JP2930809B2 - 特異結合分析方法および装置 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、試料中の分析対象物を
簡便・迅速に定性もしくは定量するための特異結合分析
方法と、該方法を実施するのに好適な特異結合分析装置
に関する。

【０００２】より詳細には、例えば、特異結合物質が
不溶化されたマトリクスの場で、分析対象物と競合して
特異結合物質と結合するか、または該特異結合物質とは
結合せず分析対象物に特異的に結合する物質であるよう
な特異結合に関与する物質であってかつ直接または間接
に信号物質を発生できる物質を標識（信号物質発生体）
として用い、分析対象物と該分析対象物と特異的に結合
する物質（特異結合物質）との少なくとも１つの特異結
合反応によって、検出部に対する相対的な標識（信号物
質発生体）の位置分布を分析対象物濃度に応じて変化で
きること、さらに標識（信号物質発生体）によって発
生され、かつ、検出部においてのみ検出可能な信号を発
生するあるいは発生させる信号物質を用いて、検出部に
おいて観測される信号が、標識と検出部との距離（すな
わち信号物質の拡散距離）に応じて変調されることを利
用した分析方法とこの方法の実施に好適な装置に関す
る。

【０００３】

【従来の技術】特異結合分析方法としては、抗原抗体反
応を応用したイムノアッセイ、受容体を用いたレセプタ
ーアッセイ、相補的核酸配列のハイブリダイゼーション
を用いた核酸プローブアッセイなど多くの方法が知られ
ており、その特異性の高さから、臨床検査をはじめとす
る広い分野で繁用されている。

【０００４】これらの方法は、一般的に、特異結合反応
後、未反応物の分離操作を必要とするヘテロジニアス法
と、未反応物の分離操作を必要としないホモジニアス法
に分類される。

【０００５】ヘテロジニアス法は、未反応物の干渉なし
に特異結合反応の程度を検出できるため、比較的高感度
の測定が可能で、汎用性に富んでいる。しかしながら、
未反応物の分離操作は煩雑で、洗浄装置など、特殊な用
具もしくは機器を必要とする場合があり、その簡易化や
迅速化が求められている。

【０００６】一方、操作を簡便化するために、凝集反応
法、ＥＭＩＴ法、酵素チャネリング法などのプロキシマ
ールリンケージイムノアッセイ、免疫クロマトグラフ法
など各種のホモジニアス法が開発されてきたが、性能お
よび汎用性の点で、ヘテロジニアス法に及ばないのが現
状である。

【０００７】例えば、ゲル内免疫拡散法、血球凝集反応
法、ラテックス凝集反応法など、抗原抗体反応による凝
集塊の形成もしくは形成阻害を利用した凝集反応法は、
酵素などの標識を用いた方法に比して、測定感度および
測定精度がかなり劣っている。

【０００８】酵素などの標識を用いたホモジニアス法と
しては、特異結合反応に基づく酵素活性自体の変調を利
用した測定法（ＥＭＩＴ法など）、および、相互関係を
有する２種の標識が特異結合反応によって近接した場合
に信号変調を生じるプロキシマールリンケージイムノア
ッセイ（Proximal Linkage Immunoassay）がある。ＥＭ
ＩＴ法およびその関連技術では、酵素もしくは補酵素成
分もしくは酵素阻害剤などを活性を維持しながら分析対
象物（もしくは分析対象物類縁物質）で修飾する必要性
と、さらに、その修飾物と特異結合物質との結合が酵素
活性の有意な変調を引き起こす必要性があり、分析対象
物の物理特性（分子量、形状、溶解性など）や化学特性
（反応性、官能基の位置など）によっては適用が困難な
場合があり、測定感度および汎用性に劣る。他方、プロ
キシマールリンケージイムノアッセイでは、ヘテロジニ
アス法で一般に採用されている標識法で適用可能な場合
があり、ＥＭＩＴ法などに比して汎用性が高い。しかし
ながら、特異結合反応および信号検出の面からは標識物
を含めた特異結合物質の濃度が高いほど測定感度の増大
および測定時間の短縮が期待できるが、この濃度の増大
は特異結合反応によらない標識間の接近確率を高めてし
まう。この相反する性質は、測定感度の大きな限定要因
となっている。プロキシマールリンケージイムノアッセ
イの例としては、第１酵素の生成物が第２酵素の基質で
あるような連続する２反応を触媒する２酵素を用いた酵
素チャネリング法が知られている。これに関連した先行
技術としては、特公昭63-37348号、特公平01-14541号、
特公昭63-12260号、特公平01-30109号、特公平03-8513
号、Analytical Biochemistry, Vol.106, 223-229 (198
0)がある。しかしながら、いずれの開示例においても、
特異結合反応による標識間近接により標識酵素がチャネ
リング可能なミクロ環境を形成するか、もしくは、チャ
ネリング環境を提供する分散性離散微粒子担体（デキス
トラン粒子など）あるいは非分散性担体（濾紙など）上
に標識酵素が特異結合した時と、標識酵素が遊離で存在
する時との間で、全体の酵素反応速度が変調されること
に基づいている。従って、液相中の遊離の標識酵素は自
由拡散によって固相に接近でき、標識酵素濃度が高い場
合にはその非特異的な反応が障害となることに変わりは
ない。また、もう１つの問題として、第１酵素は第２酵
素の近接度とは独立に反応を持続できるから、第２酵素
とのチャネリング環境が形成されていない場合、第１酵
素反応の生成物は測定系内に蓄積する点が挙げられる。
この第１酵素反応の生成物の蓄積も、非特異的反応を上
昇させる。これらの問題点の解決のために、チャネリン
グできなかった第１反応の生成物を除去するスカベンジ
ャーの添加が行われている。しかし、有効濃度のスカベ
ンジャーの添加は、全体反応に対して多少とも競合的妨
害効果を有しており、汎用的な解決策ではない。

【０００９】一方、特異結合物質を不溶化した多孔性担
体あるいは微粒子充填型担体から成るクロマトグラフ域
に、標識特異結合物質と共に、あるいは、標識特異結合
物質とは別個に、分析対象物を含有することが予測され
る試料液を浸透展開する操作を含む分析法が知られてい
る。この免疫クロマトグラフ法は、不溶化できる実効表
面積が大きい点で、および、特異結合反応を引き起こし
うる反応分子間の衝突頻度が液相中の反応に比して大き
い点で、測定感度および測定時間の面から有利な場合が
ある。この場合、標識自体が信号物質である、もしく
は、標識自体が信号を発生することも可能であるが、別
法として、標識自体が信号を発生するかわりに、信号発
生に関与する信号物質が標識によって発生されることも
可能である。前者の標識例としては、放射性同位体、色
素物質、蛍光物質、もしくは、発光物質などが知られ、
後者の標識例としては酵素などが知られている。前者の
標識を用いる免疫クロマトグラフ法の先行技術として
は、特開昭53-47894号、特表平01-503174 号、特開平01
-244370 号などがあり、後者の標識を用いる免疫クロマ
トグラフ法の先行技術としては、特開昭59-28662号、特
表昭61-502214 号、ＵＳ特許4,956,275 号などがある。
放射性同位体を用いずに測定感度を維持したい場合に
は、後者の標識が一般に有利である。しかしながら、後
者の標識例においては、信号物質発生に必要な成分（例
えば酵素基質、発色剤など）と標識（酵素など）との接
触によって信号物質が発生することから、分析対象物を
含有することが予測される試料液および標識特異結合物
質を浸透展開する操作を行った後に該接触を行わせる段
階（以下、現像段階という）を必要とするため簡便性に
欠けていた。

【００１０】さらに、免疫クロマトグラフ法に共通の問
題点が未解決のままであった。すなわち、標識特異結合
物質および試料液を特異結合反応領域内でクロマトグラ
フ的に特異結合反応させた場合、特異結合反応が少なく
とも２分子間の反応確率に依存しているため、該特異結
合反応領域内での標識特異結合物質のクロマト方向にお
ける結合分布は、多かれ少なかれ、なだらかなグラディ
エント状もしくはシグモイド状などの曲線性となる。試
料液中の分析対象物濃度を変化させると、該反応確率が
変化し、特異結合反応領域内での標識の結合分布が変化
する。しかし、分布形状の全体的な形状はやはり曲線性
である。そのため、例えば現像後の呈色部分の長さもし
くは位置、すなわち標識の結合分布の端点までの距離や
位置から、試料液中の分析対象物濃度を定性もしくは定
量する方法では、呈色部分と非呈色部分の境界線が明瞭
でないことが多く、大きな誤差を生じることとなる。測
定精度を上げるには、特異結合反応領域内での標識の結
合分布を全体的に把握して定量化する必要がある。ＵＳ
特許4,956,275 号には、複数の検出部を検出領域（特異
結合反応領域を兼ねている）に設けるとの記載がある。
単一検出部の場合に比べて、検出領域に複数の検出部を
設置することにより、特異結合反応領域内での標識の結
合分布の把握の精度は上がるが、装置が複雑になるこ
と、そして、設置できる検出部の数には限界があること
から、本質的な改善ではなかった。また、同特許には、
酵素チャネリング法に基づいた信号発生系を検出領域に
設置することもできる旨の記載がある。しかしながら、
この記載においては、該検出領域は不溶化抗体の存在領
域を指し、該検出領域に抗体と共に第１酵素をも不溶化
し、展開溶液に第１酵素の基質を添加しておくことによ
り、第２酵素標識物の存在部分のみが信号を発生するこ
とができることを記載するにとどまり、現像段階を簡略
化することはできても、前述の測定精度および測定感度
の面での問題の解決にはならなかった。

【００１１】免疫クロマトグラフ法の別法として、多層
分析材料から成る特異結合分析装置がある。これに関連
した先行技術としては、特開昭57-67860号、特開昭57-2
00862 号、特開昭58-18167号、特開昭62-192663 号があ
る。特開昭57-67860号および特開昭57-200862 では、検
出層の上に特異結合物質が不溶化されている多孔性部材
からなる特異結合層を設置し、特異結合反応の後、検出
層に浸透してきた標識物を検出層の試薬で検出する技術
が開示されている。また、特異結合層に結合した標識物
に由来する信号の悪影響を避けるために、検出層と特異
結合層の間に光遮蔽層を設けることも記載されている。
しかし、標識が酵素である場合のように、検出層の試薬
と反応して信号生成物を生じる場合、試薬の特異結合層
への逆拡散と特異結合層での酵素反応生成物の検出層へ
の滲み出しの悪影響は光遮蔽層では抑えられない。ま
た、特開昭58-18167号もしくは特開昭62-192663 号にお
いては、ホモジニアス法の原理もしくは不溶化酵素基質
を特異結合層に導入した多層分析材料から成る特異結合
分析装置が開示されている。しかし、いずれも先に述べ
たホモジニアス法の制限を受けるだけでなく、特異結合
層での標識の結合分布の曲線性がもたらす悪影響は、ク
ロマト部分が短い薄層であるだけに非常に深刻であっ
た。

【００１２】上述のように、簡便性および迅速性を追求
した数多くの特異結合分析が知られているが、同時に汎
用性を有し、かつ、精度高く分析対象物を半定量もしく
は定量できる高感度の特異結合分析方法は未だ知られて
いないのが現状である。

【００１３】ところで、近年、家庭内および地域医療の
充実や、緊急性の高い臨床検査等の増加に伴ない、臨床
検査の専門家でなくとも、迅速簡便で確実に測定が実施
できる特異結合分析方法の開発がとみに望まれるように
なってきた。このような中、電気化学センサーをはじめ
とした各種のセンサーが開発され、生化学的分析方法の
分野では、酵素センサー等を用いた簡便で迅速な測定方
法が既に開示されている。一例をあげると、特公平02-5
9424号、特開昭60-17346号、特開昭60-17347号がある。
そして、その特異結合分析方法への応用の試みも積極的
に行われているが、操作が簡便で汎用性に富んだ分析方
法の報告はなかった。特異結合分析センサーの内、酵素
など比較的高感度な標識を用いている電気化学センサー
には以下のような先行技術がある。

【００１４】特開昭58-58467号では、酵素（カタラー
ゼ）標識抗体を用いた電極表面での特異結合反応が開示
されている。同様に、特開平02-179461 では、酵素（グ
ルコースオキシダーゼ）標識物を用いた電極表面での競
合的特異結合反応が開示されている。これらの開示例で
は特異結合物質を電極表面に不溶化しており、電極サイ
ズに限界がある以上、不溶化量にも限界があり、さら
に、液相中での反応であるということと相まって、測定
感度および測定時間で不利であった。

【００１５】特開昭60-17360号では、酸化還元酵素（グ
ルコースオキシダーゼなど）と電子メディエータ（フェ
ロセン誘導体など）で構成される酵素活性検出センサー
において、酵素もしくは電子メディエータのいずれかを
標識として用い、特異結合反応によって、（ａ）電子メ
ディエータの有効レベルを変化させる、（ｂ）酵素の有
効レベルを変化させる、（ｃ）両者をともに変化させ
る、（ｄ）電極の有効面積を変化させることにより、そ
の特異結合反応の程度を測定する分析法を開示してい
る。この場合、特異結合反応は、固体（容器の壁または
電極）表面で行う（ヘテロジニアス法）か、もしくは、
電極が接している溶液中で行う（ホモジニアス法）とさ
れている。しかしながら、この開示例でのヘテロジニア
ス法は他のヘテロジニアス法と同様、未反応物の分離操
作あるいは洗浄操作が必要であること、さらに、不溶化
担体も容器壁あるいは電極上を利用しているにとどま
り、ヘテロジニアス法の測定性能および簡便性の改善に
は至っていなかった。また、この開示例でのホモジニア
ス法に関しても、先に述べたホモジニアス法と実質的に
同一であり、ホモジニアス法特有の問題点は未解決のま
まであった。例えば、リガンド修飾した電子メディエー
タを利用したホモジニアス法では、電子メディエータは
酵素分子のレドックス中心に接近し、そのレドックス中
心と電子の授受を行えなければならない。しかし、電子
メディエータをリガンドで修飾する際に、リガンドによ
っては電子メディエータ機能を損なう場合もあり、様々
なリガンドに適用できるという汎用性に乏しく、測定感
度上も不利であった。これと同様な先行技術として特開
平03-25360号があり、やはり、電子メディエータとリガ
ンドをキャリア分子上に結合する際の制限が残ってい
た。

【００１６】その他の同様な先行技術として、特開昭60
-127450 号、特表昭61-500706 号、特開昭60-242361
号、特開昭63-139248 号、ＵＳ特許4,963,245 号、ＵＳ
特許5,066,372 号、Anal. Chem., Vol.56, 2355 -2360
(1984) 、Clin. Chem., Vol.31,1449-1452 (1985) があ
る。これらの内、ＵＳ特許4,963,245 号、ＵＳ特許5,06
6,372 号は、特異結合反応後、未反応物の分離操作を洗
浄によって行うかわりに、特異結合物質を不溶化した磁
気粒子を電極表面上に磁気分離し洗浄せずに測定する準
ホモジニアス法を採っている。しかし、磁気粒子担体を
物理的に分離するために磁気分離装置が必要であるこ
と、および、先に述べたプロキシマールリンケージイム
ノアッセイ（酵素チャネリング法など）と同様に、液相
中の遊離の標識酵素は自由拡散によって電極に接近で
き、その非特異的な反応が障害となることに変わりな
い。

【００１７】また、特開昭62-167465 号には、不活性型
の電子メディエータ前駆体（フェロセン結合基質）から
活性型の電子メディエータへの変換反応を触媒する酵素
（アルカリフォスファターゼ）を標識として用いるヘテ
ロジニアス法の電気化学的な特異結合分析法が開示され
ている。同様に、ＰＣＴ出願WO89-05454には、前駆体
（ＮＡＤＰ＋）から酸化還元対（ＮＡＤ＋）への変換反
応を触媒する酵素（アルカリフォスファターゼ）を標識
とし、生成した酸化還元対の量を電気化学的酵素センサ
ーで測定するヘテロジニアス法の特異結合分析法が開示
されている。特開平02-112752 号には、デプスフィルタ
ー上にトラップされた生物細胞をフィルター上で酵素標
識抗体と反応後、未反応の標識抗体を洗浄除去し、電極
を用いた標識酵素活性測定によって生物細胞の検出を行
う方法が開示されている。これらは、いずれも、典型的
なヘテロジニアス法であり、センサー技術を用いること
によって、従来のヘテロジニアス法の測定性能および簡
便性の改善に至るものではなかった。

【００１８】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、特異結合分
析の原理による、未反応物の分離操作（洗浄操作）を伴
なわない簡便な方法であって、汎用性に優れ、迅速な定
性および定量測定が可能な特異結合分析方法と、該方法
の実施に好適な特異結合分析装置の提供を目的とする。

【００１９】すなわち、 比較的小型で簡易な測定装置での測定を可能とする各
種のセンサー技術に、好適に適用可能な方法、でかつ、 簡便でしかも高感度化が期待できる各種の免疫クロマ
トグラフ担体に、好適に適用可能な方法、でかつ、 免疫クロマトグラフ法の障害であった標識の結合分布
の曲線性に由来する悪影響を最小限にする方法、でか
つ、 比較的高感度な測定が可能な信号物質発生体（酵素な
ど）を、好適に利用可能な方法、でかつ、 ホモジニアス法に特有の各種制限がなく、むしろ、従
来の一般的な免疫測定法に用いられている標識方法およ
び不溶化方法を、好適に採用できる非常に汎用性に優れ
た特異結合分析方法および装置の提供を目的とする。

【００２０】

【課題を解決するための手段】本発明第一の態様は、分
析対象物と、それに特異的に結合する特異結合物質との
少なくとも１つの特異結合反応に関連して試料中の分析
対象物を定性もしくは定量する方法であって、分析対象
物を含有することが予測される試料をマトリクスを通し
て検出部に導入するに際し、前記分析対象物と前記特異
結合物質との特異結合反応によって信号物質発生体の前
記マトリクス内での分布を分析対象物量に関して変化さ
せ、前記信号物質発生体によって発生され、かつ、検出
部においてのみ検出可能な信号を発生するあるいは発生
させる信号物質を媒介として、前記信号物質発生体の前
記マトリクス内での検出部からの距離の分布または検出
部との相対位置の分布の変化を前記信号の変調の程度と
して計測することにより、前記試料中の分析対象物を定
性もしくは定量することを特徴とする特異結合分析方法
である。ここで検出部が、信号物質が発生するあるいは
発生させる信号の生成または検出に必須な成分もしくは
必須な部材の１つが実質的に不動化されてなる検出部で
ある分析方法が好ましい。

【００２１】また、本発明第二の態様は、本発明第１の
態様の分析方法を実施する装置である。より具体的には
試料導入部（ａ）、マトリクス（ｂ）および検出部
（ｃ）が配設され、必要に応じてさらに吸収部（ｄ）が
設けられる特異結合分析装置である。

【００２２】以下に、本発明を詳細に説明する。はじめ
に、本明細書中の用語を説明する。

【００２３】分析対象物とは、本発明の方法、装置によ
り、定性的あるいは定量的に検出される物質である。具
体的には、抗体分子や抗原として機能する各種蛋白質、
ポリペプチド、糖蛋白質、多糖類、複合糖脂質、核酸、
エフェクター分子、レセプター分子、酵素、インヒビタ
ー等が例示され、さらに具体的には、α−フェトプロテ
イン、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＡ１２５、ＣＡ１９
−９等の腫瘍マーカーや、β₂ −ミクログロブリン（β
₂ ｍ）、フェリチンなどの各種蛋白質、糖蛋白質もしく
は複合糖脂質、エストラジオール（Ｅ₂ ）、エストリオ
ール（Ｅ₃ ）、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣ
Ｇ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、ヒト胎盤ラクトゲン
（ｈＰＬ）などの各種ホルモン、ＨＢｓ抗原、ＨＢｓ抗
体、ＨＢｃ抗原、ＨＢｃ抗体、ＨＣＶ抗体、ＨＩＶ抗体
などの各種ウイルス関連抗原あるいはウイルス関連抗
体、各種アレルゲンおよびこれに対応するＩｇＥ抗体、
麻薬性薬物、医療性薬物およびこれらの代謝産物、ウイ
ルスおよび腫瘍関連ポリヌクレオチド配列の核酸等が例
示される。

【００２４】分析対象物類縁物質とは、後記する特異結
合物質との結合反応において、分析対象物と同様の挙動
を示す物質をいい、一般的には分析対象物の構造的類縁
物質である。具体的には、前記分析対象物の各種構造的
アナログが例示され、本発明では、主に、分析対象物が
低分子量であり、競合法による特異結合反応が行なわれ
る場合に、後記する信号物質発生体の構成成分として使
用される。

【００２５】試料とは、分析対象物が含まれると予測さ
れる液体のことであり、具体的には、尿、血清、血漿、
全血、唾液、涙液、髄液、乳頭などからの分泌液等が例
示されるが、粘液、体組織あるいは細胞等の固形または
ゲル状もしくはゾル状物を、緩衝液、抽出液あるいは溶
解液等の液体に懸濁もしくは溶解させたものであっても
よい。

【００２６】特異結合物質とは、分析対象物等のある特
定の物質に特異的に結合する、すなわち、特定の物質に
特異結合反応しうる物質である。ある特定の物質とそれ
に対する特異結合物質との組合せとしては、抗原とそれ
に対する抗体、相補的核酸配列、エフェクター分子とレ
セプター分子、酵素とインヒビター、糖鎖を有する化合
物とレクチン、ある抗体とその抗体に対する抗体、レセ
プター分子とそれに対する抗体等が例示される。

【００２７】また、特異結合物質として、ある特異結合
活性が消失しない程度に化学修飾されたもの、あるい
は、他の成分と結合してなる複合性物質もあげられる。
このような特異結合物質とある特定の物質との組合せと
しては、ビオチンで化学修飾された抗体もしくはポリヌ
クレオチドとアビジン、アビジン共有結合抗体とビオチ
ン等が例示される。なお、本明細書では、次に説明する
信号物質発生体のように、その一部に特異結合物質とし
て働く部分を有する物質も、特異結合物質と称すること
がある。

【００２８】信号物質発生体とは、分析対象物と競合し
て特異結合物質と結合するか、また分析対象物に特異的
に結合するような特異結合反応に関与する物質であって
かつ直接または間接に信号を発生する物質であり、マト
リクス内で分析対象物の量と相関関係を保つ分布の変化
を示す物質である。

【００２９】すなわち信号物質発生体とは、ある種の特
異結合物質として働く部分と、後記する信号物質の生成
に寄与する部分とを有する物質、すなわち標識特異結合
物質である。

【００３０】ここで、特異結合物質として働く部分と
は、分析対象物に対して特異結合物質となる構造、ある
いは、分析対象物もしくは分析対象物類縁物質の構造を
有する部分であり、信号物質の生成に寄与する部分と
は、具体的には、通常の免疫反応等で標識剤として使用
されている各種酵素等により構成される部分である。

【００３１】すなわち、信号物質発生体は、１つの側面
として、分析対象物とそれに対する特異結合物質との特
異結合反応に参加し、そのマトリクス内での分布が分析
対象物量に応じて変化する物質であり、もう１つの側面
として、信号物質の生成反応を司る物質であるといえ
る。

【００３２】信号物質とは、信号物質発生体の寄与する
反応によって生成される物質であり、後記する検出部に
おいて、自身が所定の信号を発するあるいは他の物質に
信号を発生させる物質である。

【００３３】信号物質の発生に関与する物質とは、字義
通りの解釈をすると、前記信号物質発生体も含むが、本
発明においては、信号物質発生体以外の、主に、信号物
質の前駆物質、および、該前駆物質を信号物質に変化さ
せるに寄与する物質を指す。電子メディエータとは、本
発明においては、酵素反応と電極反応との間を媒介し
て、両反応間の電子移動を可能ならしめる酸化還元化合
物の総称して用いられており、その中には、両反応いず
れにおいても実質上不可逆な副生成物を生じず、両反応
の間をサイクリング可能な物質を含んでいる。

【００３４】また、信号の発生に関与する物質とは、前
記信号物質が直接には信号を発生せず、他の物質に信号
を発生させる物質である場合に、あるいは、前記信号物
質が他の物質と協同して信号を発生する物質である場合
に、信号の発生に寄与する物質の内、前記信号物質を除
いた物質をいう。

【００３５】信号としては、電気化学的に計測可能な電
子移動、蛍光光度計で計測可能な蛍光、発光光度計で計
測可能な発光、目視判定および色差計で計測可能な呈色
等が例示される。

【００３６】特異結合物質、信号物質発生体、信号物質
の発生に関与する物質および信号の発生に関与する物質
は、あらかじめ反応系内に存在してもよいし、分析対象
物に先だってあるいは同時にあるいは試料の導入後に反
応系内に導入されてもよい。あらかじめ反応系内に存在
する場合は、反応系内に均質に分布していてもよいし、
反応系内の特定の箇所に備えられ、液性試料または試料
以外の展開液によって拡散するものであってもよい。

【００３７】本発明の装置において、試料導入部とは、
試料が導入される部分を指す。

【００３８】マトリクスとは、分析対象物および信号物
質発生体が展開される場をいう。例えば特異結合物質が
不溶化されて、特異結合反応が試料の流れ方向に分布を
もって起こる場をいい、具体的な例を挙げれば分析対象
物と信号物質発生体が、特異結合物質に対して競合的に
特異結合するか、分析対象物が特異結合物質に結合し、
さらに信号物質発生体が分析対象物にサンドイッチ型に
特異結合する等して、特異結合反応が試料の流れ方向に
分布をもって起こる場をいう。特異結合反応等が試料の
流れ方向に分布をもって起こる場であるマトリクスは、
特異結合物質が不溶化されている例に限定されるもので
はなく、特異結合反応に伴って起こる分子量変化等を検
知してそれを分布として示すものであってもよい。

【００３９】検出部とは、信号を検出する部位であり、
肉眼での目視で、もしくは、信号の性質に応じた好適な
外部の計測器で、信号の変調の程度を計測できる部位で
ある。

【００４０】吸収部は、吸水性材料で構成され、必要に
応じ、前記信号物質の発生に関与する物質等を保持する
部位である。また、導入された試料液を吸収保持する役
割もはたす。

【００４１】以上のように定義された用語により、本発
明をさらに具体的に説明する。

【００４２】本発明の特異結合分析方法は、特異結合反
応をマトリクス内で行わせる点、操作上Ｂ／Ｆ分離を行
うことなしに、特異結合反応によってマトリクス内での
分布が変化した信号物質発生体によって発生される信号
物質を媒介とする信号を、検出部でのみ検出できる点に
特徴を有する。なお、ここで、特異結合反応とは、分析
対象物とそれに特異的に結合する特異結合物質（含信号
物質発生体）との反応、分析対象物に特異的に結合する
特異結合物質と信号物質発生体との反応等をいう。より
詳細には、信号物質発生体の標識によって発生され、
かつ、検出部においてのみ検出可能な信号を発生するあ
るいは発生させる信号物質を用いる場合、検出部におい
て観測される信号は、標識と検出部との距離（すなわち
信号物質の拡散距離）に応じて変調されること、さら
に、分析対象物と該分析対象物と特異的に結合する物
質（特異結合物質）との少なくとも１つの特異結合反応
によって、検出部に対する相対的な信号物質発生体すな
わち標識の位置分布を分析対象物濃度に応じて変化でき
ることを見いだし、本発明の特異結合分析方法とこの方
法の実施に好適な装置の考案に至った。

【００４３】本発明の特異結合分析方法は、特異結合反
応によって、試料中の分析対象物の量に応じて、信号物
質発生体の検出部に対する距離分布を変化させ、この分
布の変化を測定する。分布を変化させる方法は、種々の
方法が可能であり、以下に記載する方法は一例にすぎな
い。また、分布が測定可能であるためには、以下の要件
が必要を満たしていることが望ましい。

【００４４】（ａ）検出部に対する信号物質発生体の距
離の分布が、試料中の分析対象物量の予測される変動範
囲に対して、信号物質の物質移動が信号発生の律速とな
る大きさで変化すること。後に説明する実施例３および
４で実証するような酵素−基質−および酵素−基質−電
子メディエータの場合には、検出部と信号物質発生体と
の間の直線距離でＬ（図３参照）＝約０〜５００μｍま
たはＬ＝約０〜１０００μｍのオーダーである。ただ
し、この大きさは、マトリクスを構成する材料、信号物
質および信号物質発生体の特性、検出部もしくは検出原
理の性能によって変えうる。

【００４５】（ｂ）試料中の分析対象物量に応じて、距
離分布の変化を観測可能なように、信号物質発生体に混
在する遊離の酵素を可能な限り少なくする。そして、検
出部の検出感度と同程度のオーダーの濃度となるように
信号物質発生体を添加する。例えば、後に説明する実施
例１（１）、５（１）および８（１）において、信号物
質発生体（酵素標識抗体）の調製時に、遊離の酵素を除
去している。 （ｃ）信号物質が発生するあるいは発生させる信号の検
出に必須な成分、もしくは部材の少なくとも１つが検出
部に実質的に不動化されている。例えば、後に説明する
実施例１、５、６および８で用いているような電極ある
いは酵素電極は、それ自体が不動化された必須部材から
構成されており、検出部として好適な例である。

【００４６】本発明方法の原理を、図１に基づいて説明
する。なお、図１に示す装置は、試料を導入すると、試
料は、試料導入部（ａ）からマトリクス（ｂ）へ導入さ
れ、検出部（ｃ）まで達して液流が実質上停止するよう
に構成されている。図１は、マトリクス（ｂ）に導入さ
れ、そこで特異結合反応を行なった後のある時点におけ
る１つの信号物質発生体１１の位置を示す。なお、１２
は信号物質の発生に関与する物質であり、また、矢印は
試料等の移動方向を示すものである。

【００４７】図１の（１）は、信号物質発生体１１がマ
トリクス（ｂ）上部にトラップされた、あるいは、移動
速度が小さいために、マトリクス（ｂ）上部にとどまっ
ている状態を、また、図１の（２）は、信号物質発生体
１１がマトリクス（ｂ）下部に到達した状態を示す。

【００４８】信号物質発生体１１が図１の（１）の状態
にある場合、信号物質の発生に関与する物質１２の少な
くとも一部は、距離ｘ₁ を拡散によって信号物質発生体
１１に到達する。そして、信号物質の発生に関与する物
質１２は、信号物質発生体１１の作用を受けて、信号物
質１３となる。この信号物質１３の少なくとも一部は、
距離ｙ₁ を拡散によって検出部（ｃ）に到達する。そし
て、検出部（ｃ）にて信号を発生させる。

【００４９】一方、信号物質発生体１１が図１の（２）
の状態にある場合は、信号物質の発生に関与する物質１
２の少なくとも一部が信号物質発生体１１に到達するの
に要する拡散距離ｘ₂ は前記ｘ₁ より、また、発生した
信号物質１３の少なくとも一部が検出部（ｃ）に到達す
るのに要する拡散距離ｙ₂ は前記ｙ₁ より、共に短いた
め、信号物質発生体１１が図１の（１）の状態にある場
合に比べ、信号物質１３が検出部（ｃ）に到達する確立
が高く、信号発生率（信号強度）および／または信号発
生速度が大きい。

【００５０】本発明方法は、この図１の（１）の状態に
ある信号物質発生体１１に係る信号と、図１の（２）の
状態にある信号物質発生体１１に係る信号との信号発生
率（信号強度）および／または発生速度の差を利用し
て、分析対象物量あるいは分析対象物の有無を測定する
ものである。

【００５１】なお、信号物質１３が直接には信号を発生
しない場合は、図８に示すように、さらに、信号の発生
に関与する物質１５が検出部（ｃ）近傍に到達あるいは
存在することを必要とするが、基本的原理は図１の場合
と同様である。

【００５２】本発明方法によって測定される信号の強度
と信号物質発生体１１のマトリクス（ｂ）への導入開始
からの時間との関係の一例は、図２に示す通りである。
例えば図１の（１）の状態にある信号物質発生体１１に
係る信号は、図１の（２）の状態にある信号物質発生体
１１に係る信号より、遅い初速度で発生する。そして、
この信号物質発生体１１のマトリクス（ｂ）内での分布
は、後記するように、試料中の分析対象物量によって規
定される。すなわち、試料中の分析対象物量によって、
図１の（１）の状態にある信号物質発生体１１と、図１
の（２）の状態にある信号物質発生体１１との比率が変
化する。検出部（ｃ）で計測される信号は、図１の
（１）および（２）の状態等にある信号物質発生体１１
に係る信号の総和となるが、図２に示すように、図１の
（１）の状態にある信号物質発生体１１の比率が高けれ
ば、信号の初速度は遅くなり、図１の（２）の状態にあ
る信号物質発生体１１の比率が高ければ、信号の初速度
は速くなる。従って、信号の初速度を測定すれば、それ
を試料中の信号物質発生体の分布の変化すなわち分析対
象物量に換算することができる。

【００５３】なお、信号の測定は、図２の場合について
述べると、任意の時間ｔでの信号強度（ｓ₁ あるいはｓ
₂ ）であってもよいし、逆に、特定の信号強度に達する
までの時間ｔであってもよい。あるいは、図２中斜線で
示される、時間ｔまでの信号強度の積分値であってもよ
い。さらに、特定の２つの時間でそれぞれ信号強度を測
定し、その信号強度の差の値を算出してもよい。なお、
これらは、信号の測定の一例であり、信号物質発生体１
１のマトリクス（ｂ）内での信号物質発生体の分布の変
化による信号の変調を計測できる測定であれば、いずれ
の測定も利用できる。

【００５４】以上の説明を数学的に模式化し、信号変調
の見積りをすると、次のようになる。

【００５５】図３は、検出部（ｃ）から距離Ｌ離れた所
に信号物質発生体１１が局在するとした場合の本発明方
法を説明するための概念図である。図３では、例えば電
極などの検出部（ｃ）から距離Ｌ（μｍ）離れたところ
に、例えば酵素標識物などの信号物質発生体１１が局在
し、擬一次反応定数ｋ（１／ｓｅｃ）の速度で連続的に
信号物質１３を発生するとする。発生した信号物質１３
は拡散定数Ｄ（ｃｍ²／ｓｅｃ）を有しており、拡散に
よって検出部表面に到達した信号物質１３はすべて、例
えば電流値などの信号Ｓを発生するとする。信号物質１
３の発生反応が擬一次反応であることを仮定しているこ
と、検出部表面に到達した信号物質１３はすべて信号ｓ
を発生するとしていること、信号物質発生に関与する物
質や信号の発生に関与する物質など他の要素の存在を無
視していること、および、信号発生後に信号物質がどう
なるかを考慮していないことなど、これはかなり簡略化
された模式であり、本発明はこの仮想的な模式に限定さ
れるものではないが、この仮想的な模式は本発明におけ
る「信号物質発生体１１によって発生され、かつ、検出
部（ｃ）においてのみ検出可能な信号を発生する信号物
質１３を媒介として、信号物質発生体１１のマトリクス
内での分布の変化を検出部（ｃ）における信号ｓの変調
の程度として計測する」という基本的な状況をよく反映
していると思われる。ここで、信号物質１３が十分な過
電圧が印加されている検出部（電極）表面において酸化
還元反応を起こし、信号ｓとして電流Ｉを観測している
とした場合で例示すると、図４に示すように、図３に示
す仮定に基づいた距離Ｌに応じた検出部（ｃ）で検出さ
れる電流信号の理論的予測図を描くことができ、距離Ｌ
によって図４に示す電流信号の変調が予測できる。本発
明者はこのような信号変調の可能性を予測し、具体的に
は実施例３および実施例４のような方法でこれを立証
し、このような信号変調を特異結合分析方法に応用すれ
ば極めて有用であることを見いだし、具体的な特異結合
分析装置の考案に至ったものである。

【００５６】すなわち、先の例では、信号物質発生体１
１が局在しており、その局在位置と電極との間の距離を
変化させた場合の信号変調という、極めて片寄った分布
を想定していた。しかし、信号物質１３の拡散など、一
般に物質拡散は重ね合わせることができるから、免疫ク
ロマトグラフ法での信号物質発生体１１の連続曲線的な
分布の場合も、微小体積に分割して考えることができ
る。個々の微小体積中の信号物質発生体１１に由来する
信号ｓは先の例のような挙動を示す。それ故、信号物質
発生体１１の連続曲線的な分布の場合の信号ｓは、その
分布を構成している個々の微小体積の信号物質発生体１
１に由来する信号ｓを重ね合わせた総和となる。従っ
て、特異結合反応によって信号物質発生体１１の連続曲
線的な分布を変化させれば、その総和の信号ｓが変調を
受けることとなる。逆に、このような信号物質発生体１
１の分布変化を感受性よく信号変調として検出できる位
置に検出部（ｃ）を設置すれば、優れた特異結合分析装
置を製造できる。後に示す実施例１、実施例５、実施例
６、および実施例８はその具体例であるが、マトリクス
（ｂ）の形状およびマトリクス（ｂ）と検出部（ｃ）と
の位置関係はこの他にも各種可能であり、これら実施例
に限定されるものではない。また、先の説明および実施
例においては、電気化学的信号検出例を例示している
が、信号物質１３が検出部（ｃ）において発生するある
いは発生させる信号ｓであれば、いずれの信号ｓであっ
ても、本発明の方法および装置は利用できる。

【００５７】次に、抗原抗体反応を代表例として、本発
明方法を実施した際の、試料中の分析対象物量による信
号物質発生体のマトリクス内での分布の変化を、図面に
基いて説明する。

【００５８】図５は、本発明方法の一態様であって、分
析対象物１４を競合法によって測定する場合の、マトリ
クス（ｂ）内における分析対象物１４と信号物質発生体
１１との分布を示すものである。なお、分析対象物１４
は抗原であり、マトリクス（ｂ）には、該抗原に対する
抗体すなわち第１の特異結合物質が不溶化されているも
のとする。また、信号物質発生体１１は、第１の特異結
合物質に対して分析対象物と競合する標識抗原とする。
信号物質発生体１１は、試料とともにマトリクス（ｂ）
内に導入される。

【００５９】図５の（１）は、試料中に分析対象物１４
が含まれていなかった場合を示す。この場合は、信号物
質発生体１１は、マトリクス（ｂ）上部（試料の流れ方
向でみて上流側）に不溶化されている抗体と反応し、全
て、マトリクス（ｂ）上部にトラップされる。この場
合、信号物質発生体１１と検出部（ｃ）との間の距離は
長いので、所定の時間経過後（まで）に測定される信号
は非常に小さいか０である。

【００６０】図５の（２）および（３）は、試料中に分
析対象物１４が含まれていた場合を示す。なお、同図か
ら明らかなように、試料中の分析対象物１４の量は、図
５の（３）＞図５の（２）である。この場合は、試料の
流れに沿って、信号物質発生体１１と分析対象物（抗
原）１４とが、競合して、マトリクス（ｂ）に不溶化さ
れている抗体と反応する。そして、分析対象物１４の量
の増大とともに、信号物質発生体１１は、不溶化抗体と
の結合を阻害される頻度が増大し、マトリクス（ｂ）の
上部から中央部にかけて（図５の（２）の場合）、ある
いは、上部から下部にかけて（図５の（３）の場合）ト
ラップされる。さらに分析対象物１４が多い場合には、
信号物質発生体１１の一部は、マトリクス（ｂ）にトラ
ップされずに検出部（ｃ）に到達する。

【００６１】図５の（２）の場合、信号物質発生体１１
と検出部（ｃ）との間の距離は、中距離〜長距離であ
り、また、図５の（３）の場合は、短距離〜長距離であ
る。従って、所定の時間経過後（まで）に測定される信
号は、図５の（２）では中程度、図５の（３）では大と
なる。

【００６２】すなわち、図７の（１）に示すように、分
析対象物１４の量に応じて信号強度は大となる。

【００６３】図６は、本発明方法の一態様であって、分
析対象物１４をサンドイッチ法によって測定する場合
の、マトリクス（ｂ）内における分析対象物１４と信号
物質発生体１１との分布を示すものである。なお、分析
対象物１４は抗原であり、マトリクス（ｂ）には、第１
の特異結合物質である該抗原のエピトープＡに対する抗
体が不溶化されているものとする。また、信号物質発生
体１１は、第２の特異結合物質である該抗原のエピトー
プＢに対する抗体に標識剤が結合されてなる標識抗体と
する。信号物質発生体１１は、試料とともにマトリクス
（ｂ）内に導入される。

【００６４】図６の（１）は、試料中に分析対象物１４
が含まれていなかった場合を示す。この場合は、マトリ
クス（ｂ）に分析対象物１４である抗原がトラップされ
ないために、信号物質発生体１１はマトリクス（ｂ）に
トラップされず、マトリクス（ｂ）の下部（試料の流れ
方向でみて下流側）まで運ばれる。この場合、信号物質
発生体１１と検出部（ｃ）との間の距離は短いので、所
定の時間経過後（まで）に測定される信号は大である。

【００６５】図６の（２）および（３）は、試料中に分
析対象物１４が含まれていた場合を示す。なお、同図か
ら明らかなように、試料中の分析対象物１４の量は、図
６の（３）＞図６の（２）である。

【００６６】この場合は、マトリクス（ｂ）に抗体を介
してトラップされた分析対象物（抗原）１４の量に対応
する量の信号物質発生体１１は、分析対象物１４と結合
してマトリクス（ｂ）の主に上部にトラップされるが、
過剰な信号物質発生体１１は、マトリクス（ｂ）にトラ
ップされず、マトリクス（ｂ）の下部にむかって運ばれ
る。

【００６７】従って、分析対象物１４が信号物質発生体
１１よりも少ない図６の（２）の場合は、信号物質発生
体１１は、マトリクス（ｂ）の上部〜中央部にかけて、
あるいは、上部〜下部にかけて分布するようになる。

【００６８】また、マトリクス（ｂ）内に不溶化されて
いる抗体量および信号物質発生体１１に対し、至適量の
分析対象物１４が存在する図６の（３）の場合は、信号
物質発生体１１は、主に、マトリクス（ｂ）の上部にト
ラップされる。

【００６９】なお、分析対象物１４がさらに多い場合に
は、分析対象物１４がマトリクス（ｂ）の上部から下部
にかけてトラップされることとなり、その結果、信号物
質発生体１１も、マトリクス（ｂ）の上部から下部にか
けてトラップされるので、信号物質発生体１１の分布
は、図６の（２）に近似したものとなる。この場合は、
測定範囲外である。

【００７０】図６の（２）の場合、信号物質発生体１１
と検出部（ｃ）との間の距離は、中距離〜長距離、ある
いは短距離〜長距離であり、図６の（３）の場合は長距
離である。従って、所定の時間経過後（まで）に測定さ
れる信号は、図６の（２）では中程度、図６の（３）で
は非常に小さいか０となる。

【００７１】すなわち、図７の（２）に示すように、分
析対象物１４の量に応じて信号強度は小となり、測定範
囲外では、再び信号強度が上昇する。

【００７２】上記説明により、本発明方法における分析
対象物１４の量と信号物質発生体１１のマトリクス
（ｂ）内での分布状態との関係が明らかとなったと考え
るが、ここで、さらに、本発明方法が最もよく適合する
免疫反応系の一成分が分析対象物である場合について、
マトリクス（ｂ）内での免疫反応（特異結合反応）の例
を示す。

【００７３】その第一は、分析対象物がハプテン様の低
分子量物質の場合に好適な例である。このような場合、
マトリクス（ｂ）には、分析対象物と同じ物質あるいは
その類縁物質を不溶化させておき、信号物質発生体とし
ては、特異結合物質である抗ハプテン抗体と標識剤（例
えば信号物質を発生させる反応に関与する酵素）との結
合体を用い、試料中の分析対象物と不溶化された分析対
象物（あるいはその類縁物質）とを、信号物質発生体中
の抗体部分に対して、競合的に反応させるとよい。その
結果、分析対象物量と信号強度との関係は、図７の
（１）に示すようになる。

【００７４】第二は、分析対象物が複数の抗体と同時に
結合しうる高分子量物質の場合に好適な例である。この
ような場合、マトリクス（ｂ）には、分析対象物の第１
の特異結合物質であるエピトープＡに対する抗体を不溶
化しておき、これに分析対象物を反応させた後、分析対
象物の第２の特異結合物質であるエピトープＢに対する
抗体と標識剤との結合体を信号物質発生体１１として分
析対象物に反応させるとよい。すなわち、試料中の分析
対象物をサンドイッチ型に反応させるのである。その結
果、分析対象物量と信号強度との関係は、図７の（２）
に示すようになる。

【００７５】第三は、やはり、分析対象物がハプテン様
の低分子量物質の場合に好適な例である。このような場
合、マトリクス（ｂ）には、第１の特異結合物質である
抗ハプテン抗体を不溶化しておき、信号物質発生体とし
ては、第１の特異結合物質に対して分析対象物と競合す
る物質である分析対象物と同じ物質あるいはその類縁物
質と標識剤との結合体を用い、試料中の分析対象物と信
号物質発生体とを、不溶化された抗ハプテン抗体に対し
て競合的に反応させるとよい。その結果、分析対象物量
と信号強度との関係は、図７の（１）に示すようにな
る。

【００７６】第四も、分析対象物がハプテン様の低分子
量物質の場合に好適な例である。このような場合、マト
リクス（ｂ）には、特異結合物質に対して分析対象物と
競合する物質である分析対象物と同じ物質あるいはその
類縁物質を不溶化させておき、かつ、特異結合物質であ
る抗ハプテン抗体を遊離の状態で存在させておく。そし
て、試料中の分析対象物と不溶化された分析対象物（あ
るいはその類縁物質）とを、遊離の抗ハプテン抗体に対
して競合的に反応させ、次に、抗−抗ハプテン抗体（第
二抗体）と標識剤との結合体からなる信号物質発生体を
結合させるとよい。その結果、分析対象物量と信号強度
との関係は、図７の（１）に示すようになる。

【００７７】ところで、上記説明では、マトリクス
（ｂ）に抗体を不溶化させ、信号物質発生体や分析対象
物を該抗体に直接あるいは間接に結合させたが、信号物
質発生体や分析対象物をマトリクス（ｂ）に結合させな
くても、すなわち先の例における抗体がマトリクス
（ｂ）に不溶化されていなくても、分析対象物の量に応
じて信号物質発生体のマトリクス（ｂ）内での分布を変
化させることは可能であり、そのような例も、本発明方
法に含まれる。

【００７８】例えば、分析対象物が微生物（例えば病原
性真菌等）であり、信号物質発生体が抗微生物抗体（抗
病原性真菌抗体等）と標識剤とが結合してなる標識特異
結合物質である場合、分析対象物（微生物）は、信号物
質発生体に比べてかなり大であるため、分析対象物と信
号物質発生体との複合体と、フリーの信号物質発生体と
では、マトリクス（ｂ）内での移動速度、すなわち到達
位置に大きな差を生じる。マトリクス（ｂ）として、例
えば多孔性材質のものを用い、そのメッシュ（ポアサイ
ズ）を適正に選択することによって、あるいは、ゲル状
もしくはゾル状担体を用い、その粘度を微生物サイズに
応じて適正に選択することによって、この到達位置の差
異を明瞭化できる。従って、分析対象物は、マトリクス
（ｂ）に結合されないが、そのマトリクス（ｂ）内での
分布は局在化され、分析対象物と特異結合反応しうる信
号物質発生体は、マトリクス（ｂ）内で分析対象物量に
応じた分布をするようになる。そして、主に検出部
（ｃ）近傍に到達したフリーの信号物質発生体が関与す
る信号を測定することで、分析対象物を定量できる。

【００７９】また、別の例として、フリーの標識抗体と
フリーの分析対象物との自発的な沈降性結合物（免疫沈
降物）形成（いわゆるゲル内免疫沈降反応）を利用した
測定があげられる。この場合には、分析対象物の量に応
じて免疫沈降物の形成量が変化し、また、形成された免
疫沈降物は、多孔性材質および／またはゲル状担体から
なるマトリクス（ｂ）の上部にトラップされるが、免疫
沈降反応に関与しなかったフリーの標識抗体は、マトリ
クス（ｂ）の内部へ侵入し得るため、試料中の分析対象
物量に応じて信号物質発生体の分布が変化する。

【００８０】あるいは、マトリクス（ｂ）として、適当
な大きさの空孔のものを用いることにより、マトリクス
（ｂ）上部に分析対象物（微生物）をトラップさせ、そ
れにより、先に説明した図６のように、信号物質発生体
を分析対象物量に応じてマトリクス（ｂ）内に分布させ
ることもできる。

【００８１】続いて、本発明方法における信号の発生に
ついて、具体的に説明する。信号物質発生体が、酵素標
識特異結合物質である場合を代表例として、図１、図８
および下記表１に基づいて説明する。

【００８２】

【表１】

【００８３】

【表２】

【００８４】表１は、本発明方法における信号の発生
を、典型的な５例について説明したものである。なお、
表１中の各欄において、上段には、本明細書中の用語
を、また下段には、上段の用語で示されるものの具体例
を示した。

【００８５】まず、であるが、これは検出部（ｃ）が
電極であり、信号が電子移動である例である。図１に基
づいて説明する。この場合は、マトリクス（ｂ）内の信
号物質発生体（α−ガラクトシダーゼ標識特異結合物
質）１１に、信号物質の発生に関与する物質（ｐ−アミ
ノフェニル−α−Ｄ−ガラクトシド）１２が到達する
と、信号物質の発生に関与する物質１２が信号物質（ｐ
−アミノフェノール）１３に変化する。この信号物質１
３が拡散によって検出部（電極）（ｃ）に到達すると、
信号物質１３は酸化（ｐ−ベンゾキノンモノイミンとな
る）され、同時に酸化電流という信号（電子移動）を発
生する。そこで、電気量や電流値として、信号である電
子移動に係る数値を計測すればよい。

【００８６】次にであるが、これも、検出部（ｃ）が
電極であり、信号が電子移動である例である。ただし、
電子の受け渡しのための電子メディエータを用いてい
る。これも、図１に基いて説明する。

【００８７】この場合は、マトリクス（ｂ）内の信号物
質発生体（グルコースオキシダーゼ標識特異結合物質）
１１に、信号物質の発生に関与する物質（グルコースと
電子メディエータであるフェリシニウムイオン）１２が
到達すると、フェリシニウムイオンが還元されてフェロ
センに変化する。このフェロセンが信号物質１３であ
る。この信号物質１３が拡散によって検出部（電極）
（ｃ）に到達すると、信号物質１３は酸化（再び酸化状
態のフェリシニウムイオンとなる）され、同時に酸化電
流という信号（電子移動）を発生する。また、この場合
は、電子メディエータ間の電子ホッピング等による電子
自体の拡散伝達と、その結果検出部（ｃ）において発生
する信号（電子移動）の測定も考えられる。

【００８８】は、検出部（ｃ）が酵素電極であり、信
号が電子移動である例である。この例では、酵素電極の
性能を上げるために、酵素電極部分に、電子メディエー
タおよび／または導電性高分子化合物（ポリピロール、
ポリチオフェンなど）を構成成分として含ましめること
も可能である。酵素電極の構成に関わらず、信号物質が
検出部（酵素電極）と反応して信号（電子移動）を発生
するあるいは発生させることに変りない。なお、好適な
信号物質としては、酵素電極に対する基質、補因子ある
いは補酵素が例示できる。また、信号物質が他の物質と
協同して信号を発生する場合、すなわち、酵素電極が信
号物質と他の信号の発生に関与する物質の存在下で信号
を発生する場合には、信号の発生に関与する物質を検出
部（ｃ）および／または検出部（ｃ）近傍に存在させて
おけばよい。これを図８に基づいて以下に説明する。

【００８９】この場合は、マトリクス（ｂ）内の信号物
質発生体（グルコースオキシダーゼ標識特異結合物質）
１１に、信号物質の発生に関与する物質（グルコースと
溶存酸素）１２が到達すると、信号物質（過酸化水素）
１３が生成される。この信号物質１３が、検出部（パー
オキシダーゼ電極）（ｃ）に到達すると、電子メディエ
ータを介してあるいは介さずに、電子を電極から受け取
り、信号の発生に関与する物質（水素イオン）１５と反
応して信号物質１３自身は還元される。その際、検出部
（パーオキシダーゼ電極）（ｃ）において、信号（電子
移動）が発生する。

【００９０】は、検出部（ｃ）が酵素（パーオキシダ
ーゼ）を実質上不動化してなる部分であり、信号が発光
である例である。この例も、信号物質１３自身は信号を
発生しない。図８に基づいて説明する。

【００９１】この場合は、マトリクス（ｂ）内の信号物
質発生体（グルコースオキシダーゼ標識特異結合物質）
１１に信号物質の発生に関与する物質（グルコースと溶
存酸素）１２が到達すると、信号物質（過酸化水素）１
３が生成される。この信号物質１３が、信号の発生に関
与する物質（ルミノール）１５と共に検出部（ペルオキ
シダーゼ不動化部位）（ｃ）に到達すると、信号の発生
に関与する物質１５を変化させ、信号（発光）を発生さ
せる。従って、所定時間経過後に、あるいは所定時間経
過後までの発光強度を測定すればよい。

【００９２】は、検出部（ｃ）が酵素（パーオキシダ
ーゼ）を実質上不動化してなる部分であり、信号が呈色
である例である。この例も、信号物質１３自身は信号を
発生しない。図８に基づいて説明する。

【００９３】この場合は、マトリクス（ｂ）内の信号物
質発生体（ウリカーゼ標識特異結合物質）１１に信号物
質の発生に関与する物質（尿酸塩と溶存酸素）１２が到
達すると、信号物質（過酸化水素）１３が生成される。
この信号物質１３が、信号の発生に関与する物質（オル
トジアニシジン）１５と共に検出部（パーオキシダーゼ
不動化部位）（ｃ）に到達すると、信号の発生に関与す
る物質１５を発色体に変化させ、信号（呈色）を発生さ
せる。従って、所定時間経過後に、あるいは所定時間経
過後までの呈色を、吸光度、反射光、肉眼等で測定すれ
ばよい。

【００９４】上記のおよびにおいて、信号の発生に
関与する物質（酵素反応の基質に相当）と、検出部
（ｃ）を構成する不動化される物質（酵素）は、いずれ
を信号の発生に関与する物質としてもよいし、その場合
他方は検出部（ｃ）を構成する不動化される物質とす
る。すなわち基質と酵素は相互に交換されてもよい。あ
るいは、両者共に、不動化することによって、検出部
（ｃ）を構成してもよい。しかし、少なくとも酵素を不
動化した方が、反応効率に優れるのでよい。

【００９５】また、上記の〜において、信号物質の
発生に関与する物質（酵素反応の基質に相当、ただし、
溶存酸素ではない方）と信号物質発生体を構成する標識
剤（酵素）も、交互に交換されてもよい。しかし、この
場合も、酵素を標識剤として用いた方が、反応効率に優
れるのでよい。

【００９６】本発明方法において、信号物質の発生に好
適な酵素（前記表１における信号物質発生体の一構成成
分、標識）と、該酵素の基質（前記表１における信号物
質の発生に関与する物質）との組合せの一例を、下表２
に示す。

【００９７】

【表３】

【００９８】表２に示した組合せは、前記表１中のお
よび〜の場合に用いることができる。しかし、の
場合（信号物質の電極上での酸化還元反応によって信号
を発生させる例）は、発生される信号物質がｐ−アミノ
フェノール、ハイドロキノン、ｐ−クレゾール等である
組合せを用いるのがよい。これらは、銀・塩化銀電極に
対して十数百ｍＶ程度の電位を印加すれば、電極への電
子移動が生じる。

【００９９】また、前記表１中のの場合には、表２中
の基質として、Ｏ₂ のかわりに、電子メディエータとし
て知られる酸化還元物質（酸化状態）を用いる。それに
より、表１に示すように反応が行なわれ、信号物質（還
元状態の電子メディエータ）が発生され、この信号物質
から、と同様に、電子メディエータに応じた電位を印
加した電極に電子が放出され、電子メディエータ自身は
酸化状態へ戻る。

【０１００】電子メディエータの候補としては、金属イ
オン、ルテニウム錯体化合物、フェロセン化合物、キノ
ン化合物、ビオロゲン化合物、ポルフィリン誘導体、チ
トクロムｃ等の蛋白質など数多く知られている。この中
には、水素供与体として酵素反応に関わる化合物も含ま
れる。下表３に代表例を挙げるが、本発明ではこれらの
化合物の化学修飾物や他の好適な電子メディエータも利
用可能である。また、電子メディエータは、信号物質発
生体によって酸化状態から還元状態に変化するものに限
定されず、逆に、還元状態から酸化状態に変化するもの
であってもよい。

【０１０１】

【表４】

【０１０２】前記表１中の〜の例のように、二段階
の酵素反応を行なわせる場合であって、信号は、一段目
の酵素反応によって発生された信号物質が他の物質に働
きかけて生成される場合の二段目の反応に関与する物質
は、次の通りである。

【０１０３】前記表１中のには、検出部（ｃ）が酵素
電極である例を示したが、この場合は、一段目の反応に
よって発生される信号物質の種類に応じ、酵素電極の酵
素が限定される。

【０１０４】例えば、一段目の反応で発生される信号物
質が過酸化水素である場合は、検出部（ｃ）を西洋わさ
び由来パーオキシダーゼなどのパーオキシダーゼを固定
化した酵素電極( J. E. Frew et al, J. Electoanal. C
hem., Vol. 201, 1 - 10, 1986 ; R.M. Paddock & E.
F. Bowden, J. Electroanal. Chem., Vol. 260, 487 -4
94, 1989 ; Ulla Wollenberger et al, Analytical Let
ters, Vol.23, 1795 -1808, 1990 など参照）とし、ま
た、例えば、信号物質がＮＡＤ⁺ あるいはＮＡＤＨであ
る場合は、検出部（ｃ）を好熱菌由来のジアフォラーゼ
Ｉを固定化した酵素電極( K. Miki et al, Analytical
Sciences, Vol. 5, 269 - 274, 1989 など参照）とすれ
ばよい。

【０１０５】このような検出部（ｃ）を酵素電極とする
場合は、表１に示したように、信号の発生に関与する物
質として、電子メディエータを用いる場合がある。電子
メディエータについては、先に表３に例示した通りであ
る。

【０１０６】なお、酵素電極に類似のものとして、化学
修飾電極が知られており、これらの酵素電極および化学
修飾電極については、「 R. W. Murray, Chemically Mod
ified Electrode, Electroanalytical Chemistry, Volu
me 13, 191 - 368, Marcel Dekker, Inc., New York, 1
984 」、 「 K. Nakamura, M. Aizawa & O. Miyawaki, Ele
ctroenzymology Coenzyme Regeneration, Springer - V
erlag, Berlin, 1988」、 「 V. J. Razumas, J. J. Jasai
tis & J. J. Kulys, Bioelectrochemistry and Bioener
getics, Volume 12, 297 - 322, 1984 」 等に記載され
ている。

【０１０７】また、前記表１中のの場合のように、信
号が蛍光や発光である場合は、一段目の反応によって発
生される信号物質の種類に応じ、二段目の反応に関与す
る物質（酵素および酵素の基質である蛍光性（発光性）
物質）が限定される。

【０１０８】例えば信号が蛍光であり、信号物質が過酸
化水素の場合は、二段目の反応に関与する物質が、パー
オキシダーゼと、４−ヒドロキシフェニル酢酸、もしく
は、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸との
組合せである例がある。

【０１０９】また、信号が発光である場合には、次のよ
うな組合せが例示される。すなわち、信号物質がＡＴＰ
の場合は、二段目の反応に関与する物質として、ホタル
ルシフェラーゼと、ルシフェリンおよびＭｇ²⁺との組合
せが例示される。また、信号物質がＮＡＤＨの場合は、
二段目の反応に関与する物質として、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：
ＦＭＮオキシドレダクターゼおよび発光バクテリア由来
のルシフェラーゼと、ＦＭＮおよびテトラデカナールな
どの飽和長鎖脂肪族アルデヒドとの組合せが例示され
る。

【０１１０】このような例において、検出部（ｃ）は、
二段目の反応に関与する物質のうちのいずれか１種以上
を不動化させてなるもので構成されるが、反応効率の観
点からは、酵素を不動化させてなるものであるのがよ
い。

【０１１１】なお、蛍光や発光を信号とする場合には、
前記表１中ののように、信号物質自体から信号を発生
せしめることも可能である。すなわち、例えば、信号物
質の発生に関与する物質として、ルシフェリンの誘導体
（例えばＤ−ルシフェリン−ｏ−リン酸）、信号物質発
生体を構成する標識剤として、アルカリフォスファター
ゼを選択し、信号物質であるルシフェリンを発生させ、
ＡＴＰおよびＭｇ²⁺の存在下に、ルシフェリンにルシフ
ェラーゼを作用させれば、発光（信号）が生じる。この
場合、検出部（ｃ）は、ＡＴＰ、Ｍｇ²⁺およびルシフェ
ラーゼのうちのいずれか１種以上を不動化させてなるも
ので構成されるが、反応効率の観点から、ルシフェラー
ゼを不動化させてなるものであるのが好適である。

【０１１２】さらに、前記表１中ののように、信号が
呈色である場合も、一段目の反応によって発生される信
号物質の種類に応じ、二段目の反応に関与する物質（酵
素および酵素の基質である発色体の前駆物質）が限定さ
れる。

【０１１３】例えば信号物質が過酸化水素の場合には、
二段目の反応に関与する物質が、パーオキシダーゼと、
呈色物質の前駆物質である、５−アミノサリチル酸、ｏ
−ジアニシジン、２，２′−アジノジ−（３−エチルベ
ンズチアゾリン−６−スルホン酸）ジアンモニウム塩
（ＡＢＴＳ）、３−メチル−２−ベンゾチアゾリンヒド
ラゾン（ＭＢＴＨ）と３−（ジメチルアミノ）安息香酸
（ＤＭＡＢ）の混合物、ｏ−トリジン、３，３′−ジア
ミノベンジジン（ＤＡＢ）、１，２−フェニレンジアミ
ン、３，３′，５，５′−テトラメチルベンジジン等と
の組合せである例がある。

【０１１４】また、信号物質がＮＡＤＨの場合には、二
段目の反応に関与する物質が、ジアフォラーゼと、呈色
物質の前駆物質であるヨードニトロテトラゾリウム・バ
イオレットとの組合せである例がある。

【０１１５】この場合も、検出部（ｃ）は、二段目の反
応に関与する物質のうちのいずれか１種以上を不動化さ
せてなるもので構成されるが、反応効率の観点からは、
酵素を不動化させてなるものであるのがよい。

【０１１６】以上、本発明方法における信号の発生につ
いて、具体例に即して説明したが、本発明方法における
信号の発生機構は、これらに限定されない。

【０１１７】本発明方法では、上記のようにして信号を
発生させ、それを計測する。計測手段は、特に限定され
るわけではないが、例えば、信号が電子移動の場合に
は、ポテンショスタット、クーロンメーター、電流計等
のような電気計測器で、蛍光の場合には蛍光光度計で、
発光の場合には発光光度計で、呈色の場合は肉眼あるい
は色差計、吸光度計、反射率計等でそれぞれ計測可能で
ある。

【０１１８】計測は、エンドポイントで行なってもよい
が、通常は連続的に信号が供給されるため、信号強度の
変調を一定時間計測することが望ましい。そして、未知
の分析対象物濃度に対して計測された変調の程度を、既
知濃度の分析対象物に対応する変調の程度と比較して、
試料中の分析対象物濃度を演算する。なお、測定の簡便
化のために、あらかじめ既知濃度の分析対象物に対する
変調の程度を演算回路に組み込んでおくことも可能であ
る。

【０１１９】続いて、本発明方法の実施に好適な、本発
明の特異結合分析装置について、説明する。

【０１２０】本発明の装置は、試料導入部（ａ）、マト
リクス（ｂ）および検出部（ｃ）が、あるいは、試料導
入部（ａ）、マトリクス（ｂ）、検出部（ｃ）および吸
収部（ｄ）を有し、さらに必要により該装置の試料の流
れるいずれかの箇所に、先に本発明方法で説明した信号
物質の発生に関与する物質を備えた装置である。

【０１２１】図面を参照しながら、本発明の装置を説明
する。図９（１）〜（５）、（７）および（８）には、
本発明の装置例の側面図を、また、図９（６）には、本
発明の装置例の平面図を示した。

【０１２２】同図に示すように、試料導入部（ａ）は、
独立した部位として設けてもよい（図９（１）、
（２）、（４）、（５）、（７）、（８）参照）し、あ
るいは、マトリクス（ｂ）の一部が試料導入部（ａ）で
あってもよい（図９の（３）、（６）参照）。

【０１２３】マトリクス（ｂ）は、試料導入部（ａ）の
下流に存在する特異結合反応が行なわれる場である。な
お、本発明の装置が吸収部（ｄ）も有する場合（図９の
（２）、（４）、（８）参照）、吸収部（ｄ）は、マト
リクス（ｂ）と隔絶されていてもよい（図９の（２）、
（８）参照）し、マトリクス（ｂ）の下流側の一部とい
う位置付けであってもよい（図９の（４）参照）。ただ
し、吸収部（ｄ）は、特異結合反応の場とはならない。

【０１２４】検出部（ｃ）は、マトリクス（ｂ）内での
信号物質発生体の位置分布の変化から生じる信号変調の
効果の大きい部位に設ければよい。通常は、マトリクス
の最下流側（図９の（１）、（２）、（３）、（４）、
（６）、（７））、あるいは、最上流側（図９の
（８））である。検出部（ｃ）は、独立した部位として
設けてもよいし、マトリクス（ｂ）または吸収部（ｄ）
の一部を加工処理し、検出部（ｃ）としてもよい（図９
の（１）、（２）、（３）、（６）、（７）は、いずれ
でも可能な例である）。

【０１２５】また、本発明の装置は、さらに、支持体
（あるいは基板）（ｅ）やカバー（ｆ）を有していても
よい（図９の（７）、（８）参照）。

【０１２６】次に、本発明の装置の各部位について、さ
らに具体的に説明する。

【０１２７】試料導入部（ａ）が独立した部位である場
合、試料導入部（ａ）は、試料量に応じた大きさの多孔
性フィルター、例えばセルロース濾紙、ガラス繊維濾
紙、不織布などで形成する。試料導入部（ａ）を独立し
た部位とすると、試料の添加が容易に行なえ、また、試
料が均一にマトリクス（ｂ）内に浸透していき、さら
に、試料中の高分子量の会合体および粒子などの妨害因
子をある程度除去できるので好ましい。

【０１２８】マトリクス（ｂ）は、例えば、多孔性担体
あるいはゲル担体で構成する。ただし、ゲル担体の場合
は、試料と接触することによってゲル状態あるいはゾル
状態となるものを用いるのがよい。あるいは、多孔性担
体に、水溶性高分子化合物を含浸させ、乾燥させたもの
を、マトリクス（ｂ）として用いてもよい。さらには、
上記多孔性担体等に固体状物質を保持させたものであっ
てもよい。

【０１２９】多孔性担体としては、セルロースアセテー
ト製、ニトロセルロース製あるいはナイロン製の多孔性
メンブレン、ガラス繊維製あるいはセルロース繊維性の
濾紙、多孔性セラミックス等が、また、ゲル担体として
は、寒天、アガロース、デキストラン、ポリアクリルア
ミド等が例示される。さらに、前記水溶性高分子化合物
としては、デンプンおよびその誘導体、マンナン、ガラ
クタン、寒天、アガロース、アルギン酸ナトリウム、ア
ラビアゴム、デキストラン、ゼラチン、カゼイン、コラ
ーゲン、メチルセルロース（ＭＣ）、エチルセルロース
（ＥＣ）、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）、カ
ルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ポリビニールア
ルコール（ポバール）、ポリアクリル酸ナトリウムなど
が例示できる。加えて、前記固体状物質としては、デキ
ストラン等の多孔性粒子、ポリスチレン製等のラテック
ス、ガラス製微粒子等の微粒子、またはそれらに結合用
の活性基を付与した微粒子が例示される。

【０１３０】マトリクス（ｂ）は、前記したように、特
異結合反応の場であるので、この部分の構成が、検出結
果に大きな影響を与える。そこで、分析対象物の種類、
特異結合反応の方式（阻止反応型、競合型、サンドイッ
チ型など）等に応じて、マトリクス（ｂ）を適当な性状
を示すように構成することが望ましい。すなわち、その
材質、大きさ（厚み）、ポアサイズあるいはゲル状態と
なった時の粘度（粘稠性）等を選択、調整することによ
り、信号物質発生体の分布状態や信号物質等の拡散速度
を任意に調節する。

【０１３１】マトリクス（ｂ）を積層体等とすることに
より、その性状を容易に調節することができる。例え
ば、マトリクス（ｂ）の検出部（ｃ）側には、ポアサイ
ズの小さい材質を用い、試料導入部（ａ）側には、ポア
サイズの大きい材質を用いると、分析対象物の量による
特異結合反応後の信号物質発生体の分布の差異をより明
瞭にできる。これを実現する具体例としては、ポリアク
リルアミドのグラディエントゲルおよびポアサイズの異
なる多孔性メンブレンの積層体等が例示できる。

【０１３２】マトリクス（ｂ）に分析対象物に対する特
異結合物質を存在あるいは不溶化させる場合、それは、
全体に均等に存在させあるいは不溶化してもよいが、例
えば試料導入部（ａ）側には多く存在あるいは不溶化さ
せ、検出部（ｃ）側には少なく存在あるいは不溶化させ
る等の濃度傾斜をつけてもよい。

【０１３３】なお、マトリクス（ｂ）に分析対象物に対
する特異結合物質を不溶化させるには、多孔性担体ある
いはゲル担体に共有結合あるいは吸着によって不溶化さ
せればよい。また、マトリクス（ｂ）を多孔性担体と水
溶性高分子化合物とで構成する場合や多孔性担体等とそ
れに保持される固体状物質とで構成する場合は、特異結
合物質の不溶化は、構成要素全てに対して行なってもよ
いし、一部にのみ行なってもよい。

【０１３４】分析対象物に対する特異結合物質を不溶化
させてマトリクス（ｂ）を構成する場合は、該特異結合
物質を不溶化させてなる固体状物質のみで、マトリクス
（ｂ）を構成することもできる。例えば図１０の（６）
に示すように、中空円柱状の支持体（ｅ）内に前記固体
状物質を詰め、その一端には検出部（ｃ）を形成するこ
とで、本発明の装置とすることができる。

【０１３５】本発明の装置のマトリクス（ｂ）の試料の
流れ方向の長さは、小さくすればするほど、試料の必要
液量を少なくできるが、小さくしすぎると、分析対象物
の量に応じた信号物質発生体の分布の変化が明瞭でなく
なる。従って、一般的には、１０μｍ〜数ｍｍ程度とす
る。

【０１３６】また、その形状に限定はないが、平面状、
平面状層の積層体、直方体、円柱状、細管（キャピラ
リ）状、円錐状、もしくはこれらの組み合わせ等が例示
される。なお、図１０に、本発明のマトリクスの形状例
の斜視図を示した。

【０１３７】検出部（ｃ）もまた、種々の構成とするこ
とができる。まず、検出部（ｃ）が電極である場合につ
いて説明する。

【０１３８】電極としては、白金、金、カーボン電極等
が使用できるが、製造に適したカーボン印刷電極が好適
である。この場合、電極基板（図９の（７）のｅに相
当）としては、液体不透過性の板、例えば塩化ビニル板
などを使用してもよいし、液体透過性のシート（図９の
（２）のｄに相当）、例えば濾紙などを使用してもよ
い。さらに微細な電極構成とするために、写真技術の応
用によって、マイクロアレイ電極を作製することもでき
る。

【０１３９】また、前記電極の参照電極としては、Ａｇ
／ＡｇＣｌ電極等が例示される。これも、印刷技術等に
よって製造できる。

【０１４０】検出部（ｃ）を酵素電極とすれば、電極反
応の特異性や感度が上昇する。この場合には、信号物質
は、酵素電極の基質もしくは補因子として作用し、電子
が電極上で授受され、信号が測定される。酵素電極は、
生化学分析あるいは分析化学分野では多数知られてい
る。

【０１４１】検出部（ｃ）が、蛍光、発光、呈色等が検
出される部位である場合は、各々、具体的には、検出部
（ｃ）は、発光反応に必要な少なくとも１つの信号の発
生に関与する物質を実質上不動化した発光発生部、蛍光
反応に必要な少なくとも１つの信号の発生に関与する物
質を実質上不動化した蛍光発生部、呈色反応に必要な少
なくとも１つの信号の発生に関与する物質を実質上不動
化した呈色発生部等である。

【０１４２】表１、に従って説明すると、検出部
（ｃ）を構成する不動化される物質は、ルミノールおよ
び／またはパーオキシダーゼ（表１）、あるいは、オ
ルトジアニシジンおよび／またはパーオキシダーゼ（表
１）であるが、少なくとも酵素を不動化して検出部
（ｃ）を構成するのが、反応効率の点から好ましい。

【０１４３】検出部（ｃ）が蛍光、発光、呈色等が検出
される部位である場合、検出部（ｃ）は、前記マトリク
ス（ｂ）または後記する吸収部（ｄ）の一部に、あるい
は、図９の（７）の例のように検出部（ｃ）の下流側に
設けられた基板（ｅ）がある場合は、その基板（ｅ）
に、前記信号の発生に関与する物質を不動化させること
で作製することができる。その場合、不動化には、３−
アミノプロピルトリエトキシシラン処理したガラス基板
とグルタルアルデヒドとを用いて酵素を基板に結合する
等の、種々の方法が利用できる。

【０１４４】吸収部（ｄ）がある場合（図９の（２）、
（４）、（８）参照）、吸収部（ｄ）は、前記マトリク
ス（ｂ）についての説明の項に記載した多孔性担体、ゲ
ル担体等で構成する。また、積層体としてもよい。ただ
し、一般的には、前記マトリクス（ｂ）に分析対象物に
対する特異結合物質を存在あるいは不溶化させた場合
に、吸収部（ｄ）には該特異結合物質は存在あるいは不
溶化させない。

【０１４５】また、本発明の装置は、上記構成要件の他
に、支持体あるいは基板（ｅ）に相当する部位および／
またはカバー（ｆ）に相当する部位を有してもよい。支
持体あるいは基板（ｅ）は、例えば、図９の（７）のよ
うに、検出部（ｃ）の下流側に設けられたり、図１０の
（６）のように、装置を取り囲む形で設けられる。カバ
ー（ｆ）は、例えば、図９の（７）、（８）のように、
試料導入部（ａ）の上流側に設けられる。さらに、この
カバー（ｆ）には、試料導入用の孔（ｇ）を設けうる。

【０１４６】なお、ここでは、支持体あるいは基板
（ｅ）は、水分不透過性の材質で形成されたものを指
し、水分透過性の材質で形成されたものは、吸収部
（ｄ）とする。また、カバー（ｆ）も、水分不透過性の
材質で形成されたものを指し、水分透過性の材質で形成
されたものは、試料導入部（ａ）とする。

【０１４７】支持体あるいは基板（ｅ）、カバー（ｆ）
の材質としては、ポリ塩化ビニル、ガラス、アクリル樹
脂、ポリスチレン、ＡＢＳ樹脂、エポキシ樹脂等が例示
され、透明でも不透明でもよいが、図９の（７）のよう
な構成で、信号が蛍光、発光、呈色等である場合は、支
持体あるいは基板（ｅ）は透明とする。

【０１４８】本発明の装置において、試料導入部
（ａ）、マトリクス（ｂ）および検出部（ｃ）のうちの
少なくとも１ヶ所に、あるいは、試料導入部（ａ）、マ
トリクス（ｂ）、検出部（ｃ）および吸収部（ｄ）のう
ちの少なくとも１ヶ所に存在する少なくとも１つの信号
物質の発生に関与する物質は、先に、本発明の分析方法
についての説明中で述べた通りである。

【０１４９】その存在箇所は、上記の通りであるが、そ
れは、本発明の装置に試料が導入された際、信号物質の
発生に関与する物質は、試料の流れに乗って、検出部
（ｃ）近傍あるいは吸収部（ｄ）に押し流されるからで
ある。すなわち、図１や図６に示す位置、あるいは、図
９の（２）や図９の（４）における吸収部（ｄ）の位置
まで、信号物質の発生に関与する物質１２が移動せられ
るからである。しかし、確実性の観点からは、信号物質
の発生に関与する物質１２は、検出部（ｃ）近傍および
／または吸収部（ｄ）に存在せしめておくのがよい。

【０１５０】本発明の装置の構成は、以上の通りである
が、さらに、信号物質の発生に関与する物質以外の物質
であって、本発明の装置を用いた分析方法に係る反応に
必要な物質を、本発明の装置の適当な箇所に存在（付
着）させておいてもよい。

【０１５１】具体的には、信号物質発生体、前記表１中
のの場合における信号の発生に関与する物質、前記表
１中の、の場合であって、検出部（ｃ）を形成する
ために不動化されなかった方の物質、すなわち、酵素と
基質のうち、いずれか不動化されなかった方の物質等が
例示される。

【０１５２】これらの物質は、それが本発明の装置の適
当な箇所に存在せられていない場合には、試料と共に、
あるいは試料の導入前や導入後に、装置に導入せられる
が、予め装置に存在せられている場合は、それらの装置
への導入の工程が省略できるので、そのような装置が好
ましい。なお、本発明の装置を用いる分析方法に係る反
応に必要な、試料中の分析対象物および通常の試料中に
含有されている物質（例えば溶存酸素）以外の全ての物
質が存在する装置を用いると、試料の導入と結果の判定
のみを行なえばよいので、そのような装置が最も好まし
い。

【０１５３】本発明の装置に、前記した反応に必要な物
質を存在させておく場合、信号物質発生体以外の物質
は、前記した少なくとも１つの信号物質の発生に関与す
る物質と同様に、試料導入部（ａ）、マトリクス（ｂ）
および検出部（ｃ）のうちの少なくとも１ヶ所に、ある
いは、試料導入部（ａ）、マトリクス（ｂ）、検出部
（ｃ）および吸収部（ｄ）のうちの少なくとも１ヶ所に
存在させる。

【０１５４】しかし、信号物質発生体については、それ
が特異結合反応を行ない、その際に、試料中の分析対象
物の量に応じたマトリクス（ｂ）内での分布とならなけ
ればいけないので、本発明の装置の試料導入部（ａ）お
よび／またはマトリクス（ｂ）の上流部に存在させる。

【０１５５】ここでは、主に、検出部（ｃ）が一箇所、
あるいは一つの分析対象物に対応する装置について説明
したが、本発明の装置は、複数の検出部（ｃ）を有して
いてもよい。例えば、検出部（ｃ）を複数設置して、マ
トリクス（ｂ）内の信号物質発生体の分布を複数部位で
計測できるようにすることは、特に精度上好ましいし、
あるいは、複数の検出部（ｃ）を設置して、それぞれに
異なる信号を計測させ、複数の分析対象物の測定を行な
わしめるのも有用である。

【０１５６】本発明の装置は、信号の検出を肉眼的に行
なう場合は、単独で使用し得るが、信号の種類によって
は、検出器械（計測器）類と接続して用いる。なお、本
発明の装置と接続される検出器械類については、本発明
方法についての説明中で述べた通りである。

【０１５７】次に、本発明の装置の使用方法について述
べる。本発明の装置が、反応に必要な物質全てを有して
いるものである場合は、試料導入部（ａ）に、所定量の
試料を添加し、所定時間経過後に、あるいは、所定時間
が経過するまで連続的に、信号の読み取りを行なえばよ
い。

【０１５８】試料が添加されると、試料中の液性成分の
ゲル内浸透、拡散もしくは毛細管吸収によって、試料中
の液性成分が検出部（ｃ）の方向へ浸透する。この際、
信号物質の発生に関与する物質、信号の発生に関与する
物質は、試料導入部（ａ）、マトリクス（ｂ）、検出部
（ｃ）または吸収部（ｄ）のいずれに存在しても一旦、
試料とともにマトリクスの下流側や吸収部（ｄ）に拡散
しつつ運ばれ、その後、逆方向に拡散して反応器中に分
布する。一方、試料中の分析対象物や信号物質発生体
は、反応しながらマトリクス（ｂ）内を移動し、あるい
は、特異結合物質が不溶化されている場合はマトリクス
（ｂ）内の所定の位置にトラップされる。そして、検出
部（ｃ）近傍や吸収部（ｄ）に運ばれた後、拡散によっ
て信号物質発生体に到達した信号物質の発生に関与する
物質は、信号物質に変換され、拡散という物質移動によ
り、検出部（ｃ）に到達し、そこで信号を発生するか、
あるいは、検出部（ｃ）に到達したら、信号の発生に関
与する物質に作用し、信号を発生させる。

【０１５９】本発明の装置が、反応に必要な物質のうち
のいくつかを欠いているものである場合には、試料の導
入に先立ち、試料の導入と同時に、あるいは試料の導入
後に、それらの反応に必要な物質を導入する。より具体
的に述べると、通常は、信号物質の発生に関与する物
質、信号の発生に関与する物質は、試料の導入に先立っ
て、適当な緩衝液等に溶解せられて導入され、反応装置
中に拡散し、定常状態となる、信号物質発生体は、試料
の導入と同時にあるいは試料の導入後に、装置に導入さ
れる。各物質のマトリクス（ｂ）内での移動、反応、検
出部（ｃ）での信号の発生等は、前記した反応に必要な
物質全てを有している装置を用いる場合と同様である。

【０１６０】本発明の特異結合分析方法、装置は、以上
の通りであるが、ここで、本発明の特異結合分析方法お
よび特異結合分析装置の一例として、α−ガラクトシダ
ーゼを信号物質発生体の構成成分（標識剤）とした、分
析対象物（ｈＣＧ）の測定であって、信号の検出が電気
化学的測定方法によるものと、その際に用いる装置例に
ついて、具体的に説明する。

【０１６１】ｈＣＧ分子の異なるエピトープを認識する
２種の単クローン性抗ｈＣＧ抗体ＨＭ２１およびＨＭ８
１を用い、片方（ＨＭ２１）をマトリクス（ｂ）の不溶
化抗体とし、もう一方（ＨＭ８１）を信号物質発生体の
構成成分とする。すなわち、信号物質発生体は、α−ガ
ラクトシダーゼ標識ＨＭ８１抗体とする。ＨＭ２１抗体
を多孔性ナイロン膜担体に吸着させて不溶化し、このナ
イロン膜をｈＣＧ測定範囲に応じて複数枚数積層したも
のを、マトリクス（ｂ）とする。Ａｇ／ＡｇＣｌ参照極
・対極と、カーボンの作用極を印刷で調製してなる検出
部（ｃ）上に、酵素反応の基質（信号物質の発生に関与
する物質）ｐ−アミノフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラ
ノシドを含浸した多孔性ナイロン膜（基質層、マトリク
ス（ｂ）の一部を構成するもの）、その上に、前記マト
リクス（ｂ）を積層し、さらにその上に、試料導入部
（ａ）としての濾紙を重ねる。それぞれの層は、アガロ
ースのような親水性ゲルで密着させておく。これをｈＣ
Ｇ分析片とし、ｈＣＧ測定に先立ち、検出部（ｃ）の作
用極側にＡｇ／ＡｇＣｌ参照電極に対して＋４００ｍＶ
の電位を印加しておく。そして、作用極もしくは対極に
流れる電流値もしくは電荷量を計測できるように設定し
ておく。

【０１６２】ここで、試料を所定量の信号物質発生体
（α−ガラクトシダーゼ標識ＨＭ８１抗体）とともに試
料導入部（ａ）に導入し、マトリクス（ｂ）内に浸透さ
せると、マトリクス（ｂ）内で不溶化ＨＭ２１抗体−分
析対象物（ｈＣＧ）−α−ガラクトシダーゼ標識ＨＭ８
１の特異結合反応複合体が形成される。この際、試料中
のｈＣＧ量が多い場合には、効率よく特異結合反応複合
体が形成されるため、信号物質発生体は、マトリクス
（ｂ）の上流側（検出部（ｃ）から離れた側）に分布が
片寄る。反対に、試料中のｈＣＧ量が少ない場合には、
信号物質発生体は、マトリクス（ｂ）の下流側（検出部
（ｃ）に近い側）に分布が片寄る。この場合、特に、ｈ
ＣＧと反応できなかった信号物質発生体は、検出部
（ｃ）近傍にまで接近する。さらに、試料は、基質層
（マトリクス（ｂ）の最下流側にあるｐ−アミノフェニ
ル−α−Ｄ−ガラクトシド等の基質が存在する層）に浸
潤し、検出部（ｃ）に到達し、作用極と参照極・対極間
を液絡させる。そして、試料の浸透は実質上停止する。

【０１６３】この時、基質層の基質は、溶解してマトリ
クス（ｂ）の上流側へ拡散する。拡散した基質は、信号
物質発生体に接すると、酵素（標識剤）によって加水分
解され、信号物質（ｐ−アミノフェノール）となる。こ
の信号物質は、その発生源である信号物質発生体を中心
として拡散する。その内、検出部（ｃ）側へ拡散した信
号物質は、検出部（ｃ）において電極反応に供され、電
子を放出するので、その際の電子移動を電気化学的信号
として計測する。この信号物質の拡散距離は、信号物質
の発生源である信号物質発生体と検出部（ｃ）との距離
に依存するため、検出部（ｃ）に近い信号物質発生体
は、検出部（ｃ）から離れて存在する信号物質発生体よ
りも、より効率よく検出部（ｃ）へ信号物質を供給し得
る。従って、マトリクス（ｂ）内における信号物質発生
体の分布が、検出部（ｃ）において計測される信号（電
流値もしくは電量値など）の強度に影響を及ぼすといえ
るのであり、また、この信号物質発生体の分布は、試料
中のｈＣＧ量に応じて変化するので、信号強度から、試
料中のｈＣＧ濃度（量）を測定できるのである。

【０１６４】

【実施例】以下に、実施例により、本発明を具体的に説
明する。

【０１６５】（実施例１）特異結合分析装置を製造し、
それを用いて試料中のｈＣＧ濃度を測定した。

【０１６６】（１）抗ｈＣＧβ抗体とα−ガラクトシダ
ーゼとの結合体（標識抗体）の作製 ｈＣＧのβ鎖を認識するマウス単クローン性抗体ＨＭ８
１（持田製薬株式会社製）を１００ｍＭ 塩化ナトリウ
ム−１ｍＭ ＥＤＴＡ−６０ｍＭ トリエタノールアミ
ン緩衝液（ｐＨ８．０）（ＴＥＡ緩衝液）に５．０ｍｇ
／ｍＬ濃度となるように溶解し、窒素ガス置換したＴＥ
Ａ緩衝液で十分に透析した。この抗体溶液０．５ｍＬに
対して、５０ｍＭの２−イミノチオラン塩酸塩（Ｐｉｅ
ｒｃｅ社製）溶液１０μＬを添加し、撹拌後、窒素ガス
下、４℃に２時間静置した。その後、窒素ガス置換した
ＴＥＡ緩衝液、さらに、窒素ガス置換した１００ｍＭ
塩化ナトリウム−１ｍＭ ＥＤＴＡ−５０ｍＭ リン酸
緩衝液（ｐＨ６．０）（ＥＤＴＡ−ＰＢ）で透析し、Ｓ
Ｈ基が導入された抗ｈＣＧβ抗体ＨＭ８１を得た。５０
Ｕのα−ガラクトシダーゼ（メリビアーゼ）（生化学工
業株式会社製）を５０ｍＭ ホウ酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ７．６）０．５ｍＬに溶解し、同緩衝液で十分に
透析後、１ｍｇのスルホＳＭＣＣ（Ｐｉｅｒｃｅ社製）
を添加し、３０℃で１．５時間反応させた。反応後、窒
素ガス置換したＥＤＴＡ−ＰＢで透析し、マレイミド化
α- ガラクトシダーゼを得た。ＳＨ基が導入された抗ｈ
ＣＧβ抗体ＨＭ８１溶液０．５ｍＬとマレイミド化α−
ガラクトシダーゼ溶液０．５ｍＬとを混合し、窒素ガス
下、４℃にて２０時間反応させた。５０ｍＭのシステア
ミン溶液１０μＬを添加し、窒素ガス下、４℃にて３０
分間反応させ、その後、窒素ガス置換したＥＤＴＡ−Ｐ
Ｂで平衡化したセファデックスＧ−２００（ファルマシ
ア社製）カラムおよびセファクリルＳ−３００ＨＲ（フ
ァルマシア社製）カラムを用いてゲル濾過クロマトグラ
フィーを行なった。２８０ｎｍにおける吸光度測定およ
びα- ガラクトシダーゼの発色基質溶液（１０ｍＭ ｐ
−ニトロフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（シグ
マ社製）溶液）を用いたα−ガラクトシダーゼ活性測定
を、ゲル濾過クロマトグラフィーの溶出分画について行
ない、遊離の酵素を含まない抗ｈＣＧβ抗体ＨＭ８１と
α−ガラクトシダーゼとの結合体の分画を集めて濃縮し
た。濃縮標品（α−ガラクトシダーゼ−ＨＭ８１と称
す）は、Ｐｈａｓｔシステムによる電気泳動（ファルマ
シア社製）で分子量を確認後、後記する測定において、
信号物質発生体として用いた。

【０１６７】（２）検出部（電極）の作製 長さ３０ｍｍ、幅１５ｍｍ、厚さ０．５ｍｍのポリ塩化
ビニル板上に、導電性カーボンインク（Ｅｌｅｃｔｒｏ
ｄａｇ１１４もしくはＥｌｅｃｔｒｏｄａｇ１０９、日
本アチソン社製）で２ｍｍ幅のカーボン線２本（それぞ
れ長さ３０ｍｍ）を２ｍｍ間隔で印刷した。一方のカー
ボン線の長さ方向１／２（１５ｍｍ）には、その上にさ
らに導電性銀インク（藤倉化成株式会社製）を重層印刷
した。この導電性銀インクを重層印刷した部分につい
て、０．１Ｍ 塩化ナトリウム水溶液中で電解反応を行
なわせ、表面に塩化銀層を形成させた。

【０１６８】（３）抗ｈＣＧα抗体不溶化多孔性ナイロ
ン膜の作製 ｈＣＧのα鎖を認識するマウス単クローン性抗体ＨＭ２
１（持田製薬株式会社製）を０．０７６Ｍ リン酸緩衝
生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解し、０．５ｍｇ／ｍＬ濃度
に調製し、それを、ポアサイズ３．０μｍの多孔性ナイ
ロン膜Ｉｍｍｕｎｏｄｙｎｅ ＢＩＡＯ３０ＨＣ５（Ｐ
ａｌｌ社製）の５×１０ｍｍ切片当たり５μＬとなるよ
うに浸潤させ、上記ＨＭ２１溶液を含有する多孔性ナイ
ロン膜を調製した。これらを湿箱に入れ、室温で１時間
反応させた後、０．１％ウシ血清アルブミン／ＰＢＳ溶
液を５×１０ｍｍ切片当たり１〜３ｍＬ添加し、振とう
撹拌しながら、４℃にて２〜１５時間ブロッキング反応
させた。その後、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ溶液
中にて、４℃で２時間振とう撹拌し、洗浄した。さら
に、この洗浄操作を３〜４回行ない、抗ｈＣＧα抗体
（ＨＭ２１）不溶化多孔性ナイロン膜を得た。

【０１６９】（４）抗ｈＣＧα抗体不溶化多孔性ナイロ
ン膜の積層による、試料導入部を有するマトリクス（一
部）の作製 濾紙上で水分を拭った抗ｈＣＧα抗体（ＨＭ２１）不溶
化多孔性ナイロン膜を、あらかじめ加温溶解し、５０℃
に保った０．２５％アガロース／０．０１％トゥイーン
２０／ＰＢＳ（加温アガロース溶液）に浸漬し、ただち
にガラス板上で５枚の切片を積層した。次に、定量濾紙
５Ｃ（アドバンテック東洋株式会社製）の４×８ｍｍ切
片（試料導入部）を、同様に加温アガロース溶液に浸漬
し、先に積層して得たナイロン膜上（最上層側）に積層
した。ただちに、上部から濾紙で余剰の水分を吸収する
と共に、上部から切片当り２００ｇの圧力でプレス密着
させ、デシケータ内で乾燥した。

【０１７０】（５）マトリクスと検出部との接合 乾燥した抗ｈＣＧα抗体不溶化多孔性ナイロン膜
（（３）にて０．５ｍｇ／ｍＬ濃度のＨＭ２１を含むＰ
ＢＳ溶液を浸潤させたもの）１枚を、検出部（電極）の
カーボン線と銀／塩化銀線の両者にまたがるように載置
し、それに、酵素基質（ｐ−アミノフェニル−α−Ｄ−
ガラクトピラノシド（シグマ社製））を加温アガロース
溶液に１０ｍＭ濃度となるように溶解した基質溶液１０
μＬを浸潤させ、乾燥した。その上部に、（４）にて作
製した試料導入部を有するマトリクス（一部）を積層
し、上部から切片当り２００ｇの圧力でプレス密着さ
せ、減圧デシケータ内で乾燥し、ｈＣＧ濃度測定用の特
異結合分析装置を得た。この分析装置は図９（１）の模
式図に近い装置である。

【０１７１】（６）測定 特異結合分析装置のカーボン線側を作用極、銀／塩化銀
線側を対極・参照極として、ポテンショスタットＨＡ−
１５０（北斗電工株式会社製）に接続した。さらに、電
量値計測のためのクーロンメータＨＦ−２０３Ｄ（北斗
電工株式会社製）、電極電位設定のためのファンクショ
ンジェネレータＨＢ−１０４（北斗電工株式会社製）、
信号記録のための記録計Ｆ−４５（理研電子株式会社
製）を接続し、さらに記録計からＧＰＩＢラインを通じ
てコンピュータへ接続し、計測およびデータ処理を行な
った。測定時には、カーボン線電極側を銀／塩化銀線電
極側に対して＋４００ｍＶとなるように電位設定した。
ｈＣＧを含有するあるいは含有しない試料を、２．０％
ウシ血清アルブミン／１００ｍＭ 塩化ナトリウム／
０．０５Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で１０Ｕ／ｍ
Ｌ濃度に調製したα- ガラクトシダーゼ−ＨＭ８１溶液
と１：１（Ｖ：Ｖ）混合し、ｈＣＧを０ｍＩＵ／ｍＬ、
α−ガラクトシダーゼ−ＨＭ８１を５Ｕ／ｍＬ含有する
溶液（Ａ）、ｈＣＧを５ｍＩＵ／ｍＬ、α−ガラクトシ
ダーゼ−ＨＭ８１を５Ｕ／ｍＬ含有する溶液（Ｂ）、ｈ
ＣＧを５０ｍＩＵ／ｍＬ、α−ガラクトシダーゼ−ＨＭ
８１を５Ｕ／ｍＬ含有する溶液（Ｃ）を調製した。溶液
（Ａ）、溶液（Ｂ）、溶液（Ｃ）のいずれかを、前記特
異結合分析装置の試料導入部に４５μＬ点着し、マトリ
クス内に浸透させ、電量値の時間変化を計測し、溶液点
着後１分間の電量値を読み取った。なお、この計測は、
溶液（Ａ）、溶液（Ｂ）、溶液（Ｃ）の各々について、
３回ずつ行なった。

【０１７２】（７）結果 ３回の平均値を表４に示したが、表４より、試料中のｈ
ＣＧの濃度により、酵素標識抗体ＨＭ８１のマトリクス
（ｂ）中での分布が変化し、この分布の変化が検出部
（ｃ）での電量値変化として測定されたことがわかり本
発明の装置によって試料中ｈＣＧ濃度の定量を簡便、迅
速に行なえることが明らかとなった。また、その詳細は
示さないが、マトリクスの作製に際し、２．０ｍｇ／ｍ
Ｌあるいは５．０ｍｇ／ｍＬ濃度のＨＭ２１を含むＰＢ
Ｓを用いた以外は同様に処理して作製した装置を用いた
場合も、同様の傾向の結果が得られた。

【０１７３】 表４ 試料中のｈＣＧ濃度と計測される電量値の関係 ────────────────────────── 試料中ｈＣＧ濃度 点着後１分間の電量値 （ｍＩＵ／ｍＬ） （μＣ） ────────────────────────── ０ １７０ １０ １３３ １００ １０３ ──────────────────────────

【０１７４】（実施例２）特異結合分析装置のマトリク
スを製造し、試料および信号物質発生体である標識抗体
を試料導入部に導入した後、マトリクス内の標識抗体の
分布の変化を調べた。

【０１７５】（１）試料導入部を有するマトリクスの作
製 まず、実施例１（４）と同様の操作を行ない、試料導入
部を有するマトリクス（一部）を作製した。次に、長さ
３０ｍｍ、幅１５ｍｍ、厚さ０．５ｍｍのポリ塩化ビニ
ル板上に、乾燥した抗ｈＣＧα抗体不溶化多孔性ナイロ
ン膜（実施例１（３）にて、０．５ｍｇ／ｍＬ濃度のＨ
Ｍ２１を含むＰＢＳ溶液を浸潤させたもの）１枚を載置
し、それに加温アガロース溶液１０μＬを浸潤させ、乾
燥した。その上部に、前記マトリクス（一部）を積層
し、上部からプレス密着させ、減圧デシケータ内で乾燥
し、図１１に示すように試料導入部（ａ）を有するマト
リクス（ｂ）および支持体（ｅ）の積層体を得た。試料
液の浸透方向２０は、矢印で示した。

【０１７６】（２）測定 ｈＣＧを含有するあるいは含有しない試料を、２．０％
ウシ血清アルブミン／１００ｍＭ 塩化ナトリウム／
０．０５Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で１０Ｕ／ｍ
Ｌ濃度に調製したα- ガラクトシダーゼ−ＨＭ８１溶液
と１：１（Ｖ：Ｖ）混合し、ｈＣＧを０ｍＩＵ／ｍＬ、
α−ガラクトシダーゼ−ＨＭ８１を５Ｕ／ｍＬ含有する
溶液（Ｄ）、ｈＣＧを１０ｍＩＵ／ｍＬ、α−ガラクト
シダーゼ−ＨＭ８１を５Ｕ／ｍＬ含有する溶液（Ｅ）、
ｈＣＧを１００ｍＩＵ／ｍＬ、α−ガラクトシダーゼ−
ＨＭ８１を５Ｕ／ｍＬ含有する溶液（Ｆ）を調製した。
溶液（Ｄ）、溶液（Ｅ）、溶液（Ｆ）のいずれかを、
（１）で作製したマトリクスの試料導入部に４５μＬ点
着した。次に、該マトリクスを構成している濾紙および
抗ｈＣＧα抗体不溶化多孔性ナイロン膜を切片単位に分
解し、各切片中のα−ガラクトシダーゼ−ＨＭ８１（標
識抗体）量を、α−ガラクトシダーゼの発色基質溶液
（１０ｍＭ ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−ガラクトピ
ラノシド（シグマ社製）溶液）を用いたα−ガラクトシ
ダーゼ活性測定によって調べた。

【０１７７】（３）結果 測定された各切片中のα−ガラクトシダーゼ−ＨＭ８１
量を、マトリクス内のα−ガラクトシダーゼ−ＨＭ８１
（α−ガラクトシダーゼ活性）分布として整理し、結果
を図１２に示した。図１２には、試料中のｈＣＧ濃度が
０ｍＩＵ／ｍＬの実験での各切片（層）のα−ガラクト
シダーゼ活性を基準（各切片（層）の１００％値）とす
る、試料中のｈＣＧ濃度が１０ｍＩＵ／ｍＬまたは１０
０ｍＩＵ／ｍＬの実験での各切片（層）のα−ガラクト
シダーゼ活性を示した。図１２より、標識抗体は、試料
中の分析対象物（ｈＣＧ）が０、１０、１００ｍＩＵ／
ｍＬと増加するに従って、マトリクスの上層（第１〜２
層）に分布するものが多くなり、下層（第３〜６層）に
分布するものが少なくなることが明らかである。なお、
図１２では、試料中の分析対象物に帰因する上層での標
識抗体分布量の増大率が、下層での減少率よりも、みか
け上小さく表われているが、これは、試料中の分析対象
物（ｈＣＧ）が０ｍＩＵ／ｍＬの時の標識抗体のマトリ
クス内の分布（基準値）自体に、上層側から下層側に向
って減少するグラディエント傾向があったためである。
従って、実施例１の方法によって測定された信号（電量
値で示されたもの）は、下層に分布している標識抗体
（信号物質発生体）にかかわる信号が主体であり、試料
中の分析対象物による標識抗体のマトリクス内の分布の
変化が、信号を変調しているものと考えられた。本発明
の特異結合分析方法が、マトリクス中の標識（酵素）分
布を測定可能であることを示す装置例について、具体的
に説明する。

【０１７８】（実施例３）α−ガラクトシダーゼ不溶化
層を含む多孔性部材積層体において、カーボン電極と酵
素層との距離を変化させた場合の電流値変化を調べ、検
出部と標識（α−ガラクトシダーゼ）との位置関係が電
流値に及ぼす効果について調べた。

【０１７９】（１）α−ガラクトシダーゼ不溶化多孔性
ナイロン膜およびウサギ正常血清不溶化ナイロン膜の作
製 ５×８ｍｍ方形にカットしたポアサイズ３．０μｍの多
孔性ナイロン膜Ｉｍｍｕｎｏｄｙｎｅ ＢＩＡ０３０Ｈ
Ｃ５（Ｐａｌｌ社製）切片に４００Ｕ／ｍＬ濃度のα−
ガラクトシダーゼ（生化学工業株式会社製）ＰＢＳ溶液
もしくは正常ウサギ血清（ＮＲＳ、日本生物材料センタ
ー製）を５μＬずつ浸潤させ、室温で１時間反応させ
た。その後、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／
ＰＢＳ溶液中で４℃１５時間振とう撹拌してブロッキン
グを行った。その後、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ
溶液中で４℃２時間以上振とう撹拌して洗浄した。この
洗浄操作を５回以上繰り返し、α−ガラクトシダーゼ不
溶化ナイロン膜およびＮＲＳ不溶化ナイロン膜を得た。

【０１８０】（２）α−ガラクトシダーゼ不溶化層を含
む多孔性部材積層体の作製 濾紙上で水分を拭ったα−ガラクトシダーゼ不溶化ナイ
ロン膜１枚とＮＲＳ不溶化ナイロン膜５枚とを積み重ね
た全６層からなる積層体をスライドガラス上に作製し
た。この際、α−ガラクトシダーゼ不溶化層１層を、そ
れぞれ上から１層目、２層目、３層目、４層目、５層
目、６層目の位置に積層したもの６種とＮＲＳ不溶化ナ
イロン膜６枚のみの積層体を作製した。積層後、最上層
に４×６ｍｍ方形にカットした濾紙（Ｎｏ．１６５、Ｗ
ｈａｔｍａｎ社製）をのせ、あらかじめ加温溶解し５０
℃に保った０．２５％アガロース／０．０１％Ｔｗｅｅ
ｎ２０／ＰＢＳ（加温アガロース溶液）４０μＬを濾紙
部から浸潤させた。上部から濾紙で余剰の水分を吸収す
ると共に、上部から切片当たり２００ｇの圧力でプレス
密着させ、デシケータ内で乾燥し、α−ガラクトシダー
ゼ不溶化層を含む多孔性部材積層体とした。

【０１８１】（３）基質層の作製 ５×８ｍｍ方形にカットしたポアサイズ３．０μｍの多
孔性ナイロン膜Ｉｍｍｕｎｏｄｙｎｅ ＢＩＡ０３０Ｈ
Ｃ５（Ｐａｌｌ社製）１枚当たり、酵素基質（ｐ−アミ
ノフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド、Ｓｉｇｍａ
社製）を１００ｍＭ濃度で含む加温アガロース溶液５μ
Ｌを浸透させ乾燥して基質層とした。

【０１８２】（４）α−ガラクトシダーゼ不溶化層を含
む多孔性部材積層体と検出部との接合 基質層１層を実施例１第（２）項の方法で作製した電極
上のカーボン線と銀／塩化銀線の両者にまたがるように
載置し、その上に、第（２）項で作製したα−ガラクト
シダーゼ不溶化層を含む多孔性部材積層体を重ねた。さ
らにその上から試料導入用の孔（直径３ｍｍ）をあけた
アクリル板をかぶせて、α−ガラクトシダーゼ不溶化層
を含む多孔性部材積層体装置とした。この際、試料導入
用の孔は、積層体の最上層の濾紙の真上にくるように設
置し、測定中、アクリル板は電極表面から１２００μｍ
の間隔を維持するようにした。すなわち、図１３に示す
ように、試料液の浸透方向２０の順に、試料導入口２１
を有するアクリル板２２の次に、第０層として試料点着
（導入）用濾紙部３０、多孔性ナイロン膜第１層、第２
層、第３層、第４層、第５層および第６層を有し、次に
第７層として基質層を検出部との間に有する多孔性部材
積層体装置を作製した。

【０１８３】（５）α−ガラクトシダーゼ不溶化層を含
む多孔性部材積層体装置を用いた電流測定 第（４）項で作製した装置のカーボン線側を作用極、銀
／塩化銀線側を対極・参照極として、実施例１第（６）
項に記載のようにポテンショスタットなどの測定装置を
接続した。測定時には、カーボン線電極側を銀／塩化銀
線電極側に対して＋４００ｍＶとなるように電位設定し
た。そして、反応用緩衝液として、２％ウシ血清アルブ
ミン−５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）−１００
ｍＭ塩化ナトリウム水溶液３０μＬを、前記装置の上面
アクリル板の試料導入用の孔を通じて導入し、電流値を
記録した。

【０１８４】（６）結果 α−ガラクトシダーゼ不溶化層を含む多孔性部材積層体
装置を用いた測定での電流の経時変化を図１４（ａ）お
よび（ｂ）に示した。α−ガラクトシダーゼ不溶化層が
カーボン電極（検出部）に近いほど電流値が大きく、α
−ガラクトシダーゼ不溶化層が電極（検出部）から離れ
るほど電流値が小さかった。すなわち、この実験条件下
では、検出部から少なくとも約１０００μｍの範囲内に
存在する酵素が電流値に寄与でき、しかも検出部近くに
存在する酵素ほど電流への寄与がゆるやかに大きくなる
ことが確認された。これは、本発明が、実施例１のよう
なマトリクス中の酵素分布を的確に測定可能であること
を立証するものである。

【０１８５】（実施例４）西洋わさびパーオキシダーゼ
（ＨＲＰＯ）不溶化層、もしくは、グルコースオキシダ
ーゼ（ＧＯＤ）不溶化層、もしくは、西洋わさびパーオ
キシダーゼ（ＨＲＰＯ）不溶化層とグルコースオキシダ
ーゼ（ＧＯＤ）不溶化層を含む多孔性部材積層体におい
て、カーボン電極とＨＲＰＯ不溶化層、もしくは、カー
ボン電極とＧＯＤ不溶化層、もしくは、ＧＯＤ不溶化層
とＨＲＰＯ不溶化層被覆カーボン電極との距離を変化さ
せた場合の電流値変化を調べ、検出部と標識（ＧＯＤ）
との位置関係が電流値に及ぼす効果について調べた。

【０１８６】（１）酵素不溶化多孔性メンブレンの作製 西洋わさびパーオキシダーゼ（ＨＲＰＯ、東洋紡社
製）、および、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ，Ｂｏ
ｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）をそれぞれ
５ｍｇ／ｍＬ濃度となるように、０．０７６Ｍ リン酸
緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解した。不溶化担体は、
ポアサイズ３．０μｍの硝酸セルロース／酢酸セルロー
スの混合メンブレン（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＳＳＷＰ１４２０
０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を５×８ｍｍの方形にカ
ットしたものを用いた。カットしたメンブレンを直径９
０ｍｍの定量濾紙（５Ａ、アドバンテック東洋社製）２
枚の間に必要数はさみ、さらにこれをアクリル板２枚の
間にはさんだものを２組作製し、それぞれ、酵素溶液を
濾紙部分に浸透させた後にアクリル板をシールし、４℃
２４時間以上静置して酵素をメンブレンに吸着固定し
た。静置後、メンブレンを取り出し、ＰＢＳで洗浄後、
１００ｍＬビーカーへ移し、０．１％ウシ血清アルブミ
ン（ＢＳＡ）／ＰＢＳ溶液６０ｍＬを加え、浸透撹拌し
ながら、４℃で１日間以上ブロッキング反応した。その
後、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ溶液中にて、４℃
で浸透撹拌して洗浄した。この洗浄操作を４回以上繰り
返し、ＨＲＰＯ不溶化メンブレンおよびＧＯＤ不溶化メ
ンブレンを得た。

【０１８７】（２）ＨＲＰＯ不溶化層を含む多孔性部材
積層体の作製 第（１）項で作製したＨＲＰＯ不溶化メンブレンを乾燥
したもの１枚と５×８ｍｍの方形にカットした濾紙（Ｎ
ｏ．５４、Ｗｈａｔｍａｎ社製）５枚とを積み重ねた全
６層からなる積層体を作製した。この際、ＨＲＰＯ不溶
化層１層を、上からそれぞれ１層目、２層目、３層目、
４層目、５層目の位置に積層したもの計５種の積層体を
作製した。この積層体をそれぞれ実施例１第（２）項の
方法で作製した電極上のカーボン線と銀／塩化銀線の両
者にまたがるように載置し、さらにその上から試料導入
口２１（直径３ｍｍ）をあけたアクリル板２２をかぶせ
て、ＨＲＰＯ不溶化層を含む多孔性部材積層体装置とし
た。この際、試料導入口は、積層体の最上層の濾紙の真
上にくるように設置し、測定中、アクリル板２２は電極
表面から１２００μｍの間隔を維持するようにした。す
なわち、図１５に示すように、試料液の浸透方向２０の
順に、試料導入口２１を有するアクリル板２２の次に、
第０層として試料点着（導入）用濾紙部３０、第１層、
第２層、第３層、第４層および第５層を有し、次に検出
部としての電極部を有する多孔性部材積層体装置を作製
した。

【０１８８】（３）ＨＲＰＯ不溶化層を含む多孔性部材
積層体装置を用いた電流測定 第（２）項で作製した装置のカーボン線側を作用極、銀
／塩化銀線側を対極・参照極として、実施例１第（６）
項に記載のようにポテンショスタットなどの測定装置を
接続した。そして、以下の組成の水溶液を調製した。 ハイドロキノン水溶液（ＨＱ液） １００ｍＭ ハイドロキノン（和光純薬工業株式会社
製） ５０ｍＭ リン酸緩衝液 ｐＨ６．０ １００ｍＭ 塩化ナトリウム 過酸化水素液 ３．４％ 過酸化水素 ５０ｍＭ リン酸緩衝液 ｐＨ６．０ １００ｍＭ 塩化ナトリウム 電解質溶液 ５０ｍＭ リン酸緩衝液 ｐＨ６．０ １００ｍＭ 塩化ナトリウム 測定直前に、ＨＱ液１０μＬ、過酸化水素液４０μＬ、
電解質溶液９５０μＬを十分に混合した。その結果、最
終濃度として、ハイドロキノンを１ｍＭ、過酸化水素を
約４０ｍＭ含有する溶液を得た。この溶液の４０μＬ
を、前記装置の上面アクリル板の試料導入用の孔を通じ
て導入した。作用極の静止電位が安定した後（試料導入
から１分間経過後）、作用極を対極・参照極に対して−
２００ｍＶとなるように電位設定し、電流値を記録し
た。結果を図１６に示した。

【０１８９】（４）ＧＯＤ不溶化層を含む多孔性部材積
層体の作製 第（１）項で作製したＧＯＤ不溶化メンブレンを乾燥し
たもの１枚と５×８ｍｍの方形にカットした濾紙（Ｎ
ｏ．５４、Ｗｈａｔｍａｎ社製）５枚とを積み重ねた全
６層からなる積層体を作製した。この際、ＧＯＤ不溶化
層１層を、上から１層目、２層目、３層目、４層目、５
層目の位置に積層したもの計５種の積層体を作製した。
この積層体をそれぞれ実施例１第（２）項の方法で作製
した電極上のカーボン線と銀／塩化銀線の両者にまたが
るように載置し、さらにその上から試料導入用の孔（直
径３ｍｍ）をあけたアクリル板をかぶせて、ＧＯＤ不溶
化層を含む多孔性部材積層体装置とした。この際、試料
導入用の孔は、積層体の最上層の濾紙の真上にくるよう
に設置し、測定中、アクリル板は電極表面から１２００
μｍの間隔を維持するようにした。すなわち、図１７に
示すように、試料液の浸透方向２０の順に、試料導入口
２１を有するアクリル板２２の次に、試料導入用濾紙部
３０としての第１層、マトリクスとしての第２層、第３
層、第４層、第５層および第６層を有し、次に検出部と
しての電極部を有する多孔性部材積層体装置を作製し
た。

【０１９０】（５）ＧＯＤ不溶化層を含む多孔性部材積
層体装置を用いた電流測定 第（４）項で作製した装置のカーボン線側を作用極、銀
／塩化銀線側を対極・参照極として、実施例１第（６）
項に記載のようにポテンショスタットなどの測定装置を
接続した。そして、以下の組成の水溶液を調製した。た
だし、グルコース液は調製後、４８時間以上冷蔵保存し
たものを使用した。 ハイドロキノン水溶液（ＨＱ液） ５ｍＭ ハイドロキノン（和光純薬工業株式会社製） １００ｍＭ リン酸緩衝液 ｐＨ７．０ １００ｍＭ 塩化ナトリウム グルコース液 １．５ Ｍ グルコース １００ｍＭ リン酸緩衝液 ｐＨ７．０ １００ｍＭ 塩化ナトリウム 測定直前に、ＨＱ液５０μＬ、グルコース液５０μＬを
十分に混合した。その結果、最終濃度として、ハイドロ
キノンを２．５ｍＭ、グルコースを０．７５Ｍ含有する
溶液を得た。この溶液の４０μＬを、前記装置の上面ア
クリル板の試料導入用の孔を通じて導入した。作用極の
静止電位が安定した後（試料導入から１分間経過後）、
作用極を対極・参照極に対して＋３００ｍＶとなるよう
に電位設定し、電流値を記録した。結果を図１８に示し
た。

【０１９１】（６）ＨＲＰＯ不溶化層とＧＯＤ不溶化層
とを含む多孔性部材積層体の作製 第（１）項で作製したＨＲＰＯ不溶化メンブレンとＧＯ
Ｄ不溶化メンブレンを乾燥したものそれぞれ１枚ずつと
５×８ｍｍの方形にカットした濾紙（Ｎｏ．５４、Ｗｈ
ａｔｍａｎ社製）５枚とを積み重ねた全７層からなる積
層体を作製した。この際、ＨＲＰＯ不溶化層１層は、必
ず最下層とし、ＧＯＤ不溶化層１層は上から１層目、２
層目、３層目、４層目、５層目の位置に積層したもの計
５種の積層体を作製した。この積層体をそれぞれ実施例
１第（２）項の方法で作製した電極上のカーボン線と銀
／塩化銀線の両者にまたがるように載置し、さらにその
上から試料導入用の孔（直径３ｍｍ）をあけたアクリル
板をかぶせて、ＨＲＰＯ不溶化層とＧＯＤ不溶化層とを
含む多孔性部材積層体装置とした。この際、試料導入用
の孔は、積層体の最上層の濾紙の真上にくるように設置
し、測定中、アクリル板は電極表面から１２００μｍの
間隔を維持するようにした。すなわち、図１９に示すよ
うに、試料液の浸透方向２０の順に、試料導入口２１を
有するアクリル板２２の次に、第０層として試料点着
（導入）用濾紙部、第１層、第２層、第３層、第４層、
第５層およびＨＲＰＯ不溶化層としての第６層を有し、
次に検出部としての電極部を有する多孔性部材積層体装
置を作製した。

【０１９２】（７）ＨＲＰＯ不溶化層とＧＯＤ不溶化層
とを含む多孔性部材積層体装置を用いた電流測定 第（６）項で作製した装置のカーボン線側を作用極、銀
／塩化銀線側を対極・参照極として、実施例１第（６）
項に記載のようにポテンショスタットなどの測定装置を
接続した。そして、以下の組成の水溶液を調製した。た
だし、グルコース液は調製後、４８時間以上冷蔵保存し
たものを使用した。 ハイドロキノン水溶液（ＨＱ液） １０ｍＭ ハイドロキノン（和光純薬工業株式会社製） １００ｍＭ リン酸緩衝液 ｐＨ７．０ １００ｍＭ 塩化ナトリウム グルコース液 １．５ Ｍ グルコース １００ｍＭ リン酸緩衝液 ｐＨ７．０ １００ｍＭ 塩化ナトリウム 電解質溶液 １００ｍＭ リン酸緩衝液 ｐＨ７．０ １００ｍＭ 塩化ナトリウム 測定直前に、ＨＱ液４５μＬ、グルコース液３００μ
Ｌ、電解質溶液５５５μＬを十分に混合した。その結
果、最終濃度として、ハイドロキノンを０．５ｍＭ、グ
ルコースを０．５Ｍ含有する溶液を得た。この溶液の４
０μＬを、前記装置の上面アクリル板の試料導入用の孔
を通じて導入した。作用極の静止電位が安定した後（試
料導入から１分間経過後）、作用極を対極・参照極に対
して−２００ｍＶとなるように電位設定し、電流値を記
録した。結果を図２０に示した。

【０１９３】（８）結果 第（３）項のＨＲＰＯ不溶化層を含む多孔性部材積層体
装置を用いた測定での電流の経時変化を図１６に示し
た。ＨＲＰＯ層がカーボン電極（検出部）に近いほど電
流値が大きく、ＨＲＰＯ層が電極（検出部）から離れる
ほど電流値が小さかった。第（５）項のＧＯＤ不溶化層
を含む多孔性部材積層体装置を用いた測定での電流の経
時変化を図１８に示した。ＧＯＤ層がカーボン電極（検
出部）に近いほど電流値が大きく、ＧＯＤ層が電極（検
出部）から離れるほど電流値が小さかった。これらの場
合、両者とも、酵素層の電流値への寄与は、酵素層と電
極（検出部）との距離が離れるにしたがって急速に減衰
し、酵素層が電極（検出部）から２層以上離れた場合、
酵素層が電流値に与える影響は無視できるほど小さくな
っていることが確認された。おそらく、これらの実験条
件下では、酵素と電極の間での信号物質（おそらくハイ
ドロキノン／ベンゾキノン対）のサイクリング機構が関
与していると推測された。これらの結果により、検出部
から約５００μｍの範囲内に存在する酵素が主として電
流値に寄与し、その５００μｍの範囲内でも検出部近く
に存在する酵素ほど電流への寄与が急速に大きくなるこ
とが確認された。これは、本発明が、数百μｍという薄
層中の酵素分布を的確に測定可能であることを立証する
ものである。第（５）項のＨＲＰＯ不溶化層とＧＯＤ不
溶化層とを含む多孔性部材積層体装置を用いた測定での
電流の経時変化を図２０に示した。この場合も同様に、
ＧＯＤ層がＨＲＰＯ層被覆カーボン電極（検出部）に近
いほど電流値が大きく、ＧＯＤ層がＨＲＰＯ層被覆電極
（検出部）から離れるほど電流値が小さい傾向が示され
た。しかし、酵素（ＧＯＤ）層の電流値への寄与は、酵
素層とＨＲＰＯ層被覆電極（検出部）との距離が離れる
にしたがって比較的緩やかに減衰し、酵素層が電極（検
出部）から５層以上離れても、酵素層が電流値に与える
影響を無視できない点が前２者の場合と異なっていた。
このように、実施例３の場合と同様、信号物質サイクリ
ング機構の関与が小さいか、あるいは、関与がない場合
には、比較的広い範囲の標識分布によって検出部の信号
が変調を受ける傾向が確認された。すなわち、この実験
条件下では、検出部から少なくとも約１０００μｍの範
囲内に存在する酵素が電流値に寄与でき、その範囲内で
も検出部近くに存在する酵素ほど電流への寄与がゆるや
かに大きくなることが確認された。これは、本発明が、
厚みのあるマトリクス中の酵素分布に対しても的確に測
定可能であることを立証するものである。これらの結果
から、本発明の方法によって、検出部に接するマトリク
ス中の標識（酵素など）の分布を的確に、かつ、汎用性
をもって、簡便、迅速に行えることが明らかとなった。

【０１９４】本発明の特異結合分析方法および特異結合
分析装置の別の例として、グルコースオキシダーゼを標
識（信号物質発生体）の構成成分（標識剤）とした、分
析対象物（ｈＣＧ）の測定であって、信号の検出が電流
値測定によるものと、その際に用いる装置例について具
体的に説明する。

【０１９５】実施例１と同様に、抗ｈＣＧ抗体ＨＭ２１
をマトリクス（ｂ）の不溶化抗体とし、抗ｈＣＧ抗体Ｈ
Ｍ８１を信号物質発生体の構成成分とする。すなわち、
標識（信号物質発生体）は、グルコースオキシダーゼ標
識ＨＭ８１抗体とする。そして、マトリクス（ｂ）は、
長方形にカットされた多孔性ナイロン膜担体にＨＭ２１
抗体を吸着させて不溶化したものを１層だけ水平方向に
用いるものとする。

【０１９６】（実施例５）特異結合分析装置を製造し、
それを用いて試料中のｈＣＧ濃度を測定した。 （１）抗ｈＣＧβ抗体とグルコースオキシダーゼとの結
合体（標識抗体）の作製 ｈＣＧのβ鎖を認識するマウス単クローン性抗体ＨＭ８
１（持田製薬株式会社製）を１００ｍＭ 塩化ナトリウ
ム−１ｍＭ ＥＤＴＡ−６０ｍＭ トリエタノールアミ
ン緩衝液（ｐＨ８．０）（ＴＥＡ緩衝液）に３．９ｍｇ
／ｍＬ濃度となるように溶解し、窒素ガス置換したＴＥ
Ａ緩衝液に十分に透析した。この抗体溶液１．０ｍＬに
対して、５０ｍＭの２−イミノチオラン塩酸塩（Ｐｉｅ
ｒｃｅ社製）溶液５５μＬを添加し、撹拌後、窒素ガス
雰囲気下、４℃で１．５時間静置した。その後、窒素ガ
ス置換した１００ｍＭ 塩化ナトリウム−１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ−１００ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）（ＥＤ
ＴＡ−ＰＢ）で十分に透析し、ＳＨ基が導入された抗ｈ
ＣＧβ抗体ＨＭ８１を得た。グルコースオキシダーゼ
（ＧＯＤ，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社
製）を７０μＭとなるように１００ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）の１．４３ｍＬに溶解し、３０℃でゆっ
くり撹拌しながら５０ｍＭのスルホＳＭＣＣ（Ｐｉｅｒ
ｃｅ社製）２０μＬを添加し、４５分間反応させた。反
応後、窒素ガス置換したＥＤＴＡ−ＰＢで十分に透析
し、マレイミド化ＧＯＤを得た。マレイミド化ＧＯＤに
対して１．５倍モルのＳＨ基導入ＨＭ８１抗体を添加混
合後、窒素ガス雰囲気下、４℃にて２０時間反応させ
た。５０ｍＭのシステアミン溶液５０μＬを添加し、窒
素ガス雰囲気下、４℃にて３０分間反応させ、その後、
窒素ガス置換したＥＤＴＡ−ＰＢで平衡化したセファク
リル３００ＨＲ（ファルマシア社製）カラムを用いてゲ
ルろ過クロマトグラフィーを行った。２８０ｎｍおよび
４５２ｎｍにおける吸光度測定およびＧＯＤ活性測定
（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社「Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｃａ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ」に記載の活
性測定方法）を、ゲルろ過クロマトグラフィーの溶出分
画について行い、遊離の酵素を含まないＨＭ８１とＧＯ
Ｄとの結合体の分画を集めて濃縮した。濃縮標品（ＧＯ
Ｄ−ＨＭ８１と称す）は、Ｐｈａｓｔシステムによる電
気泳動（ファルマシア社製）で分子量を確認後、後記す
る測定において、信号物質発生体として用いた。

【０１９７】（２）抗ｈＣＧα抗体不溶化多孔性ナイロ
ン膜の作製 ｈＣＧのα鎖を認識するマウス単クローン性抗体ＨＭ２
１（持田製薬株式会社製）を０．１Ｍ 炭酸水素ナトリ
ウム水溶液（ｐＨ８．３）に溶解し、１．０ｍｇ／ｍＬ
濃度に調製し、それを、ポアサイズ３．０μｍの多孔性
ナイロン膜Ｉｍｍｕｎｏｄｙｎｅ ＢＩＡ０３０ＨＣ５
（Ｐａｌｌ社製）の４×１５ｍｍ切片当たり８μＬ浸潤
させた。室温で１時間反応させた後、ナイロン膜を１０
０ｍＬビーカーへ移し、０．１％ウシ血清アルブミン
（ＢＳＡ）／ＰＢＳ溶液６０ｍＬを加え、浸透撹拌しな
がら、４℃で２日間ブロッキング反応した。その後、
０．１％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ溶液中にて、４℃で浸
透撹拌して洗浄した。この洗浄操作を４回以上繰り返
し、抗ｈＣＧα抗体（ＨＭ２１）不溶化多孔性ナイロン
膜を得た。

【０１９８】（３）抗ｈＣＧα抗体不溶化多孔性ナイロ
ン膜１層を電極上に設置した、試料導入部および吸収部
を有する特異結合反応分析装置の作製 図２１に示すように検出部（ｃ）（電極）は、実施例１
第（２）項の方法で作製したものを作用極２３と対極お
よび参照極２４として用いた。乾燥したＨＭ２１抗体不
溶化多孔性ナイロン膜１枚をマトリクス（ｂ）として、
検出部（ｃ）（電極）の作用極２３のカーボン線の方向
とナイロン膜の長辺方向とが一致するように、かつ、カ
ーボン線上を覆うように載置した。そのナイロン膜の両
方の端にＷｈａｔｍａｎ濾紙Ｎｏ．５４の５×８ｍｍ切
片を４層、それぞれ、８ｍｍ方向が電極線に垂直方向と
なるように重積した。ただし、電極の端子に近い側の重
積濾紙（試料導入部）は銀／塩化銀線とカーボン線の両
方にまたがるように配置し、試料導入部（ａ）とした。
電極の端子から遠い側の重積濾紙は銀／塩化銀線上には
かからずカーボン線にのみかかるように配置し吸収部
（ｄ）とした。さらに、試料導入口２１（直径３ｍｍ）
をあけたアクリル板２２を試料導入部（ａ）にかぶせ
て、ｈＣＧ濃度測定用の特異結合分析装置を得た。試料
導入口２１は、ちょうど試料導入部（ａ）の重積濾紙の
真上にくるように設置し、測定中、アクリル板２２は電
極表面から１２００μｍの間隔を維持するようにした。
この分析装置は、図９（５）の模式図に近い装置であ
る。

【０１９９】（４）測定 特異結合分析装置のカーボン線側を作用極、銀／塩化銀
線側を対極・参照極として、実施例１第（６）項に記載
のようにポテンショスタットなど測定装置を接続した。
ｈＣＧの含有量の異なる３種の試料を、０．１％ ＢＳ
Ａを添加した１００ｍＭ 塩化ナトリウム／０．１Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）（以下、反応用ＰＢと略
す）で抗体濃度換算で７．５μｇ／ｍＬに調製したＧＯ
Ｄ−ＨＭ８１溶液と１：１（Ｖ：Ｖ）混合した。そし
て、この混合液５５μＬに対して、０．１％ＢＳＡ含有
の反応用ＰＢで調製した４００μＭ ハイドロキノン溶
液を５５μＬ、さらに、反応用ＰＢで調製した１．５Ｍ
グルコース溶液を１１０μＬ添加し、十分に混合し
た。その結果、最終濃度として、ＧＯＤ−ＨＭ８１を抗
体濃度換算で０．９４μｇ／ｍＬ、ハイドロキノンを１
００μＭ、グルコースを０．７５Ｍ含有し、ｈＣＧ濃度
が０ＩＵ／Ｌの溶液（Ａ）、０．３１ＩＵ／Ｌの溶液
（Ｂ）、および、３．１ＩＵ／Ｌの溶液（Ｃ）の３種の
反応液を調製した。溶液（Ａ）、溶液（Ｂ）、溶液
（Ｃ）のいずれかを、前記特異結合分析装置の上面アク
リル板の試料導入用の孔を通じて、試料導入部に５５μ
Ｌ点着した。マトリクス、さらには吸収部まで浸透した
後（試料点着から３分間経過後）、作用極を対極・参照
極に対して＋３００ｍＶとなるように電位設定し、電流
値を記録した。

【０２００】（５）結果 作用極に電位をかけた後、２分後、４分後、６分後、８
分後の電流値を表５に示した。いずれの時間において
も、ｈＣＧ濃度に依存して電流値は高くなった。この結
果から、本発明の装置によって試料中ｈＣＧ濃度の定量
を簡便、迅速に行えることが明らかとなった。

【０２０１】 表 ５ 反応溶液中のｈＣＧ濃度と計測される電流値の関係 ──────────────────────────────── 反応液中 電流値 （ｎＡ） ｈＣＧ濃度 （ＩＵ／Ｌ） ２分後 ４分後 ６分後 ８分後 ──────────────────────────────── ０．０ １９５ １７０ １５６ １４８ ０．３１ ２１５ １９０ １７７ １６８ ３．１ ２３２ ２０４ １８９ １８２ ────────────────────────────────

【０２０２】本発明の特異結合分析方法および特異結合
分析装置の別の例として、グルコースオキシダーゼを信
号物質発生体の構成成分（標識剤）とした、分析対象物
（ｈＣＧ）の測定であって、信号の検出が電流値の時間
変化の測定によるものと、その際に用いる装置例につい
て具体的に説明する。

【０２０３】実施例１と同様に、抗ｈＣＧ抗体ＨＭ２１
をマトリクス（ｂ）の不溶化抗体とし、抗ｈＣＧ抗体Ｈ
Ｍ８１を信号物質発生体の構成成分とする。すなわち、
信号物質発生体は、グルコースオキシダーゼ標識ＨＭ８
１抗体とする。そして、マトリクス（ｂ）は、実施例１
と同様、方形にカットされた多孔性硝酸セルロース／酢
酸セルロースの混合メンブレン担体にＨＭ２１抗体を吸
着させて不溶化したものを多層化して用いるものとす
る。

【０２０４】（実施例６）特異結合分析装置を製造し、
それを用いて試料中のｈＣＧ濃度を測定した。 （１）抗ｈＣＧα抗体不溶化多孔性膜およびＨＲＰＯ不
溶化多孔性膜の作製 ポアサイズ３．０μｍの硝酸セルロース／酢酸セルロー
スの混合メンブレン（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＳＳＷＰ１４２０
０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を５×８ｍｍの方形にカ
ットし、１．０％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液５０ｍＬの入った
ビーカー内へ入れた。４℃６０時間浸透撹拌し、さらに
６０℃３０分間加熱して、ＢＳＡをメンブレン上に不溶
化した。その後、液を除去し、ＰＢＳで置換し、４℃
１．５時間以上浸透撹拌して洗浄した。この洗浄操作を
５回繰り返した。乾燥したメンブレン１枚に対して、ｈ
ＣＧのα鎖を認識するマウス単クローン性抗体ＨＭ２１
（持田製薬株式会社製）の１．０ｍｇ／ｍＬ濃度のＰＢ
Ｓ溶液１５μＬを浸潤し、さらに、０．１％グルタルア
ルデヒド（ＧＡ、和光純薬工業株式会社製）水溶液１５
μＬを浸潤して乾燥し、抗ｈＣＧα抗体不溶化多孔性膜
を得た。また、別個に、乾燥したメンブレン１枚に対し
て、ＨＲＰＯ（東洋紡製）の５ｍｇ／ｍＬ濃度のＰＢＳ
溶液１５μＬを浸潤し、さらに、０．１％グルタルアル
デヒド（ＧＡ、和光純薬工業株式会社製）水溶液１５μ
Ｌを浸潤して乾燥し、ＨＲＰＯ不溶化多孔性膜とした。
それぞれ、１００ｍＬビーカーへ移し、０．１％ウシ血
清アルブミン（ＢＳＡ）／ＰＢＳ溶液６０ｍＬを加え、
浸透撹拌しながら、４℃で１５時間以上ブロッキング反
応した。その後、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ溶液
中にて、４℃で浸透撹拌して洗浄した。この洗浄操作を
４回以上繰り返した。

【０２０５】（２）抗ｈＣＧα抗体不溶化多孔性膜９層
をＨＲＰＯ不溶化層被覆電極上に設置したマトリクスの
作製 第（１）項で作製したＨＲＰＯ不溶化多孔性膜１層の上
に抗ｈＣＧα抗体不溶化多孔性膜を９層積層し、さら
に、５×８ｍｍ方形にカットした濾紙（Ｎｏ．５４、Ｗ
ｈａｔｍａｎ社製）を２層のせて、全１２層からなる積
層体を作製した。この積層体を実施例１第（２）項の方
法で作製した電極上のカーボン線と銀／塩化銀線の両者
にまたがるように載置し、さらにその上から試料導入用
の孔（直径３ｍｍ）をあけたアクリル板をかぶせて、ｈ
ＣＧ濃度測定用の特異結合分析装置を得た。この際、試
料導入用の孔は、積層体の最上層の濾紙の真上にくるよ
うに設置し、測定中、アクリル板は電極表面から１８０
０μｍの間隔を維持するようにした。この分析装置は図
９（１）の模式図に近い装置である。

【０２０６】（３）測定 特異結合分析装置のカーボン線側を作用極、銀／塩化銀
線側を対極・参照極として、実施例１第（６）項に記載
のようにポテンショスタットなど測定装置を接続した。
ｈＣＧの含有量の異なる４種の試料を、０．１％ ＢＳ
Ａを添加した１００ｍＭ 塩化ナトリウム／０．１Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）（以下、反応用ＰＢと略
す）で抗体濃度換算で４．０μｇ／ｍＬに調製したＧＯ
Ｄ−ＨＭ８１溶液と１：１（Ｖ：Ｖ）混合した。その結
果、最終濃度として、ＧＯＤ−ＨＭ８１を抗体濃度換算
で２．０μｇ／ｍＬ、ｈＣＧ濃度が ０ＩＵ／Ｌの溶液
（Ａ）、１０ＩＵ／Ｌの溶液（Ｂ）、１００ＩＵ／Ｌの
溶液（Ｃ）、および、１０００ＩＵ／Ｌの溶液（Ｄ）の
４種の反応液を調製した。また、次の組成のハイドロキ
ノン−グルコース水溶液（ＨＱ−グルコース液）を調製
した。ただし、用いた１００ｍＭグルコース液は調製後
４８時間以上冷蔵保存したものを使用した。 ハイドロキノン−グルコース水溶液（ＨＱ−グルコース
液） ０．５ｍＭ ハイドロキノン（和光純薬工業株式会社
製） １００ｍＭ グルコース ０．１％ ＢＳＡ １００ｍＭ リン酸緩衝液 ｐＨ７．０ １００ｍＭ 塩化ナトリウム そして、このＨＱ−グルコース液を前記特異結合分析装
置の上面アクリル板の試料導入用の孔を通じて、試料導
入部に５０μＬ導入した。作用極の静止電位が安定した
後（ＨＱ−グルコース液導入から約２分間経過後）、作
用極を対極・参照極に対して−２００ｍＶとなるように
電位設定し、電流値の記録を開始した。さらに、電位設
定から１分後に、反応液（Ａ）、反応液（Ｂ）、反応液
（Ｃ）、反応液（Ｄ）のいずれかを、前記特異結合分析
装置の上面アクリル板の試料導入用の孔を通じて、試料
導入部に１０μＬ導入し、電流値の記録を継続した。そ
して、反応液の導入から３分後と９分後の電流値の差を
求めた。

【０２０７】（４）結果 反応液の導入後、３分後の電流値と９分後の電流値の差
から１ｍｉｎ当たりの電流値変化を求めて電流値変化率
とし、表６に示した。ｈＣＧ濃度に依存して電流値変化
率は低くなった。これは、特異結合反応の結果、ｈＣＧ
濃度の増加とともに、標識抗体が多層積層構造のマトリ
クスの上部でトラップされる確率が高くなり、それにつ
れて標識の分布がマトリクス上方に片寄ったことを反映
するものと思われた。この結果から、本発明の装置によ
って試料中ｈＣＧ濃度の定量を簡便、迅速に行えること
が明らかとなった。

【０２０８】 表 ６ 反応溶液中のｈＣＧ濃度 と電流値変化率との関係 ──────────────────── 反応液中 電流値変化率 ｈＣＧ濃度 （ＩＵ／Ｌ） （ｎＡ／ｍｉｎ） ──────────────────── ０ ７．８ １０ ７．８ １００ ６．５ １０００ ４．５ ──────────────────── 次に、本発明のマトリクス作製法の別の作製例として、
微粒子担体を特異結合物質の不溶化担体とした場合につ
いて具体的に説明する。

【０２０９】（実施例７）抗原不溶化の例としてウシ血
清アルブミン（ＢＳＡ）、および、抗体不溶化の例とし
て抗Ｃ反応性蛋白（ＣＲＰ）抗体を不溶化した微粒子を
調製し、特異結合反応用マトリクスを作製した。

【０２１０】（１）ＢＳＡ不溶化微粒子および抗ＣＲＰ
抗体不溶化微粒子の作製 過ヨウ素酸ナトリウム（和光純薬工業株式会社製）４．
２８ｇを蒸留水１００ｍＬに溶解して４℃に冷却後、平
均粒径約６μｍの結晶セルロース（ＡＶＩＣＥＬ ＰＨ
−Ｍ０６、旭化成工業株式会社製）１．０ｇを懸濁し、
遮光して４℃１６時間ゆっくりと撹拌した。この懸濁液
を、１．５ｇエチレングリコール（和光純薬工業株式会
社製）を蒸留水１００ｍＬに溶解した溶液に加え、４℃
１時間撹拌した。その後、グラスフィルター上で吸引濾
過し、さらに１ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ４．４）で８回
以上洗浄し、同緩衝液で１００ｍｇＡｖｉｃｅｌ／ｍＬ
に調製した。ＢＳＡ（生化学工業株式会社製）およびウ
サギ抗ヒトＣＲＰ抗体（株式会社日本バイオテスト研究
所製）溶液をそれぞれ１ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ４．４）で十分に透析した。１ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐ
Ｈ４．４）溶液中に懸濁された上記処理済みの結晶セル
ロースと未処理の結晶セルロースとをそれぞれ超音波処
理して撹拌後、ＢＳＡ溶液もしくは抗ＣＲＰ溶液と混合
し、以下の組成の懸濁液（Ａ〜Ｌ）を調製した。 懸濁液Ａ ＢＳＡ ２０ mg/mL 処理済み結晶セルロース ８０mg/mL 懸濁液Ｂ ＢＳＡ ５ mg/mL 処理済み結晶セルロース ８０mg/mL 懸濁液Ｃ ＢＳＡ １ mg/mL 処理済み結晶セルロース ８０mg/mL 懸濁液Ｄ ＢＳＡ ０．２mg/mL 処理済み結晶セルロース ８０mg/mL 懸濁液Ｅ ＢＳＡ ０．０mg/mL 処理済み結晶セルロース ８０mg/mL 懸濁液Ｆ ＢＳＡ ２０ mg/mL 未処理 結晶セルロース ８０mg/mL 懸濁液Ｇ ＢＳＡ ５ mg/mL 未処理 結晶セルロース ８０mg/mL 懸濁液Ｈ ＢＳＡ １ mg/mL 未処理 結晶セルロース ８０mg/mL 懸濁液Ｉ ＢＳＡ ０．２mg/mL 未処理 結晶セルロース ８０mg/mL 懸濁液Ｊ ＢＳＡ ０．０mg/mL 未処理 結晶セルロース ８０mg/mL 懸濁液Ｋ 抗ＣＲＰ抗体 １mg/mL 処理済み結晶セルロース ８０mg/mL 懸濁液Ｌ 抗ＣＲＰ抗体 １mg/mL 未処理 結晶セルロース ８０mg/mL 調製した懸濁液を４℃で５時間振とう撹拌後、０．２Ｍ
炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５）を１／２０量添
加した。さらに４℃で１時間以上振とう撹拌後、遠心分
離を行い、それぞれの懸濁液の上清の吸光度（２８０ｎ
ｍ）を測定し、上清中の残存蛋白量を算出した。遠心沈
査は、ＰＢＳで再懸濁し、再度遠心操作を行った。この
洗浄操作を５回以上繰り返し、洗浄後、懸濁液Ａおよび
懸濁液ＫをＢＳＡ不溶化微粒子および抗ＣＲＰ抗体不溶
化微粒子とし、それぞれ５０％結晶セルロース／１０％
ゼラチン／ＰＢＳ懸濁液を調製した。

【０２１１】（２）結果 最初に添加したＢＳＡおよび抗ＣＲＰ抗体量と、第
（１）項の遠心上清中の残存蛋白量の差が結晶セルロー
スへの蛋白結合量とした。そして、処理済み結晶セルロ
ースでの蛋白結合量と未処理結晶セルロースでの蛋白結
合量との差を、実際の結合量とし、表７に示した。

【０２１２】 表 ７ 結晶セルロースへの結合量 ──────────────────────── 結合反応時 結合量 の蛋白濃度 （μｇ蛋白／ｍｇ （ｍｇ／ｍＬ） 結晶セルロース） ──────────────────────── ＢＳＡ ２０ １９ ＢＳＡ ５ １３ ＢＳＡ １ ８．４ ＢＳＡ ０．２ ２．５ ＢＳＡ ０．０ ０．０ 抗ＣＲＰ抗体 １ ９．２ ────────────────────────

【０２１３】（３）ＢＳＡ不溶化微粒子を用いた特異結
合反応用マトリクスの作製 超音波処理した５０％結晶セルロース／１０％ゼラチン
／ＰＢＳの組成のＢＳＡ不溶化微粒子懸濁液０．８ｍＬ
に、１０％グリセリン水溶液０．２ｍＬを添加し、十分
に混合した。電極基板上に作製した型の中にこの懸濁液
を分注し、水平に保ったままデシケータ内で乾燥して、
特異結合反応用マトリクスを作製した。

【０２１４】（実施例８）本発明の特異結合分析方法お
よび特異結合分析装置のさらに別の例として、西洋ワサ
ビパーオキシダーゼを信号物質発生体の構成成分（標識
剤）とした、分析対象物（ｈＣＧ）の測定であって、信
号の検出が電流値測定によるものと、その際に用いる装
置例について具体的に説明する。実施例１と同様に、抗
ｈＣＧ抗体ＨＭ２１をマトリクス（ｂ）の不溶化抗体と
し、抗ｈＣＧ抗体ＨＭ８１を信号物質発生体の構成成分
とする。すなわち、信号物質発生体は、西洋ワサビパー
オキシダーゼ標識ＨＭ８１抗体とする。そして、マトリ
クス（ｂ）は、円形のセルロース混合エステル多孔性膜
担体にＨＭ２１抗体を結合させて不溶化したものを１層
用いるものとする。

【０２１５】特異結合装置を製造し、それを用いて試料
中のｈＣＧ濃度を測定した。図２２は、用いた特異結合
装置１の組立て図を示す。この装置では、試料液の浸透
方向２０が、矢印で示すように、試料導入部（ａ）では
垂直方向であり、マトリクス（ｂ）上では、吸収部
（ｄ）の表面に設けられた液体不透過性のシール部２８
のために、水平方向となる。また、検出部（ｃ）である
電極部は、連通部２３の上表面と下表面の周囲にそれぞ
れ対極／参照極および作用極として設けられ、連通部２
３の下流側にある連通部２３より拡径されたマトリクス
（ｂ）内での半径方向の特異結合反応の分布を測定する
ことができる。以下にこの装置の詳細を説明するが、以
下で説明する構造に限定されるものではなく、上述の試
料液方向と特異結合反応分布と電極部とを備えるもので
あれば、いかなる構造であってもよい。図２２の装置
は、上流側から下流側に向かって試料導入口２１を有す
る上部板２２の次に濾紙等からなる試料導入部（ａ）を
有し、次に検出部（ｃ）を有する。検出部（ｃ）には流
れ方向に貫通口２９があけられ、貫通口２９の上表面に
は、対極および参照極２４がその円周に沿って設けら
れ、貫通口２９の下表面には、作用極２５がその円周に
沿って設けられている。対極および参照極２４は、参照
極端子２６で図示しない外部に設けられる測定器と電気
的に接続されることができ、作用極２５は作用極端子２
７で同様に接続されることができる。貫通口２９の内部
は、濾紙等からなる連通部２３で試料導入部（ａ）とマ
トリクス（ｂ）とを液体拡散の場として連通している。
貫通口２９の直径より大きい径でその下流側には抗体が
不溶化されたメンブレン等からなるマトリクス（ｂ）が
設けられる。さらに下流側には貫通口２９の直径よりは
大きく、マトリクス（ｂ）の直径よりは小さい径の液体
不透過性のシール部２８を表面に有する吸収部（ｄ）が
配置される。さらにその下部は支持体（ｅ）で支持され
る。図２３（Ａ）は、図２２の特異結合装置を組立てた
測定時の状態を示す斜視図であり、図２３（Ｂ）はその
断面図である。

【０２１６】（１）抗ｈＣＧβ抗体と西洋ワサビパーオ
キシダーゼとの結合体（標識抗体）の作製 ｈＣＧのβ鎖を認識するマウス単クローン性抗体ＨＭ８
１（持田製薬株式会社製）を１００ｍＭ 塩化ナトリウ
ム−１ｍＭ ＥＤＴＡ−６０ｍＭ トリエタノールアミ
ン緩衝液（ｐＨ８．０）（ＴＥＡ緩衝液）に８．３ｍｇ
／ｍＬ濃度となるように溶解し、窒素ガス置換したＴＥ
Ａ緩衝液に十分に透析した。この抗体溶液１．１ｍＬに
対して、ＴＥＡ緩衝液中に調製した５０ｍＭの２−イミ
ノチオラン塩酸塩（Ｐｉｅｒｃｅ社製）溶液６１μＬを
添加し、撹拌後、窒素ガス雰囲気下、４℃で１．５時間
静置した。その後、窒素ガス置換した１００ｍＭ 塩化
ナトリウム−１ｍＭ ＥＤＴＡ−１００ｍＭ リン酸緩
衝液（ｐＨ７．０）（ＥＤＴＡ−ＰＢ）で十分に透析
し、ＳＨ基が導入された抗ｈＣＧβ抗体ＨＭ８１を得
た。１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で２０ｍｇ
／ｍＬ濃度に調製された西洋ワサビパーオキシダーゼ
（ＨＲＰＯ，東洋紡社製）溶液５００μＬを３０℃でゆ
っくり撹拌しながら、５０ｍＭのスルホＳＭＣＣ（Ｐｉ
ｅｒｃｅ社製）５００μＬを添加して２０分間反応させ
た。反応後、窒素ガス置換したＥＤＴＡ−ＰＢで平衡化
したＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５（ファルマシア社製）カ
ラム（２．６φ×１５ｃｍ）を通して未反応のスルホＳ
ＭＣＣを除去し、濃縮器ＣＥＮＴＲＩＰＲＥＰ−１０
（Ａｍｉｃｏｎ社製）を用いて濃縮し、マレイミド化Ｈ
ＲＰＯを得た。得られたマレイミド化ＨＲＰＯの濃度
は、４０３ｎｍの吸光度から求めた。１．２５×１０^-8
モルもしくは１．５６×１０^-8モルのマレイミド化ＨＲ
ＰＯ溶液に対して、それぞれ３倍モル量もしくは１／３
倍モル量のＳＨ基導入ＨＭ８１抗体を添加混合後、窒素
ガス雰囲気下、４℃にて１２時間反応させた。次いで、
それぞれ５０ｍＭのシステアミン溶液５０μＬを添加
し、窒素ガス雰囲気下、４℃にて６０分間反応させ、そ
の後、窒素ガス置換したＥＤＴＡ−ＰＢで平衡化したＵ
ＬＴＲＯＧＥＬ ＡｃＡ３４（ＩＢＦ Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｉｃｓ社製）カラムを用いてゲルろ過クロマトグラフ
ィーを行った。２８０ｎｍおよび４０３ｎｍにおける吸
光度測定を、ゲルろ過クロマトグラフィーの溶出分画に
ついて行い、遊離の酵素を含まないＨＭ８１とＨＲＰＯ
との結合体の分画を集めて濃縮した。濃縮標品（ＨＲＰ
Ｏ−ＨＭ８１と称す）は、Ｐｈａｓｔシステムによる電
気泳動（ファルマシア社製）で分子量を確認後、吸光度
と酵素活性から含有される抗体および酵素量を決定し、
後記する測定において信号物質発生体として用いた。

【０２１７】（２）抗ｈＣＧα抗体不溶化多孔性セルロ
ース混合エステル膜の作製 ウシγグロブリン（製品コードＧ７５１６、シグマ社
製）の１．０％（Ｗ／Ｖ）ＰＢＳ溶液２００ｍＬを入れ
たビーカー中に、ポアサイズ８．０μｍ、直径１３ｍｍ
の円形の酢酸セルロース／硝酸セルロース混合エステル
多孔性膜（カタログ番号ＳＣＷＰ０１３００、日本ミリ
ポア工業株式会社製）２００枚を入れ、ゆっくり撹拌し
ながら６０℃で２時間加熱した。上澄みを除去し、さら
に残液を吸引除去した後、洗浄液として十分量のＰＢＳ
を加えてよく撹拌し、再度内容液を除去して洗浄を行っ
た。ＰＢＳの洗浄をさらに２回行い、その後、蒸留水で
の洗浄を７回繰り返した。洗浄終了後、１．０％ グル
タルアルデヒド水溶液２００ｍＬを添加し、ゆっくり撹
拌しながら２５℃で３時間反応させた。反応後、蒸留水
で１０回洗浄を行い、ガラス板の上に多孔性膜を１枚ず
つ並べて乾燥した。ｈＣＧのα鎖を認識するマウス単ク
ローン性抗体ＨＭ２１（持田製薬株式会社製）を０．０
５Ｍ 炭酸水素ナトリウム−０．０５Ｍ塩化ナトリウム
水溶液に溶解して１．０ｍｇ／ｍＬ濃度に調製した。こ
の溶液を、ガラス板上で乾燥させた多孔性膜（１３ｍｍ
φ）当たり２５μＬを中央部分から浸潤させた。室温で
１時間反応させた後、多孔性膜を０．２％ウシ血清アル
ブミン（ＢＳＡ）／ＰＢＳ溶液２００ｍＬに移し、振と
う撹拌しながら、４℃で２日間ブロッキング反応した。
その後、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ溶液で３回洗
浄し、さらにＰＢＳで７回洗浄し、抗ｈＣＧα抗体（Ｈ
Ｍ２１）不溶化多孔性セルロース混合エステル膜を得
た。

【０２１８】（３）検出部（電極）の作製 長さ４０ｍｍ、幅２０ｍｍ、厚さ０．３ｍｍの透明塩化
ビニル板の裏側および表側に、導電性カーボンインク
（Ｅｌｅｃｔｒｏｄａｇ１０９、日本アチソン社製）
で、直径６ｍｍの円形部とそれにつながる幅１．５ｍｍ
の端子部を印刷した。この際、直径６ｍｍの円形部の位
置は、裏側および表側で一致させた（図２２参照）。表
側の円形部には、その上にさらに導電性銀インク（藤倉
化成株式会社製）を重層印刷した。その後、この円形部
の中央をパンチングし、直径３ｍｍの孔を開けて貫通口
とし、貫通口の表側表面および裏側表面に環状の導電部
分が残るようにした。また、開口後、表側と裏側の導電
部がそれぞれ電気的に独立していることを確認した。次
に、導電性銀インクを重層印刷した部分について、０．
１Ｍ 塩化ナトリウム水溶液中で電解反応（＋１．０Ｖ
ｖｓ 銀／塩化銀電極）を２時間行ない、表面に塩化
銀層を形成させた。表側および裏側の導電部はいずれ
も、環状部と端子部を残してメンディングテープ（住友
スリーエム株式会社製）を貼り付けてシールした。露出
している環状部の内、銀／塩化銀層が重層されている側
を参照極および対極、カーボンのみの側を作用極とし、
後記する測定において作用極を検出部として用いた。

【０２１９】（４）抗ｈＣＧα抗体不溶化多孔性セルロ
ース混合エステル膜１層を作用極下に設置した、試料導
入部および吸収部を有する特異結合反応分析装置の作製
（図２２参照） アクリル製の下部支持体上に、クロマトグラフろ紙（１
７ Ｃｈｒ、Ｗｈａｔｍａｎ社製）からパンチングして
作製した直径１２ｍｍの円形ろ紙２枚を吸水部として乗
せた。この円形ろ紙の最上部表面中央には、メンディン
グテープ（住友スリーエム株式会社製）からパンチング
して作製した直径６ｍｍのシールを貼り付けた。実施例
８第（２）項の方法で作製した直径１３ｍｍの円形の抗
ｈＣＧα抗体（ＨＭ２１）不溶化多孔性セルロース混合
エステル膜を乾燥し、シール部を有する吸水部ろ紙の上
に中心位置を合わせて重積し、マトリクスとした。検出
部（電極）は、実施例８第（３）項の方法で作製したも
のを用いた。銀／塩化銀電極面を上側にして、電極中央
部の直径３ｍｍの貫通口の中心を、マトリクスの円形多
孔性膜の中心と一致させて重積した。ガラス繊維ろ紙
（ＧＦ７５、アドバンテック東洋株式会社製）からパン
チングして作製した直径３ｍｍの円形ろ紙を、電極の貫
通口にはめ込んで連通部とした。次に、ガラス繊維ろ紙
（ＧＡ２００、アドバンテック東洋株式会社製）からパ
ンチングして作製した直径１２ｍｍの円形ろ紙を、その
中心が電極の貫通口の中心と一致するように重積して、
試料導入部とした。その上に、直径４ｍｍの試料導入口
を有するアクリル製上部板（厚さ５ｍｍ）を、その試料
導入口の中心が試料導入部円形ろ紙の中心と一致するよ
うに上乗せして、ｈＣＧ濃度測定用の特異結合分析装置
を得た（図２２、図２３参照）。上部板の下面と下部支
持体の上面とは、３２００μｍの間隔を維持するように
した。この分析装置は、図９（１）の模式図に近い装置
である。

【０２２０】（５）測定 特異結合分析装置の電極においてカーボン環側を作用
極、銀／塩化銀環側を対極・参照極として、実施例１第
（６）項に記載のようにポテンショスタットなど測定装
置を接続した。ｈＣＧの含有量の異なる５種の試料を、
０．１％ ＢＳＡを添加した１００ｍＭ 塩化ナトリウ
ム／０．１Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）（以下、反
応用ＰＢと略す）で抗体濃度換算で０．１μｇ／ｍＬに
調製したＨＲＰＯ−ＨＭ８１溶液と１：１（Ｖ：Ｖ）混
合した。そして、この混合液２８５μＬに対して、１０
０ｍＭ塩化ナトリウム／０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
６．０）で調製した２．５ｍＭ ｐ−ベンゾキノン溶液
を１２．５μＬ、さらに、１００ｍＭ塩化ナトリム／
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で調製した約０．
２５Ｍ濃度の過酸化水素溶液を１２．５μＬ添加し、十
分に混合した。その結果、最終濃度として、ＨＲＰＯ−
ＨＭ８１を抗体濃度換算で０．０４６μｇ／ｍＬ、ｐ−
ベンゾキノンを１００μＭ、過酸化水素をおよそ１０ｍ
Ｍ含有し、ｈＣＧ濃度が０ＩＵ／Ｌの溶液（Ａ）、１Ｉ
Ｕ／Ｌの溶液（Ｂ）、１０ＩＵ／Ｌの溶液（Ｃ）、１０
０ＩＵ／Ｌの溶液（Ｄ）および１０００ＩＵ／Ｌの溶液
（Ｅ）の５種の反応液を調製した。溶液（Ａ）、溶液
（Ｂ）、溶液（Ｃ）、溶液（Ｄ）、溶液（Ｅ）のいずれ
かを、前記特異結合分析装置の上面アクリル板の試料導
入口を通じて、試料導入部に２６０μＬ導入した。マト
リクス、さらには吸収部まで浸透した後（試料点着から
１分間経過後）、作用極を対極・参照極に対して−２０
０ｍＶとなるように電位設定し、電流値を記録した。

【０２２１】（６）結果 作用極に電位をかけた後、３分後の電流値を表８に示し
た。いずれの時間においても、ｈＣＧ濃度に依存して電
流値は高くなった。この結果から、本発明の装置によっ
て試料中ｈＣＧ濃度の定量を簡便、迅速に行えることが
明らかとなった。

【０２２２】 表 ８ 反応溶液中のｈＣＧ濃度と計測される電流値の関係 ───────────────────────────────── 反応液中 電流値 （ｎＡ） ｈＣＧ濃度 （ＩＵ／Ｌ） ───────────────────────────────── ０ ９６０ １ １０００ １０ １０３０ １００ １０８０ １０００ １２７０ ─────────────────────────────────

【０２２３】

【発明の効果】本発明により、特異結合分析の原理によ
る、未反応物の分離操作を伴わない簡便なホモジニアス
法であって、汎用性に優れ、迅速な定性および定量測定
が可能な特異結合分析方法と、該方法の実施に好適な特
異結合分析装置が提供される。

【０２２４】本発明は、試料の性状に関わらず、さら
に、分析対象物の分子量などの性状に関わらずに、サン
ドイッチ型反応および阻止型反応などを含む特異結合反
応に適用でき、また、その結果の判定は、呈色反応、蛍
光反応、発光反応、電気化学反応などに基づいて行なう
ことができる、すなわち、肉眼での目視で、もしくは、
発生した信号の性質に応じた好適な外部の計測器で検出
もしくは計測できるので、様々な態様に適応させ得る。
また、本発明の装置は、マトリクスの形状や大きさ、検
出部の設置方法が限定されないため、測定に最も適合し
た態様とすることができ、例えばその大きさの微小化も
可能である。従って、試料が微量である場合にも適用可
能である。さらに、本発明の装置は、外部の計測器への
着脱が可能なため、使い捨てとすることができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明方法の原理を説明するための概念図で
ある。

【図２】 測定開始からの経過時間と信号強度との関係
を示すグラフである。

【図３】 本発明方法の原理を説明するための概念図で
ある。

【図４】 図３に示す仮定に基づいた距離Ｌに応じた検
出部（ｃ）で検出される電流信号の理論的予測図であ
る。

【図５】 本発明方法の原理を説明するための概念図で
ある。

【図６】 本発明方法の原理を説明するための概念図で
ある。

【図７】 試料中の分析対象物量と信号強度との関係を
示すグラフである。

【図８】 本発明方法の原理を説明するための概念図で
ある。

【図９】 本発明の装置の一例を示す側面図または平面
図である。

【図１０】 本発明の装置のマトリクスの形状の一例を
示す斜視図である。

【図１１】 実施例２の実験を説明する模式図である。

【図１２】 実施例２の実験結果を示すグラフである。

【図１３】 実施例３に用いた分析装置を示す模式図で
ある。

【図１４】 実施例３の測定結果を示すグラフである。

【図１５】 実施例４（２）で作製した分析装置を示す
模式図である。

【図１６】 実施例４（３）の測定結果を示すグラフで
ある。

【図１７】 実施例４（４）で作製した分析装置を示す
模式図である。

【図１８】 実施例４（５）の測定結果を示すグラフで
ある。

【図１９】 実施例４（６）で作製した分析装置を示す
模式図である。

【図２０】 実施例４（７）で作製した分析装置を示す
模式図である。

【図２１】 実施例５（３）で作製した分析装置を示す
斜視図である。

【図２２】 実施例８で作製した分析装置の組立て図で
ある。

【図２３】 Ａは図２２の装置の測定時の状態を示す斜
視図であり、Ｂはその断面図である。

【符号の説明】

ａ 試料導入部 ｂ マトリクス ｃ 検出部 ｄ 吸収部 ｅ 支持体（あるいは基板） ｆ カバー ｇ 孔 ｓ 信号 １ 特異結合分析装置 １１ 信号物質
発生体 １２ 信号物質の発生に関与する物質 １３ 信号物質 １４ 分析対象
物 １５ 信号の発生に関与する物質 ２０ 試料液の
浸透方向 ２１ 試料導入口 ２２ 上部板 ２３ 連通部 ２４ 対極およ
び参照極 ２５ 作用極 ２６ 参照極端
子 ２７ 作用極端子 ２８ シール部 ２９ 貫通孔 ３０ 試料導入
用濾紙部

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) G01N 33/558 G01N 33/542 G01N 33/543 G01N 33/557

Claims (23)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】分析対象物と、それに特異的に結合する特
   異結合物質との少なくとも１つの特異結合反応に関連し
   て試料中の分析対象物を定性もしくは定量する方法であ
   って、分析対象物を含有することが予測される試料をマ
   トリクスを通して検出部に導入するに際し、前記分析対
   象物と前記特異結合物質との特異結合反応によって信号
   物質発生体の前記マトリクス内での分布を分析対象物量
   に関して変化させ、前記信号物質発生体によって発生さ
   れ、かつ、検出部においてのみ検出可能な信号を発生す
   るあるいは発生させる信号物質を媒介として、前記信号
   物質発生体の前記マトリクス内での検出部からの距離の
   分布または検出部との相対位置の分布の変化を前記信号
   の変調の程度として計測することにより、前記試料中の
   分析対象物を定性もしくは定量することを特徴とする特
   異結合分析方法。
2. 【請求項２】分析対象物と、それに特異的に結合する特
   異結合物質との少なくとも１つの特異結合反応に関連し
   て試料中の分析対象物を定性もしくは定量する方法であ
   って、 分析対象物を含有することが予想される液性試料を、分
   析対象物を展開する場となるマトリクス内に導入するに
   際し、 （１）該マトリクス内で該分析対象物と第１の特異結合
   物質とを反応させるか、あるいは、 （２）該マトリクス外で該分析対象物と第１の特異結合
   物質とを反応させた後にマトリクスに導入し、 この特異結合反応によって、 第２の特異結合物質であるか、または第１の特異結合物
   質に対して分析対象物と競合する物質であり、かつ検出
   部においてのみ検出可能な信号を発生するあるいは発生
   させる信号物質を発する信号物質発生体をマトリクス内
   に分布させ、 分析対象物量に応じた検出部からの距離の分布または検
   出部との相対位置の分布の変化を、 該信号物質発生体から発生される信号物質の物質移動に
   律速される信号の変調として、検出部で検出することを
   特徴とする特異結合分析方法。
3. 【請求項３】分析対象物と、それに特異的に結合する特
   異結合物質との少なくとも１つの特異結合反応によっ
   て、試料中の分析対象物を展開する場となるマトリクス
   内に導入するに際し、 （１）該マトリクス内で該分析対象物と、特異結合物質
   に対して分析対象物と競合する物質とを、特異結合物質
   でありかつ検出部においてのみ検出可能な信号を発生す
   るあるいは発生させる信号物質を発する信号物質発生体
   に対して競合的に反応させるか、あるいは、 （２）該マトリクス外で該分析対象物と、特異結合物質
   に対して分析対象物と競合する物質とを、特異結合物質
   でありかつ検出部においてのみ検出可能な信号を発生す
   るあるいは発生させる信号物質を発する信号物質発生体
   に対して競合的に反応させた後にマトリクスに導入し、 この特異結合反応によって、 該信号物質発生体をマトリクス内に分布させ、 分析対象物量に応じた検出部からの距離の分布または検
   出部との相対位置の分布の変化を、該信号物質発生体か
   ら発生される信号物質の物質移動に律速される信号の変
   調として、検出部で検出することを特徴とする特異結合
   分析方法。
4. 【請求項４】検出部が、信号物質が発生するあるいは発
   生させる信号の生成または検出に必須な成分もしくは必
   須な部材の１つが実質的に不動化されてなる検出部であ
   る請求項１〜３のいずれかに記載の特異結合分析方法。
5. 【請求項５】前記信号が電子移動である請求項１〜４の
   いずれかに記載の特異結合分析方法。
6. 【請求項６】前記計測が電気量あるいは電流量の計測で
   ある請求項５に記載の特異結合分析方法。
7. 【請求項７】前記信号が呈色、蛍光または発光である請
   求項１〜４のいずれかに記載の特異結合分析方法。
8. 【請求項８】前記信号物質発生体が酵素を含むものであ
   る請求項１〜７のいずれかに記載の特異結合分析方法。
9. 【請求項９】請求項１〜４のいずれかに記載の分析方法
   を実施する装置であって、 試料導入部（ａ）、マトリクス（ｂ）前記マトリクス内
   の前記信号物質発生体の検出部（Ｃ）からの距離の分布
   または検出部との相対位置の分布の変化を、該信号物質
   発生体から発生される信号物質の物質移動に律速される
   信号として検出しうる検出部（ｃ）および必要により吸
   収部（ｄ）を有することを特徴とする特異結合分析装
   置。
10. 【請求項１０】分析対象物を含有することが予測される
    試料の流れ方向でみて上流側から順に試料導入部
    （ａ）、マトリクス（ｂ）、検出部（ｃ）および必要に
    より吸収部（ｄ）が配設され、少なくとも１つの信号物
    質の発生に関与する物質が、前記試料導入部（ａ）、前
    記マトリクス（ｂ）、前記検出部（ｃ）および必要によ
    り配設される吸収部（ｄ）のうちの少なくとも１ケ所に
    備えられている請求項９に記載の特異結合分析装置。
11. 【請求項１１】前記信号物質の発生に関与する物質が前
    記検出部（ｃ）近傍および／または吸収部（ｄ）にある
    請求項１０に記載の特異結合分析装置。
12. 【請求項１２】前記マトリクス（ｂ）が多孔質材料製で
    ある請求項９〜１１のいずれかに記載の特異結合分析装
    置。
13. 【請求項１３】前記マトリクス（ｂ）が試料吸収時にゲ
    ル状態もしくはゾル状態となる物質を含む請求項９〜１
    ２のいずれかに記載の特異結合分析装置。
14. 【請求項１４】前記マトリクス（ｂ）が積層体である請
    求項９〜１３のいずれかに記載の特異結合分析装置。
15. 【請求項１５】前記マトリクス（ｂ）が前記分析対象物
    に対する特異結合物質を含む請求項９〜１４のいずれか
    に記載の特異結合分析装置。
16. 【請求項１６】前記特異結合物質が前記マトリクス
    （ｂ）に不溶化されてなる請求項１５に記載の特異結合
    分析装置。
17. 【請求項１７】前記特異結合物質が濃度傾斜をもって分
    布している請求項１５または１６に記載の特異結合分析
    装置。
18. 【請求項１８】前記試料導入部（ａ）および／または前
    記マトリクス（ｂ）の上流部に信号物質発生体が備えら
    れている請求項９〜１７のいずれかに記載の特異結合分
    析装置。
19. 【請求項１９】前記検出部（ｃ）が電極である請求項９
    〜１８のいずれかに記載の特異結合分析装置。
20. 【請求項２０】前記試料導入部（ａ）、前記マトリクス
    （ｂ）、前記検出部（ｃ）および前記吸収部（ｄ）のう
    ちの少なくとも１ヶ所に存在する前記信号物質の発生に
    関与する物質が、信号物質の前駆物質である基質である
    請求項１９に記載の特異結合分析装置。
21. 【請求項２１】前記試料導入部（ａ）、前記マトリクス
    （ｂ）、前記検出部（ｃ）および前記吸収部（ｄ）のう
    ちの少なくとも１ヶ所に存在する前記信号物質の発生に
    関与する物質が、酵素反応の基質および／または電子メ
    ディエータである請求項１９に記載の特異結合分析装
    置。
22. 【請求項２２】請求項９〜１８のいずれかに記載の、そ
    の使用時に酵素の二段階反応の結果として信号が生成さ
    れる装置であって、前記検出部（ｃ）が酵素電極である
    特異結合分析装置。
23. 【請求項２３】請求項９〜１８のいずれかに記載の、そ
    の使用時に酵素の二段階反応の結果として信号が生成さ
    れる装置であって、前記検出部（ｃ）が、前記酵素の二
    段階反応の二段目に係る酵素および／または基質を実質
    上不動化してなる部分であり、前記試料導入部（ａ）、
    前記マトリクス（ｂ）、前記検出部（ｃ）および前記吸
    収部（ｄ）のうちの少なくとも１ヶ所に存在する前記信
    号物質の発生に関与する物質が、前記酵素の二段階反応
    の一段目に係る基質である特異結合分析装置。