JP4057521B2 - バイオセンサー - Google Patents
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Description
本発明は、バイオセンサーに関するものである。より詳細には、多孔性薄膜、第1電極系、第2電極系、及び1対の絶縁膜からなっていて、前記第1電極系が多孔性薄膜の一表面に形成されていて、第2電極系が多孔性薄膜の反対側表面に形成されているバイオセンサーに関するものである。
バイオセンサーは、適当な試料と接触した時、目標とする分析物質が存在する場合、電気的な信号を生成する装置、探針または電極を意味する。一般的に、バイオセンサーは、分析物質の濃度を定量可能な信号に転換させるために適当な誘導システムを持った接触面に、生物学的活性がある物質を固定させることによって製造する。
a) 小型化、
b) 一つ以上の感応要素を結合した配列センサーシステムによる多数の反応物の測定、
c) 大量生産可能で使い捨てに使用できるセンサーの開発、
d) 移植可能なバイオチップを使用したインビボ分析(in vivo analysis)、
e) 人工知能システムを持った配列センサーシステムでの結果算出。
本発明の目的は、多孔性薄膜;生物学的に活性がある物質が固定されている作用電極、第1電極連結部、及び第1リード排出口からなる第1電極系;対電極、第2電極連結部、及び第2リード排出口からなる第2電極系;作用電極、第1電極連結部、対電極、及び第2電極連結部を除外した第1電極系と第2電極系の表面を覆っている及び一対の絶縁膜を含み、前記第1電極系は多孔性薄膜の一表面に形成されていて、前記第2電極系は多孔性薄膜の反対側表面に形成されていて、前記作用電極と対電極が多孔性薄膜に直接的に形成されることによって、電極が多孔性になり、試料が作用電極の表面を通って対電極の表面へ通過できるようにするバイオセンサーを提供することである。
本発明は、多孔性薄膜、第1電極系、第2電極系、及び1対の絶縁膜(または電極連結部がある1対の絶縁基質)を含み、前記第1電極系は多孔性薄膜の一表面に形成されていて、第2電極系は多孔性薄膜の反対側表面に形成されているバイオセンサーを提供する。本発明によるバイオセンサーは、追加的ないかなる電極も必要としない。
使用された物質と反応物質を下記に示す:
グルコース酸化酵素(GOx; EC 1.1.3.4, VII-s 形態, 245-900単位/g, Aspergillus Nigerから入手); 2-[N-モルホリノ]エタンスルホン酸(MES)、1-エチル-3,3-ジメチルアミノプロピルカルボジイミド(EDAC)、N-ヒドロキシスルホスクシンイミド(NHS)、カリウムフェリシアニド(K3Fe(CN)6)、β-D(+)-グルコース、2-メルカプトエチルアミン、及びDL-6,8-チオチク(thiotic)酸アミン(Sigmaから入手、St. Louis, Missouri, USA); 1,2-ジチオラン-3-ペンタノイック酸、3-メルカプトプロピオニック酸、11-メルカプトウンデカノイック酸、16-メルカプトヘキサデカノイック酸(MHDA/C16)、及びフェロセンアセト酸(Fc-COOH)(Aldrichから入手, Milwaukee, Wisconsin, USA); リン酸水素二ナトリウム及びリン酸二水素ナトリウム(Kanto Chemicalから入手, Tokyo, 日本); ニトラン(Nytran)中性多孔性ナイロン膜(空隙の大きさ0.2μm)(Schleicher及びSchull of Keene, New Hampshireから入手);及びニトロセルロース(NC)膜(Whatman Internationalから入手, Maidstone, 英国)。使用した他の物質は、すべて等級分析に該当するものである。
多孔性ナイロン膜(15×30mm2)を半径6mm及び幅13mmの排出口ストリップを持った適当なカバー膜を下に置いた(電気的な連結のための目的)。物理的な蒸着方法を使用して、膜の両面を金でコーティングした;時間300秒、圧力75mmTorr、血清電流25-30mA、ポテンシャル350-500Vでスパッタリングした。これは、外部半径4mm及び厚み約300Åで膜の中心にディスク-形態の金電極を生成した。テトラヒドロフラン(THF)(1:6w/v)に溶解させたPVC(33% PVCと67% ビス(2-エチルヘキシル)セバケート(全てw/w%))を、せまい金リード排出口を含み中心ディスク電極にキャスティングした。これは、6mmディスク形態の金電極が中心で接しないようにした。電極の形態は図2Aに記載されている。他の実施例で、金をカバー膜なしにナイロン膜(6×6cm2)の両面にコーティングさせて、図2Aに記載された形態に切断した。金でコーティングされた電極の一部をスクリーン-プリントされた電極連結部がある二個の絶縁膜間に位置させて圧着し、対称性二重-対面多孔性電極を組み合わせた。
縁より中心が薄い形態の中心を持った作用電極の形態の対電極をナイロン膜の1面に炭素ペースト(または銀/塩化銀等の伝導性あるペースト)でスクリーンプリントした。膜の反対側面に対しては実施例1-1で記述した物理的な蒸着方法を実施して金電極を製造した。金電極を図2Eに示した形態に切断して、スクリーン-プリントされた電極連結部を持った2個の絶縁膜間で圧着させた。非対称性二重-対面多孔性電極の電気化学的特徴は、緩衝溶液を含むFe(III)/Fe(II)でサイクリックボルタモグラム(スキャン速度:60mV/分)を使用して調査した。図10に示したように、電極は蒸着された金とスクリーン-プリントされた炭素間の短絡なしに可逆的な反応を提供した。
電極をMES緩衝溶液で洗浄して、pH7.4、10mg/mlGOxと140mM NaClを含む10μlの撹拌状態のホスファート緩衝溶液に即時に入れ、1時間維持して金電極の表面にGOxが物理的に吸着されるようにした後、ホスファート緩衝溶液で洗浄した。
空隙があるニトロセルロース(NC)ストリップと吸収パッドとしてガラス繊維間に多孔性金ストリップ電極を積層させ、図4A及び図4Bで示した自己試料採取及び流れ系形グルコースセンサーを製作した。
グルコースセンサーを利用した分析試験をするために、標準グルコース溶液を使用して、電流測定分析法によりグルコースの安定-状態反応を測定した。図11は、0.8Vポテンシャルでバイオセンサーの典型的な検定曲線を示している。これは、前記グルコースセンサーが約30分間グルコースに対して感応できることを示したものである。0mg/dLないし200mg/dL濃度のグルコース範囲で直線形感応を得ることができた。傾きは、2.60×10-3nA(mg/dL)で、補正常数は、0.988だった。前記結果から、本発明によるバイオセンサーにより連続的な自体試料採取及び検出が可能であることが確認できた。
実施例1-1に記述したのと同じ方法で金電極を得た。
電極をMES緩衝溶液で洗浄して、pH7.4、10mg/mlGOx、200mMカリウムフェリシアニド、140mM NaClを含む10μlの撹拌状態のホスファート緩衝溶液に即時に入れ1時間維持した後、ホスファート緩衝溶液で洗浄した。
空隙のあるNCストリップと吸収パッドのガラス繊維間に多孔性金ストリップ電極を積層させ、自体試料採取及び流れ系形グルコースセンサーを製作した。
グルコースセンサーを利用した分析試験をするために、電流測定分析法によりグルコースの安定-状態感応を測定した。図12は、グルコース分析に対し0.38Vポテンシャルでバイオセンサーの典型的な動的感応曲線を示している。これは、グルコースセンサーが各々のグルコース溶液(50mg/dL、100 mg/dL及び200mg/dL)に対し感応できることを示している。図12は、グルコース分析に対し典型的な動的感応曲線を示している。0mg/dLないし200mg/dL 濃度のグルコース範囲で直線形感応を得られた。傾きは、85.8nA(mg/dL)で、 補正常数は0.998だった。前記結果は、0.38Vの非常に低い電圧下でもより感度が高いグルコース感応を得られることを示している。前記結果から、本発明によるバイオセンサーにより、連続的な自体試料採取及び検出が可能であることを確認できた。
実施例1-1に記述したのと同じ方法で金電極を得た。
電極をMES緩衝溶液で洗浄した。0.05mg/mlアビジン及び0.05Mナトリウムカルボナートを含むpH9.6のホスファート緩衝溶液を作用電極に滴下した。それから、電極を4℃で16時間培養した。パッド114aとしてグルコース酸化酵素-ビオチン接合体(2.5μg/ml)50μlが吸収されているガラス繊維膜(ワットマンインターナショナル, Maidstone, 英国)を使用した。
実施例3-2から得た免疫センサーで検定を行なった。標準ビオチン溶液を10-5Mから10-14Mの濃度まで稀釈した。標準溶液各々を上部カバー115に形成された孔117を通じて免疫センサーに注入した。アビジンとビオチンまたは酵素接合体間の競争結合は、適用ポテンシャル+800mVで安定化させた。それから、基質(グルコース)を下部カバー116に形成された孔118を通じて注入した。酵素反応により生成された電流を測定した。図13は検定曲線を示している。前記曲線で、電流変化はビオチンの濃度により異なることが分かる。最適信号差は、ビオチン10-7M(1.0μA)と10-10M(0.5μA)で見られた。
実施例3-2で得た免疫センサーを用いて動的感応曲線を得た。10-12Mビオチン緩衝溶液と10-4Mビオチンがない緩衝溶液を各々免疫センサーに注入した。センサーが安定状態にあるようにした後、グルコース溶液10μlを孔118を通じてセンサーの後面から注入した。免疫センサーの動的感応曲線を電流測定分析法により測定して、その結果を図14に示した。
Claims (12)
- 多孔性薄膜;
抗体が固定されている作用電極、第1電極連結部、及び第1リード排出口からなる第1電極系;
対電極、第2電極連結部及び第2リード排出口からなる第2電極系;
作用電極、第1電極連結部、対電極及び第2電極連結部を除外した第1電極系と第2電極系の表面を覆っている1対の絶縁膜;
作用電極上部に酵素−分析物質接合体または酵素−抗体接合体を含むパッド;及び
孔がある上部カバーと孔がある下部カバーからなる1対のカバーを有し、
ここで、前記第1電極系が多孔性薄膜の一表面に形成されていて、前記第2電極系が前記第1電極系に対して多孔性薄膜の反対側表面に形成されていて、
前記作用電極と対電極が多孔性薄膜に直接的に形成されていて、電極が多孔性になり、試料溶液が作用電極の表面を通って対電極の表面へ通過できるようにして、基質が対電極の表面を通過して作用電極の表面に通過することを可能にすると共に、
前記上部カバーは前記パッドの上にあって、前記下部カバーは第2電極系の表面を覆う絶縁膜上にあり、前記上部カバーの孔は前記パッド上に位置するように形成されていて、前記下部カバーの孔は前記対電極の下に位置するように形成されている、酵素免疫分析用バイオセンサー。 - 前記作用電極及び対電極が電気的に伝導性ある物質で対称的に製造されている、請求項1記載の酵素免疫分析用バイオセンサー。
- 前記作用電極及び対電極が電気的に伝導性ある物質で非対称的に製造されている、請求項1記載の酵素免疫分析用バイオセンサー。
- 前記第1電極系及び前記第2電極系は、前記第1リード排出口と前記第1連結部が、そして前記第2リード排出口と前記第2連結部が分離して形成された、請求項1記載の酵素免疫分析用バイオセンサー。
- 前記第1絶縁膜及び第2絶縁膜が形成された電気的連結部を別個に含み、前記対称的または非対称的二重−対面電極が絶縁膜間に積層されていて、絶縁膜の連結部に連結されている、請求項2または請求項3の酵素免疫分析用バイオセンサー。
- 前記電気的に伝導性ある物質が、金、白金、銀、塩化銀、ロジウム、イリジウム、ルテニウム、パラジウム、オスミウム、炭素、銅及びこれらの混合物からなる群から選択される、請求項2または3記載の酵素免疫分析用バイオセンサー。
- 前記多孔性薄膜が、有機高分子、無機高分子、天然繊維または合成繊維、紙及びセラミックからなる群から選択される、請求項1記載の酵素免疫分析用バイオセンサー。
- 前記多孔性薄膜が、多孔性ナイロンメッシュである、請求項1記載の酵素免疫分析用バイオセンサー。
- 対電極下に基質を含むパッドをさらに含む、請求項1記載の酵素免疫分析用バイオセンサー。
- 作用電極の上部にあるパッドと上部カバーの間にろ過パッドをさらに含む、請求項1または請求項9記載の酵素免疫分析用バイオセンサー。
- 下部カバー内部に基質貯蔵所が前記下部カバーの孔から離れて形成されていて、前記基質貯蔵所が下部カバーの孔と毛細管で連結されていることを特徴とする請求項1記載の酵素免疫分析用バイオセンサー。
- 前記酵素−分析物質接合体または酵素−抗体接合体における酵素が、還元酵素または酸化酵素から選択されることを特徴とする請求項1記載の酵素免疫分析用バイオセンサー。
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