KR0156176B1 - 전기화학식 면역 바이오센서 - Google Patents

전기화학식 면역 바이오센서 Download PDF

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Abstract

본 발명은 전기화학식 면역 바이오센서에 관한 것으로, 항원-항체의 면역 반응 결과를 전기화학적으로 측정하여 시료내에 존재하는 생리 활성 물질의 농도를 정량할 수 있는 면역 바이오센서에 관한 것이다.
본 발명은 절연성기판위에 다수의 전극이 형성되고, 상기 전극부위에 절연층이 선택적으로 형성되어 전극부위의 일부만을 노출시킨 전극부와, 측정물질-리포좀 파괴인자 적합체가 흡착된 부위와 측정물질에 결합하는 리셉터가 공유결합된 부위 및 전극활성물질이 포획된 리포좀이 고정된 부위를 갖는 리포좀신호 증폭 및 면역 크로마토그래피 기능을 수행하는 매트릭스부로 구성되며, 상기 전극부의 노출된 전극부위와 상기 매트릭스부의 리포좀 고정부위가 서로 일치되도록 접합된 것을 특징으로 하는 전기화학식 면역 바이오센서를 제공한다.

Description

전기화학식 면역 바이오센서
제1도는 본 발명에 의한 면역바이오센서의 삼전극계로 구성된 전극시스템의 사시도.
제2도는 본 발명에 의한 면역바이오센서의 삼전극계로 구성된 전극시스템의 평면도.
제3도는 본 발명에 의한 면역 바이오센서의 이전극계로 구성된 전극시스템의 사시도.
제4도는 본 발명에 의한 면역 바이오센서의 이전극계로 구성된 전극시스템의 평면도.
제5도는 본 발명의 면역 바이오센서의 매드릭스부 구조도.
제6도는 본 발명의 면역 바이오센서의 사시도.
제7도는 본발명에 의한 면역 바이오센서의 신호발생원리를 나타낸 도면.
제8도는 본 발명의 일실시예에 의한 B형 간염 바이러스의 표면항체 및 표면항원 동시 측정용 면역 바이오센서의 사시도.
제9도는 본 발명의 다른 실시예에 의한 다성분 측정용 면역 바이오센서의 사시도.
* 도면의 주요부분에 대한 부호의 설명
1 : 절연기판 2,3,4 : 도전경로
5,5' : 지시전극 6 : 대전극
7 : 절연층 8,8' : 기준전극
9 : 전극 시스템 10 : 전극부위
15 : 매트릭스부 16 : 양면 접착용 테이프
17 : 상부지지막 18 : 시료 투여부위
19, 22-25 : 바이오센서
20 : B형 간염 바이러스의 표면항원 측정용 면역 바이오센서
21 : B형 바이러스의 표면항체 측정용 면역 바이오센서
26 : 비교센서 27 : 측정회로 접속부
28 : 시료접촉부위
본 발명은 전기화학식 면역 바이오센서에 관한 것으로, 특히 항원-항체의 면역 반응 결과를 전기화학적으로 측정하여 시료내에 존재하는 생리 활성 물질의 농도를 정량할 수 있는 면역 바이오센서에 관한 것이다.
항원-항체(antigen-antibody) 반응을 이용하는 면역 바이오센서는 감지 반응이 고도의 특이성과 강한 결합력으로이루어지므로 매우 낮은 농도로 존재하는 생리 활성 물질을 분석하는데 있어 여타의 센서들보다 훨씬 우수한 특성을 보인다. 기존의 면역 바이오센서들은 주로 광학적 현상을 이용하는 것으로서, 광 섬유 끝에 고정된 항체와 측정 대상 물질(항원)과의 상호 작용 결과에 따라 변화되는 빛의 강도를 측정하는 방법(Anderson, G.P. et al., IEEE Trans. Biomed. Eng. 1994, 41, 578-584)과 압전소자위에 항체를 고정하고 이것이 대상물질(항원)과 결합될 때 유발되는 질량 변화를 전기적 신호로 바꾸는 방법(Konig.B. et al., Anal. Chem. 1994, 66, 341-344), 그리고 금속과 함께 액체 계면에서 발생하는 표면 플라즈마 공명(surface plasmon resonance)현상이 금속위에 고정된 항체와 분석 대상 물질(항원)의 결합에 의해 변화되는 것을 감지하는 방법(Severs, A.M. et al., Biosensors Bioelectronics 1993, 8. 365-370)등이 있다.
전기화학적 방법을 이용한 것으로는 기존의 면역분석법, 예를 들면 효소 면역 측정법(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay : ELISA), 금속이온 표지법등을 이용하여 전기화학적 활성물질(electroactive materials)을 발생시킨 후, 이것을 분리하여 전기화학적 측정하는 방법이 있다(Hayes, F.J. et al., Anal Chem. 1994, 66, 1860-1865).
또한 새롭게 각광받고 있는 면역분석 방법으로 리포좀(liposome)을 이용하는 것이 있는데 이는 표지물질을 리포좀안에 가두었다가 면역반응이 끝난후, 리포좀을 파괴하여 표지물질을 방출시켜 측정물질의 농도와 상관관계가 있는 신호를 발생시키는 방법이다. 리포좀은 인지질이 주성분인데, 세포의 생체막과 같이 내부에 친수성 혹은 소수성인 물질을 포획하거나 이중막의 성질에 따라 포획된 물질의 통과여부를 조절할 수 있는 성질이 있어 약물운반체(drug delivery system)로서의 기능이 있다. 최근 이러한 리포좀을 면역측정법에 응용하려는 연구가 많이 진행되고 있으나, 이를 센서로 응용한 사례(Richard, A. et al., Biosensors Bioelectronics 1993, 8, xiii-xv)는 아직까지는 그리 많지 않은 실정이다.
광학적 현상을 이용하는 종래의 면역 바이오센서들은 측정시스템이 복잡하고 그에 소요되는 비용이 비싼 단점이 있다. 그에 비해 전기화학의 원리를 도입한 면역 바이오센서의 경우는 우선 그 측정시스템이 매우 단순하고 전극의 제작 또한 간단하다는 이점이 있다. 기존에 소개된 전기화학적 측정방법을 이용한 면역분석법(Athey, D. et al., Biosensors Bioelectronics 1993, 8, 415-419)이 있기는 하지만, 이것은 전기화학식 면역 바이오센서라기 보다는 기존의 면역분석 시스템을 그대로 이용하고 최종적 분석 단계에서만 전기화학적 측정을 수행하므로 여전히 긴 분석시간이 요구되고, 여러 가지 번거로운 과정들을 거쳐야 하므로 일상적으로 간편이 사용할 수 있는 것이 아니다. 일반적으로 항원-항체 반응과 같은 면역 반응은 그 반응 자체의 특성으로 인해 측정하는데 시간이 길어진다.
진정한 의미의 전기화학식 면역 바이오센서의 개발이 이렇듯 부진한 이유는 항원-항체의 결합 자체로는 전기화학적 활성을 가지는 물질을 유발시키기가 어렵다는 기술적 문제 때문이다. 즉, 효소를 이용한 전기화학식 센서의 경우는 전극상에 고정된 효소의 반응결과로 전극활성 물질이 전극상에 바로 생기고 이것을 산화 또는 환원시켜 전류를 발생시키는데 비해 항체를 전극에 고정시키고 측정하고자 하는 물질(항원)과 반응을 시킬 경우 아무런 전극활성 물질이 생겨나지 않는다. 최근 이러한 문제를 해결하기 위해 효소 활성을 갖는 항체의 제작실험이 보고된 바 있다.
또한 리포좀을 이용한 면역분석법과 이것을 센서로 응용하는 것도 번거롭기는 마찬가지인데 그것은 면역분석의 경우, 각 단계별로 필요한 재료들을 순차적으로 넣어주어야 한다는 점 때문이고, 최근에 소개된 리포좀을 이용한 면역 바이오센서의 경우도 시료만을 투입하는 것이 아니라 리포좀을 같이 투여해야 하므로 일반 사용자가 이를 이용할 때 센서 자체만이 아니라 리포좀이 들어 있는 별도의 재료까지 다루어야 한다. 뿐만 아니라 전기화학적인 측정을 수행하기 위해서는 리포좀을 깨뜨려야 하는데 이 또한 부가적인 시료의 첨가에 의해서 이루어지기 때문에 결코 간편하다고 할 수가 없다.
본 발명은 상기한 문제점들을 해결하기 위한 것으로, 표지물질인 전극활성 물질을 과량으로 포함할 수 있는 리포좀의 장점과 측정 시스템이 단순한 전기화학의 원리를 함께 이용하여 항원-항체 반응의 결과를 바로 전기화학적으로 측정할 수 있는 전기화학식 바이오센서를 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명은 시료의 분석시 사용자가 여러 단계의 조작을 수행해야 하는 번거로움 없이 단지 시료를 센서위에 떨어뜨리는 한 번의 조작으로 짧은 시간안에 간편하게 분석을 수행할 수 있는 스트립 형태의 일회용 바이오센서를 제작하기 위해 다음과 같은 기술적 과제를 해결하는데 그 목적이 있다.
기존의 스트립 형태의 효소센서와는 달리 항원-항체등의 면역 반응을 이용하는 면역 바이오센서는 효소센서와 같은 스트립 형태로 제작할 수는 없다. 그 이유는 상술한 바와 같이 항원 또는 항체만 전극상에 고정시켜서서 면역 반응 결과 아무런 전극활성 물질이 생겨나지 않기 때문이며, 전극 상부에 항체를 고정시켜 놓은 후, 시료중의 측정 물질인 항원이 항체와 결합하고 다시 효소나 전극 활성물질이 접합된 이차 항체를 반응시키는 샌드위치분석(sandwich assay)방법을 적용하는 경우, 반드시 중간에 센서를 세척하는 과정을 거쳐야하고, 또한 보조 시약들이 필요하기 때문이다.
따라서 본 발명은 별도의 보조 시약없이 센서와 시료를 한 번만 접촉, 반응시킴으로써 시료중의 분석 물질의 농도를 정량할 수 있는 방법을 제공하기 위하여 시료를 전개시키면서 면역 반응을 일으키는 스트립 형태의 크로마토그래피 매트릭스와 스트립 형태의 전극을 접합시킨 구조를 갖는 일회용 면역 바이오센서 및 그 제작 기술과, 면역반응을 일으키는 크로마토그래피 매트릭스상에는 측정물질, 리포좀 파괴인자 접합체, 측정물질과 선택적으로 결합하는 항체(또는 항원), 전기화학적 활성 물질을 담고 있는 리포좀이 각각 특정부위에 흡착 또는 고정되어 있는 구조를 갖는 매트릭스임을 특징으로 하여 시료와 접촉시 시료가 전개되면서 면역 반응이 일어나게 하는 기술과, 전기화학적 활성물질을 담고 있는 리포좀의 신호 발생원리를 이용하여 리포좀이 깨질때 방출되는 전극 활성물질이 효과적으로 산화 또는 환원 반응이 일어날 수 있도록 매트릭스와 절연성 기판위에 제조된 전극을 일체화시킨 면역 바이오센서를 이용하여 면역 관련 측정 물질을 고감도로 정확하게 측정할 수 있는 방법과, 다성분 측정용 복합 면역 바이오센서를 제작하는 기술을 실현시키는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 전기화학식 면역 바이오센서는 절연성기판위에 다수의 전극이 형성되고, 상기 전극부위에 절연층이 선택적으로 형성되어 전극부위의 일부만을 노출시킨 전극부와, 측정물질-리포좀 파괴인자 접합체가 흡착된 부위와 측정물질에 결합하는 리셉터가 공유결합된 부위 및 전극활성 물질이 포획된 리포좀이 고정된 부위를 갖는 리포좀신호 증폭 및 면역 크로마토그래피 기능을 수행하는 매트릭스부로 구성되며, 상기 전극부의 노출된 전극부위와 상기 매트릭스부의 리포좀 고정부위가 서로 일치되도록 접합된 것을 특징으로 한다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 전기화학식 면역 바이오센서의 구성은 크게 두 부분으로 나눌 수 있다. 하나는 후막공정을 이용하여 절연성 기판위에 형성시킨 전극이 있는 전극부와 시료가 투여되면 크로마토그래피의 원리 또는 모세관 현상(capillary action)으로 시료를 전개시키면서 면역 반응을 일으키는 크로마토그래피(또는 모세관) 매트릭스로 구성되는 것을 그 특징으로 한다.
본 발명의 전기화학식 면역 바이오센서의 구조를 제1도 내지 제6도를 참조하여 설명한다.
전극은 기존의 전기화학적 원리를 이용한 센서와 같이 기준 전극(reference electrode)과 지시전극(working electrode)으로 구성된 이전극계(2-electrode system) 또는 대전극(counter electrode)을 도입한 삼전극계(3-electrode system)로 구성되며, 기준전극 대비 일정한 인가전압하에 지시전극상에 전극 활성물질의 산화 또는 환원 반응이 일어나도록 되어 있다.
삼전극계로 이루어진 전극 시스템 부위(9)는 제1도 및 제2도와 같이 폴리에스테르(polyester), PVC(polyvinylchloride), 폴리카보네이트(polycarbonate)와 같은 고분자로 된 절연기판(1)상에 은(Ag) 페이스트로 인쇄된 도전경로(conduction path ; 2, 3, 4), 카본(carbon) 페이스트로 인쇄된 지시전극(5)과 대전극(6), 그리고 Ag/AgCl 기준전극(8), 절연층(7)으로 구성된다.
제2도는 절연성 기판위에 제조된 전극의 평면도이다. 반면, 이 전극계로 구성된 전극시스템은 제3도 및 제4도에 도시된 바와 같이 지시전극(5')과 기준전극(8')만으로 구성되는 특징이 있다. 일반적으로 지시전극 제조용 물질로는 탄소(carbon), 백금(platinum), 금(gold), 루테니움다이옥사이드(ruthenium dioxide)등을 사용할 수 있다.
면역 반응을 일으키는 매트릭스부(15)는 제5도에 도시된 바와 같이 여과지(filter paper), 니트로셀룰로오스(nitrocellulose), 폴리스티렌, 폴리비닐, 활성화된 나이론막등을 재질로, 이들 매트릭스부(12)부위에 측정물질-리포좀 파괴인자로 구성된 접합체를 흡착시키고, 매트릭스부(13) 부위에는 측정물질에 결합하는 항체(또는 항원)을 공유 결합시켜 이동할 수 없게 한 다음, 매트릭스부(14)부위에는 훼로신(ferrocene), 다이메틸훼로신(dimethylferrocene)과 같은 훼로신 유도체, 포타시움 훼리시아나이드(potassium ferricyanide), 바이올로겐(viologen) 유도체, DCPIP(2,6-dichlorophenolindophenol), 파라-아미노페놀(-aminophenol), TTF(tetrathiafulvalene), TCNQ(tetarcyanoquinodimethane), PMS(phenazine methosulphate), 멜돌라블루(meldola's blue, 7-dimethylamino-1,2-benzophenoxazine), BPO(1,2-benezophenoxazine-7-one), 시오닌(thionin)등과 같이 전기화학적 활성물질을 담고 있는 리포좀이 고정되어 있다. 이러한 매트릭스부(15)는 기본적으로 시료와 매트릭스상에 흡착된 측정물질-리포좀 파괴인자 접합체를 이동시키면서 면역 반응이 일어나는 역할과 함께 전극부위(10)에 전해질(electrolyte)을 제공해주는 기능을 갖는다.
본 발명에 의한 면역 바이오센서(19)는 상기와 같은 특성을 갖는 매트릭스부(15)와 전극시스템(9)을 제5도와 같이 양면 접착용 테이프(16) 및 폴리에스터 상부 지지막(17)을 이용하여 기본전극상의 절연층에 의해 노출된 전극부위(10)와 매트릭스부(15)상의 전기화학적 활성물질을 담고 있는 리포좀이 고정된 부위(14)가 일치되도록 서로 접합된 구조를 갖는 것을 그 특징으로 한다.
제6도는 이와 같이 완성된 면역 바이오센서의 사시도이며, 참조부호 18은 시료 투여부위를 나타낸다.
일실시예로서 측정하고자 하는 물질이 항원인 경우, 본 발명에 의한 면역 바이오센서의 신호발생원리를 제7도를 참조하여 설명하면 다음과 같다.
먼저, 측정물질(항원)이 들어 있는 액상 시료 일정량을 센서상의 시료 투여 부위(18)에 떨어뜨린다(제7(a)도). 그러면 제7(b)도와 같이 시료는 매트릭스부(12)부위에 흡착되어 있는 측정물질-리포좀 파괴인자 접합체와 서로 섞이게 되고, 시료의 액체를 운반체로 하여 시료내의 측정물질과 함께 크로마토그래피의 원리에 의하여 전극쪽으로 이동을 시작한다(제7(c)도). 이때, 다다르게 되는 경쟁 지점(13)에는 분석하고자 하는 물질에 특이적으로 결합하는 항체가 고정되어 있는데, 이 항원-항체의 결합자리를 두고 시료내의 측정대상 물질과 측정물질-리포좀 파괴인자 접합체가 경쟁을 하게 된다(제7(d)도).
따라서 시료내에 측정하고 하는 물질이 많을 경우, 보다 많은 측정물질-리포좀 파괴인자가 경쟁지점(13)을 통과해 전극 바로위 신호발생지점(14)에 고정되어 있는 리포좀에 도달하여 리포좀을 깨뜨리게 된다(제7(e)도). 이와 같은 면역 반응의 결과로 시료용액내에 존재하는 측정물질의 농도에 비례하여 리포좀안의 전극활성물질이 방출되며, 방출된 전극활성 물질은 전극부위(10)로 확산 되면서 도달하게 된다(제7(f)도). 이때, 기준전극(8) 대비 일정전압이 인가된 지시전극(5)상에서 전극활성 물질이 산화 또는 환원되면서 지시전극(5)과 대전극(6)간에 전류를 발생시키기 때문에 결국 시료 용액내에 존재하는 측정물질이 농도에 비례하는 전류값을 얻을 수 있다.
반면, 분석하고자 하는 물질이 항체인 경우, 제7도에서 매트릭스상 경쟁 지점(13)에 측정물질에 특이적으로 결합하는 항원을 고정시키게 되면 위와 같은 원리에 의해서 본 발명에 의한 면역 바이오센서를 이용하여 측정물질인 항체인 경우도 분석이 가능하다.
이와 같이 본 발명을 적용하면 기존의 항원-항체 반응과 같이 리간드-리셉터(ligand-receptor)간의 친화력을 이용하는 모든 면역학적 분석 방법에 그 응용이 가능하다. 예로서, 바이오틴-애비딘(biotine-avidin), 면역글로블린 G-단백질 A(immunoglobulin G-protein A), 호르몬-호르몬리셉터(hormone-hormone receptor), DNA-DNA리셉터(DNA-DNA receptor), RNA-RNA리셉터(RNA-RNA receptor), 약물-약물 리셉터(drug-drug receptor)등이 있다.
이하, 본 발명의 면역 바이오센서를 적용하여 간염 바이러스(Hepatitis), AIDS 바이러스(HIV virus)등의 바이러스, 살모넬라(Salmonella), 레지오넬라(Legionella)등과 같은 병원성 미생물, 면역 글로블린과 같은 단백질, HDL, LDL과 같은 지질 단백질(lipoprotein), 인간 성장 호르몬(Human growth hormone), 갑상선 자극 호르몬(TSH)과 같은 호르몬, 젠타마이신(Gentamicin), 토브라마이신(Tobramicin)등의 항생제, 다이곡신(Digoxin), 씨오필린(Theophylline)과 같은 약물등을 측정할 수 있는 면역 바이오센서 및 다성분을 동시에 측정할 수 있는 복합 면역 바이오센서의 제조방법을 몇가지 실시예로서 다음에 설명한다.
먼저, 제1실시예로서, B형 간염 바이러스의 표면항원(HBsAg)측정용 면역 바이오센서의 제작방법을 설명한다.
B형 간염 바이러스의 표면항원은 B형 간염균의 보균 유무를 판정하는데 지표가 된다. HBsAg를 측정하는 방법을 설명하면 다음과 같다.
제1도 및 제2도에서와 같이 두께 0.3㎜인 폴리에스터 절연기판(1)을 아세톤으로 세척한 후, 은(Ag) 페이스트를 인쇄하고 110℃정도에서 10분간 열처리하여 전도성 경로 및 접속패트(conduction path ; 2, 3, 4)를 구성한다. 다음에 지시전극(5)과 대전극(6) 부위에 카본 페이스트를 인쇄하고 상기와 같이 열처리한다.
이어서 절연 페이스트를 인쇄하여 절연층(7)을 형성시킨 후, 절연층에 의해 노출된 전극부위(10)를 100mM FeCl3용액으로 1분간 처리한 후 증류수로 여분의 FeCl3용액을 씻어내어 Ag/AgCl 기준전극(8)을 형성시키면 제2도와 같이 지시전극(5), 대전극(6), 기준전극(8)으로 구성된 전극시스템(9)이 완성된다.
다음에 전극 활성물질이 포획된 리포좀의 제작은 다음과 같이 행한다.
일반적으로 알려진 바업에 의해 MLV(Multilamella Lipid Vesicle) 형태로 전극 활성물질이 포획된 리포좀을 만든다. 즉, 클로로포름(cholroform)과 같은 유기 용매에 DPPC(dipalmitoylphosphatidylcholine), DPPG(dipalmitoylphosphatidyl glycerol), 콜레스테롤(cholesterol)등의 인지질을 적정비율로 녹인 후, 이를 유기용기에 넣고 감압 증발시키면 지질 필름이 만들어진다. 여기에 pH 7.4인 인산 완충용액(phosphate buffer)에 100mM 포타시움 훼리시아나이드(potassium ferricyanide)를 녹인 용액을 첨가한 뒤 격렬하게 진탕 교반하면 입자의 크기가 200-2000nm의 불투명한 리포좀상이 만들어진다.
다음에 면역반응 매트릭스의 제작은 다음과 같이 행한다.
셀룰로오즈 페이퍼(cdllulose papter)등과 같이 크로마토그래피용 페이퍼를 6㎜×50㎜의 크기로 자른후, 카제인(casein) 2.5g을 녹인 0.1M 소디움 카보네이트 완충용액(sodium carbonate buffer)에 담가 매트릭스를 전처리한 후, 증류수로 반복해서 씻은 후, 건조시킨다. 이어서 제5도와 같이 전처리시킨 매트릭스부(15)의 신호발생지점(14)에 포타시움 훼리시아나이드가 포획된 리포좀을 고정하고, 경쟁지점(13)에는 측정물질인 항원(HBsAg)과 결합하는 항체(anti-HBsAg)를 고정시킨다. 그리고 분석시작점(12)에 리포좀 파괴인자인 멜리틴(melittin)을 항원(HBsAg)과 결합시킨 접합체를 흡착시킨다.
상기와 같이 제조된 매트릭스부(15)와 전극시스템(9)을 제5도와 같이 양면 접착용 테이프(16) 및 폴리에스터 상부지지막(17)을 이용하여 기본전극상의 절연층에 의해 노출된 전극부위(10)와 매트릭스부(15)의 리포좀이 고정된 부위(14)가 일치되도록 서로 접합시키게 되면 B형 간염 바이러스의 표면항원 측정용 면역 바이오센서(19)가 완성된다.
측정시에는 측정대상자의 혈액을 시료투여부위(18)에 떨어뜨리게 되면 매트릭스(12)부위에 흡착되어 있던 시료와 멜리틴 HBsAg접합체가 시료와 함께 매트릭스상에 전개되어 이동을 시작한다. 경쟁지점(13)에 다다르게 되면 시료내의 측정물질인 HBsAg와 멜리틴-HBsAg접합체가 결합에 있어서 경쟁하게 되고, 그 결과 경쟁지점(13)을 통과해 신호발생지점(14)에 도달한 멜리틴-HBsAg 접합체의 파괴인자인 멜리틴이 리포좀을 파괴하여 리포좀안에 있던 포타시움 훼리시아나이드가 노출된다. 이때, 기준전극(8) 대비 200mV가 인가된 지시전극(5)상에서 포타시움 훼리시아나이드가 산화되어(Fe(CN)6-4→Fe(CN)6-3+e-)시료내의 HBsAg농도에 비례하는 전류를 얻을 수 있다.
다음에 제2실시예로서, B형 간염 바이러스이 표면항체(anti-HBs) 측정용 바이오센서의 제작방법을 설명한다.
B형 간염 바이러스의 표면항체는 B형 간염균에 대한 항체 형성여부, 즉, 면역 형성여부를 판정하는데 지표가 된다. 표면항체를 측정하는 방법을 설명하면 다음과 같다.
먼저, 기본 전극의 제작 및 전극활성물질이 포획된 리포좀의 제조방법은 상기한 제1실시예의 경우와 동일하므로 그 설명을 생략한다.
면역반응 매트릭스를 다음과 같이 제작한다.
셀룰로오즈 페이퍼등과 같이 크로마토그래피용 페이퍼를 6㎜×50㎜의 크기로 자른후, 카제인 2.5g을 녹인 0.1M소디움 카보네이트 완충용액에 담가 매트릭스를 전처리한 후, 증류수로 반복해서 씻은 다음 건조시킨다. 전처리시킨 매트릭스부(15)의 신호발생지점(14)에 포타시움 훼리시아나이드가 포획된 리포좀을 고정하고, 경쟁지점(13)에는 측정물질인 항체와 결합하는 항원을 고정시킨다.
그리고 분석시작점(12)에 리포좀 파괴인자인 멜리틴을 항체와 결합시킨 접합체를 흡착시킨다.
위와 같이 제조된 매트릭스부(15)와 전극시스템(9)을 제5도와 같이 양면 접착용 테이프(16) 및 폴리에스터 상부지지막(17)을 이용하여 기본전극상의 절연층에 의해 노출된 전극부위(10)와 매트릭스부(15)의 리포좀이 고정된 부위(14)가 일치되도록 서로 접합시키게 되면 B형 간염 바이러스의 표면항체 측정용 면역 바이오센서(19)가 완성된다.
측정시에는 측정대상자의 혈액을 매트릭스부(18)부위에 떨어뜨리게 되면 시료와 멜라틴 표면항체 접합체가 매트릭스상에서 전개되어 이동을 시작한다. 경쟁지점(13)에 다다르게 되면 시료내의 측정물질인 anti-HBs와 멜라틴 anti-HBs접합체가 결합체가 결합에 있어서 경쟁하게 되고, 그 결과 경쟁재점(13)을 통과해 신호발생지점(14)에 도달한 멜라틴 anti-HBs 접합체의 파괴인자이 멜라틴의 리포좀을 파괴하여 리포좀안에 있던 포타시움 훼리시아나이드가 노출된다. 이때, 기준 전극(8) 대비 200mV가 인가된 지시전극(5)상에서 포타시움 훼리시아나이드가 산화되어(Fe(CN)6 -4→Fe(CN)6 -3+e-)시료내의 anti-HBs농도에 비례하는 전류를 얻을 수 있다.
다음에 제3실시에로서, 씨오필린(Theophyline) 측정용 면역 바이오센서의 제작방법을 설명한다.
기본전극의 제작 및 전극활성물질이 포획된 리포좀의 제조방법은 상기한 제1실시예의 경우와 동일하므로 그 설명을 생략한다.
전극활성물질이 포획된 리포좀의 제조방법은 다음과 같이 이루어진다.
일반적으로 알려진 방법에 의해 MLV형태로 전극활성물질이 포획된 리포좀을 만든다. 즉, 플로로포름과 같은 유기 용매에 DMPC (Dimyristoylphosphatidylcholine), 폴레스테롤등의 인지질을 적정비율로 녹인 후, 이를 유리용기에 넣고 감압 증발시키면 지질 필름이 만들어진다. 여기에 pH 7.4인 인산완충용액에 100mM 훼로신을 녹인 용액을 첨가한뒤 격렬하게 진탕 교반하여 입자의 크기가 200-200nm의 불투명한 리포좀상이 만들어진다.
면역반응 매트릭스의 제작방법은 다음과 같다.
전처리시킨 나이트로 셀룰로오즈 매트릭스부(15)의 신호발생지점(14)에 훼로신이 포획된 리포좀을 고정하고, 경쟁지점(13)에는 측정물질인 씨오필린과 결합하는 항체를 고정시킨다. 그리고 분석시작점(12)에 리포좀 파괴인자인 포스포리파제 C(phospholipase C)를 시오필린을 결합시킨 접합체를 흡착시킨다.
위와 같이 제조된 매트릭스부(15)와 전극시스템(9)을 제5도와 같이 양면 접착용 테이프(16) 및 폴리에스터 상부지지막(17)을 이용하여 기본적극상의 절연층에 의해 노출된 전극부위(10)와 매트릭스부(15)의 리포좀이 고정된 부위(14)가 일치되도록 서로 접합시키게 되면 씨오필린 측정용 면역 바이오센서(19)가 완성된다.
측정시에는 측정 대상자의 혈액을 시료투여부위(18)에 떨어뜨리게 되면 시료와 포스포리파제 C-씨오필린 접합체가 매트릭스상에서 전개되어 이동을 시작한다. 경쟁지점(13)에 다다르게 되면 시료내의 측정물질인 씨오필린과 포스포리파제 C-씨오필린 접합체가 결합에 있어서 경쟁하게 되고, 그 결과 경쟁지점(13)을 통과해 신호발생지점(14)에 도달한 포스포리파제 C-씨오필린 접합체의 파괴인자인 포스포리파제 C가 리포좀을 파괴하여 리포좀안에 훼로신이 노출된다. 이때, 기준전극(8) 대비 약 150mV가 인가된 지시전극(5)상에 훼로신이 산화되어(ferrocene→forricinium +e-)시료내의 씨오필린 농도에 비례하는 전류를 얻을 수 있다.
다음에 제4실시예로서, 인간성장 호르몬(human growth hormone, HGH) 측정용 면역 바이오센서의 제작에 대해 설명한다.
기본전극의 제작 및 전극활성물질이 포획된 리포좀의 제조방법은 상기한 제1실시예의 경우와 동일하므로 그 설명을 생략한다.
전극활성물질이 포획된 리포좀의 제조방법은 다음과 같이 이루어진다.
일반적으로 알려진 방법에 의해 MLV 형태로 전극활성물질이 포획된 리포좀을 만든다. 즉, 클로로포름과 같은 유기용매에 DMPC, 콜레스테롤등의 인지질을 적정비율로 녹인 후, 이를 유리용기에 넣고 감압 증발시키면 지질 필름이 만들어진다. 여기에 pH 7.4인 인산 완충용액에 100mM DCPIP(2,6-dichlorophenolindophenol)를 녹인 용액을 첨가한뒤 격렬하게 진탕 교반하면 입자의 크기가 200-2000nm의 불투명한 리포좀상이 만들어진다.
면역반응 매트릭스의 제작은 다음과 같다.
전처리시킨 나이트로 셀룰로오즈 매트릭스부(15)의 신호발생지점(14)에 DCPIP이 포획된 리포좀을 고정하고, 경쟁지점(13)에는 측정물질인 HGH과 결합하는 항체를 고정시킨다. 그리고 분석 시작점(12)에 리포좀 파괴인자인 포스포리파제C를 HGH를 결합시킨 접합체를 흡착시킨다.
위와 같이 제조된 매트릭스부(15)와 전극시스템(9)을 제5도와 같이 양면 접착용 테이프(16) 및 폴리에스터 상부지지막(17)을 이용하여 기본전극상의 절연층에 의해 노출된 전극부위(10)와 매트릭스부(15)의 리포좀이 고정된 부위(14)가 일치되도록 서로 접합시키게 되면 HGH 측정용 면역 바이오센서(19)가 완성된다.
측정시에는 측정대상자의 혈액을 시료투여부위(18)에 떨어뜨리게 되면 시료와 포스포리파제 C-HGH 접합체가 매트릭스상에서 전개되어 이동을 시작한다. 경쟁지점(13)에 다다르게 되면 시료내의 측정물질인 HGH과 포스포리파제 C-HGH 접합체가 결합에 있어서 경쟁하게 되고, 그 결과 경쟁지점(13)을 통과해 신호 발생지점(14)에 도달한 포스포리파제 C-HGH 접합체의 파괴인자인 포스포리파제 C가 리포좀을 파괴하여 리포좀 안에 있던 DCPIP이 노출된다. 이때, 기준전극(8) 대비 약 50mv가 인가된 지시전극(5)상에 DCPIP이 산화되어 시료내의 HGH 농도에 비례하는 전류를 얻을 수 있다.
다음에 본 발명의 제5실시예로서, 상기 제1실시예와 제2실시예예서 각각 제작한 B형 간염 바이러스의 표면항원 측정용 면역 바이오센서(20) 및 B형 간염 바이러스의 표면항체 측정용 면역 바이오센서(21)를 제8도와 같이 결합시키게 되면 B형 간염 바이러스의 표면항체 및 표면항원 동시 측정용 면역 바이오센서를 제작할 수 있다.
또한, 본 발명의 제6실시예로서, 상기 제5실시예와 유사하게 제1실시예 내지 제4실시예에서와 같이 각각 제작된 개개의 면역 바이오센서(22-25)를 서로 중첩시켜 제9도에 도시된 바와 같이 다성분 측정용 면역 바이오센서를 제작할 수 있다. 이때, 개개의 면역 바이오센서(22-25) 제조시 동일한 전극활성 물질이 포획된 리포좀을 이용하고, 일종의 기준신호를 발생시키는 비교(control) 센서(26)를 중첩시켜 다성분 측정용 면역 바이오센서를 제작하면 각각의 면역 바이오센서(22-25)상에 출력되는 전극 신호는 면역 반응과 상관없는 비교신호(background signal)와 차동 증폭되어 간접효과를 배제한 검출신호를 얻을 수 있다. 기준신호를 발생시키는 비교 센서(26)는 면역 반응 매트릭스 제작시 전처리시킨 나이트로셀룰로오즈 매트릭스부(15)의 신호발생지점(14)에만 전극활성물질이 포획된 리포좀을 고정시킨 것이 특징이다. 따라서 시료중에 리포좀 파괴인자가 존재하는 리포좀이 경우나 면역반응과 상관없이 깨지는 경우라 해도 정확한 측정이 가능해진다. 시료측정시에는 제9도와 같이 측정회로 접속부(27)를 측정기에 접속시키고 시료를 다성분 측정용 면역 바이소센서로서의 시료접촉부위(28)와 반응시키게 된다.
본 발명은 표지물질인 전극활성 물질을 과량으로 포함할 수 있는 리포좀의 장점과 다른 어떤 방법보다도 그 측정 시스템이 단순한 전기화학의 원리를 같이 이용하여 항원-항체 반응의 결과를 바로 전기화학적으로 측정할 수 있는 전기 화학식 면역 바이오센서이기 때문에 본 발명에 의한 센서를 이용하게 되면 단지 시료를 센서의 특정부위에 올려놓는 과정으로서 짧은 시간안에 모든 분석이 수행되므로 여러 임상적인 분야에 신속하고 간편하게 응용될 수 있는 뛰어난 면역 분석 수단이 된다.
또한, 본 발명에 의한 스트립 형태의 일회용 면역 바이오센서는 건조된 형태로 포장, 공급할 수 있기 때문에 제품에 대한 사용자의 편의를 놓여 줄 수 있는 장점이 있다.
이와 같이 본 발명에 의한 스트립 형태의 일회용 면역 바이오센서를 활용하면 종합병원 뿐만 아니라 개인병원내 의사진료실에서도 환자의 건강상태를 직접 그자리에서 진단할 수 있는 방법을 제공해 줄 뿐 아니라, 빠른 처방을 내릴 수 있어 국민건강 복지향상에도 크게 기여할 수 있다. 따라서 본 발명에 의한 면역 바이오센서는 보통 수일이 소요되는 기존의 분석 시스템과도 분명한 제품의 차별성을 갖는 장점이 있다.
또한, 본 발명에서 사용한 면역반응을 일으키는 크로마토그래피 매트릭스상에는 측정물질-리포좀 파고인자 접합체, 측정물질과 선택적으로 결합하는 항체(또는 항원), 전기화학적 활성물질을 담고 있는 리포좀이 각각 특정부위에 흡착 또는 고정되어 있는 구조를 갖는 매트릭스임을 특징으로 하기 때문에 본 발명을 적용하면 기존의 항원-항체 반응과 같이 리간드 리셉터, 면역글로블린 G-단백질 A, 호르몬-호르몬 리셉터, DNA-DNA 리셉터, RNA-RNA 리셉터, 약물-약물리셉터등에 응용할 수 있는 장점이 있다.
따라서 본 발명을 이용하면 바이러스, 병원성 미생물, 단백질, 지질단백질, 호르몬, 항생제, 약물등을 측정할 수 있는 면역 바이오센서 및 다성분을 동시에 측정할 수 있는 복합 면역 바이오센서를 제작할 수 있는 장점이 있어 본 발명에 의한 효과는 매우 크다.
한편, 본 발명을 적용하면 리포좀-측정물질 복합체를 갖는 면역 바이오센서를 제작할 수도 있어 발명의 파급효과 또는 매우 크다. 즉, 상술한 리포좀 파괴인자-측정물질 복합체 대신 리포좀-측정물질 복합체를 만들고, 이것을 측정시료와 함께 매트릭스상에서 이동시켜 면역반응 결과 경쟁지점을 통과한 리포좀-측정물질 복합체가 전극 부근에 고정되어 있는 리포좀 파괴인자에 의해 깨져 신호를 발생시키는 형태가 된다.
이상 상술한 바와 같이 본 발명에 의하면, 면역 바이오센서를 실용화시킬 수 있다.

Claims (10)

  1. 절연성기판위에 다수의 전극이 형성되고, 상기 전극부위에 절연층이 선택적으로 형성되어 전극부위의 일부만을 노출시킨 전극부와, 측정물질-리포좀 파괴인자 접합체가 흡착된 부위와 측정물질에 결합하는 리셉터가 공유결합된 부위 및 전극활성물질이 포획된 리포좀이 고정된 부위를 갖는 리포점신호 증폭 및 면역 크로마토그래피 기능을 수행하는 매트릭스부로 구성되며, 상기 전극부의 노출된 전극부위와 상기 매트릭스부의 리포좀 고정부위가 서로 일치되도록 접합된 것을 특징으로 하는 전기화학식 면역 바이오센서.
  2. 제1항에 있어서, 상기 매트릭스부는 셀룰로오즈, 니트로 셀룰로오즈등의 여과지, 폴리스티렌, 폴리비닐, 활성화된 나일론막중에서 선택된 어느 하나를 재질로 하여 구성된 것임을 특징으로 하는 전기화학식 면역 바이오센서.
  3. 제1항에 있어서, 상기 전극활성물질이 포획된 리포좀은 DPPC, DPPG, DMPC, 콜레스테롤등의 인지질을 성분으로한 MLV형태로 된 것임을 특징으로 하는 전기화학식 면역 바이오센서.
  4. 제3항에 있어서, 상기 리포좀내 포획된 전극활성물질은 훼로신, 다이메틸훼로신과 같은 훼로신 유도체, 포타시움 훼리시아나이드, 바이올로겐 유도체, DCPIP, 파리-아미노페놀, TTF, TCNQ, PMS, 멜돌라블루, BPO, 시오닌중에서 선택된 어느 하나임을 특징으로 하는 전기화학식 면역 바이오센서.
  5. 제1항에 있어서, 상기 매트릭스부의 측정물질-리포좀 파괴인자 접합체가 흡착된 부위와 측정물질에 결합하는 리셉터가 공유결합된 부위에서 측정물질과 측정물질에 결합하는 리셉터는 각각 항원-항체, 바이오틴-이배딘, 면역글로블린 G-단백질 A, 호르몬-호르몬리셉터, DNA-DNA리셉터, RNA-RNA리셉터, 약물-약물리셉터등의 생리활성물질쌍으로 구성된 것임을 특징으로 하는 전기화학식 면역 바이오센서.
  6. 제1항에 있어서, 상기 측정물질-리포좀 파괴인자 접합체의 리포좀 파괴인자는 멜리틴, 포스포리페이즈 C등의 생리활성 물질인 것을 특징으로 하는 전기화학식 면역 바이오센서.
  7. 제1항에 있어서, 상기 절연성 기판은 폴리에스테르, PVC, 폴리카보네이트등의 고분자기판인 것을 특징으로 하는 전기화학식 면역 바이오센서.
  8. 제1항에 있어서, 상기 전극부는 박막 또는 후막공정을 이용하여 기준전극과 지시전극으로 구성된 이전극계 또는 대전극을 도입한 삼전극계로 구성됨을 특징으로 하는 전기화학식 면역 바이오센서.
  9. 제8항에 있어서, 상기 지시전극은 탄소, 백금, 금, 루테니움다이옥사이드중에서 선택된 어느 한 물질로 이루어진 것임을 특징으로 하는 전기화학식 면역 바이오센서.
  10. 제8항에 있어서, 상기 기준전극은 Ag/AgCl 또는 백금으로 이루어짐을 특징으로 하는 전기화학식 면역 바이오센서.
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