KR100455907B1 - 대면형 다공성 전극을 이용한 비분리형 효소-면역센서 - Google Patents

대면형 다공성 전극을 이용한 비분리형 효소-면역센서 Download PDF

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Abstract

본 발명은 대면형 다공성 전극을 이용한 비분리형 효소-면역센서에 관한 것으로, 구체적으로 전극연결부; 상기 전극연결부 일단에 형성된 다공성 작동전극; 상기 작동전극면을 제외한 부분은 절연막으로 구성된 1 전극계; 상기 전극연결부 상에 형성된 작동전극과 대면 위치에 형성된 다공성 보조/기준 전극; 및 상기 보조/기준 전극면을 제외한 부분은 절연막으로 구성된 2 전극계; 상기 전극계 사이에 삽입된 다공성 박막; 및 상기 다공성 전극상에 분석 물질에 따라 기능이 다른 패드가 적층되는 것을 특징으로 하는 비분리형 효소-면역센서에 관한 것이다. 본 발명의 비분리형 효소-면역센서는 높은 민감도 및 선택성을 가지며, 다공성 박막의 공극을 통한 확산이동을 이용하여 분리단계를 생략할 수 있기 때문에 신속하고 간편하며 소형화가 가능하고, 측정장소의 제약을 받지 않아 현장 측정용 일회용 센서의 개발이 가능하다.

Description

대면형 다공성 전극을 이용한 비분리형 효소-면역센서{Non-separation type enzyme-immunsensor using parallel microporous electrodes}
본 발명은 전극연결부(3); 상기 전극연결부(3) 일단에 형성된 다공성 작동전극(2); 상기 작동전극(2) 면을 제외한 부분은 절연막(1)으로 구성된 1 전극계; 상기 전극연결부(3) 상에 형성된 작동전극(2)과 대면 위치에 형성된 다공성 보조/기준 전극(5); 및 상기 보조/기준 전극(5) 면을 제외한 부분은 절연막(1)으로 구성된 2 전극계; 상기 전극계 사이에 삽입된 다공성 박막(4); 및 상기 다공성 박막(4)이 삽입되지 않은 면의 다공성 전극상에 완충패드, 효소접합체패드, 및 기질패드 중 하나 이상의 패드가 적층되는 것을 특징으로 하는 비분리형 효소-면역센서에 관한 것이다.
최근 질병을 진단하고 예방하거나, 식품화학 또는 공업화학분야에서 특정 공정을 위하여 또는 환경분야에서 오염물질을 분석하기 위하여 시료중의 유기물 또는 무기물 농도측정에 대한 필요성이 증대되고 있다. 이와 같은 생체시료(혈액, 뇨 등), 식품 및 공업시료, 환경시료에 존재하는 미량의 유기물 또는 무기물 농도를 측정하는 방법으로 초기에는 화학적 방법이 많이 이용되었다. 그러나 이러한 화학적 방법은 실험조건에 매우 민감하고, 다른 물질의 방해작용이 크며, 다량의 시료가 필요하다는 단점이 있다.
반면에 소량의 시료를 이용하여 선택성과 정확성이 뛰어나며, 조작이 간편한면역분석법(enzyme immunoassay; EIA)은 시료 내에 극미량 존재하는 단백질(대사물질), 호르몬, 아미노산, 비타민 또는 화학약품 등을 선택적으로 검출하기 위한 유용한 분석도구로서, 현재까지 많은 임상학적 분석분야에서 이용되고 있다.
효소면역분석법은 결합물질(항체, binding protein등의 binder)에 면역결합된 분석물질-효소 접합체와 면역결합되지 않은 분석물질-효소 접합체의 분리 유무에 따라 용액상 면역분석법과 고체상 면역분석법으로 분류할 수 있다. 또한 분석물질/결합물질(항원/항체)간의 결합효용에 따라 경쟁 및 비경쟁 분석법으로 분류할 수 있다.
용액상 효소면역분석법은 분석물질의 농도에 따른 표지효소의 촉매활동도 변화를 분석의 신호로 이용한다. 즉 분석물질-효소 접합체에 결합되는 결합물질에 의해 유도되는 입체장애로 인해, 억제되는 표지효소의 촉매활동도 변화를 분석신호로 이용하게 된다. 따라서 면역결합에 참여하지 않은 분석물질-효소 접합체의 분리단계가 필요하지 않으며, 이로 인해 연속자동화 분석 및 신속한 분석이 가능하다. 그러나 이 방법은 자동화되지 않은 경우 매 측정 시 실험조건이 바뀔 수 있고 생물학적 시료의 범위에 존재하는 광범위한 화합물의 분석을 위한 전기화학적 검출에 한계가 있다.
반면 고체상 효소면역분석법의 여러 가지 방법들 중 비경쟁-샌드위치 분석법은 우수한 민감도 및 특이성을 나타낸다. 주어진 시료 및 표준물질 내의 분자량이 큰 단백질 분석물질인 병원균, 바이러스, 세포 등은 고체상 결합단백질 또는항체(immobilized binding protein or antibody)에 결합되고, 세척 후에 2 차 항 단백질 결합물질-효소 접합체가 결합하게 된다. 따라서 고체상에 남는 표지효소의 양은 분석물질의 양에 비례하게 된다. 그 후 결합되지 않은 2 차 항 단백질 결합물질-효소 접합체를 세척하여 제거한 뒤 고체상에 면역결합으로 남아있는 표지효소의 양을 기질과의 반응속도 측정으로 알 수 있다. 이러한 방법은 호르몬, 바이러스, 암세포 등의 진단상의 단백질 검출에 일반적으로 사용되고 있다.
이에 비해 분자량이 5000 Da 이하의 작은 분석물질인 헵텐을 분석하는 방법으로는 경쟁분석법이 사용되며 비타민, 약물, 환경독소물질을 검출하는데 이용된다. 경쟁분석법은 분석물질에 대한 특정 결합단백질 및 합성된 항체를 결합물질로 이용하며, 한정된 양의 고체상 결합물질에 대하여 분석물질과 분석물질-효소 접합체가 경쟁적으로 면역결합하게 되고, 결합하지 않은 분석물질은 세척을 통하여 제거한 후, 신호 발생 기질을 가하면 분석물질의 농도에 반비례하여 남아 있는 효소표지의 양을 검출하게 된다. 고체상 면역분석법은 가장 널리 사용되는 방법임에도 불구하고 분석과정 중에 반드시 번거로운 세척과정이 포함되어야 하는 단점이 있다.
비분리형 고체상 효소면역분석법은 고체상 면역분석법의 높은 민감도 및 선택성을 가진다. 다공성 작동전극 상에 항체나 단백질 결합물질을 물리ㆍ화학적인 방법으로 고정시키고 고안된 셀(cell)에 장착한 뒤 전극면에서 고정된 항체의 결합자리에 대하여 분석물질과 분석물질-효소 접합체를 함께 배양함으로서 경쟁결합을유도한다. 그 후 일정 전위를 걸어주고, 다공성 박막의 뒤쪽 (즉, 보조/기준전극면)에서 대면의 다공성 전극내의 공극을 통해 일정 속도로 빠르게 확산되는 기질은 표면에 결합된 효소 접합체와 기질-효소 반응을 통해 생성된 산화 및 환원의 생성물로 되고 상기 생성물은 전극에서 계속 분해되고 전기화학 반응을 통해 검출하게 된다. 비분리형 고체상 효소면역분석법은 원리상 세척과정을 필요로 하지 않으므로 기존의 고체상 효소면역분석법의 단점을 보완할 뿐만 아니라, 경우에 따라서는 더 우수한 검출한계를 제공하고, 시료 패드를 전극의 앞뒷면에 도입하여 건조화학분석 키트(dry chemistry kit)로 제작할 수 있는 장점들을 갖는다.
이때, 작동전극면에 형성되는 효소층의 효소표지 양에 따라 기질의 반응속도에 영향을 주고, 상기 효소표지의 양은 분석물질의 농도에 관계된다. 분석물질의 양이 많은 경우, 한정된 양의 고정된 결합자리에 대하여 분석물질-효소 접합체의 면역결합 정도는 감소하게 되고 전극부위의 효소표지 양이 감소한다. 따라서 막의 뒤쪽에서 일정 속도로 빠르게 확산되는 기질의 반응속도가 감소하게 되고 전기적 신호의 크기도 작게 된다. 반면 분석물질의 양이 적은 경우, 경쟁하는 분석물질-효소 접합체의 양이 증가하여 큰 신호를 내게된다.
분석법의 경쟁적 성질에 기인하여 전류값의 크기는 시료내의 분석물질의 농도에 반비례하게 된다. 분석을 위한 검출 특성은 효소 접합체의 잔류활동도, 기질의 순도 및 전극의 물리적 특성에 의존한다. 또한 고정화되는 결합물질의 양, 첨가되는 기질의 양에 의해서도 전기적 검출특성은 달라질 수 있다. 고체상 면역분석법의 경우 가역적인 상호작용이 불가능하므로 한번 면역 결합된 전극은 일회용으로사용된다.
이에 본 발명자들은 상기에서 상술한 비분리형 고체상 효소-면역분석법을 이용하여 전극연결부(3); 상기 전극연결부(3) 일단에 형성된 다공성 작동전극(2); 상기 작동전극(2) 면을 제외한 부분은 절연막(1)으로 구성된 1 전극계; 상기 전극연결부(3) 상에 형성된 작동전극(2)과 대면 위치에 형성된 다공성 보조/기준 전극(5); 및 상기 보조/기준 전극(2) 면을 제외한 부분은 절연막(1)으로 구성된 2 전극계; 상기 전극계 사이에 삽입된 다공성 박막(4); 및 상기 다공성 박막(4)이 삽입되지 않은 면의 다공성 전극상에 완충패드, 효소접합체패드, 및 기질패드 중 하나 이상의 패드가 적층되는 것을 특징으로 하는 비분리형 효소-면역센서를 제작하였고, 고가의 분광기나 복잡한 검출기기를 사용하지 않고 소형화된 형태로 현장측정(point-of-care testing)이 가능함을 알아냄으로서 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 전극연결부(3); 상기 전극연결부(3) 일단에 형성된 다공성 작동전극(2); 상기 작동전극(2) 면을 제외한 부분은 절연막(1)으로 구성된 1 전극계; 상기 전극연결부(3) 상에 형성된 작동전극(2)과 대면 위치에 형성된 다공성 보조/기준 전극(5); 및 상기 보조/기준 전극(5) 면을 제외한 부분은 절연막(1)으로 구성된 2 전극계; 상기 전극계 사이에 삽입된 다공성 박막(4); 및 상기 다공성 박막(4)이 삽입되지 않은 면의 다공성 전극상에 완충패드, 효소접합체패드, 및 기질패드 중 하나 이상의 패드가 적층되는 것을 특징으로 하는 비분리형 효소-면역센서를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 다공성 작동 전극상에 물리ㆍ화학적으로 고정된 항체 또는 분자인지 물질과 시료주입에 의해 전극면에서 면역 반응에 참여하는 효소-분석물질 접합체 및 대면의 다공성 보조/기준 전극 및 다공성 박막을 통해 확산 이동하는 기질을 포함하는 면역 결합 반응에 기초한 효소-면역센서를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 전기화학적 측정이 가능한 효소-기질 시스템을 도입한 본 발명의 대면형 다공성 전극을 포함하는 소형 일회용 효소-면역센서를 제공하는 것이다.
도 1a는 본 발명의 대면형 다공성 전극의 분해사시도이고,
도 1b는도 1a의 대면형 다공성 전극의 결합사시도를 도시한 것이고,
도 1c는도 1b의 대면형 다공성 전극에 표시된 ㄱ-ㄱ' 직선의 단면도이고,
도 1d는도 1b의 대면형 다공성 전극에 표시된 ㄴ-ㄴ' 직선의 단면도이고,
도 2는 본 발명의 대면형 다공성 전극을 포함하는 비분리형 효소-면역센서의 분석원리 연구를 위해 고안된 셀에 전극을 장착한 구조도이고,
도 3a는 본 발명의 대면형 다공성 작동전극 상에 시료 도입을 위한 완충 패드 및 효소 접합체 패드가 순차적으로 적층되어 센서의 전면부에 장착된 단백질 분석을 위한 효소-면역센서를 도시한 것이고,
도 3b는도 3a의 단백질 분석을 위한 효소-면역센서에 표시된 ㄱ-ㄱ' 직선의 단면도이고,
도 3c는도 3a의 단백질 분석을 위한 효소-면역센서에 표시된 ㄴ-ㄴ' 직선의 단면도이고,
도 3d는도 3a의 단백질 분석을 위한 효소-면역센서를 제작하는 단계도이며,
도 4a는 본 발명의 대면형 다공성 작동전극 상에 효소 접합체 패드가 적층되어 센서의 후면부에 장착된 헵텐 분석을 위한 효소-면역센서를 도시한 것이고,
도 4b는도 4a의 헵텐 분석을 위한 효소-면역센서에 표시된 ㄱ-ㄱ' 직선의 단면도이고,
도 4c는도 4a의 헵텐 분석을 위한 효소-면역센서에 표시된 ㄴ-ㄴ' 직선의 단면도이고,
도 4d는도 4a의 헵텐 분석을 위한 효소-면역센서를 제작하는 단계도이며,
도 5a는 본 발명의 대면형 다공성 작동전극 상에 시료 도입을 위한 완충 패드, 효소 접합체 패드 및 미세 다공성 박막이 추가 적층되어 센서의 전면부에 장착된 단백질 방해작용을 줄인 효소-면역센서를 도시한 것이고,
도 5b는도 5a의 효소-면역센서에 표시된 ㄱ-ㄱ' 직선의 단면도이고,
도 5c는도 5a의 효소-면역센서에 표시된 ㄴ-ㄴ' 직선의 단면도이고,
도 6는 본 발명의 비분리형 효소-면역센서 (도 3, 도 4, 도 5)의 외형이며,
도 7는 본 발명의 대면형 다공성 전극을 고안된 셀에 장착하여 (도 2) 다공성 작동전극 상에 아비딘(avidin)을 고정시키고, 바이오틴(biotin)과 글루코오스 산화 환원효소-바이오틴 접합체를 이용하여 측정한 바이오틴 표준용액에 대한 검정곡선이고,
도 8는 본 발명의 비분리형 효소-면역센서에 아비딘을 고정시키고 바이오틴 및 글루코오스 산화 환원효소를 이용하여 바이오틴의 양에 따른 전류값 및 아비딘이 존재하지 않을 때의 전류값에 대한 동적감응곡선이고,
a : 10-12M의 바이오틴이 존재할 때
b : 10-4M의 바이오틴이 존재할 때 및
c : 아비딘이 존재하지 않을 때 전류값의 감응이며,
도 9는 본 발명의 비분리형 효소-면역센서에 아비딘을 고정시키고 바이오틴 및 알카리 포스페이트 수화효소를 이용하여 바이오틴의 양에 따른 전류값 및 아비딘이 존재하지 않을 때의 전류값에 대한 동적감응곡선이다.
a : 10-12M의 바이오틴이 존재 할 때
b : 10-4M의 바이오틴이 존재할 때 및
c : 알카리 포스페이트 수화효소가 존재하지 않을 때 4-아미노페닐포스페이트 자체의 전류값의 변화이다.
<도면의 주요 부분에 관한 부호의 설명>
1: 절연막 2: 다공성 작동전극
3: 전극연결부 4: 다공성 박막
5: 다공성 보조/기준전극 6: 시료도입을 위한 완충패드
7: 효소 접합체 패드 8: 기질패드
9: 미세 다공성 박막 10: 시료주입구
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 전극연결부(3); 상기 전극연결부(3) 일단에 형성된 다공성 작동전극(2); 상기 작동전극(2) 면을 제외한 부분은 절연막(1)으로 구성된 1 전극계; 상기 전극연결부(3) 상에 형성된 작동전극(2)과 대면 위치에 형성된 다공성 보조/기준 전극(5); 및 상기 보조/기준 전극(5) 면을 제외한 부분은 절연막(1)으로 구성된 2 전극계; 상기 전극계 사이에 삽입된 다공성 박막(4); 및 상기 다공성 박막(4)이 삽입되지 않은 면의 다공성 전극상에 완충패드, 효소접합체패드, 및 기질패드 중 하나 이상의 패드가 적층되는 대면형 다공성 전극을 포함하는 비분리형 효소-면역센서를 제공한다.
상기 다공성 작동전극 상에는 항체 또는 분자인지 물질이 고정되며, 분석물질의 종류에 따라 다공성 작동전극 및 다공성 보조/기준전극 상에 기능이 다른 패드가 적층될 수 있으며 상기 패드의 순서 및 위치가 변형될 수 있고, 그에 따라 시료주입구의 위치와 개수도 달라질 수 있다.
이하 첨부된 도면을 기초로 본 발명을 보다 상세히 기술한다.
도 1a는 본 발명의 대면형 다공성 전극의 분해사시도이며, 전극연결부(3); 상기 전극연결부(3) 일단에 형성된 다공성 작동전극(2); 상기 전극연결부(3) 및 작동전극(2)을 제외한 부분은 절연막(1)으로 구성된 1 전극계; 상기 전극연결부(3) 상에 형성된 작동전극(2)과 대면 위치에 형성된 별도의 전극연결부(3) 일단에 다공성 보조/기준 전극(5); 상기 전극연결부(3) 및 상기 보조/기준 전극(5)을 제외한 부분은 절연막(1)으로 구성된 2 전극계; 및 상기 전극계 사이에 삽입된 다공성 박막(4)을 포함한다.
상기 다공성 박막은 망사와 같은 구조를 가지고 있으며 실제 대면형 다공성 전극은 스크린인쇄법과 침착법을 포함하는 물리적 증기 증착법 또는 화학적 증기 증착법을 이용하여, 은, 백금, 금 및 팔라듐 등의 전극형성물질이 다공성 박막(4)위에 인쇄된 형태이며 상기 절연막(1)은 전극면 (2, 5)및 전극 연결부(3)를 제외하고 다공성 박막(4)내로 흡수되어 고형화된다. 따라서 물질의 이동은 다공성 작동전극(2) 및 대면의 다공성 보조/기준전극(5) 면을 통해서만 이루어진다.
도 1b는도 1a의 대면형 다공성 전극의 결합사시도이며, 다공성 박막(4)의 앞 뒷면의 일측에 원형의 다공성 작동전극(2) 및 다공성 보조/기준 전극(5)이 대면형으로 형성되고, 동일 크기와 형태의 구멍이 구비되도록 절연막(1) 층으로 도포되고, 상기 절연막(1)은 전극면 부위를 제외하고 다공성 박막(4) 내부로 침투하여 공극을 채우고 다공성 전극계를 보호한다. 전극면과 전극연결부는 전기적으로 연결되며 공극은 원형의 전극면에만 존재한다.(도 1c및도 1d참조)
도 2는 본 발명의 대면형 다공성 전극을 포함하는 비분리형 효소-면역센서의 분석원리 연구를 위해, 고안된 셀에 전극을 장착한 구조를 도시한 것이다.도 2에서보는 바와 같이, 대면형 다공성 전극은 구멍이 뚤린 U 자형의 셀 사이에 장착되어 2 개의 반응기 사이의 격막 역할을 수행한다. 다공성 작동 전극(2) 및 다공성 보조/기준전극(5)은 정전압 회로에 연결되며 각각의 반응기에는 자석 교반기가 위치한다. 상기 고안된 셀은 본 발명의 대면형 다공성 전극을 포함하는 비분리형 효소-면역센서의 시료도입을 위한 완충패드(6) 및 기질 패드(7)의 역할을 수행한다. 분석물질-효소 접합체는 시료와 혼합되어 셀 내에 주입된다.
도 3a는 본 발명의 다공성 작동전극 상에 시료 도입을 위한 완충 패드 및 효소 접합체 패드가 순차적으로 적층되어 센서의 전면부에 장착된 단백질 분석을 위한 효소-면역센서를 도시한 것이다. 보다 상세하게는 전극연결부(3); 상기 전극연결부(3) 일단에 형성된 다공성 작동전극(2); 상기 작동전극(2) 면을 제외한 부분은 절연막(1)으로 구성된 1 전극계; 별도의 전극연결부(3) 상에 형성된 작동전극(2)과 대면 위치에 형성된 다공성 보조/기준 전극(5); 및 상기 보조/기준 전극(5) 면을제외한 부분은 절연막(1)으로 구성된 2 전극계; 상기 전극계 사이에 삽입된 다공성 박막(4); 및 상기 다공성 작동전극(2) 상에 시료 도입을 위한 완충 패드(6) 및 효소 접합체 패드(7)가 순차적으로 적층되어 센서의 전면부에 장착되고, 다공성 보조/기준 전극(5) 상에 기질패드(8)가 적층되어 센서의 후면부에 장착된 구조이다.
상기도 3a는 본 발명의 비분리형 효소-면역분석 센서의 대표적인 유형이며 분석대상 물질이 병원균, 바이러스 및 세포 등의 거대 단백질로부터 호르몬, 비타민, 약물 및 환경독소물질의 헵텐까지 사용할 수 있다. 시료도입을 위한 완충패드(6)에는 완충용액 및 단백질 안정제 등이 결정형태로 포함되어 있으며 소량의 시료주입으로 용해되어 면역반응에 최적의 조건을 맞추게 된다. 또한 추가 적층되는 효소 접합체 패드에서 시료와 혼합된 효소-분석물질 접합체가 균일하게 혼합되어 다공성 작동전극(2) 면에 고정된 항체 또는 결합물질과 반응할 수 있도록 가교역할을 수행하며 흐름속도를 조절한다.
도 3d는도 3a의 단백질 분석을 위한 효소-면역센서를 제작하는 단계도로서, 다공성 작동전극(2)상에 적층된 시료도입을 위한 완충 패드(6) 및 효소 접합체 패드(7) 상부에 시료주입구(10)가 구비되고, 다공성 보조/기준 전극(5) 상에 적층된 기질패드 상에 별도의 시료주입구(10)를 통하여 기질이 주입되도록 한다.
상기 다공성 작동전극(2) 측의 시료주입구(10)을 통해 소량의 시료를 주입하고 센서를 정전압 회로 측정기에 연결하여 일정 전위를 걸어준 후 센서의 후면부에위치한 대면형 다공성 보조/기준 전극(5) 측의 시료주입구(10)을 통해서 기질을 주입하면 공극을 통해 확산되는 기질은 표면에 면역결합된 효소 접합체와 기질-효소 촉매반응을 통해 전극반응이 가능한 산화 및 환원 형태의 생성물로 되고 이물질은 전극에서 계속 분해되어 전기화학 반응을 통해 분석신호를 얻게된다.
도 4a는 본 발명의 다공성 작동전극 상에 효소 접합체 패드가 적층되어 센서의 후면부에 장착된 헵텐 분석을 위한 효소-면역센서의 일예를 도시한 것으로, 전극연결부(3); 상기 전극연결부(3) 일단에 형성된 다공성 보조/기준 전극(5); 상기 다공성 보조/기준 전극(5)을 제외한 부분은 절연막(1)으로 구성된 1 전극계; 상기 전극연결부(3) 상에 형성된 다공성 보조/기준 전극(5)과 대면 위치에 형성된 작동전극(2); 및 상기 작동전극(2)을 제외한 부분은 절연막(1)으로 구성된 2 전극계; 상기 전극계 사이에 삽입된 다공성 박막(4); 및 상기 다공성 보조/기준 전극(5) 상에 기질패드(8)가 적층되어 센서의 전면부에 장착되며 다공성 작동전극(2)상에 효소 접합체 패드(7)가 적층되어 센서의 후면부에 장착된 구조이다.
상기도 3a의 단백질 분석을 위한 비분리형 효소-면역센서와는 달리, 다공성 작동전극(2) 상에 효소 접합체 패드(7)가 적층되어 센서의 후면부에 장착되어 헵텐 분석을 위한 효소-면역센서이다. 시료중의 분석 물질이 센서의 전면부에 위치한 기질 패드(8)에 주입되어 다공성 박막(4)의 공극을 통과하여 시료도입을 위한 완충 패드 역할을 동시에 수행하는 효소-접합체 패드(7)에서 효소-분석물질 접합체와 혼합되어 면역 반응에 참여하게 되고, 일정 시간 후 전면부의 기질 패드(8) 측을 통해 연속적으로 기질 주입이 가능하며, 다공성 보조/기준 전극(5)이 거대 단백질의 필터 역할을 하여 소량의 시료측정 시 별도의 처리없이 분리할 수 있으며, 따라서 작은 분자량의 분석물질 검출에 효과적이다. 효소-접합체 패드(7)가 시료도입을 위한 완충 패드 역할을 겸하고 연속적인 시료 도입이 가능함으로써, 기질 패드의 상부에 한 개의 시료주입구를 포함할 수 있으므로 센서 사용에 간편하다(도 4d참조).
도 5a는 본 발명의 다공성 작동전극 상에 시료 도입을 위한 완충 패드, 효소 접합체 패드 및 미세 다공성 박막을 추가 적층되어 센서의 전면부에 장착되어 단백질 방해작용을 줄인 효소-면역센서를 도시한 것이다. 보다 구체적으로는 전극연결부(3); 상기 전극연결부(3) 일단에 형성된 다공성 작동전극(2); 상기 작동전극(2) 면을 제외한 부분은 절연막(1)으로 구성된 1 전극계; 별도의 전극연결부(3) 상에 형성된 작동전극(2)과 대면 위치에 형성된 다공성 보조/기준 전극(5); 및 상기 보조/기준 전극(5) 면을 제외한 부분은 절연막(1)으로 구성된 2 전극계; 상기 전극계 사이에 삽입된 다공성 박막(4); 및 상기 다공성 작동전극(2)상에 상에 시료 도입을 위한 완충 패드(6), 효소 접합체 패드(7) 및 미세 다공성 박막(9)가 순차적으로 적층되어 센서의 전면부에 장착되고, 다공성 보조/기준 전극(5) 상에 기질패드가 적층되어 센서의 후면부에 장착된 구조이다.
상기 미세 다공성 박막을 추가 적층함으로써 소량의 시료를 사용하는 경우 다른 거대 단백질에 의한 흡착 및 전극반응으로 인한 오차를 줄일 수 있다. 또한추가 적층되는 미세 다공성 박막(9)는 다른 기능을 가지는 패드로 대체 가능하며 이 경우 크로마토그래피 기능을 이용하여 산화제 및 환원제 필터로 사용이 가능하다.
도 6은 본 발명의 비분리형 효소-면역센서(도 3, 도 4, 도 5)의 외형이며, 상기 비분리형 효소-면역센서는 패드 두께 만큼의 양면 테이프로 상ㆍ하부에 폴리에틸렌 필름을 붙혀 압측하여 제작되고 최종적으로 다공성 전극의 위쪽과 아래쪽으로 시료주입구가 구비되어 시료도입 및 기질의 도입을 가능하게 한다. 단, 분석물질의 크기가 작은 경우도 4a의 센서 제작이 바람직하며 이때는 센서의 전면부의 장착된 다공성 전극 상에 1 개의 시료주입구가 구비되어 시료 및 기질의 연속적인 도입을 가능하게 한다.
상기 다공성 박막(4)의 재료는 나일론 망사, 나이트로셀룰오즈, 거름종이, 유리섬유막 및 나이론의 유기 고분자 및 흡수성 세라믹으로 구성되는 무기 고분자로 구성되는 군에서 선택되는 것이 바람직하나, 이들에 한정되는 것은 아니며 모세관을 통하여 시료를 도입하고, 이를 흡수할 수 있는 물질이면 특별히 그 종류에 제한되지 아니하며, 시료 및 기질의 흐름 통로 역할 및 분리막의 역할을 동시에 할 수 있는 물질이면 모두 사용 가능하다.
이 때, 사용된 다공성 박막(4)의 공극의 크기는 0.2 ∼ 0.45 μm 이며, 이러한 공극간을 단백질은 통과할 수 없는 반면에 분자량 5000 Da 이하의 작은 물질 및기질 등은 자유롭게 확산 이동할 수 있다.
본 발명에서 사용한 다공성 작동전극(2) 및 다공성 보조/기준 전극(5)은 은, 백금, 금 및 팔라듐 등의 전도성이 있는 금속을 사용하거나 탄소 또는 전도성 고분자의 다양한 다공성 전극 물질을 도입하였다. 상기 다공성 전극계는 다공성 박막(4)의 앞 뒷면에 다공성 작동전극(2)과 다공성 보조/기준 전극(5)을 동시에 형성하고 동일한 소재의 전극물질을 도포함으로써 전극의 제작이 간편하고 소형화가 가능하다. 도포된 전극의 두께에 따라 기질의 확산이동 속도 및 감응 크기가 달라지며, 바람직한 전극의 두께는 450 ∼ 600 Å로 한다.
상기 다공성 작동전극(2) 표면에 항체 또는 분자인지 물질을 전극에 고정화하는 방법은 물리적ㆍ화학적인 방법이 병행될 수 있으며, 상기 물리적 흡착방법은 전극 표면과 항체 사이의 친유성 결합력을 이용하며 항체를 희석하여 다공성 작동전극(2) 상에 적하 한 후, 4 ℃에서 16 시간동안 배양하는 것으로 수행되므로 간단하고 고정화시키는 시간이 짧다. 또한, 화학적 방법은 1 차 아민, 싸이올, 탄화수소기를 이용하여 전극표면과 항체사이의 공유결합을 유도하여 높은 밀도의 기능 분자들이 오랫동안 전극 표면에 배열될 수 있도록 유도한다.
상기 기능성 패드는 니트로셀롤오즈, 거름종이 및 유리 섬유막에서 선택된 것을 사용한다.
상기 절연막(1)은 폴리 비닐 클로라이드 (poly (vinyl chloride)) 70 % w/w 및 비스(2-에틸헥실)세바케이트 (bis(2-ethylhexyl)sebacate) 30 % w/w 로 형성한 폴리비닐 클로라이드 막을 사용하거나, 절연성 고분자 페이스트를 스크린 프린팅한후 열처리에 의해서 형성되며, 상기 절연막(1)은 전극 면적을 일정하게 유지시켜 재현성을 향상시킬 수 있다.
본 발명은 다공성 작동 전극상에 물리ㆍ화학적으로 고정된 항체 또는 분자인지 물질과 시료주입에 의해 전극면에서 면역 반응에 참여하는 효소-분석물질 접합체 및 대면의 다공성 보조/기준 전극 및 다공성 박막을 통해 확산 이동하는 기질을 포함하는 면역 결합 반응에 기초한 효소-면역센서를 제공한다.
보다 상세하기로는 비분리형 고체상 효소면역 분석법으로서, 다공성 작동전극(2) 상에 항체 또는 분자인지 물질을 물리ㆍ화학적인 방법으로 고정시키고 상기 물질이 고정된 전극 상에 적층될 효소 접합체 패드(7) 내의 효소-분석물질 접합체가 시료주입을 위한 완충 패드(6)로 확산되어 면역 반응 생성물을 만들고, 일정 시간 후 다공성 보조/기준 전극(5)을 통해 주입된 기질은 다공성 전극의 공극을 통해 확산되어 작동전극(2)의 표면에서 면역 생성물과 반응 후, 전기화학적으로 측정이 가능한 생성물을 만드므로 시료 중의 분석물질을 전기화학적 방법으로 간편하게 정량할 수 있다. 항원-항체 및 분석물질-결합 단백질간의 특이 면역 인식력을 이용한 분석법에서 면역결합은 특이 모양으로 배열된 3 개의 작용기 사이의 강한 결합으로 인해 비가역적으로 일어나며 따라서 효소-면역센서의 재사용은 불가능하다.
항원-항체간의 특이 인식력을 이용한 고체상 면역 분석법은 고정된 항체에 결합된 표지만을 분석신호물질로 이용하기 때문에 결합에 참여하지 않은 항원-표지물질 접합체는 검출 전에 제거되어야한다. 본 발명의 대면형 다공성 전극을 이용한 비분리형 효소-면역센서는 이러한 고체상 면역분석법의 원리를 가지며 다공성 박막을 통해 표지물질이 존재하지 않는 곳에서 확산 이동하는 기질에 의해 분석신호가 발생하므로 분리단계를 제거할 수 있다. 따라서 고체상 면역분석법의 특성인 높은 민감도 및 선택성을 가지면서도 복잡한 분리단계를 제거할 수 있으므로 보다 간편하고 신속하게 측정이 가능하다.
본 발명은 전기화학적 측정이 가능한 효소-기질 시스템을 도입한 대면형 다공성 전극을 포함하는 소형 일회용 효소-면역센서를 제공한다.
혈액 및 뇨 등의 체액시료와 폐수, 지표수 등의 환경시료 내의 분석물질을 측정하는 효소-면역센서의 반응과정은 사용하는 효소의 종류에 따라 다양하게 측정 가능하다. 그의 일예로, 글루코오스는 글루코오스 산화-환원효소의 촉매작용에 의해서 글루코산(gluconic acid)으로 산화되며 기질과의 촉매 반응시 H2O2를 생산하거나 O2를 소모한다. 생성된 H2O2는 Ag/AgCl 보조전극에 대하여 약 +700 mV에서 산화되어 전기적 신호로 전환된다.
다른 일예로는 알카리 포스페이트 수화효소(alkaline phosphatase)는 4-아미노페닐포스페이트(p-aminophenyl phosphate)를 기질로 사용하여 전극표면에 형성된 효소층에서 4-아미노페놀(p-aminophenol)로 되고 산화반응을 통해 약 +190 mV에서 산화되어 전류를 측정할 수 있다.
또한, 고추냉이 과산화효소(horseradish peroxidase)는 기질인 H2O2와 전자전달매개체로 사용된 Fe(Ⅱ)가 Fe(Ⅲ)로 산화되며, 생성된 Fe(Ⅲ)는 전극 표면까지 확산되는데 이때 전극표면에 Fe(Ⅲ)의 환원 전위 -100 mV를 걸어 주어 생성되는 환원전류를 측정할 수 있다. 따라서 이러한 효소들을 표지로 이용할 경우에도 전기화학적 검출법이 가능하다.
이상에서 적용한 바와 같이, 다공성 전극 위에 단백질, 아미노산, 뇨 등의 생체시료와 환경시료, 농ㆍ공업시료 또는 식품시료중의 다양한 유기물 또는 무기물 농도를 정량할 수 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<제조예 1> 대면형 다공성 금전극의 제작
대면형 다공성 금전극의 제작은 LVC-76 SEM Sputtering System을 이용하여 침착기술로 제작하였다. 전극형태가 새겨진 가림막 밑에 나일론 망사(microporous nylon membrane)(15 ×30 ㎟)을 놓은 후 진공 상태에서 아르곤 가스를 주입하면서 금 입자를 방출시켜 금이 침착되도록 하였다. 이때 반응 용기의 압력은 75 mTorr이며, 플라즈마(plasma) 전류는 25 ∼ 30 mA, 작동 전위는 350 ∼ 500 V로 사용하였다. 동일한 방법으로 다른 일면에도 금을 침착하여 대면형 다공성 금전극을 형성하였다. 형성된 다공성 금전극은 작동부위 (지름 4 ㎜)를 제외하고 폴리비닐클로라이드 (PVC) 절연막으로 도포하여 다공성 박막의 공극을 막아서 시료나 기질이 다공성 전극 부분으로만 흡수되도록 하였다. 상기 물리적 증기 증착법은 대량생산이 가능함으로써 경제적 센서의 제작이 가능하고, 유기고분자인 니트로셀룰오즈, 거름종이, 유리섬유막 및 나이론 등의 종이류에 저온에서의 전극 제작이 가능하다.
<제조예 2> 대면형 다공성 전극상에 항체 및 결합단백질 고정화
상기 제조예 1에서 제작된 대면형 다공성 전극상에 물리적인 흡착방법으로 항체를 고정화시키기 위하여 항체를 희석하여 10 μL씩 다공성 작동전극 표면에 적하하여 4 ℃에서 16 시간동안 배양하였다. 화학적 결합을 위해서 상기 제작된 다공성 전극을 무수 에탄올 및 싸이옥틱산 (thioctic acid) 용액에 12 시간동안 담갔다. 그 후 에탄올로 세척하여 싸이옥틱산의 화학적 흡착에 의해 다공성 전극이 카르복실 산으로 활성화되어 형성된다. 다시 무수 아세토나이트릴과 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필)카르보다이이미드(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)의 용액에 최종적으로 5 시간 동안 침지하여 자가 형성 단일층(self-assembled monolayer)으로 대면형 다공성 작동전극에 항체 및 결합단백질을 고정시켰다.
<실시예 1> 글루코오스 산화환원효소를 이용한 항 바이오틴 효소-면역센서
바이오틴(biotin)에 대해서 특이적인 인식력을 가진 아비딘(avidin)을 1mg/mL을 기준용액으로 1/40로 pH 9.6 carbonate 0.05 M의 완충용액에 희석한 후, 다공성 작동전극에 10 ㎕를 적하하여 4 ℃에서 16 시간이상 보관하였다. 그 후 다공성 전극의 앞면에 시료도입을 위한 완충패드(6)와 글루코오스 산화환원효소 50 ㎕를 주입하였다가 말린 효소접합체 패드(7)를 적층하여 다공성 작동전극을 형성하고, 다공성 박막의 뒷면에 대면형으로 위치한 다공성 보조/기준전극 상에 기질패드(8)를 적층하여 항 바이오틴 효소-면역센서를 제작하였다.
<실시예 2> 알카리 포스페이트 수화효소를 이용한 항 바이오틴 효소-면역센서
상기 실시예 1과 동일한 방법으로 다공성 전극을 준비한 후, 다공성 전극의 앞면에는 시료도입을 위한 완충패드(6)와 알카리 포스페이트 수화효소 50 ㎕를 주입하였다가 말린 효소 접합체 패드(7)를 적층하여 다공성 작동전극을 형성하고, 다공성 박막의 뒷면에 대면형으로 위치한 다공성 보조/기준전극 상에 기질패드(8)를 적층하여 항 바이오틴 효소-면역센서를 제작하였다.
이하 본 발명에 의한 바이오센서의 특성을 실험하였다.
<실험예 1> 대면형 다공성 전극을 이용한 바이오틴 표준용액의 검정
상기 제조예 2에서 제작된 대면형 다공성 전극을 고안된 셀에 장착한 후 가장 최적화된 농도인 0.05 mg/ml의 아비딘, 2.5 μg/ml의 글루코오스 산화 환원효소-바이오틴 접합체와 10 mg/ml의 기질을 이용하여 실험을 반복하였고, 가장 짧은 시간에 적당한 양의 시료 농도를 가지고 가장 큰 값의 전류값 변화를 측정하였다. 결정된 조건을 가지고 상기 작동전극 상에 아비딘을 고정시키고, 바이오틴 표준용액과 글루코오스 산화 환원효소-바이오틴 접합체 혼합용액 2 ml을 주입하였다. 이때 바이오틴 표준용액은 10-5M부터 10-14M까지 1 : 9의 비율로 희석시켜 사용하였다. 그 후 다공성 전극을 EZ 정전압 프로그램으로 +800 mV의 전압을 걸어주어 안정화되었을 때 기질용액을 대면형의 다공성 보조/기준 전극에 주입하여 생성된 전류값의 변화를 바이오틴의 농도에 따른 결과를 나타내었다.도 7은 상기의 방법으로 측정한 바이오틴의 표준용액에 대한 검정곡선이다. 최적화된 조건에서 10-7M ~ 10-10M 사이에서 현저한 신호차이를 보이고 있으며 이때 전류값이 약 0.5 ㎂ 정도이다.
<실험예 2> 글루코오스 산화 환원효소를 이용한 바이오틴 양에 따른 항 바이오틴 효소-면역센서의 신호 분리
상기 실시예 1에서 제작된 글루코오스 산화 환원효소를 이용한 비분리형 효소-면역센서의 다공성 작동전극 상에 적층된 효소접합체 패드(7)에 10-12M과 10-4M의 바이오틴 시료를 30 ㎕씩 주입한 후 10 분동안 면역반응 시간을 주었다. 또한 다공성 작동전극에 아비딘을 고정화시키지 않은 전극도 준비한 후, 효소접합체 패드(7)에 pH 9.6 carbonate 0.05 M의 완충용액을 30 ㎕를 주입하였다. 그 후 각 전극을 EZ 정전압 프로그램(EZ potentiostat program)으로 +800 mV의 전압을 걸어주어 안정화되었을 때 기질패드(8)에 10 ㎕의 글루코오스 용액을 주입하였다. 그 후변화하는 전류값을 측정하였다.
도 8은아비딘이 고정되고 바이오틴 및 글루코오스 산화 환원효소를 이용한 항 바이오틴 효소-면역센서에 바이오틴의 양에 따른 전류값 및 아비딘이 존재하지 않을 때의 전류값에 대한 동적감응곡선이다.
상기도 8의 결과에 따르면, 곡선 a는 주입한 시료속에 10-12M의 바이오틴이 존재할 때, 약 1 ㎂ 의 전류값 변화를 보이고 있으며, 곡선 b는 10-4M의 바이오틴이 존재할 때로 0.4 ㎂의 전류값 변화를 나타낸다. 따라서 바이오틴이 저농도와 고농도로 존재할 때의 전류값이 약 0.6 ㎂ 정도 차이가 나타났다. 또한 곡선 c는 아비딘이 존재하지 않을 때 전류값의 변화로 곡선 a 와 곡선 b와 비교하면 면역 반응을 하지 않고 측정될 수 있는 전류값의 변화라 할 수 있다. 따라서 다공성 전극을 이용한 효소-면역센서를 이용한다면 효과적으로 바이오틴의 양에 따른 전류값 변화를 알 수 있다.
<실험예 3> 알카리 포스페이트 수화효소를 이용한 바이오틴 양에 따른 항 바이오틴 효소-면역센서의 신호 분리
상기 실시예 2에서 제작된 알카리 포스페이트 수화효소를 이용한 비분리형 효소-면역센서의 다공성 작동전극(2) 상에 적층된 효소접합체 패드(7)에 10-12M과 10-4M의 바이오틴 시료를 30 ㎕씩 주입한 후 10 분동안 면역반응 시간을 주었다.또한 다공성 작동전극인 금전극에 아비딘을 고정화시키지 않은 전극도 준비하여, 알카리 포스페이트 수화효소를 주입하지 않은 효소접합체 패드(7)에 pH 9.6 carbonate 0.05 M의 완충용액을 30 ㎕를 주입하였다. 그 후 각 전극을 EZ 정전압 프로그램(EZ potentiostat program)으로 +200 mV의 전압을 걸어주어 안정화되었을 때 기질패드에 20 ㎕의 4-아미노페닐포스페이트 용액을 주입하여 전류값을 측정한다.
도 9는 아비딘이 고정되고 바이오틴 및 알카리 포스페이트 수화효소를 이용한 항 바이오틴 효소-면역센서에 바이오틴의 양에 따른 전류값 및 알카리 포스페이트 수화효소가 존재하지 않을 때의 전류값에 대한 동적감응곡선이다.
상기도 9의 결과에 따르면, 곡선 a 는 주입한 시료 속에 10-12M의 바이오틴이 존재할 때로 약 0.7 ㎂ 의 전류값 변화를 보이고 있으며, 곡선 b는 10-4M의 바이오틴 이 존재할 때로 0.15 ㎂의 전류값 변화를 나타낸다. 따라서 바이오틴이 저농도와 고농도로 존재할 때의 전류값이 약 0.55 ㎂ 정도 차이가 나타났다. 또한 곡선 c는 알카리 포스페이트 수화효소가 존재하지 않는 효소접합체 패드를 이용하였을 때의 전류값 변화로 4-아미노페닐포스페이트 자체의 전류값의 변화로서 다공성 금전극을 이용한 면역센서를 이용한다면 효과적으로 바이오틴의 양에 따른 전류값 변화를 알 수 있다.
이상에서 살펴본 바와 같이 본 발명의 대면형 다공성 전극을 이용한 비분리형 효소-면역센서는 표면에서의 면역반응 후 항체 또는 분자인지 물질과 결합하지 않고 남아있는 효소-분석물질 접합체의 분리 단계를 다공성 박막의 공극을 통한 확산 이동을 이용하여 생략할 수 있기 때문에 측정 시간이 짧고 간편하며 우수한 민감도 및 선택성을 가진다. 또한 대면형 다공성 전극과 시료패드를 사용함으로서 소형화가 가능하며 검출신호가 크고, 다공성 박막에 의해서 적은 양의 시료 측정시 방해작용을 하는 혈구 및 혈중 거대 단백질을 제거할 수 있으며, 전기화학 검출법을 이용하기 때문에 소형 측정기로 측정이 가능하여 현장 측정용 센서로 이용될 수 있다.

Claims (15)

  1. 전극연결부(3); 상기 전극연결부(3) 일단에 형성된 다공성 작동전극(2); 상기 작동전극(2) 면을 제외한 부분은 절연막(1)으로 구성된 1 전극계; 상기 전극연결부(3) 상에 형성된 작동전극(2)과 대면 위치에 형성된 다공성 보조/기준 전극(5); 및 상기 보조/기준 전극(5) 면을 제외한 부분은 절연막(1)으로 구성된 2 전극계; 상기 전극계 사이에 삽입된 다공성 박막(4); 및 상기 다공성 박막(4)이 삽입되지 않은 면의 다공성 전극상에 완충패드, 효소접합체패드, 및 기질패드 중 하나 이상의 패드가 적층되는 것을 특징으로 하는 비분리형 효소-면역센서.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 효소-면역센서가 다공성 작동전극의 상에 시료 도입을 위한 완충 패드 및 효소 접합체 패드가 순차적으로 적층되어 센서의 전면부에 장착된 단백질 분석을 위한 것으로, 전극연결부(3); 상기 전극연결부(3) 일단에 형성된 다공성 작동전극(2); 상기 작동전극(2)면을 제외한 부분은 절연막(1)으로 구성된 1 전극계; 별도의 전극연결부(3) 상에 형성된 작동전극(2)과 대면 위치에 형성된 다공성 보조/기준 전극(5); 및 상기 보조/기준 전극(5) 면을 제외한 부분은 절연막(1)으로 구성된 2 전극계; 상기 전극계 사이에 삽입된 다공성 박막(4); 및 상기 다공성 작동전극(2)상에 시료 도입을 위한 완충 패드(6) 및 효소 접합체 패드(7)가 순차적으로 적층되어 센서의 전면부에 장착되고, 다공성 보조/기준전극(5) 상에 기질패드(8)가 적층되어 센서의 후면부에 장착된 효소-면역센서.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 효소-면역센서가 다공성 작동전극 상에 효소 접합체 패드가 적층되어 센서의 후면부에 장착된 헵텐 분석을 위한 것으로, 전극연결부(3); 상기 전극연결부(3) 일단에 형성된 다공성 보조/기준 전극(5); 상기 다공성 보조/기준 전극(5)을 제외한 부분은 절연막(1)으로 구성된 1 전극계; 별도의 전극연결부(3) 상에 형성된 다공성 보조/기준 전극(5)과 대면 위치에 형성된 작동전극(2); 및 상기 작동전극(2)을 제외한 부분은 절연막(1)으로 구성된 2 전극계; 상기 전극계 사이에 삽입된 다공성 박막(4); 및 상기 다공성 보조/기준 전극(5) 상에 기질패드(8)가 적층되어 센서의 전면부에 장착되고, 다공성 작동전극(2)상에 효소 접합체 패드(7)가 적층되어 센서의 후면부에 장착된 효소-면역센서.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 효소-면역센서가 다공성 작동전극 상에 시료 도입을 위한 완충 패드, 효소 접합체 패드 및 미세 다공성 박막을 적층되어 센서의 전면부에 장착되어 단백질 방해 작용을 줄인 것으로, 전극연결부(3); 상기 전극연결부(3) 일단에 형성된 다공성 작동전극(2); 상기 작동전극(2) 면을 제외한 부분은 절연막(1)으로 구성된 1 전극계; 별도의 전극연결부(3) 상에 형성된 작동전극(2)과대면 위치에 형성된 다공성 보조/기준 전극(5); 및 상기 다공성 보조/기준 전극(5) 면을 제외한 부분은 절연막(1)으로 구성된 2 전극계; 상기 전극계 사이에 삽입된 다공성 박막(4); 및 상기 다공성 작동전극(2)상에 상에 시료 도입을 위한 완충 패드(6), 효소 접합체 패드(7) 및 미세 다공성 박막(9)가 순차적으로 적층되어 센서의 전면부에 장착되고, 다공성 보조/기준 전극(5) 상에 기질패드(8)가 적층되어 센서의 후면부에 장착된 효소-면역센서.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 다공성 박막(4)이 시료 및 기질의 흐름 통로 역할 및 분리막의 역할을 동시에 할 수 있는 물질로 형성된 것을 특징으로 하는 효소-면역센서.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 다공성 박막(4)에 사용되는 물질은 유기 고분자, 무기 고분자 및 이들의 혼합물로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 효소-면역센서.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 유기고분자는 니트로셀룰오즈, 거름종이, 유리섬유막 및 나이론으로 구성되는 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 효소-면역센서.
  8. 제 6 항에 있어서, 상기 무기고분자는 흡수성 세라믹으로 구성되는 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 효소-면역센서.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 패드가 니트로셀롤오즈, 거름종이, 유리 섬유막 및 나일론을 포함하는 유기 고분자로 구성된 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 효소-면역센서.
  10. 제 1 항에 있어서, 상기 다공성 작동전극(2) 및 다공성 보조/기준 전극(5)을 형성하는 전극물질이 은, 백금, 금 및 팔라듐에서 선택되는 것을 특징으로 하는 효소-면역센서.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 다공성 작동전극(2) 및 다공성 보조/기준 전극(5)이 물리적 증기 증착 및 화학적 증기 증착법에 의해 형성되어 미세공극을 보유하는 것을 특징으로 하는 효소-면역센서.
  12. 제 1 항에 있어서, 상기 다공성 작동전극(2) 상에 고정되는 물질이 항체 및 분자인지 물질로 구성되는 것을 특징으로 하는 효소-면역센서.
  13. 제 1 항에 있어서, 상기 효소-면역센서가 전기화학적으로 측정이 가능한 효소-기질 시스템을 도입한 소형 일회용 효소-면역센서.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 효소가 글루코오스 산화효소인 것을 특징으로 하는 효소-면역센서.
  15. 제 13 항에 있어서, 상기 효소가 알카리 포스페이트 수화효소인 것을 특징으로 하는 효소-면역센서.
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