ基とカルボキシル
基の双方を有する化合物としては前述のシステイン酸、
およびコンドロイチン硫酸が挙げられ、これらも好適に
用いられる。成分（ａ）として用いる、カルボン酸の
塩、リン酸の塩、またはスルホン酸の塩としては、上記
カルボン酸、リン酸、スルホン酸の、アルカリ金属、ア
ルカリ土類金属の塩が好ましいが、特に上記の各酸のナ
トリウム塩、カリウム塩が好ましい。
ルフォン酸、アミノアルカンスルフォン酸、ヒドロキシ
ベンゼンスルフォン酸等が好適に用いられる。具体的に
はイセチオン酸、タウリン、システイン酸、グアイアコ
ールスルフォン酸等が好ましい。特にシステイン酸およ
びその塩が好ましい。また、キレート作用等でカルボキ
シル基、ホスホノ基の存在が分析上不適当な場合には本
発明の成分（ａ）として、ヒドロキシアルカンスルフォ
ン酸およびその塩が好ましい。スルホ基とカルボキシル
基の双方を有する化合物としては前述のシステイン酸、
およびコンドロイチン硫酸が挙げられ、これらも好適に
用いられる。成分（ａ）として用いる、カルボン酸の
塩、リン酸の塩、またはスルホン酸の塩としては、上記
カルボン酸、リン酸、スルホン酸の、アルカリ金属、ア
ルカリ土類金属の塩が好ましいが、特に上記の各酸のナ
トリウム塩、カリウム塩が好ましい。
【００３６】本発明に用いる単糖としてはペントース、
ヘキソース、ヘプトースが挙げられる。このうちヘキソ
ースとしてはグルコース、ガラクトースが好適に用いら
れる。また二糖としてはサッカロース、マルトース、ラ
クトース、トレハロースが好適に用いられる。糖アルコ
ールとしてはマンニトールが好適に用いられる。また、
それらのポリマーとしては、デキストラン、セルロース
が好適に用いられる。
ヘキソース、ヘプトースが挙げられる。このうちヘキソ
ースとしてはグルコース、ガラクトースが好適に用いら
れる。また二糖としてはサッカロース、マルトース、ラ
クトース、トレハロースが好適に用いられる。糖アルコ
ールとしてはマンニトールが好適に用いられる。また、
それらのポリマーとしては、デキストラン、セルロース
が好適に用いられる。
【００３７】成分（ａ）の濃度は、その過酸化水素保持
能に依存するが、おおむね用いる（ｂ）過酸化水素量に
対して、モル比で０．０１〜１０００倍用いるのが好ま
しく、特に好ましくは、０．１〜１００倍、成分（ｂ）
過酸化物の量は、後述するＭＥＤＩＡ分析装置内に配置
する場合は、水溶液中の濃度で１〜１０００ｍＭとする
のが好ましい。
能に依存するが、おおむね用いる（ｂ）過酸化水素量に
対して、モル比で０．０１〜１０００倍用いるのが好ま
しく、特に好ましくは、０．１〜１００倍、成分（ｂ）
過酸化物の量は、後述するＭＥＤＩＡ分析装置内に配置
する場合は、水溶液中の濃度で１〜１０００ｍＭとする
のが好ましい。
【００３８】乾燥状態の付加物の製造方法は、成分
（ａ）と成分（ｂ）とを水溶液または緩衝液中で混合溶
液とし、加熱、減圧、凍結乾燥等の方法によって溶媒を
除去する方法があり、なかでも凍結乾燥が好ましい。そ
の理由は、乾燥物内の濃度が均一となるためである。分
析装置として水系溶液が浸透できる多孔質体を用いる場
合には、上述の混合溶液を直接多孔質体に含浸させ、乾
燥することができる。あるいは、カルボキシル基、ホス
ホノ基、スルホ基などの官能基を導入して過酸化水素含
浸担体自体に過酸化水素保持能を付与した濾紙などの天
然繊維、合成樹脂、合成繊維等よりなる多孔質体に過酸
化水素溶液を直接含浸させ、乾燥して過酸化水素保持担
体としてもよい。これらはいずれも固体物質のカルボキ
シル基、ホスホノ基、スルホ基およびそれらの塩として
適している。あるいは、ポリウロン酸、ポリアクリル
酸、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）などの水溶
性高分子を過酸化水素の保持担体、保持ゲルあるいは保
持ゾルとして用いてもよい。あるいは、これらの過酸化
水素保持担体、保持ゲルあるいは保持ゾルとヒダントイ
ン酸、Ｌ−シトルリン、クエン酸、リン酸などとの混合
物を過酸化水素保持剤として用いてもよい。ウロン酸と
しては、グルクロン酸、グルロン酸、マンヌロン酸、ガ
ラクツロン酸、イズロン酸などが例示できる。ポリウロ
ン酸としては、これらのウロン酸のホモポリマーあるい
はヘテロポリマーである。ヘテロポリマーとしては、ウ
ロン酸とアルドースとのヘテロポリマーであってもよ
い。ポリウロン酸としては、アルギン酸、ペクチン酸が
例示できる。
（ａ）と成分（ｂ）とを水溶液または緩衝液中で混合溶
液とし、加熱、減圧、凍結乾燥等の方法によって溶媒を
除去する方法があり、なかでも凍結乾燥が好ましい。そ
の理由は、乾燥物内の濃度が均一となるためである。分
析装置として水系溶液が浸透できる多孔質体を用いる場
合には、上述の混合溶液を直接多孔質体に含浸させ、乾
燥することができる。あるいは、カルボキシル基、ホス
ホノ基、スルホ基などの官能基を導入して過酸化水素含
浸担体自体に過酸化水素保持能を付与した濾紙などの天
然繊維、合成樹脂、合成繊維等よりなる多孔質体に過酸
化水素溶液を直接含浸させ、乾燥して過酸化水素保持担
体としてもよい。これらはいずれも固体物質のカルボキ
シル基、ホスホノ基、スルホ基およびそれらの塩として
適している。あるいは、ポリウロン酸、ポリアクリル
酸、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）などの水溶
性高分子を過酸化水素の保持担体、保持ゲルあるいは保
持ゾルとして用いてもよい。あるいは、これらの過酸化
水素保持担体、保持ゲルあるいは保持ゾルとヒダントイ
ン酸、Ｌ−シトルリン、クエン酸、リン酸などとの混合
物を過酸化水素保持剤として用いてもよい。ウロン酸と
しては、グルクロン酸、グルロン酸、マンヌロン酸、ガ
ラクツロン酸、イズロン酸などが例示できる。ポリウロ
ン酸としては、これらのウロン酸のホモポリマーあるい
はヘテロポリマーである。ヘテロポリマーとしては、ウ
ロン酸とアルドースとのヘテロポリマーであってもよ
い。ポリウロン酸としては、アルギン酸、ペクチン酸が
例示できる。
【００３９】本発明の方法では、成分（ａ）と（ｂ）の
付加物に、水系溶液を加え過酸化物水溶液、具体的には
過酸化水素水溶液を発生させて、これを試薬として用い
る。水系溶液とは、主成分として水を含むもので、過酸
化物を溶解して過酸化物水溶液とするものであるが、具
体的には、水、塩溶液、緩衝液あるいは液性試料であ
り、液性試料としては、尿、血清、血漿、全血、唾液、
涙液、髄液、乳頭などからの分泌液等が例示される。粘
液、体組織あるいは細胞、菌体等の固形またはゲル状も
しくはゾル状物を、緩衝液、抽出液あるいは溶解液等の
液体に懸濁もしくは溶解させた液性試料そのものを用い
てもよい。この付加物に水系溶液を加える方法は、水系
溶液と付加物とを直接混合してもよいが、分析装置とし
て前述の多孔質体を用いる場合は、乾燥した付加物の付
着した多孔質体に水系溶液を含浸させて行うことができ
る。付加物に水系溶液を加えると過酸化物、具体的には
過酸化水素等が溶出し分析装置として用いることができ
る。本発明の方法では、成分（ａ）が蛋白質を変性した
り、分析対象物の特異反応の１つである免疫反応、ある
いは標識剤の反応である酵素反応等を阻害したりしない
ので、付加物を反応の場に予め配置することもできる
し、反応の場の上流側に配置し、水系溶液に溶出した成
分（ａ）と（ｂ）が反応の場に運ばれるようにしてもよ
い。また、反応の場の下流側に配置し、成分（ａ）と
（ｂ）が反応の場に浸透するようにしてもよい。付加物
を反応の場近くに配置すれば、分析試薬としての過酸化
水素を短時間で活性状態にすることができる。分析対象
物の特異反応においては、成分（ａ）の悪影響がなく、
かつ、保持能が高いので、成分（ａ）濃度をより低濃度
で用いることができ、また、成分（ａ）による妨害はほ
とんど認められないという効果も得られる。
付加物に、水系溶液を加え過酸化物水溶液、具体的には
過酸化水素水溶液を発生させて、これを試薬として用い
る。水系溶液とは、主成分として水を含むもので、過酸
化物を溶解して過酸化物水溶液とするものであるが、具
体的には、水、塩溶液、緩衝液あるいは液性試料であ
り、液性試料としては、尿、血清、血漿、全血、唾液、
涙液、髄液、乳頭などからの分泌液等が例示される。粘
液、体組織あるいは細胞、菌体等の固形またはゲル状も
しくはゾル状物を、緩衝液、抽出液あるいは溶解液等の
液体に懸濁もしくは溶解させた液性試料そのものを用い
てもよい。この付加物に水系溶液を加える方法は、水系
溶液と付加物とを直接混合してもよいが、分析装置とし
て前述の多孔質体を用いる場合は、乾燥した付加物の付
着した多孔質体に水系溶液を含浸させて行うことができ
る。付加物に水系溶液を加えると過酸化物、具体的には
過酸化水素等が溶出し分析装置として用いることができ
る。本発明の方法では、成分（ａ）が蛋白質を変性した
り、分析対象物の特異反応の１つである免疫反応、ある
いは標識剤の反応である酵素反応等を阻害したりしない
ので、付加物を反応の場に予め配置することもできる
し、反応の場の上流側に配置し、水系溶液に溶出した成
分（ａ）と（ｂ）が反応の場に運ばれるようにしてもよ
い。また、反応の場の下流側に配置し、成分（ａ）と
（ｂ）が反応の場に浸透するようにしてもよい。付加物
を反応の場近くに配置すれば、分析試薬としての過酸化
水素を短時間で活性状態にすることができる。分析対象
物の特異反応においては、成分（ａ）の悪影響がなく、
かつ、保持能が高いので、成分（ａ）濃度をより低濃度
で用いることができ、また、成分（ａ）による妨害はほ
とんど認められないという効果も得られる。
【００４０】以下に、本発明の分析方法を用いた具体例
を説明する。例えば、潜血試験では、尿、便あるいは便
抽出液などの試料を発色剤ο−トリジン、グアヤコー
ル、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）などと過酸化水
素に触れさせて、試料中のヘモグロビンのパーオキシダ
ーゼ活性の有無を発色剤の呈色反応で調べる。通常、少
なくとも過酸化水素は溶液状態でキットに添付されてお
り、試料を塗抹した濾紙あるいは採取スティックなどの
採取具あるいは採取容器に滴下する。しかし、本発明の
過酸化水素付加物は、乾燥状態で安定であり、尿素のよ
うに酵素反応過程に悪影響を与えることもないため、試
料を塗抹した濾紙あるいは採取スティックなどの採取具
あるいは採取容器にあらかじめ乾燥状態で存在させてお
くことができる。例えば、発色剤を含浸させた濾紙と本
発明の過酸化水素付加物を含浸させた濾紙とを重積した
り、採取具あるいは採取容器内に並置させておけばよ
い。このような潜血試験方法では、試料を採取後すぐに
発色反応を起こさせることが可能となる。また、便など
の固形物を試料とする場合で、水分を滴下する必要性が
ある場合でも、不安定な過酸化水素液ではなく、緩衝液
を添付するだけでよい。すなわち、潜血試験において
も、本発明の過酸化水素付加物は、分析試薬の安定性と
分析操作の簡便性を向上させる。
を説明する。例えば、潜血試験では、尿、便あるいは便
抽出液などの試料を発色剤ο−トリジン、グアヤコー
ル、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）などと過酸化水
素に触れさせて、試料中のヘモグロビンのパーオキシダ
ーゼ活性の有無を発色剤の呈色反応で調べる。通常、少
なくとも過酸化水素は溶液状態でキットに添付されてお
り、試料を塗抹した濾紙あるいは採取スティックなどの
採取具あるいは採取容器に滴下する。しかし、本発明の
過酸化水素付加物は、乾燥状態で安定であり、尿素のよ
うに酵素反応過程に悪影響を与えることもないため、試
料を塗抹した濾紙あるいは採取スティックなどの採取具
あるいは採取容器にあらかじめ乾燥状態で存在させてお
くことができる。例えば、発色剤を含浸させた濾紙と本
発明の過酸化水素付加物を含浸させた濾紙とを重積した
り、採取具あるいは採取容器内に並置させておけばよ
い。このような潜血試験方法では、試料を採取後すぐに
発色反応を起こさせることが可能となる。また、便など
の固形物を試料とする場合で、水分を滴下する必要性が
ある場合でも、不安定な過酸化水素液ではなく、緩衝液
を添付するだけでよい。すなわち、潜血試験において
も、本発明の過酸化水素付加物は、分析試薬の安定性と
分析操作の簡便性を向上させる。
【００４１】また、前記した化学発光分析の場合、過酸
化水素または一連の検出反応を起こさせるための引き金
となる試薬を含むトリガー液を分注すると同時に発光を
検出する必要がある。そのため、トリガー液の分注攪拌
機構と発光検出機構との精密な連動が要求される。しか
し、あらかじめ本発明の過酸化水素付加物を反応容器に
乾燥状態で組み込んでおくことにより、試料液を反応容
器に分注するだけで過酸化水素が発生して発光を生起で
きる。さらに好ましい方法として、特異結合物質を不溶
化する担体として磁性粒子などの微粒子担体を用いる方
法が例示できる。この場合、特異結合反応後の微粒子担
体を濾紙などのフィルター上で捕捉し、化学発光に必要
な成分をフィルター上に滴下すれば、微粒子担体上に結
合している標識物に由来する化学発光をこのフィルター
上で観測できる。本発明の過酸化水素付加物は、濾紙な
どのフィルター内に安定に含浸乾燥できるから、あらか
じめ本発明の過酸化水素付加物を含浸乾燥したフィルタ
ー上で前記した特異結合反応後の微粒子担体の捕捉を行
えば、過酸化水素を滴下せずとも化学発光を生起でき、
迅速で正確な化学発光特異結合分析が可能となる。
化水素または一連の検出反応を起こさせるための引き金
となる試薬を含むトリガー液を分注すると同時に発光を
検出する必要がある。そのため、トリガー液の分注攪拌
機構と発光検出機構との精密な連動が要求される。しか
し、あらかじめ本発明の過酸化水素付加物を反応容器に
乾燥状態で組み込んでおくことにより、試料液を反応容
器に分注するだけで過酸化水素が発生して発光を生起で
きる。さらに好ましい方法として、特異結合物質を不溶
化する担体として磁性粒子などの微粒子担体を用いる方
法が例示できる。この場合、特異結合反応後の微粒子担
体を濾紙などのフィルター上で捕捉し、化学発光に必要
な成分をフィルター上に滴下すれば、微粒子担体上に結
合している標識物に由来する化学発光をこのフィルター
上で観測できる。本発明の過酸化水素付加物は、濾紙な
どのフィルター内に安定に含浸乾燥できるから、あらか
じめ本発明の過酸化水素付加物を含浸乾燥したフィルタ
ー上で前記した特異結合反応後の微粒子担体の捕捉を行
えば、過酸化水素を滴下せずとも化学発光を生起でき、
迅速で正確な化学発光特異結合分析が可能となる。
【００４２】すなわち、本発明の分析方法は、前記した
各種分析方法を含めて、分析試薬の１成分として過酸化
物、具体的には過酸化水素を用いるいずれの分析方法に
おいても、分析試薬の安定性を高め、分析操作を簡便化
でき、正確で迅速な分析を行うことができる。さらに、
本発明の分析方法は、潜血試験等のパーオキシダーゼ活
性分析、化学発光分析、特異結合反応に基づく分析方法
に好適であり、流路と検出部とを有する装置を用いる特
異結合分析にも好ましい。
各種分析方法を含めて、分析試薬の１成分として過酸化
物、具体的には過酸化水素を用いるいずれの分析方法に
おいても、分析試薬の安定性を高め、分析操作を簡便化
でき、正確で迅速な分析を行うことができる。さらに、
本発明の分析方法は、潜血試験等のパーオキシダーゼ活
性分析、化学発光分析、特異結合反応に基づく分析方法
に好適であり、流路と検出部とを有する装置を用いる特
異結合分析にも好ましい。
【００４３】次に、本発明の方法を用いる分析装置の一
例を挙げて本発明の分析方法を詳細に説明する。本発明
の方法を用いる分析装置の原理は、過酸化物を使用する
ものであれば特に限定されるものではないが、過酸化物
のひとつである過酸化水素が、ＨＲＰＯの酵素基質であ
ることから、酸化還元酵素としてＨＲＰＯを標識剤と
し、液体試料と共にマトリクス中に展開することによ
り、液体試料中の分析対象物と特異結合物質との特異結
合反応によって標識剤の電極部からの距離分布を形成さ
せ、電子伝達物質の拡散に律速された液体試料中の分析
対象物の濃度に対応する電流値を計測し、これによって
分析対象物濃度を測定するＭＥＤＩＡ法(Mediator Diff
usion-Controlled Immunoassay) として知られる特異結
合分析方法（特開平５−２６４５５２号公報（欧州特許
公開公報 0 525 723 A2 号）、特開平７−２３４２０１
号公報参照）に適用するのが好ましい。
例を挙げて本発明の分析方法を詳細に説明する。本発明
の方法を用いる分析装置の原理は、過酸化物を使用する
ものであれば特に限定されるものではないが、過酸化物
のひとつである過酸化水素が、ＨＲＰＯの酵素基質であ
ることから、酸化還元酵素としてＨＲＰＯを標識剤と
し、液体試料と共にマトリクス中に展開することによ
り、液体試料中の分析対象物と特異結合物質との特異結
合反応によって標識剤の電極部からの距離分布を形成さ
せ、電子伝達物質の拡散に律速された液体試料中の分析
対象物の濃度に対応する電流値を計測し、これによって
分析対象物濃度を測定するＭＥＤＩＡ法(Mediator Diff
usion-Controlled Immunoassay) として知られる特異結
合分析方法（特開平５−２６４５５２号公報（欧州特許
公開公報 0 525 723 A2 号）、特開平７−２３４２０１
号公報参照）に適用するのが好ましい。
【００４４】従って、以下に、本発明を適用することが
できるＭＥＤＩＡ法特異結合分析方法の基本的原理につ
いて、本発明をＭＥＤＩＡ法特異結合分析装置に適用し
た一例に基づいて本発明を説明する。なお、本明細書中
で用いる用語の定義は、特開平５−２６４５５２号公
報、特開平７−２３４２０１号公報に記載されているの
で、これらの公報の内容を引用し、本発明の記載とす
る。
できるＭＥＤＩＡ法特異結合分析方法の基本的原理につ
いて、本発明をＭＥＤＩＡ法特異結合分析装置に適用し
た一例に基づいて本発明を説明する。なお、本明細書中
で用いる用語の定義は、特開平５−２６４５５２号公
報、特開平７−２３４２０１号公報に記載されているの
で、これらの公報の内容を引用し、本発明の記載とす
る。
【００４５】本発明の方法を実施する分析装置の一例
は、流路と検出部とを有し、原理的に図１に示され、具
体的に図２に示される装置が挙げられる。流路ｅとは、
試料導入部から導入された液性試料が流れる経路であ
り、分析対象物および信号物質発生体が展開され、特異
結合反応が起こる場をいう。試料導入部から導入された
液性試料は、ポンプなどの外圧、重力などの外力あるい
は自発的な浸透力によって、流路内へ導入される。簡便
な装置構成で、再現性ある液性試料の流路内への導入を
可能とするためには、流路を細管（キャピラリ）あるい
は狭い間隙で構成するか、あるいは流路を多孔性部材で
構成して、液性試料の自発的な浸透力によって導入する
のが望ましい。
は、流路と検出部とを有し、原理的に図１に示され、具
体的に図２に示される装置が挙げられる。流路ｅとは、
試料導入部から導入された液性試料が流れる経路であ
り、分析対象物および信号物質発生体が展開され、特異
結合反応が起こる場をいう。試料導入部から導入された
液性試料は、ポンプなどの外圧、重力などの外力あるい
は自発的な浸透力によって、流路内へ導入される。簡便
な装置構成で、再現性ある液性試料の流路内への導入を
可能とするためには、流路を細管（キャピラリ）あるい
は狭い間隙で構成するか、あるいは流路を多孔性部材で
構成して、液性試料の自発的な浸透力によって導入する
のが望ましい。
【００４６】例えば、流路を構成する細管あるいは多孔
性部材に特異結合物質が不溶化されており、液性試料お
よび信号物質発生体がここを所定方向に流れることで、
特異結合反応が試料の流れ方向に分布をもって起こる。
より具体的な例を挙げれば、分析対象物と信号物質発生
体が、特異結合物質に対して競合的に特異結合するか、
分析対象物が特異結合物質に結合し、さらに信号物質発
生体が分析対象物にサンドイッチ型に特異結合する等し
て、特異結合反応が液性試料の流れ方向に分布をもって
起こることによって、液性試料中の分析対象物の濃度に
応じた信号物質発生体の分布が形成される。なお、特異
結合反応等が試料の流れ方向に分布をもって起こる場で
ある流路は、特異結合物質が不溶化されている例に限定
されるものではなく、特異結合反応に伴って起こる分子
量あるいは粒子サイズの変化等に基づいてそれを分布と
して示すものであってもよい。
性部材に特異結合物質が不溶化されており、液性試料お
よび信号物質発生体がここを所定方向に流れることで、
特異結合反応が試料の流れ方向に分布をもって起こる。
より具体的な例を挙げれば、分析対象物と信号物質発生
体が、特異結合物質に対して競合的に特異結合するか、
分析対象物が特異結合物質に結合し、さらに信号物質発
生体が分析対象物にサンドイッチ型に特異結合する等し
て、特異結合反応が液性試料の流れ方向に分布をもって
起こることによって、液性試料中の分析対象物の濃度に
応じた信号物質発生体の分布が形成される。なお、特異
結合反応等が試料の流れ方向に分布をもって起こる場で
ある流路は、特異結合物質が不溶化されている例に限定
されるものではなく、特異結合反応に伴って起こる分子
量あるいは粒子サイズの変化等に基づいてそれを分布と
して示すものであってもよい。
【００４７】検出部ｃとは、到達した信号物質が発する
信号を検出する部位であり、肉眼での目視で、もしく
は、信号の性質に応じた好適な外部の計測器で、信号の
変調の程度を計測できる部位である。
信号を検出する部位であり、肉眼での目視で、もしく
は、信号の性質に応じた好適な外部の計測器で、信号の
変調の程度を計測できる部位である。
【００４８】以上説明した特異結合物質、信号物質発生
体、ならびに信号の発生に関与する物質は、あらかじめ
装置内に存在してもよいし、液性試料の導入に先立ち、
あるいは液性試料と同時に、あるいは液性試料の導入後
に、装置内に導入されてもよい。なお、あらかじめ装置
内に存在する場合は、装置内に均質に分布していてもよ
いし、装置内の特定の箇所に備えられ、液性試料または
試料以外の展開液によって溶解するものであってもよ
い。ここで、本発明において必須の過酸化水素付加物
は、信号物質の発生に関与する物質の役割を有し、ま
た、特異結合反応への悪影響が小さいので、流路ｅの上
流側に配置することができる。このように配置すること
により、過酸化水素水溶液が直接特異結合反応の場に溶
出するため、迅速に測定結果が得られるので好ましい。
体、ならびに信号の発生に関与する物質は、あらかじめ
装置内に存在してもよいし、液性試料の導入に先立ち、
あるいは液性試料と同時に、あるいは液性試料の導入後
に、装置内に導入されてもよい。なお、あらかじめ装置
内に存在する場合は、装置内に均質に分布していてもよ
いし、装置内の特定の箇所に備えられ、液性試料または
試料以外の展開液によって溶解するものであってもよ
い。ここで、本発明において必須の過酸化水素付加物
は、信号物質の発生に関与する物質の役割を有し、ま
た、特異結合反応への悪影響が小さいので、流路ｅの上
流側に配置することができる。このように配置すること
により、過酸化水素水溶液が直接特異結合反応の場に溶
出するため、迅速に測定結果が得られるので好ましい。
【００４９】なお、液性試料の自発的な流れを増強した
り、流路ｅを通過する試料液量を増大させるために、必
要に応じて、流路ｅの下流に連結して吸収部を配置する
こともできる。吸収部は、吸水性材料で構成され、必要
に応じ、信号物質の発生に関与する物質等を保持する部
位であってもよい。また、導入された試料液を吸引し保
持する役割もはたす。
り、流路ｅを通過する試料液量を増大させるために、必
要に応じて、流路ｅの下流に連結して吸収部を配置する
こともできる。吸収部は、吸水性材料で構成され、必要
に応じ、信号物質の発生に関与する物質等を保持する部
位であってもよい。また、導入された試料液を吸引し保
持する役割もはたす。
【００５０】本発明を適用することができる装置の原理
は図１に示され、液性試料を導入する試料導入部ａと、
過酸化水素付加物、その他必要により信号の発生に関与
する物質（例えば、ＨＲＰＯ）等を備える試薬部ｂと、
検出部ｃと、検出部ｃに連結したマトリクスｄとを有す
る。試料導入部ａ、試薬部ｂおよびマトリクスｄは流路
ｅの一部であるか、もしくは各部は流路ｅでそれぞれ連
結されている。試薬部ｂが複数存在してもよい。図１に
示される例において、分析対象物量未知の液性試料を試
料導入部ａから装置内に導入し、試薬部ｂで過酸化水素
等を溶解し、分析対象物と特異結合物質との少なくとも
１つの特異結合反応により、マトリクスｄ内で液性試料
中の分析対象物量に応じた信号物質発生体１０の分布を
形成させ、必要な場合には信号物質の発生に関与する物
質１４を反応させて、マトリクスｄ内に分布する各々の
信号物質発生体１０によって信号物質１２を発生させ、
発生した信号物質１２が、それぞれ流路内を拡散して検
出部ｃまで到達して発する信号を、検出部ｃにおいて計
測する。
は図１に示され、液性試料を導入する試料導入部ａと、
過酸化水素付加物、その他必要により信号の発生に関与
する物質（例えば、ＨＲＰＯ）等を備える試薬部ｂと、
検出部ｃと、検出部ｃに連結したマトリクスｄとを有す
る。試料導入部ａ、試薬部ｂおよびマトリクスｄは流路
ｅの一部であるか、もしくは各部は流路ｅでそれぞれ連
結されている。試薬部ｂが複数存在してもよい。図１に
示される例において、分析対象物量未知の液性試料を試
料導入部ａから装置内に導入し、試薬部ｂで過酸化水素
等を溶解し、分析対象物と特異結合物質との少なくとも
１つの特異結合反応により、マトリクスｄ内で液性試料
中の分析対象物量に応じた信号物質発生体１０の分布を
形成させ、必要な場合には信号物質の発生に関与する物
質１４を反応させて、マトリクスｄ内に分布する各々の
信号物質発生体１０によって信号物質１２を発生させ、
発生した信号物質１２が、それぞれ流路内を拡散して検
出部ｃまで到達して発する信号を、検出部ｃにおいて計
測する。
【００５１】すなわち、図１においては１つの信号物質
発生体１０のみを例示するが、検出部ｃにおいて計測さ
れるのは、マトリクスｄ内に分布する多数の信号物質発
生体１０から連続的に発生された信号物質１２の拡散に
律速された信号に依存する。つまり、信号物質１２の発
生源である信号物質発生体１０から検出部ｃに至るま
で、拡散によって信号物質１２が流路内を移動しなけれ
ばならない距離ｘに依存した信号となる。
発生体１０のみを例示するが、検出部ｃにおいて計測さ
れるのは、マトリクスｄ内に分布する多数の信号物質発
生体１０から連続的に発生された信号物質１２の拡散に
律速された信号に依存する。つまり、信号物質１２の発
生源である信号物質発生体１０から検出部ｃに至るま
で、拡散によって信号物質１２が流路内を移動しなけれ
ばならない距離ｘに依存した信号となる。
【００５２】ここで、後に詳述するが、信号物質発生体
１０の分布は液性試料中の分析対象物の量に依存する。
従って、試料導入部ａに導入された液性試料中の分析対
象物量が異なると、マトリクスｄにおける信号物質発生
体１０から検出部ｃに至るまでの信号物質１２の拡散距
離の分布が分析対象物量に応じて異なる結果となり、こ
の信号物質発生体１０の分布の違いを検出部ｃに到達し
た信号物質１２が発する信号の違いとして検出すること
ができる。ここで例示する特異結合分析方法は、上記の
仕組みを利用したものであって、検出部ｃにおいて信号
物質１２が発する信号から液性試料中の分析対象物量を
測定するものである。
１０の分布は液性試料中の分析対象物の量に依存する。
従って、試料導入部ａに導入された液性試料中の分析対
象物量が異なると、マトリクスｄにおける信号物質発生
体１０から検出部ｃに至るまでの信号物質１２の拡散距
離の分布が分析対象物量に応じて異なる結果となり、こ
の信号物質発生体１０の分布の違いを検出部ｃに到達し
た信号物質１２が発する信号の違いとして検出すること
ができる。ここで例示する特異結合分析方法は、上記の
仕組みを利用したものであって、検出部ｃにおいて信号
物質１２が発する信号から液性試料中の分析対象物量を
測定するものである。
【００５３】前述のように、特異結合反応とは、分析対
象物とそれに特異的に結合する特異結合物質（含信号物
質発生体１０）との反応、特異結合物質と信号物質発生
体１０との反応等をいう。すなわち、ここで例示する分
析装置は、 信号物質発生体１０の標識によって発生され、かつ、
検出部ｃにおいてのみ検出可能な信号を発生するあるい
は発生させる信号物質１２を媒介させる場合、検出部ｃ
において観測される信号は、標識（信号物質発生体１
０）と検出部ｃとの距離（すなわち信号物質１２の拡散
距離）に応じた出力強度となること； 分析対象物と特異結合物質との少なくとも１つの特異
結合反応によって、信号物質発生体１０（すなわち標
識）の位置分布を液性試料中の分析対象物濃度に応じて
異なるものとできること； 従って、検出部ｃにおいて検出される信号は、液性試
料中の分析対象物濃度に対応していること；をその分析
方法の基本概念としたものである。
象物とそれに特異的に結合する特異結合物質（含信号物
質発生体１０）との反応、特異結合物質と信号物質発生
体１０との反応等をいう。すなわち、ここで例示する分
析装置は、 信号物質発生体１０の標識によって発生され、かつ、
検出部ｃにおいてのみ検出可能な信号を発生するあるい
は発生させる信号物質１２を媒介させる場合、検出部ｃ
において観測される信号は、標識（信号物質発生体１
０）と検出部ｃとの距離（すなわち信号物質１２の拡散
距離）に応じた出力強度となること； 分析対象物と特異結合物質との少なくとも１つの特異
結合反応によって、信号物質発生体１０（すなわち標
識）の位置分布を液性試料中の分析対象物濃度に応じて
異なるものとできること； 従って、検出部ｃにおいて検出される信号は、液性試
料中の分析対象物濃度に対応していること；をその分析
方法の基本概念としたものである。
【００５４】本発明者らは、上記基本概念を見出し、先
にこれを用いた特異結合分析方法および装置を提案した
（特開平５−２６４５５２号公報、欧州特許公開公報 0
525723 A2 号、特開平７−２３４２０１号公報参
照）。この分析方法が、ＭＥＤＩＡ法と呼ばれる。この
分析方法（装置）によれば、未反応物の除去操作なし
に、試料中の分析対象物を高感度、かつ迅速に測定する
ことが可能である。
にこれを用いた特異結合分析方法および装置を提案した
（特開平５−２６４５５２号公報、欧州特許公開公報 0
525723 A2 号、特開平７−２３４２０１号公報参
照）。この分析方法が、ＭＥＤＩＡ法と呼ばれる。この
分析方法（装置）によれば、未反応物の除去操作なし
に、試料中の分析対象物を高感度、かつ迅速に測定する
ことが可能である。
【００５５】特開平７−２３４２０１号公報に記載のＭ
ＥＤＩＡ法では、前述のように、過酸化水素の供給源と
して、尿素と過酸化水素との混合溶液をガラス濾紙ある
いはセルロース濾紙等に含浸・乾燥させたものが用いら
れている。これは保存安定性、過酸化水素水溶液を別に
調合する必要がないという簡便性等の理由からである。
なお、尿素を用いているのは、尿素に過酸化水素の保持
効果がある、溶解性が高い等の理由による。しかしなが
ら、蛋白変性剤としても知られる尿素は、抗原抗体反応
において、いったん酵素標識抗体あるいは不溶化抗体な
どに結合した抗原を脱離させてしまい測定を不安定にす
るという悪影響を及ぼすことから、尿素ができるだけ反
応の場に影響を及ぼさないよう、尿素を用いた過酸化水
素付加物は、反応に影響を及ぼしにくい分析装置最下流
に配置する必要があり、具体的には後述する図２に示す
装置の吸収部２８に配置されていた。このため、尿素に
保持される過酸化水素も反応の場から遠くに位置するこ
ととなり、この場合反応系への過酸化水素の供給は下流
側からの拡散によって行われることから、安定な応答が
得られるまでに時間がかかり、迅速に測定結果が得られ
ない、さらには、最下流に置かれていても、尿素の逆拡
散により時間とともに応答を阻害するという欠点があっ
た。また、尿素の過酸化水素保持能も必ずしも高いとは
いえない程度のものであった。
ＥＤＩＡ法では、前述のように、過酸化水素の供給源と
して、尿素と過酸化水素との混合溶液をガラス濾紙ある
いはセルロース濾紙等に含浸・乾燥させたものが用いら
れている。これは保存安定性、過酸化水素水溶液を別に
調合する必要がないという簡便性等の理由からである。
なお、尿素を用いているのは、尿素に過酸化水素の保持
効果がある、溶解性が高い等の理由による。しかしなが
ら、蛋白変性剤としても知られる尿素は、抗原抗体反応
において、いったん酵素標識抗体あるいは不溶化抗体な
どに結合した抗原を脱離させてしまい測定を不安定にす
るという悪影響を及ぼすことから、尿素ができるだけ反
応の場に影響を及ぼさないよう、尿素を用いた過酸化水
素付加物は、反応に影響を及ぼしにくい分析装置最下流
に配置する必要があり、具体的には後述する図２に示す
装置の吸収部２８に配置されていた。このため、尿素に
保持される過酸化水素も反応の場から遠くに位置するこ
ととなり、この場合反応系への過酸化水素の供給は下流
側からの拡散によって行われることから、安定な応答が
得られるまでに時間がかかり、迅速に測定結果が得られ
ない、さらには、最下流に置かれていても、尿素の逆拡
散により時間とともに応答を阻害するという欠点があっ
た。また、尿素の過酸化水素保持能も必ずしも高いとは
いえない程度のものであった。
【００５６】このような問題点を解決するために、本発
明者らが鋭意検討を重ねた結果、本発明の方法では、過
酸化水素と、カルボン酸およびカルボン酸の塩の少なく
とも一成分とを含む、過酸化水素と、スルホン酸および
スルホン酸の塩の少なくとも一成分とを含む、過酸化水
素と、リン酸およびリン酸の塩の少なくとも一成分とを
含む、過酸化水素と単糖、二糖、糖アルコール、および
それらのポリマーのすくなくとも１成分とを含む、ある
いは過酸化水素と、Ｎ−アセチル−グルコサミン、アス
コルビン酸、クレアチニン、およびポリエチレングリコ
ールの少なくとも一成分とを含む、乾燥状態の付加物を
過酸化物の供給源として用いることにより、過酸化水素
保持能が高く、かつ、特異結合反応等への悪影響が少な
くなることを見出して、本発明を完成したものである。
明者らが鋭意検討を重ねた結果、本発明の方法では、過
酸化水素と、カルボン酸およびカルボン酸の塩の少なく
とも一成分とを含む、過酸化水素と、スルホン酸および
スルホン酸の塩の少なくとも一成分とを含む、過酸化水
素と、リン酸およびリン酸の塩の少なくとも一成分とを
含む、過酸化水素と単糖、二糖、糖アルコール、および
それらのポリマーのすくなくとも１成分とを含む、ある
いは過酸化水素と、Ｎ−アセチル−グルコサミン、アス
コルビン酸、クレアチニン、およびポリエチレングリコ
ールの少なくとも一成分とを含む、乾燥状態の付加物を
過酸化物の供給源として用いることにより、過酸化水素
保持能が高く、かつ、特異結合反応等への悪影響が少な
くなることを見出して、本発明を完成したものである。
【００５７】以下に、特異結合反応の具体例として、免
疫反応系の一成分が分析対象物である場合について、マ
トリクスｄ内での免疫反応（特異結合反応）を例示す
る。ここで例示する免疫反応は、特異結合反応によっ
て、液性試料中の分析対象物の量に応じて、マトリクス
ｄ内での信号物質発生体１０の分布を変化させ、この分
布の変化を、検出部ｃで測定する。なお、液性試料中の
分析対象物の量に応じて、流路内の信号物質発生体１０
の分布を変化させる方法は、種々の方法が可能であり、
以下に記載する方法は一例にすぎない。
疫反応系の一成分が分析対象物である場合について、マ
トリクスｄ内での免疫反応（特異結合反応）を例示す
る。ここで例示する免疫反応は、特異結合反応によっ
て、液性試料中の分析対象物の量に応じて、マトリクス
ｄ内での信号物質発生体１０の分布を変化させ、この分
布の変化を、検出部ｃで測定する。なお、液性試料中の
分析対象物の量に応じて、流路内の信号物質発生体１０
の分布を変化させる方法は、種々の方法が可能であり、
以下に記載する方法は一例にすぎない。
【００５８】その第一は、分析対象物と同じ物質あるい
はその類縁物質を反応の場に不溶化して行う競合法であ
る。この場合、マトリクスｄには、分析対象物と同じ物
質あるいはその類縁物質を不溶化しておき、信号物質発
生体１０としては、特異結合物質である抗分析対象物抗
体と標識剤（例えば信号物質１２を発生させる反応に関
与する酵素）との結合体を用いる。液性試料にあらかじ
め信号物質発生体１０を混合しておき、これを試料導入
部ａから流すことにより、あるいは、信号物質発生体１
０を含む試薬部ｂにおいて信号物質発生体１０と液性試
料とを混合した後、マトリクスｄに流すことにより、試
料中の分析対象物と不溶化された分析対象物（あるいは
その類縁物質）とを、信号物質発生体１０中の抗体部分
（特異結合物質）に対して、競合的に反応させる。その
結果、液性試料中の分析対象物量が多いほど、信号物質
発生体１０はマトリクスｄ内のより下流側に分布が変動
する。この方法は、分析対象物がハプテン様の低分子量
物質の場合でも、分析対象物が高分子量物質の場合でも
好適に用いることができる。分析対象物がハプテンの場
合、分析対象物と同じハプテンかあるいは特異結合物質
が交叉反応しうる別のハプテンを、特異結合物質が結合
可能な様式でマトリクスｄに不溶化すればよい。分析対
象物が高分子量の蛋白質などの場合、蛋白質自体あるい
は特異結合物質が結合するエピトープのペプチド配列を
マトリクスｄに不溶化すればよい。
はその類縁物質を反応の場に不溶化して行う競合法であ
る。この場合、マトリクスｄには、分析対象物と同じ物
質あるいはその類縁物質を不溶化しておき、信号物質発
生体１０としては、特異結合物質である抗分析対象物抗
体と標識剤（例えば信号物質１２を発生させる反応に関
与する酵素）との結合体を用いる。液性試料にあらかじ
め信号物質発生体１０を混合しておき、これを試料導入
部ａから流すことにより、あるいは、信号物質発生体１
０を含む試薬部ｂにおいて信号物質発生体１０と液性試
料とを混合した後、マトリクスｄに流すことにより、試
料中の分析対象物と不溶化された分析対象物（あるいは
その類縁物質）とを、信号物質発生体１０中の抗体部分
（特異結合物質）に対して、競合的に反応させる。その
結果、液性試料中の分析対象物量が多いほど、信号物質
発生体１０はマトリクスｄ内のより下流側に分布が変動
する。この方法は、分析対象物がハプテン様の低分子量
物質の場合でも、分析対象物が高分子量物質の場合でも
好適に用いることができる。分析対象物がハプテンの場
合、分析対象物と同じハプテンかあるいは特異結合物質
が交叉反応しうる別のハプテンを、特異結合物質が結合
可能な様式でマトリクスｄに不溶化すればよい。分析対
象物が高分子量の蛋白質などの場合、蛋白質自体あるい
は特異結合物質が結合するエピトープのペプチド配列を
マトリクスｄに不溶化すればよい。
【００５９】第二は、分析対象物が複数の抗体と同時に
結合しうる抗原等の高分子量物質の場合に好適なサンド
イッチ法を用いる例である。この場合、マトリクスｄに
は、分析対象物の第１の特異結合物質であるエピトープ
Ａに対する抗体を不溶化しておき、分析対象物の第２の
特異結合物質であるエピトープＢに対する抗体と標識剤
との結合体を信号物質発生体１０として、液性試料にあ
らかじめ信号物質発生体１０を混合しておき、これをマ
トリクスｄに流すことにより、あるいは、信号物質発生
体１０を含む試薬部ｂにおいて信号物質発生体１０と液
性試料とを混合した後、マトリクスｄに流すことによ
り、分析対象物に反応させるとよい。すなわち、試料中
の分析対象物をサンドイッチ型に反応させるのである。
その結果、液性試料中の分析対象物量が多いほど、信号
物質発生体１０はマトリクスｄ内のより上流側に分布が
変動する。また、分析対象物が抗体の場合、マトリクス
ｄには特異結合物質である抗原を不溶化しておき、抗
（抗体）抗体と標識剤との結合体を信号物質発生体１０
として分析対象物に反応させるとよい。
結合しうる抗原等の高分子量物質の場合に好適なサンド
イッチ法を用いる例である。この場合、マトリクスｄに
は、分析対象物の第１の特異結合物質であるエピトープ
Ａに対する抗体を不溶化しておき、分析対象物の第２の
特異結合物質であるエピトープＢに対する抗体と標識剤
との結合体を信号物質発生体１０として、液性試料にあ
らかじめ信号物質発生体１０を混合しておき、これをマ
トリクスｄに流すことにより、あるいは、信号物質発生
体１０を含む試薬部ｂにおいて信号物質発生体１０と液
性試料とを混合した後、マトリクスｄに流すことによ
り、分析対象物に反応させるとよい。すなわち、試料中
の分析対象物をサンドイッチ型に反応させるのである。
その結果、液性試料中の分析対象物量が多いほど、信号
物質発生体１０はマトリクスｄ内のより上流側に分布が
変動する。また、分析対象物が抗体の場合、マトリクス
ｄには特異結合物質である抗原を不溶化しておき、抗
（抗体）抗体と標識剤との結合体を信号物質発生体１０
として分析対象物に反応させるとよい。
【００６０】第三は、分析対象物に対する特異結合物質
を不溶化して行う競合法である。この場合、マトリクス
ｄには、特異結合物質である抗分析対象物抗体を不溶化
しておき、信号物質発生体１０としては、不溶化特異結
合物質に対して分析対象物と競合する物質である分析対
象物と同じ物質あるいはその類縁物質と標識剤との結合
体を用い、液性試料にあらかじめ信号物質発生体１０を
混合しておき、これをマトリクスｄに流すことにより、
あるいはマトリクスｄの上流域に存在する信号物質発生
体１０を含む試薬部において信号物質発生体１０と液性
試料とを混合した後、マトリクスｄに流すことにより、
分析試料中の分析対象物と信号物質発生体１０とを、不
溶化された特異結合物質に対して競合的に反応させると
よい。その結果、液性試料中の分析対象物量が多いほ
ど、信号物質発生体１０は流路内のより下流側に分布が
変動する。また、分析対象物が抗体の場合、流路には特
異結合物質である抗原あるいはエピトープ部分を不溶化
しておき、不溶化特異結合物質に対して分析対象物の抗
体と競合的に結合する別の抗体と標識剤との結合体を信
号物質発生体１０として用いることができる。
を不溶化して行う競合法である。この場合、マトリクス
ｄには、特異結合物質である抗分析対象物抗体を不溶化
しておき、信号物質発生体１０としては、不溶化特異結
合物質に対して分析対象物と競合する物質である分析対
象物と同じ物質あるいはその類縁物質と標識剤との結合
体を用い、液性試料にあらかじめ信号物質発生体１０を
混合しておき、これをマトリクスｄに流すことにより、
あるいはマトリクスｄの上流域に存在する信号物質発生
体１０を含む試薬部において信号物質発生体１０と液性
試料とを混合した後、マトリクスｄに流すことにより、
分析試料中の分析対象物と信号物質発生体１０とを、不
溶化された特異結合物質に対して競合的に反応させると
よい。その結果、液性試料中の分析対象物量が多いほ
ど、信号物質発生体１０は流路内のより下流側に分布が
変動する。また、分析対象物が抗体の場合、流路には特
異結合物質である抗原あるいはエピトープ部分を不溶化
しておき、不溶化特異結合物質に対して分析対象物の抗
体と競合的に結合する別の抗体と標識剤との結合体を信
号物質発生体１０として用いることができる。
【００６１】ところで、上記説明では、マトリクスｄに
抗体あるいは抗原を不溶化させ、信号物質発生体１０や
分析対象物を抗体に直接あるいは間接に結合させたが、
信号物質発生体１０や分析対象物をマトリクスｄに結合
させなくても、すなわち先の例における抗体あるいは抗
原がマトリクスｄに不溶化されていなくても、分析対象
物の量に応じて信号物質発生体１０のマトリクスｄ内で
の分布を変化させることは可能であり、そのような例
も、ここに含まれる。
抗体あるいは抗原を不溶化させ、信号物質発生体１０や
分析対象物を抗体に直接あるいは間接に結合させたが、
信号物質発生体１０や分析対象物をマトリクスｄに結合
させなくても、すなわち先の例における抗体あるいは抗
原がマトリクスｄに不溶化されていなくても、分析対象
物の量に応じて信号物質発生体１０のマトリクスｄ内で
の分布を変化させることは可能であり、そのような例
も、ここに含まれる。
【００６２】例えば、分析対象物が微生物（例えば病原
性真菌等）であり、信号物質発生体１０が抗微生物抗体
（抗病原性真菌抗体等）と標識剤とが結合してなる標識
特異結合物質である場合、分析対象物（微生物）は、信
号物質発生体１０に比べてかなり大であるため、分析対
象物と信号物質発生体１０との複合体と、フリーの信号
物質発生体１０とでは、マトリクスｄ内での移動速度、
すなわち到達位置に大きな差を生じる。この場合には、
マトリクスｄとして、例えば多孔性材質のものを用い、
そのメッシュ（ポアサイズ）を適正に選択することによ
って、あるいは、ゲル状もしくはゾル状担体を用い、そ
の粘度を微生物サイズに応じて適正に選択することによ
って、この到達位置の差異を明瞭化できる。従って、分
析対象物は、マトリクスｄには結合されないが、そのマ
トリクスｄ内での分布は局在化され、分析対象物と特異
結合反応しうる信号物質発生体１０は、マトリクスｄ内
で分析対象物量に応じた分布をするようになる。この場
合でも、成分（ａ）と（ｂ）過酸化水素との付加物を試
薬として用いて、本発明の分析方法を行うことができ
る。
性真菌等）であり、信号物質発生体１０が抗微生物抗体
（抗病原性真菌抗体等）と標識剤とが結合してなる標識
特異結合物質である場合、分析対象物（微生物）は、信
号物質発生体１０に比べてかなり大であるため、分析対
象物と信号物質発生体１０との複合体と、フリーの信号
物質発生体１０とでは、マトリクスｄ内での移動速度、
すなわち到達位置に大きな差を生じる。この場合には、
マトリクスｄとして、例えば多孔性材質のものを用い、
そのメッシュ（ポアサイズ）を適正に選択することによ
って、あるいは、ゲル状もしくはゾル状担体を用い、そ
の粘度を微生物サイズに応じて適正に選択することによ
って、この到達位置の差異を明瞭化できる。従って、分
析対象物は、マトリクスｄには結合されないが、そのマ
トリクスｄ内での分布は局在化され、分析対象物と特異
結合反応しうる信号物質発生体１０は、マトリクスｄ内
で分析対象物量に応じた分布をするようになる。この場
合でも、成分（ａ）と（ｂ）過酸化水素との付加物を試
薬として用いて、本発明の分析方法を行うことができ
る。
【００６３】また、別の例として、フリーの標識抗体と
フリーの分析対象物との自発的な沈降性結合物（免疫沈
降物）形成（いわゆるゲル内免疫沈降反応）を利用した
測定があげられる。この場合には、分析対象物の量に応
じて免疫沈降物の形成量が変化し、また、形成された免
疫沈降物は、多孔性材質および／またはゲル状担体から
なるマトリクスｄの上流に留まるが、免疫沈降反応に関
与しなかったフリーの標識抗体は、マトリクスｄの下流
へ侵入し得るため、試料中の分析対象物量に応じて信号
物質発生体１０の分布が変化する。同様に、特異結合物
質を不溶化した微粒子担体と分析対象物との特異結合凝
集反応による微粒子の会合サイズの変化を信号物質発生
体１０の分布変化に利用することもできる。この場合
も、成分（ａ）と（ｂ）過酸化水素との付加物を試薬と
して用いて、本発明の分析方法を行うことができる。
フリーの分析対象物との自発的な沈降性結合物（免疫沈
降物）形成（いわゆるゲル内免疫沈降反応）を利用した
測定があげられる。この場合には、分析対象物の量に応
じて免疫沈降物の形成量が変化し、また、形成された免
疫沈降物は、多孔性材質および／またはゲル状担体から
なるマトリクスｄの上流に留まるが、免疫沈降反応に関
与しなかったフリーの標識抗体は、マトリクスｄの下流
へ侵入し得るため、試料中の分析対象物量に応じて信号
物質発生体１０の分布が変化する。同様に、特異結合物
質を不溶化した微粒子担体と分析対象物との特異結合凝
集反応による微粒子の会合サイズの変化を信号物質発生
体１０の分布変化に利用することもできる。この場合
も、成分（ａ）と（ｂ）過酸化水素との付加物を試薬と
して用いて、本発明の分析方法を行うことができる。
【００６４】ここでは、信号物質発生体が、ペルオキシ
ダーゼ酵素標識特異結合物質である場合について、特異
結合分析における信号の発生について、図１に基づいて
説明する。
ダーゼ酵素標識特異結合物質である場合について、特異
結合分析における信号の発生について、図１に基づいて
説明する。
【００６５】酵素基質として過酸化水素付加物から供給
される過酸化水素は、標識特異結合物質の構成成分であ
るペルオキシダーゼにより水に還元され、同時に水素供
与体である電子メディエータを酸化型電子メディエータ
とし、これが検出部ｃである電極で酸化還元反応を起こ
し、電気信号を発生する。
される過酸化水素は、標識特異結合物質の構成成分であ
るペルオキシダーゼにより水に還元され、同時に水素供
与体である電子メディエータを酸化型電子メディエータ
とし、これが検出部ｃである電極で酸化還元反応を起こ
し、電気信号を発生する。
【００６６】電子メディエータとは、本発明において
は、酵素反応と電極反応との間を媒介して、両反応間の
電子移動を可能ならしめる酸化還元化合物を総称して用
いられており、その中には、両反応いずれにおいても不
可逆な副生成物を実質的に生じず、両反応の間をサイク
リング可能な物質を含んでいる。
は、酵素反応と電極反応との間を媒介して、両反応間の
電子移動を可能ならしめる酸化還元化合物を総称して用
いられており、その中には、両反応いずれにおいても不
可逆な副生成物を実質的に生じず、両反応の間をサイク
リング可能な物質を含んでいる。
【００６７】図１において、マトリクスｄ内の信号物質
発生体（パーオキシターゼ標識特異結合物質）１０に信
号物質の発生に関与する物質（過酸化水素と還元型電子
メディエータ）１４が反応すると、還元型電子メディエ
ータが酸化型電子メディエータに変換される。この酸化
型電子メディエータが信号物質１２である。この信号物
質１２が拡散によって−１５０ｍＶ（ｖｓ．Ａｇ／Ａｇ
Ｃｌ）に電位設定された検出部ｃ（電極）に到達する
と、信号物質１２は還元されて再び還元型電子メディエ
ータに戻り、同時に還元電流という信号（電子移動）を
発生する。なお、信号物質の発生に関与する物質１４と
なる還元型電子メディエータ（水素供与体）としては、
ハイドロキノン、Ｐ−フェニレンジアミン（ＰＰＤ）、
Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フェニレンジアミン（ＤＭＰ
Ｄ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ´，Ｎ´−テトラメチル−ｐ−フェニ
レンジアミン（ＴＭＰＤ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ´，Ｎ´−テト
ラエチル−ｐ−フェニレンジアミン（ＴＥＰＤ）、Ｎ，
Ｎ，Ｎ´，Ｎ´−テトラキスカルボキシメチル−ｐ−フ
ェニレンジアミン（ＴＣＰＤ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ´，Ｎ´−
テトラキス（２−ヒドロキシエチル）−ｐ−フェニレン
ジアミン（ＴＨＥＰＤ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ´，Ｎ´−テトラ
キス（２，３−ジヒドロキシプロピル）−ｐ−フェニレ
ンジアミン（ＴＤＨＰＤ）等が例示され、好ましくはＴ
ＤＨＰＤ、ＴＣＰＤ、ＴＨＥＰＤである。
発生体（パーオキシターゼ標識特異結合物質）１０に信
号物質の発生に関与する物質（過酸化水素と還元型電子
メディエータ）１４が反応すると、還元型電子メディエ
ータが酸化型電子メディエータに変換される。この酸化
型電子メディエータが信号物質１２である。この信号物
質１２が拡散によって−１５０ｍＶ（ｖｓ．Ａｇ／Ａｇ
Ｃｌ）に電位設定された検出部ｃ（電極）に到達する
と、信号物質１２は還元されて再び還元型電子メディエ
ータに戻り、同時に還元電流という信号（電子移動）を
発生する。なお、信号物質の発生に関与する物質１４と
なる還元型電子メディエータ（水素供与体）としては、
ハイドロキノン、Ｐ−フェニレンジアミン（ＰＰＤ）、
Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フェニレンジアミン（ＤＭＰ
Ｄ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ´，Ｎ´−テトラメチル−ｐ−フェニ
レンジアミン（ＴＭＰＤ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ´，Ｎ´−テト
ラエチル−ｐ−フェニレンジアミン（ＴＥＰＤ）、Ｎ，
Ｎ，Ｎ´，Ｎ´−テトラキスカルボキシメチル−ｐ−フ
ェニレンジアミン（ＴＣＰＤ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ´，Ｎ´−
テトラキス（２−ヒドロキシエチル）−ｐ−フェニレン
ジアミン（ＴＨＥＰＤ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ´，Ｎ´−テトラ
キス（２，３−ジヒドロキシプロピル）−ｐ−フェニレ
ンジアミン（ＴＤＨＰＤ）等が例示され、好ましくはＴ
ＤＨＰＤ、ＴＣＰＤ、ＴＨＥＰＤである。
【００６８】流路ｅは、例えば多孔性担体あるいはゲル
担体で構成する。ただし、ゲル担体の場合は、試料と接
触することによってゲル状態あるいはゾル状態となるも
のを用いるのがよい。好ましくは、多孔性担体である。
あるいは、多孔性担体に、水溶性高分子化合物を含浸さ
せ、乾燥させたものを流路ｅとして用いてもよい。さら
には、前記多孔性担体等に固体状物質を保持させたもの
であってもよい。
担体で構成する。ただし、ゲル担体の場合は、試料と接
触することによってゲル状態あるいはゾル状態となるも
のを用いるのがよい。好ましくは、多孔性担体である。
あるいは、多孔性担体に、水溶性高分子化合物を含浸さ
せ、乾燥させたものを流路ｅとして用いてもよい。さら
には、前記多孔性担体等に固体状物質を保持させたもの
であってもよい。
【００６９】より具体的には、流路ｅを形成する多孔性
担体としては、セルロース製、セルロースアセテート
製、ニトロセルロース製あるいはナイロン製の多孔性メ
ンブレン、ガラス繊維製あるいはセルロース繊維製の濾
紙、多孔性セラミックス等が、また、ゲル担体として
は、寒天、アガロース、デキストラン、ポリアクリルア
ミド等が例示される。さらに、前記水溶性高分子化合物
としては、デンプンおよびその誘導体、マンナン、ガラ
クタン、寒天、アガロース、アルギン酸ナトリウム、ア
ラビアゴム、デキストラン、ゼラチン、カゼイン、コラ
ーゲン、メチルセルロース（ＭＣ）、エチルセルロース
（ＥＣ）、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）、カ
ルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ポリビニールア
ルコール（ポバール）、ポリアクリル酸ナトリウムなど
が例示できる。加えて、前記固体状物質としては、デキ
ストラン等の多孔性粒子、ポリスチレン製等のラテック
ス、ガラス製微粒子等の微粒子、またはそれらに結合用
の活性基を付与した微粒子が例示される。
担体としては、セルロース製、セルロースアセテート
製、ニトロセルロース製あるいはナイロン製の多孔性メ
ンブレン、ガラス繊維製あるいはセルロース繊維製の濾
紙、多孔性セラミックス等が、また、ゲル担体として
は、寒天、アガロース、デキストラン、ポリアクリルア
ミド等が例示される。さらに、前記水溶性高分子化合物
としては、デンプンおよびその誘導体、マンナン、ガラ
クタン、寒天、アガロース、アルギン酸ナトリウム、ア
ラビアゴム、デキストラン、ゼラチン、カゼイン、コラ
ーゲン、メチルセルロース（ＭＣ）、エチルセルロース
（ＥＣ）、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）、カ
ルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ポリビニールア
ルコール（ポバール）、ポリアクリル酸ナトリウムなど
が例示できる。加えて、前記固体状物質としては、デキ
ストラン等の多孔性粒子、ポリスチレン製等のラテック
ス、ガラス製微粒子等の微粒子、またはそれらに結合用
の活性基を付与した微粒子が例示される。
【００７０】流路ｅを複数の構造および材質から構成さ
せることにより、例えば積層体等とすることにより、そ
の性状を詳細に調節することができる。例えば、流路ｅ
の検出部ｃ近傍にポアサイズの小さい材質を用い、流路
ｅの試料導入部ａ側には、ポアサイズの大きい材質を用
いると、分析対象物量による特異結合反応後の信号物質
発生体の分布の差異をより明瞭にできる。これを実現す
る具体例としては、ポリアクリルアミドのグラディエン
トゲルおよびポアサイズの異なる多孔性メンブレンの積
層体等が例示できる。
せることにより、例えば積層体等とすることにより、そ
の性状を詳細に調節することができる。例えば、流路ｅ
の検出部ｃ近傍にポアサイズの小さい材質を用い、流路
ｅの試料導入部ａ側には、ポアサイズの大きい材質を用
いると、分析対象物量による特異結合反応後の信号物質
発生体の分布の差異をより明瞭にできる。これを実現す
る具体例としては、ポリアクリルアミドのグラディエン
トゲルおよびポアサイズの異なる多孔性メンブレンの積
層体等が例示できる。
【００７１】マトリクスｄに分析対象物に対する特異結
合物質を存在あるいは不溶化させる場合、それは、全体
に均等に存在させあるいは不溶化してもよいが、マトリ
クスｄの一部分に局在させてもよい。また、上流側には
多く存在あるいは不溶化させ、下流側には少なく存在あ
るいは不溶化させる等の濃度傾斜をつけてもよい。
合物質を存在あるいは不溶化させる場合、それは、全体
に均等に存在させあるいは不溶化してもよいが、マトリ
クスｄの一部分に局在させてもよい。また、上流側には
多く存在あるいは不溶化させ、下流側には少なく存在あ
るいは不溶化させる等の濃度傾斜をつけてもよい。
【００７２】なお、マトリクスｄに分析対象物に対する
特異結合物質を不溶化させるには、多孔性担体あるいは
ゲル担体に共有結合あるいは吸着によって不溶化させれ
ばよい。また、マトリクスｄを複数の部材から構成する
場合、あるいは、多孔性担体と水溶性高分子化合物とで
構成する場合、あるいは、多孔性担体等とそれに保持さ
れる固体状物質とで構成する場合、特異結合物質の不溶
化は、構成要素全てに対して行なってもよいし、一部に
のみ行なってもよい。
特異結合物質を不溶化させるには、多孔性担体あるいは
ゲル担体に共有結合あるいは吸着によって不溶化させれ
ばよい。また、マトリクスｄを複数の部材から構成する
場合、あるいは、多孔性担体と水溶性高分子化合物とで
構成する場合、あるいは、多孔性担体等とそれに保持さ
れる固体状物質とで構成する場合、特異結合物質の不溶
化は、構成要素全てに対して行なってもよいし、一部に
のみ行なってもよい。
【００７３】本発明の装置の流路ｅの試料の流れ方向の
長さは、小さくすればするほど、試料の必要液量を少な
くできるが、小さくしすぎると、分析対象物の量に応じ
た信号物質発生体の分布の変化が明瞭でなくなる。従っ
て、一般的には、１０μｍ〜数十ｍｍ程度とする。
長さは、小さくすればするほど、試料の必要液量を少な
くできるが、小さくしすぎると、分析対象物の量に応じ
た信号物質発生体の分布の変化が明瞭でなくなる。従っ
て、一般的には、１０μｍ〜数十ｍｍ程度とする。
【００７４】検出部ｃは、到達した信号物質が発する信
号を、肉眼での目視で、もしくは、信号の性質に応じた
好適な外部の計測器で、信号の変調の程度を計測できる
部位であり、マトリクスｄから信号物質１２を受け取る
ことができる位置に配置される。検出部ｃは、流路ｅ内
での信号物質発生体１０の位置分布の変化から生じる信
号変調の大きい部位に設ければよい。通常は、マトリク
スｄの最下流側あるいは最上流側である。検出部におけ
る検出手段には特に限定はなく、信号物質による信号
（あるいは信号物質によって検出部が発する信号）に応
じて、各種の公知の手段が利用可能である。特に電気化
学的測定が好ましく利用される。例えば、電気化学的信
号であれば、検出部として各種の電極を用いればよい。
具体的には、作用電極および対照電極としては、白金、
金、銀、カーボン電極等が使用できるが、製造に適した
カーボン印刷電極が好適である。この場合、電極基板と
しては、液体不透過性の板、例えばＰＥＴフィルム、塩
化ビニル板あるいはガラス板などを使用してもよいし、
液体透過性のシート、例えば濾紙などを使用してもよ
い。さらに微細な電極構成とするために、マイクロ電
極、マイクロアレイ電極を作製することもできる。ま
た、前記電極の対極としては、ＡｇあるいはＡｇ／Ａｇ
Ｃｌ電極等が例示される。これも、印刷技術等によって
製造できる。検出部ｃを酵素電極とすれば、電極反応の
特異性や感度が上昇する。この場合には、信号物質は、
酵素電極の基質もしくは補因子として作用し、電子が電
極上で授受され、信号が測定される。酵素電極は、生化
学分析あるいは分析化学分野では多数知られているもの
を用いることができる。信号が蛍光、発光、呈色等であ
る場合は、各々、具体的には、検出部ｃは、発光反応に
必要な少なくとも１つの信号の発生に関与する物質を実
質上不動化した発光発生部、蛍光反応に必要な少なくと
も１つの信号の発生に関与する物質を実質上不動化した
蛍光発生部、呈色反応に必要な少なくとも１つの信号の
発生に関与する物質を実質上不動化した呈色発生部等で
ある。
号を、肉眼での目視で、もしくは、信号の性質に応じた
好適な外部の計測器で、信号の変調の程度を計測できる
部位であり、マトリクスｄから信号物質１２を受け取る
ことができる位置に配置される。検出部ｃは、流路ｅ内
での信号物質発生体１０の位置分布の変化から生じる信
号変調の大きい部位に設ければよい。通常は、マトリク
スｄの最下流側あるいは最上流側である。検出部におけ
る検出手段には特に限定はなく、信号物質による信号
（あるいは信号物質によって検出部が発する信号）に応
じて、各種の公知の手段が利用可能である。特に電気化
学的測定が好ましく利用される。例えば、電気化学的信
号であれば、検出部として各種の電極を用いればよい。
具体的には、作用電極および対照電極としては、白金、
金、銀、カーボン電極等が使用できるが、製造に適した
カーボン印刷電極が好適である。この場合、電極基板と
しては、液体不透過性の板、例えばＰＥＴフィルム、塩
化ビニル板あるいはガラス板などを使用してもよいし、
液体透過性のシート、例えば濾紙などを使用してもよ
い。さらに微細な電極構成とするために、マイクロ電
極、マイクロアレイ電極を作製することもできる。ま
た、前記電極の対極としては、ＡｇあるいはＡｇ／Ａｇ
Ｃｌ電極等が例示される。これも、印刷技術等によって
製造できる。検出部ｃを酵素電極とすれば、電極反応の
特異性や感度が上昇する。この場合には、信号物質は、
酵素電極の基質もしくは補因子として作用し、電子が電
極上で授受され、信号が測定される。酵素電極は、生化
学分析あるいは分析化学分野では多数知られているもの
を用いることができる。信号が蛍光、発光、呈色等であ
る場合は、各々、具体的には、検出部ｃは、発光反応に
必要な少なくとも１つの信号の発生に関与する物質を実
質上不動化した発光発生部、蛍光反応に必要な少なくと
も１つの信号の発生に関与する物質を実質上不動化した
蛍光発生部、呈色反応に必要な少なくとも１つの信号の
発生に関与する物質を実質上不動化した呈色発生部等で
ある。
【００７５】さらに、検出部ｃが蛍光、発光、呈色等が
検出される部位である場合、検出部ｃは、マトリクスｄ
または後記する吸収部の一部に、あるいは、検出部ｃの
下流側に設けられた基板がある場合は、その基板に、信
号の発生に関与する物質を不動化させることで作製する
ことができる。その場合、不動化には、３−アミノプロ
ピルトリエトキシシラン処理したガラス基板とグルタル
アルデヒドとを用いて酵素を基板に結合する等の、種々
の方法が利用できる。
検出される部位である場合、検出部ｃは、マトリクスｄ
または後記する吸収部の一部に、あるいは、検出部ｃの
下流側に設けられた基板がある場合は、その基板に、信
号の発生に関与する物質を不動化させることで作製する
ことができる。その場合、不動化には、３−アミノプロ
ピルトリエトキシシラン処理したガラス基板とグルタル
アルデヒドとを用いて酵素を基板に結合する等の、種々
の方法が利用できる。
【００７６】ここで、過酸化水素付加物等を備えた試薬
部ｂは、マトリクスｄの上流側に配置されるのが好まし
い。このような過酸化水素付加物に、水系溶液を加える
と過酸化水素が溶出し、過酸化水素水溶液が発生するの
で、試薬部ｂの下流側の流路に直接溶出し、ペルオキシ
ダーゼが触媒する信号物質発生反応を起こし、前記した
通り、検出部において電気信号を発生する。したがっ
て、試薬部ｂをマトリクスｄの下流側に配置した場合
（この場合、過酸化水素は、下方からの拡散によって供
給される）に比べて、迅速に測定結果を得ることができ
る。ただし、本発明の過酸化水素付加物の非妨害性およ
び溶解性などの利点は、その配置によらず有用である。
部ｂは、マトリクスｄの上流側に配置されるのが好まし
い。このような過酸化水素付加物に、水系溶液を加える
と過酸化水素が溶出し、過酸化水素水溶液が発生するの
で、試薬部ｂの下流側の流路に直接溶出し、ペルオキシ
ダーゼが触媒する信号物質発生反応を起こし、前記した
通り、検出部において電気信号を発生する。したがっ
て、試薬部ｂをマトリクスｄの下流側に配置した場合
（この場合、過酸化水素は、下方からの拡散によって供
給される）に比べて、迅速に測定結果を得ることができ
る。ただし、本発明の過酸化水素付加物の非妨害性およ
び溶解性などの利点は、その配置によらず有用である。
【００７７】図２に、このような本発明に好適なＭＥＤ
ＩＡ法特異結合分析装置であって、電気化学的信号によ
って測定を行う装置の一例の分解斜視図を、図４にこの
装置を組み立てた際の断面図を、それぞれ示す。図２に
示される分析装置は、上から、上部カバー１６、第１含
浸部１８、第２含浸部２０、単一あるいは複数の検出部
を有する電極部２２、特異結合物質不溶化流路（マトリ
クス）２６、吸収部２８、および下部基板３０を有して
構成され、図２に示されるように、各部材が上記順番で
積み重ねられて、組み合わされて構成される。
ＩＡ法特異結合分析装置であって、電気化学的信号によ
って測定を行う装置の一例の分解斜視図を、図４にこの
装置を組み立てた際の断面図を、それぞれ示す。図２に
示される分析装置は、上から、上部カバー１６、第１含
浸部１８、第２含浸部２０、単一あるいは複数の検出部
を有する電極部２２、特異結合物質不溶化流路（マトリ
クス）２６、吸収部２８、および下部基板３０を有して
構成され、図２に示されるように、各部材が上記順番で
積み重ねられて、組み合わされて構成される。
【００７８】図示例の装置においては、上部カバー１６
（その試料導入口１６ａ）、第１含浸部１８および第２
含浸部２０によって試料導入部が構成される。なお、第
１含浸部１８および第２含浸部２０以外に、フィルター
部などを必要に応じて配置してもよく、その他の部材を
必要に応じて適宜選択し、組み合わせて試料導入部を形
成してもよい。
（その試料導入口１６ａ）、第１含浸部１８および第２
含浸部２０によって試料導入部が構成される。なお、第
１含浸部１８および第２含浸部２０以外に、フィルター
部などを必要に応じて配置してもよく、その他の部材を
必要に応じて適宜選択し、組み合わせて試料導入部を形
成してもよい。
【００７９】上部カバー１６は塩化ビニル、エポキシ、
アクリルあるいはＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレー
ト）などの樹脂で成形され、その中心部分には液性試料
を注入するための試料導入口１６ａが形成される。
アクリルあるいはＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレー
ト）などの樹脂で成形され、その中心部分には液性試料
を注入するための試料導入口１６ａが形成される。
【００８０】第１含浸部１８および第２含浸部２０は、
液性試料の種類、分析対象物、利用する特異結合反応等
に応じて適宜配置されるものであって、ガラス繊維濾
紙、セルロース繊維濾紙、不織布等に、信号物質発生
体、信号物質の発生に関与する物質、信号の発生に関与
する物質、電子メディエータ等の分析に必要な試薬また
はこれに類するものおよびこれらの安定化剤もしくは保
護剤、イオン強度および／またはｐＨ調整のための塩成
分、緩衝液成分、界面活性剤、血液凝固阻害剤などの液
性試料の流動円滑化剤等が含浸・乾燥されてなるもので
ある。信号物質発生体がＨＲＰＯ標識特異結合物質の場
合、信号物質の発生に関与する物質の１つである過酸化
水素は、本発明方法に用いる過酸化水素付加物として、
好ましくはいずれかの含浸部に含浸・乾燥することがで
きる。
液性試料の種類、分析対象物、利用する特異結合反応等
に応じて適宜配置されるものであって、ガラス繊維濾
紙、セルロース繊維濾紙、不織布等に、信号物質発生
体、信号物質の発生に関与する物質、信号の発生に関与
する物質、電子メディエータ等の分析に必要な試薬また
はこれに類するものおよびこれらの安定化剤もしくは保
護剤、イオン強度および／またはｐＨ調整のための塩成
分、緩衝液成分、界面活性剤、血液凝固阻害剤などの液
性試料の流動円滑化剤等が含浸・乾燥されてなるもので
ある。信号物質発生体がＨＲＰＯ標識特異結合物質の場
合、信号物質の発生に関与する物質の１つである過酸化
水素は、本発明方法に用いる過酸化水素付加物として、
好ましくはいずれかの含浸部に含浸・乾燥することがで
きる。
【００８１】第１含浸部１８や第２含浸部２０を液性試
料が通過することによって、信号物質発生体等と共に過
酸化水素が溶出して液性試料と混合され、反応が開始さ
れる。なお、１つの含浸部に保持される物質は複数であ
ってもよく、また、図示例のように第１含浸部１８と第
２含浸部２０とに分けずに、含浸部を１つとしてもよい
のはもちろんである。また、逆に、さらに多くの含浸部
を設置してもよい。
料が通過することによって、信号物質発生体等と共に過
酸化水素が溶出して液性試料と混合され、反応が開始さ
れる。なお、１つの含浸部に保持される物質は複数であ
ってもよく、また、図示例のように第１含浸部１８と第
２含浸部２０とに分けずに、含浸部を１つとしてもよい
のはもちろんである。また、逆に、さらに多くの含浸部
を設置してもよい。
【００８２】また、このような第１含浸部１８や第２含
浸部２０等を有することによって、試料の流れ時間を長
くして反応時間を十分に確保することが可能となる。さ
らに、図示例においては、好ましい態様として第２含浸
部２０の上面中心部分には水が通過不可能なシール部２
０ａが形成される。シール部２０ａを有することによ
り、鉛直方向であった試料の流れを水平方向に変更する
ことができ、試料の流れ時間をより長くして反応時間を
十分に確保することが可能となると共に、混合効果によ
って反応効率が上り、より正確な測定を実現することが
できる。シール部２０ａの形成材料および形成方法には
特に限定はなく、塩化ビニル、セルロースアセテート、
ポリエステル等の各種の水不透性材料を、接着剤、例え
ばアクリル系接着剤等の手段を用いて第２含浸部２０の
中心部分に貼着すればよい。もしくは、水不透性樹脂あ
るいは水不透性ポリマーなどの薄膜を印刷法、光重合法
あるいは光硬化法などで形成させればよい。
浸部２０等を有することによって、試料の流れ時間を長
くして反応時間を十分に確保することが可能となる。さ
らに、図示例においては、好ましい態様として第２含浸
部２０の上面中心部分には水が通過不可能なシール部２
０ａが形成される。シール部２０ａを有することによ
り、鉛直方向であった試料の流れを水平方向に変更する
ことができ、試料の流れ時間をより長くして反応時間を
十分に確保することが可能となると共に、混合効果によ
って反応効率が上り、より正確な測定を実現することが
できる。シール部２０ａの形成材料および形成方法には
特に限定はなく、塩化ビニル、セルロースアセテート、
ポリエステル等の各種の水不透性材料を、接着剤、例え
ばアクリル系接着剤等の手段を用いて第２含浸部２０の
中心部分に貼着すればよい。もしくは、水不透性樹脂あ
るいは水不透性ポリマーなどの薄膜を印刷法、光重合法
あるいは光硬化法などで形成させればよい。
【００８３】電極部２２は、単一あるいは複数の検出部
ｃが形成されるものであって、図示例の装置において
は、電極部２２は、ＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレー
ト）等の絶縁性基板２４の上面に参照極／対極を、下面
に検出部となる作用極が形成され、流路２６に形成され
た信号発生体の分布に応じた電気的信号が作用極によっ
て検出される。
ｃが形成されるものであって、図示例の装置において
は、電極部２２は、ＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレー
ト）等の絶縁性基板２４の上面に参照極／対極を、下面
に検出部となる作用極が形成され、流路２６に形成され
た信号発生体の分布に応じた電気的信号が作用極によっ
て検出される。
【００８４】図３（ａ）に電極部２２の上面を、図３
（ｂ）に電極部２２の下面を、それぞれ示す。図示例の
電極部２２の上面には、環状の対極（参照極）３４およ
びその端子３４ａが形成され、対極３４およびその端子
部分３４ａを除いて、斜線で示されるように絶縁層３６
が形成されている。一方、電極部２２の裏面には、上面
と同様にして、環状の作用極３８およびその端子３８ａ
が形成されている。また、作用極３８およびその端子部
分３８ａを除いて、斜線で示されるように絶縁層３６が
形成されている。また、絶縁性基板２４には、対極３４
および作用極３８の中央を貫通して貫通孔３２が形成さ
れる。
（ｂ）に電極部２２の下面を、それぞれ示す。図示例の
電極部２２の上面には、環状の対極（参照極）３４およ
びその端子３４ａが形成され、対極３４およびその端子
部分３４ａを除いて、斜線で示されるように絶縁層３６
が形成されている。一方、電極部２２の裏面には、上面
と同様にして、環状の作用極３８およびその端子３８ａ
が形成されている。また、作用極３８およびその端子部
分３８ａを除いて、斜線で示されるように絶縁層３６が
形成されている。また、絶縁性基板２４には、対極３４
および作用極３８の中央を貫通して貫通孔３２が形成さ
れる。
【００８５】前述のように、液性試料は貫通孔３２を通
過して後述する特異結合物質不溶化流路２６に導入され
る。図示例の装置においては、水不透過性シール２８ａ
の存在によって、特異結合物質不溶化流路２６内での液
性試料は貫通孔３２すなわち作用極３８の中心から外方
向に向かって放射状に流れる。
過して後述する特異結合物質不溶化流路２６に導入され
る。図示例の装置においては、水不透過性シール２８ａ
の存在によって、特異結合物質不溶化流路２６内での液
性試料は貫通孔３２すなわち作用極３８の中心から外方
向に向かって放射状に流れる。
【００８６】検出部となる作用極３８は、カーボン電
極、銀電極、金電極などの各種の電極材料によって形成
される。対極３４は、銀電極、銀／塩化銀電極等で形成
される。また、基板２４は、ＰＥＴ、ポリ塩化ビニル、
ポリイミド、ポリエステル等の公知の各種の絶縁性材料
で形成される。さらに、絶縁層３６は、アクリル系樹
脂、ポリエステル等の公知の各種の絶縁性インク材料で
形成される。
極、銀電極、金電極などの各種の電極材料によって形成
される。対極３４は、銀電極、銀／塩化銀電極等で形成
される。また、基板２４は、ＰＥＴ、ポリ塩化ビニル、
ポリイミド、ポリエステル等の公知の各種の絶縁性材料
で形成される。さらに、絶縁層３６は、アクリル系樹
脂、ポリエステル等の公知の各種の絶縁性インク材料で
形成される。
【００８７】なお、図示例の装置において、各作用極、
対極（参照極）および絶縁層は、共に、スクリーン印
刷、ドクターナイフ等の厚膜形成技術、スパッタリン
グ、ＣＶＤ等の薄膜形成技術等の公知の膜形成技術によ
って形成すればよい。
対極（参照極）および絶縁層は、共に、スクリーン印
刷、ドクターナイフ等の厚膜形成技術、スパッタリン
グ、ＣＶＤ等の薄膜形成技術等の公知の膜形成技術によ
って形成すればよい。
【００８８】本発明において、作用極３８の形状は図示
例の環状に限定はされず、また、複数の作用極が配置さ
れてもよい。
例の環状に限定はされず、また、複数の作用極が配置さ
れてもよい。
【００８９】図２の特異結合物質不溶化流路２６は、Ｍ
ＥＤＩＡ法の特異結合分析装置における特異結合反応の
場として作用するもので、マトリクスともいう。例え
ば、分析対象物および信号物質発生体と特異結合する抗
体あるいは抗原が不溶化して固定されており、液体試料
中の分析対象物等の特異結合反応によって、液体試料中
の分析対象物の量に応じた信号物質発生体の分布を形成
する。特異結合物質不溶化流路２６に形成された信号物
質発生体の作用極３８からの距離分布が、信号物質を介
して電流値として測定される。このような特異結合物質
不溶化流路２６は、例えば、メンブレンフィルター等の
多孔質膜に、特異結合反応のための抗体や抗原、核酸等
を、不溶化して保持・乾燥してなるものである。また、
余剰の試料は、特異結合物質不溶化流路２６を通過して
後述の吸収部２８で吸収される。
ＥＤＩＡ法の特異結合分析装置における特異結合反応の
場として作用するもので、マトリクスともいう。例え
ば、分析対象物および信号物質発生体と特異結合する抗
体あるいは抗原が不溶化して固定されており、液体試料
中の分析対象物等の特異結合反応によって、液体試料中
の分析対象物の量に応じた信号物質発生体の分布を形成
する。特異結合物質不溶化流路２６に形成された信号物
質発生体の作用極３８からの距離分布が、信号物質を介
して電流値として測定される。このような特異結合物質
不溶化流路２６は、例えば、メンブレンフィルター等の
多孔質膜に、特異結合反応のための抗体や抗原、核酸等
を、不溶化して保持・乾燥してなるものである。また、
余剰の試料は、特異結合物質不溶化流路２６を通過して
後述の吸収部２８で吸収される。
【００９０】吸収部２８は、前述のように特異結合物質
不溶化流路２６を通過した余剰の試料を吸収するもので
あるが、吸収部２８に信号物質の発生に関与する物質お
よび／または信号の発生に関与する物質、例えば本発明
方法の過酸化水素付加物を含浸しておいてもよい。
不溶化流路２６を通過した余剰の試料を吸収するもので
あるが、吸収部２８に信号物質の発生に関与する物質お
よび／または信号の発生に関与する物質、例えば本発明
方法の過酸化水素付加物を含浸しておいてもよい。
【００９１】図示例の装置においては、好ましい態様と
して吸収部２８の上面中心部分に水が通過不可能なシー
ル部２８ａが形成される。前述のシール部２０ａと同
様、シール部２８ａを有することにより、鉛直方向であ
った試料の流れを水平方向に変更することができ、試料
の流れ時間を長くして、特異結合反応の効率を向上させ
ると共に、流路内の信号物質発生体（標識体）分布が明
瞭になり、より正確な測定を実現することができる。な
お、シール部２８ａは、前述のシール部２０ａと同様に
形成される。
して吸収部２８の上面中心部分に水が通過不可能なシー
ル部２８ａが形成される。前述のシール部２０ａと同
様、シール部２８ａを有することにより、鉛直方向であ
った試料の流れを水平方向に変更することができ、試料
の流れ時間を長くして、特異結合反応の効率を向上させ
ると共に、流路内の信号物質発生体（標識体）分布が明
瞭になり、より正確な測定を実現することができる。な
お、シール部２８ａは、前述のシール部２０ａと同様に
形成される。
【００９２】図示例の分析装置は、これらの各部材を図
２および図４に示される順序で、下部基板３０上に積層
して、上部カバー１６と下部基板３０とを貼り合わせ、
あるいは、ねじ止め、ボルトとナット等を用いて固定し
て作製される。
２および図４に示される順序で、下部基板３０上に積層
して、上部カバー１６と下部基板３０とを貼り合わせ、
あるいは、ねじ止め、ボルトとナット等を用いて固定し
て作製される。
【００９３】このような分析装置においては、前述のよ
うに、試料は上部カバー１６に形成される試料導入口１
６ａより注入される。試料導入口１６ａより注入された
試料は、第１含浸部１８に流入し、次いで第２含浸部２
０に流入する。含浸部に試料が流入することにより、乾
燥・保持された信号物質発生体および過酸化水素水等が
溶出し、試料と混合され、分析対象物の特異結合反応が
開始される。なお、図示例においては、第２含浸部２０
の上面にはシール部２０ａが形成されるので、試料の流
れ方向が鉛直方向から水平方向に変更され、十分な反応
時間が確保できるのは前述のとおりである。
うに、試料は上部カバー１６に形成される試料導入口１
６ａより注入される。試料導入口１６ａより注入された
試料は、第１含浸部１８に流入し、次いで第２含浸部２
０に流入する。含浸部に試料が流入することにより、乾
燥・保持された信号物質発生体および過酸化水素水等が
溶出し、試料と混合され、分析対象物の特異結合反応が
開始される。なお、図示例においては、第２含浸部２０
の上面にはシール部２０ａが形成されるので、試料の流
れ方向が鉛直方向から水平方向に変更され、十分な反応
時間が確保できるのは前述のとおりである。
【００９４】第２含浸部２０を通過した試料は、電極部
２２の貫通孔３２を通過し、特異結合物質不溶化流路２
６に流入する。特異結合不溶化流路２６に試料が流入す
ると、特異結合物質不溶化流路２６内で液体試料中の分
析対象物の特異結合によって信号物質発生体の分布が決
まり、信号物質発生体の作用によって発生する信号物質
が拡散によって作用極３８に到達し、作用極において、
信号物質発生体の特異結合物質不溶化流路２６内の作用
極の半径方向の分布が、反応に対応した電気化学的信号
として検出される。余剰の試料は、特異結合物質不溶化
流路２６を通過して吸収部２８で吸収される。
２２の貫通孔３２を通過し、特異結合物質不溶化流路２
６に流入する。特異結合不溶化流路２６に試料が流入す
ると、特異結合物質不溶化流路２６内で液体試料中の分
析対象物の特異結合によって信号物質発生体の分布が決
まり、信号物質発生体の作用によって発生する信号物質
が拡散によって作用極３８に到達し、作用極において、
信号物質発生体の特異結合物質不溶化流路２６内の作用
極の半径方向の分布が、反応に対応した電気化学的信号
として検出される。余剰の試料は、特異結合物質不溶化
流路２６を通過して吸収部２８で吸収される。
【００９５】作用極３８からの出力（電気信号）は、試
料導入部に所定量の液性試料を添加し、所定時間経過後
に、あるいは、所定時間が経過するまで連続的に、読み
取りを行えばよい。また、データは、所定時間経過後の
出力強度（例えば電流値）、所定時間内の出力強度の平
均値、出力が所定強度となるまでの時間、連続的な出力
の積分値（例えば電気量）出力が一定の強度になるまで
の時間等として読み取ればよい。
料導入部に所定量の液性試料を添加し、所定時間経過後
に、あるいは、所定時間が経過するまで連続的に、読み
取りを行えばよい。また、データは、所定時間経過後の
出力強度（例えば電流値）、所定時間内の出力強度の平
均値、出力が所定強度となるまでの時間、連続的な出力
の積分値（例えば電気量）出力が一定の強度になるまで
の時間等として読み取ればよい。
【００９６】
【実施例】以下、実施例により、本発明を具体的に説明
する。なお、本発明は以下の実施例に限定されない。 ［実施例１〜３、比較例１〜４］本発明方法に用いる過
酸化水素付加物を構成するのに好適な化合物を調べるた
めに、各種の化合物について、過酸化水素保持効果およ
び抗原抗体反応への影響について試験および評価を行っ
た。
する。なお、本発明は以下の実施例に限定されない。 ［実施例１〜３、比較例１〜４］本発明方法に用いる過
酸化水素付加物を構成するのに好適な化合物を調べるた
めに、各種の化合物について、過酸化水素保持効果およ
び抗原抗体反応への影響について試験および評価を行っ
た。
【００９７】（実施例１）過酸化水素保持効果の比較 ＜１＞以下に示す１０種類の化合物について、試験およ
び評価を行った。 酢酸（和光純薬工業株式会社製） ３−ヒドロキシプロピオン酸（東京化成工業株式会社
製） イセチオン酸（和光純薬工業株式会社製） Ｌ−セリン（和光純薬工業株式会社製） Ｌ−シトルリン（和光純薬工業株式会社製） アルビジン（ＳＩＧＭＡ社製） ヒダントイン酸（東京化成工業株式会社製） Ｎ−アセチルグリシン（東京化成工業株式会社製） リン酸（和光純薬工業株式会社製） クエン酸（和光純薬工業株式会社製）
び評価を行った。 酢酸（和光純薬工業株式会社製） ３−ヒドロキシプロピオン酸（東京化成工業株式会社
製） イセチオン酸（和光純薬工業株式会社製） Ｌ−セリン（和光純薬工業株式会社製） Ｌ−シトルリン（和光純薬工業株式会社製） アルビジン（ＳＩＧＭＡ社製） ヒダントイン酸（東京化成工業株式会社製） Ｎ−アセチルグリシン（東京化成工業株式会社製） リン酸（和光純薬工業株式会社製） クエン酸（和光純薬工業株式会社製）
【００９８】＜２＞界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ２０）処理
ガラス繊維濾紙の作製 ガラス繊維濾紙（ＧＡ１００、アドバンテック東洋社
製）を０．２％Ｔｗｅｅｎ２０（和光純薬工業社製）水
溶液に浸漬させ、室温にて一晩静置した。その後、蒸留
水にて１０回洗浄し、次いで、オーブン（８０℃）内で
乾燥させ界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ２０）処理ガラス繊維
濾紙を作製した。
ガラス繊維濾紙の作製 ガラス繊維濾紙（ＧＡ１００、アドバンテック東洋社
製）を０．２％Ｔｗｅｅｎ２０（和光純薬工業社製）水
溶液に浸漬させ、室温にて一晩静置した。その後、蒸留
水にて１０回洗浄し、次いで、オーブン（８０℃）内で
乾燥させ界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ２０）処理ガラス繊維
濾紙を作製した。
【００９９】＜３＞各化合物の過酸化水素保持効果の比
較 過酸化水素（和光純薬工業製）および＜１＞項の各化合
物を蒸留水に溶解し、０．５Ｍ過酸化水素−０．５Ｍ化
合物溶液を調製した。各溶液はＨＣｌ水溶液又はＮａＯ
Ｈ水溶液の添加によりｐＨを約６．０に調製した。各溶
液を下記の方法でそれぞれ凍結乾燥した。 無担体系；１．０ｍＬポリスチレン製試験管に３００
μＬずつ分注し、凍結乾燥した。 セルロース濾紙担体系；クロマトグラフ濾紙（１７Ｃ
ｈｒ、Ｗｈａｔｍａｎ社製）からパンチングして作製し
た直径１２ｍｍの円形濾紙をバット上に並べ、１枚当た
り１００μＬずつ点着して凍結乾燥した。 ガラス繊維濾紙担体系；＜２＞項で界面活性剤（Ｔｗ
ｅｅｎ２０）処理したガラス繊維濾紙からパンチングし
て作製した直径１２ｍｍの円形濾紙をバット上に並べ、
１枚当たり１４０μＬずつ点着して凍結乾燥した。乾燥
直後の各凍結乾燥体中の成分を下記の方法で再溶解し、
溶解液中の過酸化水素濃度をPeroXOquant TM Quantitat
ive Peroxide Assay（ＰＩＥＲＣＥ社製）キットを用い
て定量し、凍結乾燥前に添加した過酸化水素量に対する
回収率を算出した。 無担体系；蒸留水を乾燥後の試験管に３００μＬずつ
添加して溶解した。 セルロース濾紙担体系およびガラス繊維濾紙担体
系；乾燥後の濾紙１枚ずつを、０．１Ｍリン酸−０．１
Ｍ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）３．０ｍＬに浸
漬し、１５０ｒｐｍで１時間振とうした後、その上清を
採取した。 上記〜について、結果を図５（ａ）、図６（ａ）お
よび図７（ａ）にそれぞれ示した。
較 過酸化水素（和光純薬工業製）および＜１＞項の各化合
物を蒸留水に溶解し、０．５Ｍ過酸化水素−０．５Ｍ化
合物溶液を調製した。各溶液はＨＣｌ水溶液又はＮａＯ
Ｈ水溶液の添加によりｐＨを約６．０に調製した。各溶
液を下記の方法でそれぞれ凍結乾燥した。 無担体系；１．０ｍＬポリスチレン製試験管に３００
μＬずつ分注し、凍結乾燥した。 セルロース濾紙担体系；クロマトグラフ濾紙（１７Ｃ
ｈｒ、Ｗｈａｔｍａｎ社製）からパンチングして作製し
た直径１２ｍｍの円形濾紙をバット上に並べ、１枚当た
り１００μＬずつ点着して凍結乾燥した。 ガラス繊維濾紙担体系；＜２＞項で界面活性剤（Ｔｗ
ｅｅｎ２０）処理したガラス繊維濾紙からパンチングし
て作製した直径１２ｍｍの円形濾紙をバット上に並べ、
１枚当たり１４０μＬずつ点着して凍結乾燥した。乾燥
直後の各凍結乾燥体中の成分を下記の方法で再溶解し、
溶解液中の過酸化水素濃度をPeroXOquant TM Quantitat
ive Peroxide Assay（ＰＩＥＲＣＥ社製）キットを用い
て定量し、凍結乾燥前に添加した過酸化水素量に対する
回収率を算出した。 無担体系；蒸留水を乾燥後の試験管に３００μＬずつ
添加して溶解した。 セルロース濾紙担体系およびガラス繊維濾紙担体
系；乾燥後の濾紙１枚ずつを、０．１Ｍリン酸−０．１
Ｍ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）３．０ｍＬに浸
漬し、１５０ｒｐｍで１時間振とうした後、その上清を
採取した。 上記〜について、結果を図５（ａ）、図６（ａ）お
よび図７（ａ）にそれぞれ示した。
【０１００】（比較例１）過酸化水素保持効果の比較 ＜１＞以下に示す８種類の化合物について、実施例１と
同様の試験および評価を行った。 蒸留水 尿素（和光純薬工業株式会社製） メチルアミン（和光純薬工業株式会社製） モノエタノールアミン（和光純薬工業株式会社製） ヒドロキシ尿素（和光純薬工業株式会社製） ジメチロール尿素（和光純薬工業株式会社製） アセトアミド（東京化成工業株式会社製） 塩化ナトリウム（国産化学株式会社製） 結果を図５（ｂ）、図６（ｂ）および図７（ｂ）に示
す。
同様の試験および評価を行った。 蒸留水 尿素（和光純薬工業株式会社製） メチルアミン（和光純薬工業株式会社製） モノエタノールアミン（和光純薬工業株式会社製） ヒドロキシ尿素（和光純薬工業株式会社製） ジメチロール尿素（和光純薬工業株式会社製） アセトアミド（東京化成工業株式会社製） 塩化ナトリウム（国産化学株式会社製） 結果を図５（ｂ）、図６（ｂ）および図７（ｂ）に示
す。
【０１０１】（結果） 無担体系においては、酢酸、３ーヒドロキシプロピオ
ン酸、イセチオン酸、Ｌ−セリン、Ｌーシトルリン、ア
ルビジン、ヒダントイン酸、Ｎ−アセチルグリシン、リ
ン酸、クエン酸、尿素のいずれかを含む過酸化水素付加
物の過酸化水素保持能が高かった。 セルロース濾紙担体系においては、酢酸、３ーヒドロ
キシプロピオン酸、Ｌ−セリン、Ｌ−シトルリン、アル
ビジン、ヒダントイン酸、Ｎ−アセチルグリシン、リン
酸、クエン酸、ジメチロール尿素のいずれかを含む過酸
化水素付加物の過酸化水素保持能が高かった。 ガラス繊維濾紙担体系においては、酢酸、３ーヒドロ
キシプロピオン酸、Ｌ−セリン、Ｌ−シトルリン、アル
ビジン、ヒダントイン酸、Ｎ−アセチルグリシン、リン
酸、クエン酸のいずれかを含む過酸化水素付加物の過酸
化水素保持能が高かった。特に、酢酸、３ーヒドロキシ
プロピオン酸、Ｌ−セリン、Ｌ−シトルリン、アルビジ
ン、ヒダントイン酸、Ｎ−アセチルグリシン、リン酸、
クエン酸は、尿素と同等以上の過酸化水素保持能を示し
た。
ン酸、イセチオン酸、Ｌ−セリン、Ｌーシトルリン、ア
ルビジン、ヒダントイン酸、Ｎ−アセチルグリシン、リ
ン酸、クエン酸、尿素のいずれかを含む過酸化水素付加
物の過酸化水素保持能が高かった。 セルロース濾紙担体系においては、酢酸、３ーヒドロ
キシプロピオン酸、Ｌ−セリン、Ｌ−シトルリン、アル
ビジン、ヒダントイン酸、Ｎ−アセチルグリシン、リン
酸、クエン酸、ジメチロール尿素のいずれかを含む過酸
化水素付加物の過酸化水素保持能が高かった。 ガラス繊維濾紙担体系においては、酢酸、３ーヒドロ
キシプロピオン酸、Ｌ−セリン、Ｌ−シトルリン、アル
ビジン、ヒダントイン酸、Ｎ−アセチルグリシン、リン
酸、クエン酸のいずれかを含む過酸化水素付加物の過酸
化水素保持能が高かった。特に、酢酸、３ーヒドロキシ
プロピオン酸、Ｌ−セリン、Ｌ−シトルリン、アルビジ
ン、ヒダントイン酸、Ｎ−アセチルグリシン、リン酸、
クエン酸は、尿素と同等以上の過酸化水素保持能を示し
た。
【０１０２】（実施例２）抗原抗体反応への影響の比較 ＜１＞抗エストラジオール（Ｅ２）抗体と西洋ワサビパ
ーオキシダーゼとの結合体（信号物質発生体）の作製 エストラジオール（Ｅ２）を認識するマウス単クローン
性抗体（持田製薬社製）を１００ｍＭ 塩化ナトリウム
−１ｍＭ ＥＤＴＡ−６０ｍＭ トリエタノールアミン
緩衝液（ｐＨ８．０）（ＴＥＡ緩衝液）に５．３ｍｇ／
ｍＬ濃度となるように溶解し、窒素ガス置換したＴＥＡ
緩衝液に十分に透析した。この抗体溶液２．２ｍＬに対
して、ＴＥＡ緩衝液中に調製した５０ｍＭの２−イミノ
チオラン塩酸塩（Pierce社製）溶液７０μＬを添加し、
撹拌後、窒素ガス雰囲気下、４℃で１．５時間静置し
た。その後、窒素ガス置換した１００ｍＭ塩化ナトリウ
ム−１ｍＭ ＥＤＴＡ−１００ｍＭ リン酸緩衝液（ｐ
Ｈ６．０）（ＥＤＴＡ−ＰＢ）で十分に透析し、ＳＨ基
が導入された抗Ｅ２抗体を得た。１００ｍＭ 塩化ナト
リウム−１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）（Ｐ
Ｂ）で２０ｍｇ／ｍＬ濃度に調製された西洋ワサビパー
オキシダーゼ（ＨＲＰＯ，東洋紡社製）溶液３．１ｍＬ
を３０℃でゆっくり撹拌しながら、５０ｍＭのスルホＳ
ＭＣＣ（Pierce社製）３．１ｍＬを添加して２０分間反
応させた。反応後、窒素ガス置換したＰＢで平衡化した
ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５（ファルマシア社製）カラム
（２．５φ×１４．５ｃｍ）を通して未反応のスルホＳ
ＭＣＣを除去し、濃縮器ＣＥＮＴＲＩＰＲＥＰ−１０
（Amicon社製）を用いて濃縮し、マレイミド化ＨＲＰＯ
を得た。得られたマレイミド化ＨＲＰＯの濃度は、４０
３ｎｍの吸光度から求めた。３．３×１０-7モルのマレ
イミド化ＨＲＰＯ溶液に対して、１／５倍モル量のＳＨ
基導入抗体を添加混合後、窒素ガス雰囲気下、４℃にて
１６時間反応させた。次いで、５００ｍＭのシステアミ
ン含有ＥＤＴＡ−ＰＢ溶液９６μＬを添加し、窒素ガス
雰囲気下、４℃にて６０分間反応させ、その後、窒素ガ
ス置換したＰＢで平衡化したＵＬＴＲＯＧＥＬ ＡｃＡ
３４（ＩＢＦ Biotechnics 社製）カラムを用いてゲル
ろ過クロマトグラフィーを行った。２８０ｎｍおよび４
０３ｎｍにおける吸光度測定を、ゲルろ過クロマトグラ
フィーの溶出分画について行い、遊離の酵素を含まない
抗体とＨＲＰＯとの結合体の分画を集めて濃縮した。濃
縮標品（ＨＲＰＯ標識抗Ｅ２抗体と称す）は、Ｐｈａｓ
ｔシステムによる電気泳動（ファルマシア社製）で分子
量を確認後、吸光度と酵素活性から含有される抗体およ
び酵素量を決定し、後記する測定において信号物質発生
体として用いた。
ーオキシダーゼとの結合体（信号物質発生体）の作製 エストラジオール（Ｅ２）を認識するマウス単クローン
性抗体（持田製薬社製）を１００ｍＭ 塩化ナトリウム
−１ｍＭ ＥＤＴＡ−６０ｍＭ トリエタノールアミン
緩衝液（ｐＨ８．０）（ＴＥＡ緩衝液）に５．３ｍｇ／
ｍＬ濃度となるように溶解し、窒素ガス置換したＴＥＡ
緩衝液に十分に透析した。この抗体溶液２．２ｍＬに対
して、ＴＥＡ緩衝液中に調製した５０ｍＭの２−イミノ
チオラン塩酸塩（Pierce社製）溶液７０μＬを添加し、
撹拌後、窒素ガス雰囲気下、４℃で１．５時間静置し
た。その後、窒素ガス置換した１００ｍＭ塩化ナトリウ
ム−１ｍＭ ＥＤＴＡ−１００ｍＭ リン酸緩衝液（ｐ
Ｈ６．０）（ＥＤＴＡ−ＰＢ）で十分に透析し、ＳＨ基
が導入された抗Ｅ２抗体を得た。１００ｍＭ 塩化ナト
リウム−１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）（Ｐ
Ｂ）で２０ｍｇ／ｍＬ濃度に調製された西洋ワサビパー
オキシダーゼ（ＨＲＰＯ，東洋紡社製）溶液３．１ｍＬ
を３０℃でゆっくり撹拌しながら、５０ｍＭのスルホＳ
ＭＣＣ（Pierce社製）３．１ｍＬを添加して２０分間反
応させた。反応後、窒素ガス置換したＰＢで平衡化した
ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５（ファルマシア社製）カラム
（２．５φ×１４．５ｃｍ）を通して未反応のスルホＳ
ＭＣＣを除去し、濃縮器ＣＥＮＴＲＩＰＲＥＰ−１０
（Amicon社製）を用いて濃縮し、マレイミド化ＨＲＰＯ
を得た。得られたマレイミド化ＨＲＰＯの濃度は、４０
３ｎｍの吸光度から求めた。３．３×１０-7モルのマレ
イミド化ＨＲＰＯ溶液に対して、１／５倍モル量のＳＨ
基導入抗体を添加混合後、窒素ガス雰囲気下、４℃にて
１６時間反応させた。次いで、５００ｍＭのシステアミ
ン含有ＥＤＴＡ−ＰＢ溶液９６μＬを添加し、窒素ガス
雰囲気下、４℃にて６０分間反応させ、その後、窒素ガ
ス置換したＰＢで平衡化したＵＬＴＲＯＧＥＬ ＡｃＡ
３４（ＩＢＦ Biotechnics 社製）カラムを用いてゲル
ろ過クロマトグラフィーを行った。２８０ｎｍおよび４
０３ｎｍにおける吸光度測定を、ゲルろ過クロマトグラ
フィーの溶出分画について行い、遊離の酵素を含まない
抗体とＨＲＰＯとの結合体の分画を集めて濃縮した。濃
縮標品（ＨＲＰＯ標識抗Ｅ２抗体と称す）は、Ｐｈａｓ
ｔシステムによる電気泳動（ファルマシア社製）で分子
量を確認後、吸光度と酵素活性から含有される抗体およ
び酵素量を決定し、後記する測定において信号物質発生
体として用いた。
【０１０３】＜２＞１７β−エストラジオール−６−
［Ｏ−カルボキシメチル］オキシム−ウシγグロブリン
（Ｅ２−６ＣＭＯ−γＧ）の作製 17β-Estradiol-6-[O-carboxymethyl]oxime （Ｅ２−６
ＣＭＯ、シグマ社製）６．６ｍｇをジオキサン０．６６
ｍＬに溶解し、トリ−ｎ−ブチルアミン（和光純薬製）
４．６２μＬ、およびイソブチルクロロホルメート（ナ
カライテスク社製）４．６２μＬを加え、１０℃で３０
ｍｉｎ攪拌した。次いで、この溶液をあらかじめ５０％
ジオキサン水溶液で５ｍｇ／ｍＬに調製したウシγグロ
ブリン（シグマ社製）溶液３０．３２ｍＬに添加した。
その後、０．１Ｎ水酸化ナトリウム溶液を用いて反応溶
液のｐＨを８．０〜８．５に調節しながら１０℃で４時
間攪拌した。蒸留水に対し４℃で２０時間透析した後、
反応溶液に等量のジエチルエーテルを加えてよく攪拌
し、静置後分離したエーテル層を除去した。この抽出操
作を二度繰り返し、溶液中の未反応Ｅ２−６ＣＭＯを充
分除去した後、水層をＰＢに対して透析を行い、Ｅ２−
６ＣＭＯ−γＧを作製した。
［Ｏ−カルボキシメチル］オキシム−ウシγグロブリン
（Ｅ２−６ＣＭＯ−γＧ）の作製 17β-Estradiol-6-[O-carboxymethyl]oxime （Ｅ２−６
ＣＭＯ、シグマ社製）６．６ｍｇをジオキサン０．６６
ｍＬに溶解し、トリ−ｎ−ブチルアミン（和光純薬製）
４．６２μＬ、およびイソブチルクロロホルメート（ナ
カライテスク社製）４．６２μＬを加え、１０℃で３０
ｍｉｎ攪拌した。次いで、この溶液をあらかじめ５０％
ジオキサン水溶液で５ｍｇ／ｍＬに調製したウシγグロ
ブリン（シグマ社製）溶液３０．３２ｍＬに添加した。
その後、０．１Ｎ水酸化ナトリウム溶液を用いて反応溶
液のｐＨを８．０〜８．５に調節しながら１０℃で４時
間攪拌した。蒸留水に対し４℃で２０時間透析した後、
反応溶液に等量のジエチルエーテルを加えてよく攪拌
し、静置後分離したエーテル層を除去した。この抽出操
作を二度繰り返し、溶液中の未反応Ｅ２−６ＣＭＯを充
分除去した後、水層をＰＢに対して透析を行い、Ｅ２−
６ＣＭＯ−γＧを作製した。
【０１０４】＜３＞各化合物の抗原抗体反応に対する影
響の比較 ９６穴マイクロプレート（ＮＵＮＣ社製）に、＜２＞項
で作製したＥ２−６ＣＭＯーγＧの１０μｇ／ｍＬリン
酸緩衝液加生理食塩水（ＰＢＳ）をウェル当たり５０μ
Ｌずつ添加し、Ｅ２−６ＣＭＯーγＧを吸着固定した。
洗浄後、０．１％正常ウサギ血清（ＮＲＳ）を１００μ
Ｌ／ウェル添加し、４℃で５時間以上静置し、ブロッキ
ングを行った。洗浄後、＜１＞項で作製したＨＲＰＯ標
識抗Ｅ２抗体の希釈溶液に、実施例１の＜１＞項の各化
合物の溶液（ｐＨ６．０）をそれぞれ０．２５Ｍまたは
０．５Ｍ濃度で添加した溶液をウェル当たり５０μＬず
つ分注し、２５℃で１時間静置した。さらに、洗浄後、
ペルオキシダーゼの発色基質ＴＭＢ（ＳｃｙＴｅｋ社
製）をウェル当たり５０μＬずつ分注した。１０分後に
停止液（ＳｃｙＴｅｋ社製）をウェル当たり５０μＬず
つ添加して反応を停止し、ＥＴＹ９６プレートリーダー
（東洋測器社製）で４５０ｎｍの吸光度を測定した。図
８（ａ）に結果を示す。
響の比較 ９６穴マイクロプレート（ＮＵＮＣ社製）に、＜２＞項
で作製したＥ２−６ＣＭＯーγＧの１０μｇ／ｍＬリン
酸緩衝液加生理食塩水（ＰＢＳ）をウェル当たり５０μ
Ｌずつ添加し、Ｅ２−６ＣＭＯーγＧを吸着固定した。
洗浄後、０．１％正常ウサギ血清（ＮＲＳ）を１００μ
Ｌ／ウェル添加し、４℃で５時間以上静置し、ブロッキ
ングを行った。洗浄後、＜１＞項で作製したＨＲＰＯ標
識抗Ｅ２抗体の希釈溶液に、実施例１の＜１＞項の各化
合物の溶液（ｐＨ６．０）をそれぞれ０．２５Ｍまたは
０．５Ｍ濃度で添加した溶液をウェル当たり５０μＬず
つ分注し、２５℃で１時間静置した。さらに、洗浄後、
ペルオキシダーゼの発色基質ＴＭＢ（ＳｃｙＴｅｋ社
製）をウェル当たり５０μＬずつ分注した。１０分後に
停止液（ＳｃｙＴｅｋ社製）をウェル当たり５０μＬず
つ添加して反応を停止し、ＥＴＹ９６プレートリーダー
（東洋測器社製）で４５０ｎｍの吸光度を測定した。図
８（ａ）に結果を示す。
【０１０５】（比較例２）抗原抗体反応への影響の比較 ＜１＞比較例１＜１＞項の各化合物について、実施例２
と同様の試験および評価を行った。結果を図８（ｂ）に
示す。 （結果）メチルアミン、ジメチロール尿素、アルビジン
以外の化合物は、尿素に比べて抗原抗体反応への影響が
小さいことが示された。ここで、過酸化水素保持能を横
軸に、抗原抗体反応への影響を縦軸にプロットすると図
９のようになり、酢酸、３ーヒドロキシプロピオン酸、
Ｌ−セリン、Ｌ−シトルリン、ヒダントイン酸、Ｎ−ア
セチルグリシン、リン酸、クエン酸は、尿素よりも抗原
抗体反応への影響が小さく、かつ、過酸化水素の保持能
の大きい化合物として有用であった。アルビジンは尿素
よりも抗原抗体反応への影響は大きいが、尿素よりも過
酸化水素保持能が高いため、尿素よりも低濃度で同一の
過酸化水素を保持でき、その場合は、抗原抗体反応への
影響も尿素より低くなった。
と同様の試験および評価を行った。結果を図８（ｂ）に
示す。 （結果）メチルアミン、ジメチロール尿素、アルビジン
以外の化合物は、尿素に比べて抗原抗体反応への影響が
小さいことが示された。ここで、過酸化水素保持能を横
軸に、抗原抗体反応への影響を縦軸にプロットすると図
９のようになり、酢酸、３ーヒドロキシプロピオン酸、
Ｌ−セリン、Ｌ−シトルリン、ヒダントイン酸、Ｎ−ア
セチルグリシン、リン酸、クエン酸は、尿素よりも抗原
抗体反応への影響が小さく、かつ、過酸化水素の保持能
の大きい化合物として有用であった。アルビジンは尿素
よりも抗原抗体反応への影響は大きいが、尿素よりも過
酸化水素保持能が高いため、尿素よりも低濃度で同一の
過酸化水素を保持でき、その場合は、抗原抗体反応への
影響も尿素より低くなった。
【０１０６】（実施例３）過酸化水素保持量の化合物濃
度依存性 ＜１＞実施例１のガラス繊維濾紙担体において、Ｌ−
シトルリン、ヒダントイン酸の濃度を０．０５Ｍ、０．
１Ｍ、０．２Ｍ、０．４Ｍ、０．５Ｍ、１．０Ｍの各濃
度とした以外は実施例１と同様にして、各化合物の過酸
化水素保持量の濃度依存性を調べた。図１０に結果を示
す。
度依存性 ＜１＞実施例１のガラス繊維濾紙担体において、Ｌ−
シトルリン、ヒダントイン酸の濃度を０．０５Ｍ、０．
１Ｍ、０．２Ｍ、０．４Ｍ、０．５Ｍ、１．０Ｍの各濃
度とした以外は実施例１と同様にして、各化合物の過酸
化水素保持量の濃度依存性を調べた。図１０に結果を示
す。
【０１０７】（比較例３）過酸化水素保持量の化合物濃
度依存性 ＜１＞実施例１のガラス繊維濾紙担体において、尿素
の濃度を０．０５Ｍ、０．１Ｍ、０．２Ｍ、０．５Ｍ、
１．０Ｍ、２．０Ｍ、４．０Ｍの各濃度とした以外は実
施例１と同様にして、各化合物の過酸化水素保持効果の
濃度依存性を調べた。図１０に結果を示す。 （結果）尿素、Ｌ−シトルリン、ヒダントイン酸の３化
合物とも、化合物濃度に依存して過酸化水素保持量が増
大した。Ｌ−シトルリン、ヒダントイン酸は、尿素より
も１０倍程度高い過酸化水素保持能を示した。例えば、
４０ｍＭの過酸化水素を保持するのに必要な濃度を比較
すると、尿素２．０Ｍに対し、Ｌ−シトルリンは３００
ｍＭ、ヒダントイン酸は１００ｍＭであった。
度依存性 ＜１＞実施例１のガラス繊維濾紙担体において、尿素
の濃度を０．０５Ｍ、０．１Ｍ、０．２Ｍ、０．５Ｍ、
１．０Ｍ、２．０Ｍ、４．０Ｍの各濃度とした以外は実
施例１と同様にして、各化合物の過酸化水素保持効果の
濃度依存性を調べた。図１０に結果を示す。 （結果）尿素、Ｌ−シトルリン、ヒダントイン酸の３化
合物とも、化合物濃度に依存して過酸化水素保持量が増
大した。Ｌ−シトルリン、ヒダントイン酸は、尿素より
も１０倍程度高い過酸化水素保持能を示した。例えば、
４０ｍＭの過酸化水素を保持するのに必要な濃度を比較
すると、尿素２．０Ｍに対し、Ｌ−シトルリンは３００
ｍＭ、ヒダントイン酸は１００ｍＭであった。
【０１０８】（比較例４）抗原抗体反応に対する尿素濃
度の影響 実施例２において、尿素の濃度を０．５Ｍ、１．０Ｍ、
２．０Ｍ、４．０Ｍの各濃度とした以外は実施例２と同
様にして、４５０ｎｍの吸光度を測定した。図１１に結
果を示す。 （結果）尿素濃度が高いほど、４５０ｎｍの吸光度が低
い、すなわち、残存酵素活性が低下することが示され
た。従って、尿素が多く存在するほど、抗原抗体反応が
阻害されることが分かる。実施例３および比較例３から
明らかなように、ガラス繊維濾紙担体系で過酸化水素を
保持するには、尿素は、Ｌ−シトルリンやヒダントイン
酸に比べて、高濃度で添加しなければならないが、高濃
度では抗原抗体反応に悪影響を及ぼすため、実用的では
ない。
度の影響 実施例２において、尿素の濃度を０．５Ｍ、１．０Ｍ、
２．０Ｍ、４．０Ｍの各濃度とした以外は実施例２と同
様にして、４５０ｎｍの吸光度を測定した。図１１に結
果を示す。 （結果）尿素濃度が高いほど、４５０ｎｍの吸光度が低
い、すなわち、残存酵素活性が低下することが示され
た。従って、尿素が多く存在するほど、抗原抗体反応が
阻害されることが分かる。実施例３および比較例３から
明らかなように、ガラス繊維濾紙担体系で過酸化水素を
保持するには、尿素は、Ｌ−シトルリンやヒダントイン
酸に比べて、高濃度で添加しなければならないが、高濃
度では抗原抗体反応に悪影響を及ぼすため、実用的では
ない。
【０１０９】［実施例４〜５、比較例５〜７］Ｌ−シト
ルリン、ヒダントイン酸または尿素を用いた過酸化水素
付加物を、以下に示すように、それぞれ特異結合分析装
置における電極の上流側または下流側に配置して装置を
組み立て、血清中エストラジオール（Ｅ２）の測定を行
った。
ルリン、ヒダントイン酸または尿素を用いた過酸化水素
付加物を、以下に示すように、それぞれ特異結合分析装
置における電極の上流側または下流側に配置して装置を
組み立て、血清中エストラジオール（Ｅ２）の測定を行
った。
【０１１０】＜１＞電極部の作製 厚さ０．２５ｍｍの透明ＰＥＴフィルムの表側および裏
側に、導電性カーボンインク（４００−ＣＴ、アサヒ化
研社製）、導電性銀ぺースト（ＬＳ４１１Ｎ、アサヒ化
研社製）およびレジスト（ＸＢ−１０１Ｇ、藤倉化成社
製）を用いてスクリーン印刷し、図３に示されるような
電極部２２を作製した。まず、絶縁性基板２４となるＰ
ＥＴフィルムの表面に、カーボンインクを用いてスクリ
ーン印刷を行い、対極（参照極）３４と、対極３４に導
通する端子３４ａを形成し、次いで、絶縁性レジストを
用いて絶縁層３６を形成した。さらに、リング状の対極
３４を銀ペーストで上塗り印刷した。続いて、絶縁性基
板２４となるＰＥＴフィルムの裏面に、同様にして作用
極３８と、作用極３８に導通する端子３８ａをカーボン
インクで形成し、さらに絶縁層３６を形成した（すなわ
ち、銀ペースト印刷はおこなっていない）。各電極およ
び絶縁層を形成した後、ＰＥＴフィルムを長さ４４ｍ
ｍ、幅１８ｍｍのサイズに切断し、さらに、対極３４お
よび作用極３８の中心をパンチングして貫通孔３２を形
成し、図３に示されるような電極部２２を作製した。各
電極部の諸元は下記のとおりである。
側に、導電性カーボンインク（４００−ＣＴ、アサヒ化
研社製）、導電性銀ぺースト（ＬＳ４１１Ｎ、アサヒ化
研社製）およびレジスト（ＸＢ−１０１Ｇ、藤倉化成社
製）を用いてスクリーン印刷し、図３に示されるような
電極部２２を作製した。まず、絶縁性基板２４となるＰ
ＥＴフィルムの表面に、カーボンインクを用いてスクリ
ーン印刷を行い、対極（参照極）３４と、対極３４に導
通する端子３４ａを形成し、次いで、絶縁性レジストを
用いて絶縁層３６を形成した。さらに、リング状の対極
３４を銀ペーストで上塗り印刷した。続いて、絶縁性基
板２４となるＰＥＴフィルムの裏面に、同様にして作用
極３８と、作用極３８に導通する端子３８ａをカーボン
インクで形成し、さらに絶縁層３６を形成した（すなわ
ち、銀ペースト印刷はおこなっていない）。各電極およ
び絶縁層を形成した後、ＰＥＴフィルムを長さ４４ｍ
ｍ、幅１８ｍｍのサイズに切断し、さらに、対極３４お
よび作用極３８の中心をパンチングして貫通孔３２を形
成し、図３に示されるような電極部２２を作製した。各
電極部の諸元は下記のとおりである。
【０１１１】＜電極部２２＞実施例４および比較例５、
７では以下の電極部を用いた。 貫通孔３２（作用極３８の内径）：２ｍｍ、作用極３８
の外径：４ｍｍ（すなわち、作用極３８の幅１ｍｍ） 表面の対極（参照極）の内径：２ｍｍ、対極（参照極）
の外径：６ｍｍ 実施例５および比較例６では以下の電極部を用いた。 貫通孔３２（作用極３８の内径）：４ｍｍ、作用極３８
の外径：７ｍｍ（すなわち、作用極３８の幅１．５ｍ
ｍ） 表面の対極（参照極）の内径：４ｍｍ、対極（参照極）
の外径：８ｍｍ 作製した各電極部２２について、作用極３８および対極
３４が電気的に独立しており、また、それぞれに対応す
る端子３８ａおよび端子３４ａに電気的に接続されてい
ることを確認した。また、対極３４に関しては、上述の
銀ペースト電極を対極（参照極）として使用した。
７では以下の電極部を用いた。 貫通孔３２（作用極３８の内径）：２ｍｍ、作用極３８
の外径：４ｍｍ（すなわち、作用極３８の幅１ｍｍ） 表面の対極（参照極）の内径：２ｍｍ、対極（参照極）
の外径：６ｍｍ 実施例５および比較例６では以下の電極部を用いた。 貫通孔３２（作用極３８の内径）：４ｍｍ、作用極３８
の外径：７ｍｍ（すなわち、作用極３８の幅１．５ｍ
ｍ） 表面の対極（参照極）の内径：４ｍｍ、対極（参照極）
の外径：８ｍｍ 作製した各電極部２２について、作用極３８および対極
３４が電気的に独立しており、また、それぞれに対応す
る端子３８ａおよび端子３４ａに電気的に接続されてい
ることを確認した。また、対極３４に関しては、上述の
銀ペースト電極を対極（参照極）として使用した。
【０１１２】＜２＞第１含浸部１８（信号物質発生体−
電子メディエータ含浸部＝西洋わさびパ−オキシダーゼ
標識抗Ｅ２抗体およびＮ，Ｎ，Ｎ´，Ｎ´−テトラキス
−（２´−ヒドロキシエチル）−ｐ−フェニレンジアミ
ン２塩酸塩（ＴＨＥＰＤ）を含浸させた乾燥体）の作製 先に実施例２の＜１＞項で作製した西洋わさびパ−オキ
シダ−ゼ標識抗Ｅ２抗体、およびＴＨＥＰＤ（最終濃度
２ｍＭ）を、５％正常ウサギ血清（ＮＲＳ）−１０％ラ
クトース／０．１Ｍ ＮａＣｌ含有０．０１Ｍリン酸緩
衝液 ｐＨ７．４で希釈した溶液を調製した。次いで、
実施例１の＜２＞で作製したＴｗｅｅｎ２０処理ガラス
繊維濾紙からパンチングして作製した直径１２ｍｍの円
形濾紙に上記溶液を１４０μＬずつ点着し、凍結乾燥を
行い、第１含浸部１８（信号物質発生体−電子メディエ
ータ含浸部）を作製した。
電子メディエータ含浸部＝西洋わさびパ−オキシダーゼ
標識抗Ｅ２抗体およびＮ，Ｎ，Ｎ´，Ｎ´−テトラキス
−（２´−ヒドロキシエチル）−ｐ−フェニレンジアミ
ン２塩酸塩（ＴＨＥＰＤ）を含浸させた乾燥体）の作製 先に実施例２の＜１＞項で作製した西洋わさびパ−オキ
シダ−ゼ標識抗Ｅ２抗体、およびＴＨＥＰＤ（最終濃度
２ｍＭ）を、５％正常ウサギ血清（ＮＲＳ）−１０％ラ
クトース／０．１Ｍ ＮａＣｌ含有０．０１Ｍリン酸緩
衝液 ｐＨ７．４で希釈した溶液を調製した。次いで、
実施例１の＜２＞で作製したＴｗｅｅｎ２０処理ガラス
繊維濾紙からパンチングして作製した直径１２ｍｍの円
形濾紙に上記溶液を１４０μＬずつ点着し、凍結乾燥を
行い、第１含浸部１８（信号物質発生体−電子メディエ
ータ含浸部）を作製した。
【０１１３】＜３＞第２含浸部２０の作製 後述するように、実施例４および５では過酸化水素とヒ
ダントイン酸等を含有した緩衝液を、比較例５および６
では過酸化水素と尿素等を含有した緩衝液を、比較例７
では緩衝液のみを調製した。前記実施例１の＜２＞で作
製したＴｗｅｅｎ２０処理ガラス繊維濾紙からパンチン
グして作製した直径１２ｍｍの円形濾紙に上記溶液を１
４０μＬずつ点着し、凍結乾燥を行い、第２含浸部２０
を作製した。
ダントイン酸等を含有した緩衝液を、比較例５および６
では過酸化水素と尿素等を含有した緩衝液を、比較例７
では緩衝液のみを調製した。前記実施例１の＜２＞で作
製したＴｗｅｅｎ２０処理ガラス繊維濾紙からパンチン
グして作製した直径１２ｍｍの円形濾紙に上記溶液を１
４０μＬずつ点着し、凍結乾燥を行い、第２含浸部２０
を作製した。
【０１１４】＜４＞抗原不溶化流路２６（ハプテン不溶
化メンブレン＝Ｅ２−６ＣＭＯ−γＧ不溶化多孔性セル
ロース混合エステル膜）の作製 先に実施例２の＜２＞で作製したＥ２−６ＣＭＯ−γＧ
をＰＢＳに溶解して２．０ｍｇ／ｍＬ濃度に調製した。
この溶液１００ｍＬに、ポアサイズ８．０μｍのセルロ
ース混合エステル多孔性膜（日本ミリポア社製）からパ
ンチングして作製した直径１３ｍｍの円形多孔性膜１０
００枚をビーカー内で浸漬し、３０分間２５℃で振とう
した。濾紙で水分をぬぐった多孔性膜を一晩真空乾燥し
て抗原不溶化流路２６（ハプテン不溶化メンブレン）を
作製した。
化メンブレン＝Ｅ２−６ＣＭＯ−γＧ不溶化多孔性セル
ロース混合エステル膜）の作製 先に実施例２の＜２＞で作製したＥ２−６ＣＭＯ−γＧ
をＰＢＳに溶解して２．０ｍｇ／ｍＬ濃度に調製した。
この溶液１００ｍＬに、ポアサイズ８．０μｍのセルロ
ース混合エステル多孔性膜（日本ミリポア社製）からパ
ンチングして作製した直径１３ｍｍの円形多孔性膜１０
００枚をビーカー内で浸漬し、３０分間２５℃で振とう
した。濾紙で水分をぬぐった多孔性膜を一晩真空乾燥し
て抗原不溶化流路２６（ハプテン不溶化メンブレン）を
作製した。
【０１１５】＜５＞吸収部２８（過酸化水素付加物を含
浸させた乾燥体）の作製 クロマトグラフ濾紙１７Ｃｈｒ（Ｗｈａｔｍａｎ社製）
からパンチングして直径１２ｍｍの円形濾紙を作製し
た。なお、比較例７の場合に限り、後述する溶液を上記
円形濾紙に含浸し、凍結乾燥させて、過酸化水素付加物
の乾燥体として作製した。
浸させた乾燥体）の作製 クロマトグラフ濾紙１７Ｃｈｒ（Ｗｈａｔｍａｎ社製）
からパンチングして直径１２ｍｍの円形濾紙を作製し
た。なお、比較例７の場合に限り、後述する溶液を上記
円形濾紙に含浸し、凍結乾燥させて、過酸化水素付加物
の乾燥体として作製した。
【０１１６】＜６＞特異結合分析装置の作製 このようにして作製した各部位を用い、下記のようにし
て、図２および図４に示される特異結合分析装置を作製
した。まず、アクリル製の下部基板３０上にシール部２
８ａ（厚さ２５μｍ、直径；実施例４および比較例５、
７では４ｍｍ、実施例５および比較例６では７ｍｍ）を
有する吸水部ろ紙を配置し、抗原不溶化流路２６（ハプ
テン不溶化メンブレン）をその上に中心位置を合わせて
重積した。なお、比較例７では、吸収部２８として過酸
化水素付加物を含浸させた乾燥体を用いた。さらに、電
極部２２と貫通孔３２の中心を抗原不溶化流路２６の中
心と一致させて、作用極側を下にして積層した。次に、
第２含浸部２０を、その中心が電極の貫通孔の中心と一
致するように重積した。この第２含浸部２０の上部表面
中央に、ＰＥＴ製シール（厚さ２５μｍ、直径１０ｍ
ｍ）を貼り付けた。その上に、第１含浸部１８（信号物
質発生体−電子メディエータ含浸部）を重積した。その
上に、直径３ｍｍの試料導入口１６ａを有するアクリル
製の上部カバー１６を、その試料導入口１６ａの中心が
貫通孔３２の中心と一致するように上乗せし、上部カバ
ー１６下部基板３０の四隅のネジ孔を合わせネジ留めし
て図２および４に示されるような、エストラジオール濃
度測定用の特異結合分析装置を作製した。装置の断面図
（図１２）を用いて過酸化水素含浸部の配置を示す。図
１２（ａ）は過酸化水素−ヒダントイン酸水溶液の含浸
乾燥体４０を上流側に配置した場合、図１２（ｂ）は過
酸化水素−尿素水溶液の含浸乾燥体４２を下流側に配置
した場合である。
て、図２および図４に示される特異結合分析装置を作製
した。まず、アクリル製の下部基板３０上にシール部２
８ａ（厚さ２５μｍ、直径；実施例４および比較例５、
７では４ｍｍ、実施例５および比較例６では７ｍｍ）を
有する吸水部ろ紙を配置し、抗原不溶化流路２６（ハプ
テン不溶化メンブレン）をその上に中心位置を合わせて
重積した。なお、比較例７では、吸収部２８として過酸
化水素付加物を含浸させた乾燥体を用いた。さらに、電
極部２２と貫通孔３２の中心を抗原不溶化流路２６の中
心と一致させて、作用極側を下にして積層した。次に、
第２含浸部２０を、その中心が電極の貫通孔の中心と一
致するように重積した。この第２含浸部２０の上部表面
中央に、ＰＥＴ製シール（厚さ２５μｍ、直径１０ｍ
ｍ）を貼り付けた。その上に、第１含浸部１８（信号物
質発生体−電子メディエータ含浸部）を重積した。その
上に、直径３ｍｍの試料導入口１６ａを有するアクリル
製の上部カバー１６を、その試料導入口１６ａの中心が
貫通孔３２の中心と一致するように上乗せし、上部カバ
ー１６下部基板３０の四隅のネジ孔を合わせネジ留めし
て図２および４に示されるような、エストラジオール濃
度測定用の特異結合分析装置を作製した。装置の断面図
（図１２）を用いて過酸化水素含浸部の配置を示す。図
１２（ａ）は過酸化水素−ヒダントイン酸水溶液の含浸
乾燥体４０を上流側に配置した場合、図１２（ｂ）は過
酸化水素−尿素水溶液の含浸乾燥体４２を下流側に配置
した場合である。
【０１１７】＜７＞血清中でのＥ２測定 このようにして作製した特異結合分析装置の電極部２２
において、対極３４の端子３４ａを電流計測回路の対極
（参照極）端子に接続し、同回路の作用極端子に、作用
極３８（検出部）の端子３８ａを接続した。そして、同
回路からナショナルインスツルメンツ社製のデータ集録
ボードＡＴ−ＭＩＯ−１６Ｘを通じてコンピュータ内に
データを取り込み解析を行った。プール血清（Scantibo
dies Laboratory 社製、code3SH027）に標準濃度のＥ２
を添加して、Ｅ２ ０．１ｎｇ／ｍＬおよびＥ２ １０
０ｎｇ／ｍＬの血清検体を調製した。Ｅ２を含む血清検
体をそれぞれ、前記特異結合分析装置の上面アクリル板
の試料導入口を通じて、試料導入部に２００μＬ導入し
た。試料導入後、各作用極を対極・参照極に対して−１
５０ｍＶとなるように電位設定し、電流値を記録した。
において、対極３４の端子３４ａを電流計測回路の対極
（参照極）端子に接続し、同回路の作用極端子に、作用
極３８（検出部）の端子３８ａを接続した。そして、同
回路からナショナルインスツルメンツ社製のデータ集録
ボードＡＴ−ＭＩＯ−１６Ｘを通じてコンピュータ内に
データを取り込み解析を行った。プール血清（Scantibo
dies Laboratory 社製、code3SH027）に標準濃度のＥ２
を添加して、Ｅ２ ０．１ｎｇ／ｍＬおよびＥ２ １０
０ｎｇ／ｍＬの血清検体を調製した。Ｅ２を含む血清検
体をそれぞれ、前記特異結合分析装置の上面アクリル板
の試料導入口を通じて、試料導入部に２００μＬ導入し
た。試料導入後、各作用極を対極・参照極に対して−１
５０ｍＶとなるように電位設定し、電流値を記録した。
【０１１８】（実施例４）特異結合分析装置による血清
中エストラジオール（Ｅ２）測定（過酸化水素−ヒダン
トイン酸を電極の上流側に配置した場合；本発明に対
応） ５００ｍＭ 過酸化水素−１００ｍＭ ヒダントイン酸
（ＫＯＨでｐＨ６．０に調製）−１６０Ｕ／ｍＬヘパリ
ン−０．１Ｍ ＮａＣｌを調製し、上記溶液を用いて＜
３＞の第２含浸部を作製し、＜６＞の装置を組み立て、
＜７＞の測定を行った。結果を図１３に示した。
中エストラジオール（Ｅ２）測定（過酸化水素−ヒダン
トイン酸を電極の上流側に配置した場合；本発明に対
応） ５００ｍＭ 過酸化水素−１００ｍＭ ヒダントイン酸
（ＫＯＨでｐＨ６．０に調製）−１６０Ｕ／ｍＬヘパリ
ン−０．１Ｍ ＮａＣｌを調製し、上記溶液を用いて＜
３＞の第２含浸部を作製し、＜６＞の装置を組み立て、
＜７＞の測定を行った。結果を図１３に示した。
【０１１９】（比較例５）特異結合分析装置による血清
中エストラジオール（Ｅ２）測定（過酸化水素−尿素を
電極の上流側に配置した場合） ５００ｍＭ 過酸化水素−２．０Ｍ 尿素−１６０Ｕ／
ｍＬヘパリン−０．１Ｍ ＮａＣｌを調製し、上記溶液
を用いて＜３＞の第２含浸部を作製し、＜６＞の装置を
組み立て、＜７＞の測定を行った。 （結果）実施例４では、Ｅ２の濃度に依存した電流応答
が見られたが、比較例５では高濃度の尿素が原因でハプ
テン不溶化メンブレンで目詰まりをおこし、測定不可能
であった。実施例３、比較例３から明らかなように、１
００ｍＭ ヒダントイン酸（実施例４）と２．０Ｍ 尿
素（比較例５）は、ほぼ同様の過酸化水素を保持してい
るが、高濃度の尿素を電極の上流側に配置すると試料液
の流れを阻害し、不適切であった。
中エストラジオール（Ｅ２）測定（過酸化水素−尿素を
電極の上流側に配置した場合） ５００ｍＭ 過酸化水素−２．０Ｍ 尿素−１６０Ｕ／
ｍＬヘパリン−０．１Ｍ ＮａＣｌを調製し、上記溶液
を用いて＜３＞の第２含浸部を作製し、＜６＞の装置を
組み立て、＜７＞の測定を行った。 （結果）実施例４では、Ｅ２の濃度に依存した電流応答
が見られたが、比較例５では高濃度の尿素が原因でハプ
テン不溶化メンブレンで目詰まりをおこし、測定不可能
であった。実施例３、比較例３から明らかなように、１
００ｍＭ ヒダントイン酸（実施例４）と２．０Ｍ 尿
素（比較例５）は、ほぼ同様の過酸化水素を保持してい
るが、高濃度の尿素を電極の上流側に配置すると試料液
の流れを阻害し、不適切であった。
【０１２０】（実施例５）特異結合分析装置による血清
中エストラジオール（Ｅ２）測定（過酸化水素−ヒダン
トイン酸を電極の上流側に配置した場合；本発明に対
応） ２５ｍＭ 過酸化水素−１００ｍＭ ヒダントイン酸
（ＫＯＨでｐＨ６．０に調製）−１６０Ｕ／ｍＬヘパリ
ン−０．１Ｍ ＮａＣｌを調製し、上記溶液を用いて＜
３＞の第２含浸部を作製し、＜６＞の装置を組み立て、
＜７＞の測定を行った。結果を図１４に示す。
中エストラジオール（Ｅ２）測定（過酸化水素−ヒダン
トイン酸を電極の上流側に配置した場合；本発明に対
応） ２５ｍＭ 過酸化水素−１００ｍＭ ヒダントイン酸
（ＫＯＨでｐＨ６．０に調製）−１６０Ｕ／ｍＬヘパリ
ン−０．１Ｍ ＮａＣｌを調製し、上記溶液を用いて＜
３＞の第２含浸部を作製し、＜６＞の装置を組み立て、
＜７＞の測定を行った。結果を図１４に示す。
【０１２１】（比較例６）特異結合分析装置による血清
中エストラジオール（Ｅ２）測定（過酸化水素−尿素を
電極の上流側に配置した場合） ５００ｍＭ 過酸化水素−２．０Ｍ 尿素−１６０Ｕ／
ｍＬヘパリン−０．１Ｍ ＮａＣｌを調製し、上記溶液
を用いて＜３＞の第２含浸部を作製し、＜６＞の装置を
組み立て、＜７＞の測定を行った。結果を図１５に示
す。 （結果）過酸化水素、ヒダントイン酸、および尿素を各
々最適濃度組成にし、ハプテン不溶化メンブレンへの試
料液浸潤が速くなるよう、電極部貫通孔径を２ｍｍ（実
施例４、比較例５）から４ｍｍ（実施例４、比較例５）
に拡大したＭＥＤＩＡ分析装置を用いて、尿素とヒダン
トイン酸との比較を行った。ヒダントイン酸（実施例
５）を用いた場合は、約２００秒という短時間でＥ２濃
度に依存した安定な電流応答が得られたが、尿素を用い
た場合（比較例６）は、この貫通孔径でも電流の立ち上
がりが遅く、電流値も不安定であった。
中エストラジオール（Ｅ２）測定（過酸化水素−尿素を
電極の上流側に配置した場合） ５００ｍＭ 過酸化水素−２．０Ｍ 尿素−１６０Ｕ／
ｍＬヘパリン−０．１Ｍ ＮａＣｌを調製し、上記溶液
を用いて＜３＞の第２含浸部を作製し、＜６＞の装置を
組み立て、＜７＞の測定を行った。結果を図１５に示
す。 （結果）過酸化水素、ヒダントイン酸、および尿素を各
々最適濃度組成にし、ハプテン不溶化メンブレンへの試
料液浸潤が速くなるよう、電極部貫通孔径を２ｍｍ（実
施例４、比較例５）から４ｍｍ（実施例４、比較例５）
に拡大したＭＥＤＩＡ分析装置を用いて、尿素とヒダン
トイン酸との比較を行った。ヒダントイン酸（実施例
５）を用いた場合は、約２００秒という短時間でＥ２濃
度に依存した安定な電流応答が得られたが、尿素を用い
た場合（比較例６）は、この貫通孔径でも電流の立ち上
がりが遅く、電流値も不安定であった。
【０１２２】（比較例７）特異結合分析装置による血清
中エストラジオール（Ｅ２）測定（過酸化水素−尿素を
電極の下流側に配置した場合；従来技術に対応） ０．１Ｍ ＮａＣｌ含有０．０１Ｍリン酸緩衝液 ｐＨ
７．４を調製し、上記溶液を用いて＜３＞の第２含浸部
を作製した。また、過酸化水素（和光純薬工業製）およ
び尿素（和光純薬工業製）を蒸留水に溶解し、１．０Ｍ
過酸化水素−４．０Ｍ尿素溶液を調製し、＜５＞の円形
濾紙に上記溶液を１００μＬ点着し、凍結乾燥を行い、
尿素の過酸化水素付加物の乾燥体を作製した。これらを
用いて、＜６＞の装置を組み立て、＜７＞の測定を行っ
た。結果を図１６に示した。
中エストラジオール（Ｅ２）測定（過酸化水素−尿素を
電極の下流側に配置した場合；従来技術に対応） ０．１Ｍ ＮａＣｌ含有０．０１Ｍリン酸緩衝液 ｐＨ
７．４を調製し、上記溶液を用いて＜３＞の第２含浸部
を作製した。また、過酸化水素（和光純薬工業製）およ
び尿素（和光純薬工業製）を蒸留水に溶解し、１．０Ｍ
過酸化水素−４．０Ｍ尿素溶液を調製し、＜５＞の円形
濾紙に上記溶液を１００μＬ点着し、凍結乾燥を行い、
尿素の過酸化水素付加物の乾燥体を作製した。これらを
用いて、＜６＞の装置を組み立て、＜７＞の測定を行っ
た。結果を図１６に示した。
【０１２３】（結果）抗原抗体反応及び液流に対する尿
素の悪影響を回避するために尿素の過酸化水素付加物を
下硫側に配置した場合（比較例７の尿素の過酸化水素付
加物を用いた場合；図１６）に比べて、ヒダントイン酸
の過酸化水素付加物を上流に配置した場合（実施例５の
ヒダントイン酸の過酸化水素付加物を用いた場合；図１
４）では電流値の立ち上がりを待つ必要がなくなり、よ
り短時間での測定が可能になると共に、より安定な電流
応答が得られた。すなわち、図１６（尿素の過酸化水素
付加物を用いて下流側に配置した場合）では、時間０秒
で試料液を導入すると、溶解した酵素標識抗体、電子メ
ディエータなどの作用極上の通過に起因する電流（図で
は−方向の還元電流）が一過性に流れた後、２００秒後
には電流値は一旦低下する。試料液が最下層の吸収部に
到達して、含浸されている過酸化水素を溶解すると、過
酸化水素が逆拡散し、約２５０秒後から電流値は再び増
大し始める。その結果、約６００秒後に、Ｅ2 １００ｎ
ｇ／ｍＬとＥ2 ０．１ｎｇ／ｍＬの試料間の電流値の差
が最大値を示した。しかし、図１４（ヒダントイン酸の
過酸化水素付加物を用いて上流側に配置した場合）で
は、時間０秒に試料液を導入すると、溶解した酵素標識
抗体、電子メディエータなどの作用極上の通過に起因す
る電流（図では−方向の還元電流）が一過性に流れた
後、約２００〜３００秒で速やかにＥ2 １００ｎｇ／ｍ
ＬとＥ2 ０．１ｎｇ／ｍＬの試料間の電流値の差が安定
に現れた。同様の結果は、ヒダントイン酸の代わりにＬ
−シトルリン、リン酸、クエン酸、酢酸、あるいは、Ｎ
−アセチルグリシンを用いた場合にも得られた。
素の悪影響を回避するために尿素の過酸化水素付加物を
下硫側に配置した場合（比較例７の尿素の過酸化水素付
加物を用いた場合；図１６）に比べて、ヒダントイン酸
の過酸化水素付加物を上流に配置した場合（実施例５の
ヒダントイン酸の過酸化水素付加物を用いた場合；図１
４）では電流値の立ち上がりを待つ必要がなくなり、よ
り短時間での測定が可能になると共に、より安定な電流
応答が得られた。すなわち、図１６（尿素の過酸化水素
付加物を用いて下流側に配置した場合）では、時間０秒
で試料液を導入すると、溶解した酵素標識抗体、電子メ
ディエータなどの作用極上の通過に起因する電流（図で
は−方向の還元電流）が一過性に流れた後、２００秒後
には電流値は一旦低下する。試料液が最下層の吸収部に
到達して、含浸されている過酸化水素を溶解すると、過
酸化水素が逆拡散し、約２５０秒後から電流値は再び増
大し始める。その結果、約６００秒後に、Ｅ2 １００ｎ
ｇ／ｍＬとＥ2 ０．１ｎｇ／ｍＬの試料間の電流値の差
が最大値を示した。しかし、図１４（ヒダントイン酸の
過酸化水素付加物を用いて上流側に配置した場合）で
は、時間０秒に試料液を導入すると、溶解した酵素標識
抗体、電子メディエータなどの作用極上の通過に起因す
る電流（図では−方向の還元電流）が一過性に流れた
後、約２００〜３００秒で速やかにＥ2 １００ｎｇ／ｍ
ＬとＥ2 ０．１ｎｇ／ｍＬの試料間の電流値の差が安定
に現れた。同様の結果は、ヒダントイン酸の代わりにＬ
−シトルリン、リン酸、クエン酸、酢酸、あるいは、Ｎ
−アセチルグリシンを用いた場合にも得られた。
【０１２４】［実施例６〜９、比較例８］本発明に用い
る過酸化水素付加物を構成するのに好適な化合物を調べ
るために、各種の化合物について、過酸化水素保持効果
の試験および評価を行った。
る過酸化水素付加物を構成するのに好適な化合物を調べ
るために、各種の化合物について、過酸化水素保持効果
の試験および評価を行った。
【０１２５】（実施例６）過酸化水素保持効果の比較 ＜１＞表１に示した各化合物を蒸留水に溶解し、２００
ｍＭ化合物溶液を調製した。各溶液はＨＣｌ水溶液又は
ＮａＯＨ水溶液の添加によりｐＨを約６．０に調整し
た。これらの溶液と過酸化水素（和光純薬工業製）を用
いて１００ｍＭ過酸化水素−１００ｍＭ化合物溶液を調
製した。各溶液をガラス製バイアル（容積３．０ｍＬ）
に１００μＬずつ分注し、凍結乾燥した。乾燥後各バイ
アルに蒸留水を１．０ｍＬずつ添加して凍結乾燥体中の
成分を再溶解し、溶解液中の過酸化水素濃度をＰｅｒｏ
ＸＯｑｕａｎｔTMＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｐｅｒｏ
ｘｉｄｅ Ａｓｓａｙ（ＰＩＥＲＣＥ社製）キットを用
いて定量し、凍結乾燥前に添加した過酸化水素量に対す
る回収率を算出した。結果を表１に示す。
ｍＭ化合物溶液を調製した。各溶液はＨＣｌ水溶液又は
ＮａＯＨ水溶液の添加によりｐＨを約６．０に調整し
た。これらの溶液と過酸化水素（和光純薬工業製）を用
いて１００ｍＭ過酸化水素−１００ｍＭ化合物溶液を調
製した。各溶液をガラス製バイアル（容積３．０ｍＬ）
に１００μＬずつ分注し、凍結乾燥した。乾燥後各バイ
アルに蒸留水を１．０ｍＬずつ添加して凍結乾燥体中の
成分を再溶解し、溶解液中の過酸化水素濃度をＰｅｒｏ
ＸＯｑｕａｎｔTMＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｐｅｒｏ
ｘｉｄｅ Ａｓｓａｙ（ＰＩＥＲＣＥ社製）キットを用
いて定量し、凍結乾燥前に添加した過酸化水素量に対す
る回収率を算出した。結果を表１に示す。
【０１２６】
【表１】
【表２】
【０１２７】（実施例７）過酸化水素保持効果の比較 ＜１＞各化合物の過酸化水素保持効果の比較 表２に示した各化合物を最終濃度０．２５％あるいは
２．０％で用いた以外は実施例６と同様にして、各成分
の過酸化水素保持効果を評価した。結果を表２に示す。
２．０％で用いた以外は実施例６と同様にして、各成分
の過酸化水素保持効果を評価した。結果を表２に示す。
【０１２８】
【表３】
【０１２９】（比較例８）表３に示す化合物について、
実施例６と同様の試験および評価を行った。結果を表３
に示す。 （結果）表１に示した化合物はいずれも過酸化水素保持
効果を示した。また、溶液のｐＨが少なくとも４〜９の
範囲でこの過酸化水素保持効果は認められた。さらに、
この過酸化水素保持効果は、凍結乾燥物を４５℃・２４
時間、あるいは４℃・６ヶ月保存した後も認められた。
表２に示したポリマーも過酸化水素保持効果を示し、化
合物濃度が高いほど過酸化水素保持効果が高くなる傾向
にあった。しかし、過酸化水素保持効果が既に知られて
いる尿素は、実施例６の化合物と同濃度（１００ｍＭ）
ではほとんど過酸化水素保持効果を示さなかった（表
３）。
実施例６と同様の試験および評価を行った。結果を表３
に示す。 （結果）表１に示した化合物はいずれも過酸化水素保持
効果を示した。また、溶液のｐＨが少なくとも４〜９の
範囲でこの過酸化水素保持効果は認められた。さらに、
この過酸化水素保持効果は、凍結乾燥物を４５℃・２４
時間、あるいは４℃・６ヶ月保存した後も認められた。
表２に示したポリマーも過酸化水素保持効果を示し、化
合物濃度が高いほど過酸化水素保持効果が高くなる傾向
にあった。しかし、過酸化水素保持効果が既に知られて
いる尿素は、実施例６の化合物と同濃度（１００ｍＭ）
ではほとんど過酸化水素保持効果を示さなかった（表
３）。
【０１３０】
【表４】
【０１３１】各化合物の構造と過酸化水素保持効果との
相関については以下のような傾向が認められた。少な
くとも、水酸基、カルボキシル基、リン酸基、硫酸基を
有する化合物は過酸化水素保持効果を示すが、中でもカ
ルボキシル基、あるいはリン酸基を有する化合物の過酸
化水素保持効果が高い。カルボキシル基と水酸基を併
せ持つ化合物等、複数種の官能基を有する化合物の過酸
化水素保持効果が高い。カルボキシル基を１つ有する
化合物よりも２つ以上有する化合物のほうが過酸化水素
保持効果が高い。すなわち、複数の官能基を有する化合
物の過酸化水素保持効果が一般に高かった。表４にカル
ボキシル基を２つ有する化合物の場合で例示したよう
に、化合物の分子鎖長に関わらず過酸化水素保持効果を
示した。また、二重結合や三重結合が存在する化合物、
あるいは、官能基がシクロヘキサン環やベンゼン環上に
存在する化合物も、過酸化水素保持効果を示した。すな
わち、いずれの化合物も比較例の尿素よりも過酸化水素
保持効果は高く、過酸化水素抱合剤として好適な化合物
であった。
相関については以下のような傾向が認められた。少な
くとも、水酸基、カルボキシル基、リン酸基、硫酸基を
有する化合物は過酸化水素保持効果を示すが、中でもカ
ルボキシル基、あるいはリン酸基を有する化合物の過酸
化水素保持効果が高い。カルボキシル基と水酸基を併
せ持つ化合物等、複数種の官能基を有する化合物の過酸
化水素保持効果が高い。カルボキシル基を１つ有する
化合物よりも２つ以上有する化合物のほうが過酸化水素
保持効果が高い。すなわち、複数の官能基を有する化合
物の過酸化水素保持効果が一般に高かった。表４にカル
ボキシル基を２つ有する化合物の場合で例示したよう
に、化合物の分子鎖長に関わらず過酸化水素保持効果を
示した。また、二重結合や三重結合が存在する化合物、
あるいは、官能基がシクロヘキサン環やベンゼン環上に
存在する化合物も、過酸化水素保持効果を示した。すな
わち、いずれの化合物も比較例の尿素よりも過酸化水素
保持効果は高く、過酸化水素抱合剤として好適な化合物
であった。
【０１３２】
【表５】
【０１３３】（実施例８）過酸化水素保持効果の比較 ＜１＞表５に示す化合物について、実施例６と同様にし
て１００ｍＭ過酸化水素−１００ｍＭ化合物溶液を調製
した。クロマトグラフ濾紙（５１４Ａ、アドバンテック
東洋社製）からパンチングして作製した直径１０ｍｍの
円形濾紙をバット上に並べ、各溶液を１枚当たり２５μ
Ｌずつ点着して凍結乾燥した。凍結乾燥後の濾紙は乾燥
剤と共にアルミパックに封入して４℃あるいは４５℃で
２４時間保存した。濾紙１枚ずつを、０．１Ｍリン酸−
０．１Ｍ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）３．０ｍ
Ｌに浸漬し、１５０ｒｐｍで１時間振とうした後、その
上清を採取した。上清中の過酸化水素を実施例６と同様
の方法で定量し、凍結乾燥前に添加した過酸化水素量に
対する回収率を算出した。結果を表５に示す。
て１００ｍＭ過酸化水素−１００ｍＭ化合物溶液を調製
した。クロマトグラフ濾紙（５１４Ａ、アドバンテック
東洋社製）からパンチングして作製した直径１０ｍｍの
円形濾紙をバット上に並べ、各溶液を１枚当たり２５μ
Ｌずつ点着して凍結乾燥した。凍結乾燥後の濾紙は乾燥
剤と共にアルミパックに封入して４℃あるいは４５℃で
２４時間保存した。濾紙１枚ずつを、０．１Ｍリン酸−
０．１Ｍ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）３．０ｍ
Ｌに浸漬し、１５０ｒｐｍで１時間振とうした後、その
上清を採取した。上清中の過酸化水素を実施例６と同様
の方法で定量し、凍結乾燥前に添加した過酸化水素量に
対する回収率を算出した。結果を表５に示す。
【０１３４】
【表６】 （結果）表５に示した化合物はいずれも過酸化水素保持
効果を示した。さらに、この過酸化水素保持効果は、凍
結乾燥物を４５℃・２４時間保存した後も認められた。
すなわち、いずれの化合物も過酸化水素抱合剤として保
存安定性が優れていた。
効果を示した。さらに、この過酸化水素保持効果は、凍
結乾燥物を４５℃・２４時間保存した後も認められた。
すなわち、いずれの化合物も過酸化水素抱合剤として保
存安定性が優れていた。
【０１３５】（実施例９）特異結合分析装置による血漿
中エストラジオール（Ｅ２）測定 実施例８で作製した過酸化水素乾燥体を吸収部として特
異結合分析装置の電極に対して下流側に配置し、血漿中
エストラジオール（Ｅ２）の測定を行った。
中エストラジオール（Ｅ２）測定 実施例８で作製した過酸化水素乾燥体を吸収部として特
異結合分析装置の電極に対して下流側に配置し、血漿中
エストラジオール（Ｅ２）の測定を行った。
【０１３６】＜１＞吸収部４３（過酸化水素付加物を含
浸させた乾燥体）の作製 実施例８＜１＞で作製した過酸化水素付加物を含浸させ
た乾燥体を吸収部４３として用いた。
浸させた乾燥体）の作製 実施例８＜１＞で作製した過酸化水素付加物を含浸させ
た乾燥体を吸収部４３として用いた。
【０１３７】＜２＞界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ２０）処理
ガラス繊維濾紙の作製 ガラス繊維濾紙（ＧＦ／Ｃ、Ｗｈａｔｍａｎ社製）を用
い、実施例１＜２＞の手順で界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ２
０）処理ガラス繊維濾紙を作製した。この界面活性剤
（Ｔｗｅｅｎ２０）処理ガラス繊維濾紙からパンチング
して作製した直径１０ｍｍの円形濾紙を第１層４４およ
び第２層４５として用いた。
ガラス繊維濾紙の作製 ガラス繊維濾紙（ＧＦ／Ｃ、Ｗｈａｔｍａｎ社製）を用
い、実施例１＜２＞の手順で界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ２
０）処理ガラス繊維濾紙を作製した。この界面活性剤
（Ｔｗｅｅｎ２０）処理ガラス繊維濾紙からパンチング
して作製した直径１０ｍｍの円形濾紙を第１層４４およ
び第２層４５として用いた。
【０１３８】＜３＞試薬乾燥体４６（信号物質発生体−
電子メディエータ含浸部＝西洋わさびパーオキシダーゼ
標識抗Ｅ２抗体およびＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラキス
−（２’−ヒドロキシエチル）−ｐ−フェニレンジアミ
ン２塩酸塩（ＴＨＥＰＤ）を含浸させた乾燥体）の作製 先に実施例２の＜１＞項で作製した西洋わさびパーオキ
シダーゼ標識抗Ｅ２抗体、およびＴＨＥＰＤ（最終濃度
９ｍＭ）を、５％正常ウサギ血清（ＮＲＳ）−１０％ラ
クトース／０．１Ｍ ＮａＣｌ含有０．０１Ｍリン酸緩
衝液 ｐＨ７．４で希釈した溶液を調製した。上記溶液
をバット上に２０μＬずつ点着し、凍結乾燥を行い、試
薬乾燥体４６（信号物質発生体−電子メディエータ）を
作製した。
電子メディエータ含浸部＝西洋わさびパーオキシダーゼ
標識抗Ｅ２抗体およびＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラキス
−（２’−ヒドロキシエチル）−ｐ−フェニレンジアミ
ン２塩酸塩（ＴＨＥＰＤ）を含浸させた乾燥体）の作製 先に実施例２の＜１＞項で作製した西洋わさびパーオキ
シダーゼ標識抗Ｅ２抗体、およびＴＨＥＰＤ（最終濃度
９ｍＭ）を、５％正常ウサギ血清（ＮＲＳ）−１０％ラ
クトース／０．１Ｍ ＮａＣｌ含有０．０１Ｍリン酸緩
衝液 ｐＨ７．４で希釈した溶液を調製した。上記溶液
をバット上に２０μＬずつ点着し、凍結乾燥を行い、試
薬乾燥体４６（信号物質発生体−電子メディエータ）を
作製した。
【０１３９】＜４＞抗原不溶化流路４７（ハプテン不溶
化メンブレン＝Ｅ２−６ＣＭＯ−γＧ不溶化多孔性セル
ロース混合エステル膜）の作製 実施例４＜４＞と同様にして抗原不溶化流路４７（ハプ
テン不溶化メンブレン）を作製した。ただし、円形多孔
性膜の直径は１０ｍｍとした。
化メンブレン＝Ｅ２−６ＣＭＯ−γＧ不溶化多孔性セル
ロース混合エステル膜）の作製 実施例４＜４＞と同様にして抗原不溶化流路４７（ハプ
テン不溶化メンブレン）を作製した。ただし、円形多孔
性膜の直径は１０ｍｍとした。
【０１４０】＜５＞電極部 電極部２２は図３に示した通りである。実施例９で用い
た電極の諸元は下記の通りである。 貫通孔３２（作用極３８の内径）：３．５ｍｍ、作用極
３８の外径：６．５ｍｍ（すなわち、作用極３８の幅
１．５ｍｍ） 表面の対極（参照極）の内径：３．５ｍｍ、対極（参照
極）の外径：７ｍｍ
た電極の諸元は下記の通りである。 貫通孔３２（作用極３８の内径）：３．５ｍｍ、作用極
３８の外径：６．５ｍｍ（すなわち、作用極３８の幅
１．５ｍｍ） 表面の対極（参照極）の内径：３．５ｍｍ、対極（参照
極）の外径：７ｍｍ
【０１４１】＜６＞特異結合分析装置の作製 このようにして作製した各部材を用い、下記のようにし
て図１７に示される特異結合分析装置を作製した。先
ず、アクリル製の下部基板４８上にシール部４３ａ（厚
さ２５μｍ、直径７ｍｍ）を有する吸水部４３を配置
し、抗原不溶化流路４７（ハプテン不溶化メンブレン）
をその上に中心位置を合わせて重積した。さらに、電極
部２２と貫通孔３２の中心を抗原不溶化流路４７の中心
と一致させて、作用極側を下にして積層した。次に、第
２層４５を、その中心が電極の貫通孔の中心と一致する
ように重積した。この第２層４５の上部表面中央に、Ｐ
ＥＴ製シール（厚さ２５μｍ、直径８ｍｍ）を張りつけ
た。その上に、第１層４４を重積した。その上に、直径
２ｍｍの試料導入口４９ａを有するアクリル製の上部カ
バー４９を、その試料導入口４９ａの中心が貫通孔３２
の中心と一致するように上乗せし、上部カバー４９下部
基板４８の四隅のネジ孔を合わせネジ留めした。試料導
入口４９ａに試薬乾燥体４６を配置して、エストラジオ
ール濃度測定用の特異結合分析装置を作製した。装置の
概略図を図１７に示す。
て図１７に示される特異結合分析装置を作製した。先
ず、アクリル製の下部基板４８上にシール部４３ａ（厚
さ２５μｍ、直径７ｍｍ）を有する吸水部４３を配置
し、抗原不溶化流路４７（ハプテン不溶化メンブレン）
をその上に中心位置を合わせて重積した。さらに、電極
部２２と貫通孔３２の中心を抗原不溶化流路４７の中心
と一致させて、作用極側を下にして積層した。次に、第
２層４５を、その中心が電極の貫通孔の中心と一致する
ように重積した。この第２層４５の上部表面中央に、Ｐ
ＥＴ製シール（厚さ２５μｍ、直径８ｍｍ）を張りつけ
た。その上に、第１層４４を重積した。その上に、直径
２ｍｍの試料導入口４９ａを有するアクリル製の上部カ
バー４９を、その試料導入口４９ａの中心が貫通孔３２
の中心と一致するように上乗せし、上部カバー４９下部
基板４８の四隅のネジ孔を合わせネジ留めした。試料導
入口４９ａに試薬乾燥体４６を配置して、エストラジオ
ール濃度測定用の特異結合分析装置を作製した。装置の
概略図を図１７に示す。
【０１４２】＜７＞血漿中でのＥ２測定 このようにして作製した特異結合分析装置の電極部２２
において、対極３４の端子３４ａを電流計回路の対極
（参照極）端子に接続し、同回路の作用極端子に、作用
極３８（検出部）の端子３８ａを接続した。そして、同
回路からナショナルインスツルメンス社製のデータ集録
ボードＡＴ−ＭＩＯ−１６Ｘを通じてコンピュータ内に
データを取り込み解析を行った。健常人血漿に標準濃度
のＥ２を添加して、Ｅ２ １ｎｇ／ｍＬおよびＥ２ １
０ｎｇ／ｍＬの血漿検体を調製した。Ｅ２を含む血漿検
体をそれぞれ、前記特異結合分析装置の上面アクリル板
の試料導入口を通じて、試料導入部に８０μＬ導入し
た。あらかじめ各作用極を対極・参照極に対して−１５
０ｍＶとなるように電位設定した特異結合分析装置に試
料を導入し、電流値を記録した。
において、対極３４の端子３４ａを電流計回路の対極
（参照極）端子に接続し、同回路の作用極端子に、作用
極３８（検出部）の端子３８ａを接続した。そして、同
回路からナショナルインスツルメンス社製のデータ集録
ボードＡＴ−ＭＩＯ−１６Ｘを通じてコンピュータ内に
データを取り込み解析を行った。健常人血漿に標準濃度
のＥ２を添加して、Ｅ２ １ｎｇ／ｍＬおよびＥ２ １
０ｎｇ／ｍＬの血漿検体を調製した。Ｅ２を含む血漿検
体をそれぞれ、前記特異結合分析装置の上面アクリル板
の試料導入口を通じて、試料導入部に８０μＬ導入し
た。あらかじめ各作用極を対極・参照極に対して−１５
０ｍＶとなるように電位設定した特異結合分析装置に試
料を導入し、電流値を記録した。
【０１４３】（結果）表５に示したいずれの化合物を用
いた場合も、実施例４及び実施例５と同様に、Ｅ２濃度
に依存した電流応答が観察された。したがって、これら
の化合物はいずれも、ここに例示した特異結合分析のよ
うな分析方法において試薬の配置にかかわらずに、分析
原理に対する影響が小さい汎用性の高い過酸化水素抱合
剤である。また、本発明の過酸化水素付加物は、ここに
例示したＭＥＤＩＡ分析装置に限定されず、分析試薬と
して少なくとも過酸化水素を用いる分析方法において好
適に使用できる。
いた場合も、実施例４及び実施例５と同様に、Ｅ２濃度
に依存した電流応答が観察された。したがって、これら
の化合物はいずれも、ここに例示した特異結合分析のよ
うな分析方法において試薬の配置にかかわらずに、分析
原理に対する影響が小さい汎用性の高い過酸化水素抱合
剤である。また、本発明の過酸化水素付加物は、ここに
例示したＭＥＤＩＡ分析装置に限定されず、分析試薬と
して少なくとも過酸化水素を用いる分析方法において好
適に使用できる。
【０１４４】
【発明の効果】本発明によれば、過酸化物、具体的には
過酸化水素の供給源として、分析への悪影響が小さく、
過酸化水素保持能の高い安定な過酸化水素付加物を使用
することにより、正確で、かつ、感度の優れた、分析操
作の簡便な分析装置が提供される。
過酸化水素の供給源として、分析への悪影響が小さく、
過酸化水素保持能の高い安定な過酸化水素付加物を使用
することにより、正確で、かつ、感度の優れた、分析操
作の簡便な分析装置が提供される。
【０１４５】さらに、ＭＥＤＩＡ法特異結合分析装置に
適用する場合には、過酸化水素付加物の配置にかかわら
ず、迅速な測定が可能である。
適用する場合には、過酸化水素付加物の配置にかかわら
ず、迅速な測定が可能である。
【図１】 本発明の分析方法を利用する特異結合分析
（ＭＥＤＩＡ）装置の一例の原理を概念的に示す図であ
る。
（ＭＥＤＩＡ）装置の一例の原理を概念的に示す図であ
る。
【図２】 本発明の分析方法を利用する特異結合分析
（ＭＥＤＩＡ）装置の一例の概略分解斜視図である。
（ＭＥＤＩＡ）装置の一例の概略分解斜視図である。
【図３】 （ａ）は図２に示される特異結合分析（ＭＥ
ＤＩＡ）装置の電極部の上面、（ｂ）は同電極部の裏面
を、それぞれ示す概略図である。
ＤＩＡ）装置の電極部の上面、（ｂ）は同電極部の裏面
を、それぞれ示す概略図である。
【図４】 図２に示される特異結合分析（ＭＥＤＩＡ）
装置を組み立てた際の概略断面図である。
装置を組み立てた際の概略断面図である。
【図５】 過酸化水素−各化合物水溶液を無担体で凍結
乾燥した場合の添加量に対する過酸化水素回収率を示す
実施例（ａ）および比較例（ｂ）のグラフである。
乾燥した場合の添加量に対する過酸化水素回収率を示す
実施例（ａ）および比較例（ｂ）のグラフである。
【図６】 過酸化水素−各化合物水溶液をセルロース濾
紙に含浸させて凍結乾燥した場合の添加量に対する過酸
化水素回収率を示す実施例（ａ）および比較例（ｂ）の
グラフである。
紙に含浸させて凍結乾燥した場合の添加量に対する過酸
化水素回収率を示す実施例（ａ）および比較例（ｂ）の
グラフである。
【図７】 過酸化水素−各化合物水溶液をガラス濾紙に
含浸させて凍結乾燥した場合の添加量に対する過酸化水
素回収率を示す実施例（ａ）および比較例（ｂ）のグラ
フである。
含浸させて凍結乾燥した場合の添加量に対する過酸化水
素回収率を示す実施例（ａ）および比較例（ｂ）のグラ
フである。
【図８】 各化合物の抗原抗体反応への影響を示す実施
例（ａ）および比較例（ｂ）のグラフである。
例（ａ）および比較例（ｂ）のグラフである。
【図９】 各化合物の過酸化水素保持能と抗原抗体反応
への影響との関係を示すグラフである。
への影響との関係を示すグラフである。
【図１０】 各化合物の過酸化水素保持量の化合物濃度
依存性を示すグラフである。
依存性を示すグラフである。
【図１１】 尿素濃度と抗原抗体反応への影響との関係
を示すグラフである。
を示すグラフである。
【図１２】 （ａ）は過酸化水素−ヒダントイン酸水溶
液の含浸乾燥体を上流側に配置した場合、（ｂ）は過酸
化水素−尿素の含浸乾燥体を下流側に配置した場合の装
置の概略図である。
液の含浸乾燥体を上流側に配置した場合、（ｂ）は過酸
化水素−尿素の含浸乾燥体を下流側に配置した場合の装
置の概略図である。
【図１３】 過酸化水素−ヒダントイン酸水溶液の含浸
乾燥体を上流側に配置した場合の電流値の変化の様子を
示すグラフである。
乾燥体を上流側に配置した場合の電流値の変化の様子を
示すグラフである。
【図１４】 過酸化水素−ヒダントイン酸水溶液の含浸
乾燥体を上流側に配置した場合の電流値の変化の様子を
示すグラフである。
乾燥体を上流側に配置した場合の電流値の変化の様子を
示すグラフである。
【図１５】 過酸化水素−尿素水溶液の含浸乾燥体を上
流側に配置した場合の電流値の変化の様子を示すグラフ
である。
流側に配置した場合の電流値の変化の様子を示すグラフ
である。
【図１６】 過酸化水素−尿素水溶液の含浸乾燥体を下
流側に配置した場合の電流値の変化の様子を示すグラフ
である。
流側に配置した場合の電流値の変化の様子を示すグラフ
である。
【図１７】 実施例９のＥ２測定に使用した分析装置の
概略図である。
概略図である。
ａ 試料導入部 ｂ 試薬部 ｃ 検出部 ｄ マトリクス ｅ 流路 １０ 信号物質発生体 １２ 信号物質 １４ 信号物質の発生に関与する物質 １６ 上部カバー １６ａ 試料導入口 １８ 第１含浸部 ２０ 第２含浸部 ２０ａ，２８ａ シール部 ２２ 電極部 ２４ 絶縁性基板 ２６ 特異結合物質不溶化流路（マトリクス） ２８ 吸収部 ３０ 下部基板 ３２ 貫通孔 ３４ 対極 ３４ａ 端子部分 ３６ 絶縁層 ３８ 作用極 ３８ａ 端子部分 ４０ 過酸化水素−ヒダントイン酸含浸乾燥部 ４２ 過酸化水素−尿素含浸乾燥部 ４３ 吸収部 ４３ａ シール部 ４４ 第１層 ４５ 第２層 ４５ａ シール部 ４６ 試薬乾燥体 ４７ 抗原不溶化流路 ４８ 下部基板 ４９ 上部カバー ４９ａ 試料導入口
Claims (13)
- 【請求項１】分析試薬として、少なくとも過酸化物を用
いる分析方法において、 （ａ）カルボン酸、カルボン酸の塩、リン酸、リン酸の
塩、スルホン酸およびスルホン酸の塩からなる群より選
ばれる少なくとも１成分と、 （ｂ）過酸化水素との乾燥状態の付加物を、測定時に水
系溶液を加え、過酸化物を発生させ、分析試薬として用
いることを特徴とする分析方法。 - 【請求項２】少なくとも流路と検出部とを有する装置を
用いて、分析試薬として少なくとも過酸化物を用いる分
析方法において、 （ａ）カルボン酸、カルボン酸の塩、リン酸、リン酸の
塩、スルホン酸およびスルホン酸の塩からなる群より選
ばれる少なくとも１成分と、 （ｂ）過酸化水素との乾燥状態の付加物を、流路内のい
ずれかに配置し、測定時に水系溶液を溶解し、過酸化物
を発生させて、発生した過酸化物を用いて、分析対象物
を検出または検量する請求項１に記載の分析方法。 - 【請求項３】前記分析方法がパーオキシダーゼ活性を有
する触媒を用いて分析対象物の測定を行う方法であっ
て、前記測定時に水系溶液を加えることにより、触媒反
応に関わる物質としての過酸化物を発生する請求項１ま
たは２に記載の分析方法。 - 【請求項４】前記成分（ａ）が、下記式（１）で表され
るモノカルボン酸、ピルビン酸、およびそれらのナトリ
ウム塩あるいはカリウム塩からなる群より選ばれる少な
くとも１成分である請求項１〜３のいずれかに記載の分
析方法。 【化１】 - 【請求項５】前記成分（ａ）が、脂肪族ジカルボン酸、
芳香族ジカルボン酸、および、それらのナトリウム酸あ
るいはカリウム塩からなる群より選ばれる少なくとも１
成分である請求項１〜３のいずれかに記載の分析方法。 - 【請求項６】前記成分（ａ）が、下記式（２）または
（３）で表されるトリカルボン酸、および、該トリカル
ボン酸のナトリウム塩あるいはカリウム塩からなる群よ
り選ばれる少なくとも１成分である請求項１〜３のいず
れかに記載の分析方法。 【化２】 （ただし、Ｒ4 ；Ｈ，−ＯＨ （ｐ＝１〜３，ｑ＝０〜
３，ｒ＝０〜３）） 【化３】 （ただし、Ｒ5 ；Ｈ，−ＣＨ3 （ｓ＝１〜３）） - 【請求項７】前記成分（ａ）が、下記式（４）で表され
るテトラカルボン酸、および該テトラカルボン酸のナト
リウム塩あるいはカリウム塩からなる群より選ばれる少
なくとも１成分である請求項１〜３のいずれかに記載の
分析方法。 【化４】 （ｔ＝０〜３，ｕ＝０〜３，ｖ＝０〜３） - 【請求項８】前記成分（ａ）がウロン酸、ポリウロン
酸、および、それらのナトリウム塩あるいはカリウム塩
からなる群より選ばれる少なくとも１成分である請求項
１〜３のいずれかに記載の分析方法。 - 【請求項９】前記成分（ａ）がヒドロキシアルカンスル
フォン酸、アミノアルカンスルフォン酸、ヒドロキシベ
ンゼンスルフォン酸、および、それらのナトリウム塩あ
るいはカリウム塩からなる群より選ばれる少なくとも１
成分である請求項１〜３のいずれかに記載の分析方法。 - 【請求項１０】前記成分（ａ）が、リン酸、および該リ
ン酸のナトリウム塩あるいはカリウム塩からなる群より
選ばれる少なくとも１成分である請求項１〜３のいずれ
かに記載の分析方法。 - 【請求項１１】分析試薬として、少なくとも過酸化物を
用いる分析方法において、 （ａ）単糖、二糖、糖アルコール、およびそれらのポリ
マーからなる群より選ばれる少なくとも１成分と、 （ｂ）過酸化水素との乾燥状態の付加物に、水系溶液を
加え、過酸化物を発生させ、分析試薬として用いること
を特徴とする分析方法。 - 【請求項１２】分析試薬として、少なくとも過酸化物を
用いる分析方法において、 （ａ）Ｎ−アセチル−グルコサミン、アスコルビン酸、
クレアチニン、およびポリエチレングリコールからなる
群より選ばれる少なくとも１成分と、 （ｂ）過酸化水素との乾燥状態の付加物に、水系溶液を
加え、過酸化物を発生させ、分析試薬として用いること
を特徴とする分析方法。 - 【請求項１３】少なくとも流路と検出部とを有する装置
を用いて、分析試薬として少なくとも過酸化物を用いる
分析方法において、 （ａ）流路中に存在する固体物質のカルボキシル基、ホ
スホノ基、スルホ基およびそれらの塩の少なくとも１成
分と、 （ｂ）過酸化水素との乾燥状態の付加物に、水系溶液を
加え、過酸化物を発生させ、分析試薬として用いること
を特徴とする分析方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8349790A JPH09234097A (ja) | 1995-12-28 | 1996-12-27 | 過酸化水素付加物を用いた分析方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7-343822 | 1995-12-28 | ||
| JP34382295 | 1995-12-28 | ||
| JP8349790A JPH09234097A (ja) | 1995-12-28 | 1996-12-27 | 過酸化水素付加物を用いた分析方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09234097A true JPH09234097A (ja) | 1997-09-09 |
Family
ID=26577621
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8349790A Withdrawn JPH09234097A (ja) | 1995-12-28 | 1996-12-27 | 過酸化水素付加物を用いた分析方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH09234097A (ja) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001343350A (ja) * | 2000-03-29 | 2001-12-14 | Matsushita Electric Ind Co Ltd | バイオセンサ |
| JP2002207022A (ja) * | 2000-11-09 | 2002-07-26 | Matsushita Electric Ind Co Ltd | バイオセンサ |
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| JP2021018119A (ja) * | 2019-07-18 | 2021-02-15 | 株式会社ファーストスクリーニング | 電気化学センサユニット |
-
1996
- 1996-12-27 JP JP8349790A patent/JPH09234097A/ja not_active Withdrawn
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