JP2736049B2 - 電気化学式免疫バイオセンサ - Google Patents

電気化学式免疫バイオセンサ

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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings
    • G01N33/5438—Electrodes

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は電気化学式免疫バイ
オセンサに係り、特に抗原−抗体の免疫反応結果を電気
化学的に測定して、試料内に存在する生理活性物質の濃
度を定量分析し得る免疫バイオセンサに関する。
【０００２】
【従来の技術】抗原−抗体(antigen-antibody)反応を用
いる免疫バイオセンサは、感知反応が高度の特異性と強
い結合力で行われるので、きわめて低い濃度で存在する
生理活性物質の分析において他のセンサより一層優れた
特性を示す。既存の免疫バイオセンサは主に光学的現象
を用いるものであって、鉱物繊維の端に固定された抗体
と測定対象物質（抗原）との相互作用結果によって変わ
る光の強度を測定する方法(Anderson G.P.et al.,IEEE
Trans.Biomed.Eng.1994,41,578-584)、圧電素子上に抗
体を固定し、これが対象物質（抗原）と結合するとき誘
発される質量変化を電気的信号に変える方法(Konig.B.e
t al.,Anal.Chem.1994,66,341-344)、そして金属ととも
に液体界面から発生する表面プラズマ共鳴(surface pla
sma resonance)現象が金属上に固定された抗体と分析対
象物質（抗原）の結合によって変化するのを感知する方
法(Severs,A.M.et al.,Biosensors & Bioelectronics,1
993,8,365-370)などがある。
【０００３】電気化学的方法を用いるものとしては、既
存の免疫分析法、例えば酵素免疫測定法(Enzyme-Linked
ImmunoSorbent Assay:ELISA)、金属イオン標識法など
を用いて電気化学的活性物質(electroactive species)
を発生させた後、これを分離して電気化学的に測定する
方法がある(Hayes,F.J.et al.,Anal.Chem.1994,66,1860
-1865)。
【０００４】尚、新しく脚光を浴びている免疫分析方法
としてリポソーム(liposome)を用いるものがあるが、こ
れは標識物質をリポソーム内に閉じ込めてから免疫反応
が終わった後、リポソームを破壊して標識物質を放出さ
せ測定物質の濃度と相関関係のある信号を発生させる方
法である。リポソームは燐脂質が主成分であるが、細胞
の生体膜のように内部に親水性或いは疎水性の物質を捕
獲したり、二重膜の性質に応じて捕獲された物質の通過
可否を調節し得る物質があって、薬物運搬体(drug deli
very system)としての機能がある。最近、このようなリ
ポソームを免疫測定法に応用しようとする研究が活発に
進行しているが、これをセンサに応用した事例(Richar
d,A.et al.,Biosensors & Bioelectronics,1993,8,xiii
-xv)は未だあまり多くないのが現状である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】光学的現象を用いる従
来の免疫バイオセンサは、測定システムが複雑で費用が
たくさんかかるという短所がある。それに比べて電気化
学の原理を導入した免疫バイオセンサの場合は、まず、
その測定システムが非常に単純であり、電極の制作も簡
単であるという利点がある。既存に紹介された電気化学
的測定方法を用いた免疫分析法(Athey,D.et al.,Biosen
sors & Bioelectronics,1993,8,415-419)があるが、こ
れは電気化学式免疫バイオセンサというよりは既存の免
疫分析システムをそのまま利用し、最終的な分析段階で
のみ電気化学的測定を行うので、依然と長い分析時間が
かかり、いろいろ喧しい課程を経なければならないの
で、日常的に簡便に使用可能なものではない。一般に、
抗原−抗体反応のような免疫反応はその反応自体の特性
によって測定するが、時間がたくさんかかる。
【０００６】真正な意味の電気化学式免疫バイオセンサ
の開発がこんなに微微として振るわない理由は、抗原−
抗体の結合自体では電気化学的活性をもつ物質を誘発し
難いという技術的な問題のためである。即ち、酵素を用
いた電気化学式センサの場合は、電極上に固定された酵
素の反応結果として電極活性物質が電極上に直ちに生
じ、これを酸化または還元させて電流を発生させる。こ
れに対して、抗体を電極に固定させて測定しようとする
物質（抗原）と反応させる場合には、何の電極活性物質
も生じない。最近、このような問題を解決するために酵
素活性をもつ抗体の制作実験が報告されたことがある。
尚、リポソームを用いた免疫分析法とこれをセンサに応
用することも喧しいが、その理由は免疫分析の場合、各
段階別に必要な材料を順次入れてやらなければならない
からである。最近紹介されたリポソームを用いた免疫バ
イオセンサの場合も、試料だけを投入するのではなくリ
ポソームを一緒に投与しなければならないので、一般使
用者がこれを用いるときセンサ自体だけではなくリポソ
ームの入った別途の材料まで取り扱わなければならな
い。そして、電気化学的測定を行うためにはリポソーム
を割らなければならないが、これも付加的な試料の添加
によって行われるので、決して簡便だとは言えない。
【０００７】尚、既存のストリップ状の酵素センサとは
異なり、抗原−抗体などの免疫反応を用いる免疫バイオ
センサは、酵素センサのようなストリップ状に制作する
ことはできない。なぜなら、上述したように抗原或いは
抗体だけを電極上に固定させては免疫反応結果、何の電
極活性物質も生じないためであり、且つ電極上部に抗体
を固定させておいた後、試料中の測定物質である抗原が
抗体と結合し、酵素や電極活性物質が接合された二次抗
体を再び反応させる「サンドイッチ」分析方法を適用す
る場合には、必ず中間にセンサを洗浄する課程を経なけ
ればならなく、そして補助試薬を必要とするためであ
る。
【０００８】本発明はかかる問題点を解決するためのも
ので、その目的は標識物質である電極活性物質が過量含
めるリポソームの長所と、測定システムが単純な電気化
学の原理を共に用いて、抗原−抗体反応の結果を直ちに
電気化学的に測定することのできる電気化学式免疫バイ
オセンサを提供することにある。
【０００９】本発明の他の目的は、試料の分析時に使用
者がいろんな段階の操作を行わなければならないという
喧しいさ無しでただ試料をセンサ上に落とす一度の操作
によって短い時間内に簡単に分析が行えるストリップ状
の使い捨ての免疫バイオセンサを提供することにある。
【００１０】本発明の別の目的は、別途の補助試薬なし
でセンサと試料を一度だけ接触、反応させることにより
試料中の分析物質の濃度が定量分析できるようにするた
め、試料を展開しながら免疫反応を起こすストリップ状
のクロマトグラフィマトリックスとストリップ状の電極
を接合させた構造を有する使い捨ての免疫バイオセンサ
を提供することにある。
【００１１】本発明の別の目的は、免疫反応を起こすク
ロマトグラフィマトリックス上には測定物質−リポソー
ム破壊因子接合体(analyte-cytolytic agent conjugate
s)、測定物質と選択的に結合する抗体（または抗原）、
電気化学的活性物質を込めているリポソームがそれぞれ
特定部位に吸着または固定している構造を有するように
することにより、試料との接触時に試料が展開されなが
ら免疫反応が起こるようにする電気化学式免疫バイオセ
ンサを提供することにある。
【００１２】本発明の別の目的は、電気化学的活性物質
を込めているリポソーム(electroac-tive species-cont
aining liposome)の信号発生原理を用いて、リポソーム
が割れるとき放出される電極活性物質が効果的に酸化或
いは還元反応を起こすようにマトリックスと絶縁性基板
上に製造された電極を一体化させることにより、免疫関
連測定物質を高感度で正確に測定できる電気化学式免疫
バイオセンサを提供することにある。
【００１３】本発明の別の目的は、多成分測定用複合免
疫バイオセンサを提供することにある。
【００１４】
【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
に、本発明による電気化学式免疫バイオセンサは、絶縁
性基板上に多数の電極が設けられ、前記電極部位に絶縁
層が選択的に形成されて電極部位の一部のみを露出させ
た電極部と、測定物質−リポソーム破壊因子接合体(ana
lyte-cytolytic agent conjugates)が吸着した部位、測
定物質に結合するレセプターが共有結合された部位及び
電極活性物質が捕獲されたリポソーム(electroactive s
pecies-containing liposome)が固定された部位を有す
る、免疫クロマトグラフィ機能を行うマトリックス部と
から構成し、前記電極部の露出した電極部位と前記マト
リックス部のリポソーム固定部位が互いに一致するよう
に接合させることを特徴とする。
【００１５】本発明による電気化学式多成分測定用免疫
バイオセンサは、絶縁性基板上に多数の電極が設けら
れ、前記電極部位に絶縁層が選択的に形成されて電極部
位の一部のみを露出させた電極部と、測定物質−リポソ
ーム破壊因子接合体が吸着した部位、測定物質に結合す
るレセプターが共有結合された部位及び電極活性物質が
捕獲されたリポソームが固定された部位を有するマトリ
ックス部とから構成し、前記電極部の露出した電極部位
と前記マトリックス部のリポソーム固定部位が互いに一
致するように接合させて制作された多数個の電気化学式
免疫バイオセンサを、基準信号を発生させる比較センサ
と重畳させて、免疫関連多成分の生理活性物質が同時に
測定できるようにすることを特徴とする。
【００１６】
【実施例】以下、添付図面を参照して本発明を詳細に説
明する。
【００１７】本発明による電気化学式免疫バイオセンサ
は、厚膜工程を用いて絶縁性基板上に形成した電極のあ
る電極部と、試料が投与されるとクロマトグラフィ(Chr
omatography)の原理または毛細管現象(capillary actio
n)で試料を展開しながら免疫反応を起こすクロマトグラ
フィ（もしくは毛細管）マトリックスで構成される。
【００１８】このような本発明の電気化学式免疫バイオ
センサの構造を図１乃至図６に基づいて説明する。
【００１９】電極は既存の電気化学式原理を用いたセン
サのように、基準電極(reference e-lectrode)と指示電
極(working electrode)で構成された２電極系(2-electr
odesystem)、もしくはこれに対電極(counter electrod
e)を導入した３電極系(3-ele-ctrode system)で構成さ
れ、基準電極対比一定の印加電圧の下に作用電極上で電
極活性物質の酸化または還元反応が起こるようになって
いる。
【００２０】３電極系からなる電極システム部位９は、
図１及び図２のように、ポリエステル(polyester)、Ｐ
ＶＣ(polyvinyl chloride)、ポリカーボネート(polycar
bonate)のような高分子からなる絶縁基板１上に銀（Ａ
ｇ）ペーストで印刷された伝導経路(conduction path）
２、３、４、カーボンペーストで印刷された指示電極５
と対電極６、そしてＡｇ／ＡｇＣｌ基準電極８、絶縁層
７によって構成される。
【００２１】図２は絶縁基板上に製造された電極システ
ム部位９の平面図である。
【００２２】一方、２電極系で構成された電極システム
は、図３及び図４に示すように、指示電極５’と基準電
極８’のみで構成される。
【００２３】一般に、指示電極(working electrode)製
造用物質としては炭素(carbon)、白金(platinum)、金(g
old)、二酸化ルテニウム(ruthenium dioxide)などを使
用することができる。
【００２４】そして、免疫反応を起こすマトリックス部
１５は、図５に示すように、濾過紙(filter paper)、ニ
トロセルロース(nitrocellulose)、ポリスチレン、ポリ
ビニール、活性化されたナイロン膜などを材質として使
用し、前記マトリックス部１５の左側上部、即ち分析開
始点１２には測定物質−リポソーム破壊因子で構成され
た接合体を吸着させ、中央上部、即ち競争支点１３には
測定物質に結合する抗体（または抗原）を共有結合させ
て移動できないようにした後、右側上部、即ち信号発生
支点１４にはフェロセン(ferrocene)、ジメチルフェロ
セン(dimethylfe-rrocene)のようなフェロセン誘導体、
フェロシアン化カリウム(potassium ferrocyanide)、Ｄ
ＣＰＩＰ(2,6-dichlorophenolindophenol)、パラ−アミ
ノフェノール(p-aminophenol)、ＴＴＦ(thtrathiafulva
lene)、ＴＣＮＱ(tetracyanoquino-dimethane)、ＰＭＳ
(phenazine methosulphate)、メルドラブル(meldola's
blue,7-dimethylamino-1,2-benzophenoxazine)、ＢＰＯ
(1,2-benzophenoxazine-7-one)、シオニン(thionin)な
どのように電気化学的活性物質を込めているリポソーム
が固定されている。
【００２５】このようなマトリックス部１５は、基本的
に試料とマトリックス上に吸着した測定物質−リポソー
ム破壊因子接合体を移動させながら免疫反応を起こす役
割とともに、電極部位１０に電解質(electrolyte)を提
供する役割を果たす。
【００２６】そして、前記した特性を有するマトリック
ス部１５と電極システム９を、図５のように両面接着用
テープ１６及びポリエステル上部支持膜１７を用いて基
本電極上の絶縁層によって露出された電極部位１０とマ
トリックス部１５上の電気化学的活性物質を込めている
リポソームが固定された部位１４と一致するように互い
に接合させると、本発明による免疫バイオセンサ１９が
完成する。
【００２７】図６はこのように完成した免疫バイオセン
サの斜視図であり、参照符号１８は試料投与部位を示
す。
【００２８】本発明による免疫バイオセンサの信号発生
原理を図７を参照して説明する。
【００２９】一実施例として測定しようとする物質が抗
原の場合、測定物質（抗原）の入っている液相試料一定
量をセンサ上の試料投与部位１８に落とす（図７
（Ａ））。そうすると、図７（Ｂ）のように、試料はマ
トリックス部１５の分析開始点１２に吸着していた測定
物質−リポソーム破壊因子接合体と混じり合い、試料の
液体を運搬体として試料内の測定物質とともにクロマト
グラフィの原理によって電極の方に移動し始める（図７
（Ｃ））。この際、到達した競争支点１３には分析しよ
うとする物質に特異的に結合する抗体が固定されている
が、この抗原−抗体の結合場所をおいて試料内の測定対
象物質と測定物質−リポソーム破壊因子接合体が競争を
行う（図７（Ｄ））。従って、試料内に測定しようとす
る物質が多い場合、より多くの測定物質−リポソーム破
壊因子が競争支点１３を通過して電極の真上の信号発生
支点１４に固定されているリポソームに到達し、リポソ
ームを割る（図７（Ｅ））。このような免疫反応の結果
として、試料溶液内に存在する測定物質の濃度に比べて
リポソーム内の電極活性物質が放出され、放出された電
極活性物質は電極部位１０に拡散しながら到達すること
になる（図７（Ｆ））。この際、基準電極８対比一定電
圧が印加された指示電極５上で電極活性物質が酸化また
は還元しながら指示電極５と対電極６間に電流を発生さ
せるため、結局試料溶液内に存在する測定物質の濃度に
比例する電流値が得られる。
【００３０】反面、分析しようとする物質が抗体の場
合、マトリック上の競争支点１３に、測定物質に特異的
に結合する抗原を固定させると、前記した原理によって
測定物質が抗体の場合でも分析可能である。
【００３１】このように本発明を適用すると、既存の抗
原−抗体反応のようにリガンド-レセプター(ligand-rec
eptor)間の親和力を用いるすべての免疫学的分析方法に
応用することができる。例えば、ビオチン-アビジン(bi
otine-avidin)、免疫グロブリンＧ−蛋白質Ａ(immunogl
obulin G-protein A)、ホルモン−ホルモンレセプター
(hormone-hormone receptor)、ＤＮＡ−ＤＮＡレセプタ
ー(DNA-DNA receptor)、ＲＮＡ−ＲＮＡレセプター(RNA
-RNA receptor)、薬物−薬物レセプター(drug-drug rec
eptor)などがある。
【００３２】以下、本発明の免疫バイオセンサを適用し
て肝炎ウイルス(Hepatitis virus)やＡＩＤＳウイルス
(HIV virus)などのウイルス、サルモネラ(Salmonella)
やレジオネラ(Legionella)などのような病原性微生物、
免疫グロブリンのような蛋白質、ＨＤＬやＬＤＬのよう
なリポタンパク質(lipoprotein)、人間成長ホルモン(Hu
man growth hormone)や甲状腺刺激ホルモンＴＳＨなど
のようなホルモン、ゼンタマイシン(Gentamicin)やトブ
ラマイシン(Tobramicin)などの抗生剤、ジゴキシン(Dig
oxin)やテオフィリン(Theophylline)のような薬物など
を測定し得る免疫バイオセンサ及び他姓分を同時に測定
することのできる複合免疫バイオセンサの製造方法をい
くつかの実施例を用いて説明する。
【００３３】実施例１：Ｂ型肝炎ウイルスの表面抗原
（ＨＢｓＡｇ）測定用免疫バイオセンサ Ｂ型肝炎ウイルスの表面抗原（ＨＢｓＡｇ）はＢ型肝炎
菌の保菌有無を判定するのに指標となる。
【００３４】まず、基本電極の制作は次のように行う。
【００３５】図１及び図２に示すように、厚さ０.３ｍ
ｍのポリエステル絶縁基板１をアセトンで洗浄した後、
銀ペーストを印刷し、１１０℃程度で１０分間熱処理し
て伝導性経路及び接続経路(conduction path）２、３、
４を構成する。次に、指示電極５と対電極６の部位にカ
ーボンペーストを印刷し、前記のように熱処理する。次
に、絶縁ペーストを印刷して絶縁層７を形成した後、絶
縁層７によって露出された電極部位１０を１００ｍＭ
ＦｅＣｌ3溶液で１分間処理した後、蒸留水で余分のＦ
ｅＣｌ3溶液を洗い上げてＡｇ／ＡｇＣｌ基準電極８を
形成すると、図２のように指示電極５、対電極６、基準
電極８からなる電極システム９が完成する。
【００３６】次に、電極活性物質が捕獲されたリポソー
ム(electroactive species-containing liposome)の制
作は下記のように行われる。
【００３７】一般的に知られている方法によってＬＵＶ
(Large Unilamella Vesicle)もしくはＭＬＶ(Multilame
lla Lipid Vesicle)形態に電極物質が捕獲されたリポソ
ーム(electroactive species-containing liposome)を
作る。即ち、クロロホルム(chloroform)のような有機溶
媒にＤＰＰＣ(dipalmitoylphosphatidylcholine)、ＤＰ
ＰＧ(dipalmitoylphosphatidyl glycerol)、コレステロ
ール(cholesterol)などの燐脂質を適正比率で溶かした
後、これをガラス容器に入れて減圧蒸発させると脂質フ
ィルムが作られる。ここに、ｐＨ７.４の燐酸緩衝溶液
(phosphate buffer)に１００ｍＭフェリシアン化カリウ
ムを溶かした溶液を添加した後、激烈に振盪攪拌すると
２００〜２０００ｎｍ程度の粒子サイズを有する不透明
なリポソーム相が作られる。
【００３８】次に、免疫反応マトリックスの制作は下記
のように行われる。
【００３９】セルロースペーパー(cellulose paper)な
どのようにクロマトグラフィ用ペーパーを６ｍｍｘ５０
ｍｍの大きさに切った後、カゼイン(casein)２．５ｇを
溶かした０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝溶液(sodium carb
onate buffer)に浸してマトリックスを前処理した後、
蒸留水で繰り返し洗い上げた後乾燥させる。次に、図５
に示すように、前処理したマトリックス部１５の信号発
生支点１４にフェリシアン化カリウムが捕獲されたリポ
ソームを固定し、競争支点１３には測定物質である抗原
（ＨＢｓＡｇ）と結合する抗体（anti-HBsAg）を固定さ
せる。そして、分析開始点１２にリポソーム破壊因子で
あるメリチン(melittin)を抗原（ＨＢｓＡｇ）と結合さ
せた接合体を吸着させる。
【００４０】前記のように制作されたマトリックス部１
５と電極システム９を、図５に示すように両面接着用テ
ープ１６及びポリエステル上部支持膜１７を用いて基本
電極上の絶縁層によって露出された電極部位１０とマト
リックス部１５のリポソームが固定された部位１４が一
致するように互いに接合させると、Ｂ型肝炎ウイルスの
表面抗原測定用免疫バイオセンサ１９が完成する。
【００４１】それから、測定時には測定対象者の血液を
試料投与部位１８に落とすと、マトリックス部１５の分
析開始点１２に吸着していたメリチン−ＨＢｓＡｇ接合
体が試料とともにマトリックス上で展開されて移動し始
める。そして、競争支点１３に至ると、試料内の測定物
質でる表面抗原（ＨＢｓＡｇ）とメリチン-ＨＢｓＡｇ
接合体が結合において競争し、その結果、競争支点１３
を通過して信号発生支点１４に到達したメリチン−ＨＢ
ｓＡｇ接合体の破壊因子であるメリチンがリポソームを
破壊して、リポソーム内にあったフェリシアン化カリウ
ムが露出される。この際、基準電極８対比２００ｍＶが
印加された指示電極５上でフェリシアン化カリウムが酸
化して（Ｆｅ（ＣＮ）6 -4→Ｆｅ（ＣＮ）6 -3＋ｅ-）試
料内のＨＢｓＡｇ濃度に比例する電流を得ることができ
る。
【００４２】実施例２：Ｂ型肝炎ウイルスの表面抗体(a
nti-HBsAg)測定用免疫バイオセンサ Ｂ型肝炎ウイルスの表面抗体はＢ型肝炎菌に対する抗体
形成の可否、即ち免疫形成の可否を判定するのに指標と
なる。
【００４３】基本電極の制作及び電極活性物質が捕獲さ
れたリポソームの製造方法は、前記した実施例１の場合
と同一であるので、その説明を省略する。
【００４４】そして、免疫反応マトリックスの制作は下
記のように行われる。
【００４５】セルロースペーパーなどのようにクロマト
グラフィ用ペーパーを６ｍｍｘ５０ｍｍの大きさに切っ
た後、カゼイン２．５ｇを溶かした０．１Ｍ炭酸ナトリ
ウム緩衝溶液(Sodium Carbonate Buffer)に浸してマト
リックスを前処理した後、蒸留水で繰り返して洗い上げ
た後乾燥させる。前処理したマトリックス部１５の信号
発生支点１４にフェリシアン化カリウムが捕獲されたリ
ポソームを固定し、競争支点１３には測定物質である抗
体と結合する抗原を固定させる。そして、分析開始点１
２にリポソーム破壊因子であるメリチンを抗体と結合さ
せた接合体を吸着させる。
【００４６】前記のように製造された免疫反応マトリッ
クス部１５と電極システム９を、図５に示すように両面
接着用テープ１６及びポリエステル上部支持膜１７を用
いて、基本電極上の絶縁層によって露出された電極部位
１０とマトリックス部１５のリポソームが固定された部
位１４が一致するように互いに接合させると、Ｂ型肝炎
ウイルスの表面抗体測定用免疫バイオセンサ１９が完成
する。
【００４７】測定時には測定対象者の血液を試料投与部
位１８に落とすと、マトリックス部１５の分析開始点１
２に吸着していたメリチン−表面抗体接合体が試料とと
もにマトリックス上で展開されて移動を始める。そし
て、競争支点１３に到達すると、試料内の測定物質であ
る表面抗体(anti-HBs)とメリチン−表面抗体接合体が結
合において競争し、その結果、競争支点１３を通過して
信号発生支点１４に到達したメリチン−表面抗体接合体
の破壊因子であるメリチンがリポソームを破壊して、リ
ポソーム内にあったフェリシアン化カリウムが露出され
る。この際、基準電極８対比２００ｍＶが印加された指
示電極５上でフェリシアン化カリウムが酸化して（Ｆｅ
（ＣＮ）6 -4→Ｆｅ（ＣＮ）6 -3＋ｅ-）試料内の表面抗
体(anti-HBsAg)の濃度に比例する電流を得ることができ
る。
【００４８】実施例３：テオフィリン(Theophylline)測
定用免疫バイオセンサ 基本電極の制作方法は前記した実施例１の場合と同一な
ので、その説明を省略する。
【００４９】そして、電極活性物質が捕獲されたリポソ
ーム(electroactive species-containing liposome)の
制作は下記のように行われる。
【００５０】一般的に知られた方法によってＬＵＶ(Lar
ge Unilamella Vesicle)もしくはＭＬＶ(Multilamella
Lipid Vesicle)形態に電極活性物質が捕獲されたリポソ
ーム(electroactive species-containing liposome)を
作る。即ち、クロロホルム(chloroform)のような有機溶
媒にＤＭＰＣ(Dimyristoylphosphatidylcholine)、コレ
ステロール(cholesterol)などの燐脂質を適正比率で溶
かした後、これをガラス容器に入れて減圧蒸発させる
と、脂質フィルムが作られる。ここにｐＨ７．４の燐酸
緩衝溶液(phosphate buffer)に１００ｍＭフェロセン(f
errocene)を溶かした溶液を添加した後、激烈に振盪攪
拌すると、２００〜２０００ｎｍ程度の粒子大きさを有
する不透明なリポソーム相が作られる。
【００５１】そして、免疫反応マトリックスの制作方法
は次に示す通りである。
【００５２】前処理したニトロセルロースマトリックス
部１５の信号発生支点１４にフェロセンが捕獲されたリ
ポソームを固定し、競争支点１３には測定物質であるテ
オフィリンと結合する抗体(anti-theophylline)を固定
させる。そして、分析開始点１２にリポソーム破壊因子
であるホスホリパーゼＣ(phospholipase Ｃ)とテオフィ
リンを結合させた接合体を吸着させる。
【００５３】前記のように制作されたマトリック部１５
と電極システム９を、図５のように両面接着用テープ１
６及びポリエステル上部支持膜１７を用いて、基本電極
上の絶縁層によって露出された電極部位１０とマトリッ
クス部１５のリポソームが固定された部位１４が一致す
るように互いに接合させると、テオフィリン測定用免疫
バイオセンサ１９が完成する。
【００５４】測定時には測定対象者の血液を試料投与部
位１８に落とすと、試料とホスホリパーゼＣ−テオフィ
リン接合体がマトリックス上で展開されて移動し始め
る。そして、競争支点１３に到達すると、試料内の測定
物質であるテオフィリンとホスホリパーゼＣ−テオフィ
リン接合体が結合において競争し、その結果、競争支点
１３を通過して信号発生支点１４に到達したホスホリパ
ーゼＣ−テオフィリン接合体の破壊因子であるホスホリ
パーゼＣがリポソームを破壊して、リポソーム内にあっ
たフェロセンが露出される。この際、基準電極８対比約
１５０ｍＶが印加された指示電極５上でフェロセンが酸
化して(ferrocene→ferricinium＋e-)試料内のテオフィ
リンの濃度に比例する電流が得られる。
【００５５】実施例４：人間成長ホルモン(human growt
h hormone,HGH)測定用免疫バイオセンサ 基本電極の制作方法は上記した実施例１の場合と同一な
ので、その説明を省略する。
【００５６】そして、電極活性物質が捕獲されたリポソ
ーム(electroactive species-containing liposome)の
制作は下記のように行われる。
【００５７】一般的に知られている方法によってＬＵＶ
(Large Unilamella Vesicle)もしくはＭＬＶ(Multilame
lla Lipid Vesicle)形態に電極活性物質が捕獲されたリ
ポソーム(electroactive species-containing liposom
e)を作る。即ち、クロロホルム(chloroform)のような有
機溶媒にＤＭＰＣ(Dimyristoylphosphatidylcholine)、
コレステロール(cholesterol)などの燐脂質を適正比率
で溶かした後、これをガラス容器に入れて減圧蒸発させ
ると、脂質フィルムが作られる。ここにｐＨ７．４の燐
酸緩衝溶液に１００ｍＭ ＤＣＰＩＰ(2,6-dichlorophen
oli-ndophenol)を溶かした溶液を添加した後、激烈に振
盪攪拌すると、２００〜２０００ｎｍの不透明なリポソ
ーム相が作られる。
【００５８】そして、免疫反応マトリックス部１５の制
作は次のように行われる。
【００５９】前処理したニトロセルロースマトリックス
部１５の信号発生支点１４にＤＣＰＩＰが捕獲されたリ
ポソームを固定し、競争支点１３には測定物質である人
間成長ホルモン（ＨＧＨ）と結合する抗体(anti-HGH)を
固定させる。そして、分析開始点１２にリポソーム破壊
因子であるホスホリパーゼＣとＨＧＨを結合させた接合
体を吸着させる。
【００６０】前記のように制作されたマトリック部１５
と電極システム９を、図５のように両面接着用テープ１
６及びポリエステール上部支持膜１７を用いて、基本電
極上の絶縁層によって露出された電極部位１０とマトリ
ック部１５のリポソームが固定された部位１４が一致す
るように互いに接合させると、ＨＧＨ測定用免疫バイオ
センサ１９が完成する。
【００６１】測定時には測定対象者の血液を試料投与部
位１８に落とすと、試料とホスホリパーゼＣ-ＨＧＨ接
合体がマトリックス上で展開されて移動し始める。そし
て、競争支点１３に至ると、試料内の測定物質であるＨ
ＧＨがホスホリパーゼＣ−ＨＧＨ接合体が結合において
競争し、その結果、競争支点１３を通過して信号発生支
点１４に到達したホスホリパーゼＣ-ＨＧＨ接合体の破
壊因子であるホスホリパーゼＣがリポソームを破壊し
て、リポソーム内にあったＤＣＰＩＰが露出される。こ
の際、基準電極８対比約１５０ｍＶが印加された指示電
極５上でＤＣＰＩＰが還元して試料内の人間成長ホルモ
ン（ＨＧＨ）の濃度に比例する電流が得られる。
【００６２】実施例５：Ｂ型肝炎ウイルスの表面抗体及
び表面抗原同時測定用免疫バイオセンサ 前記実施例１と実施例２でそれぞれ制作したＢ型肝炎ウ
イルスの表面抗原(HBsAg)測定用免疫バイオセンサ２０
及びＢ型肝炎ウイルスの表面抗体(anti-HBsAg)測定用免
疫バイオセンサ２１を図８のように重畳して結合させる
と、Ｂ型肝炎ウイルスの表面抗体及び表面抗原同時測定
用免疫バイオセンサを制作することができる。
【００６３】実施例６：多成分測定用免疫バイオセンサ 前記実施例５と同様に、実施例１乃至実施例４でそれぞ
れ制作された個々の免疫バイオセンサ２２〜２５を互い
に重畳させて図９に示すように多成分測定用免疫バイオ
センサを制作することができる。この際、個々の免疫バ
イオセンサ２２〜２５の製造時に同一の電極活性物質が
捕獲されたリポソームを用い、一種の基準信号を発生さ
せる比較センサ２６を重畳させて多成分測定用免疫バイ
オセンサを制作すると、それぞれの免疫バイオセンサ２
２〜２５上から出力される電極信号は免疫反応と関係な
い比較信号(background signal)と差動増幅されて干渉
効果を排除した検出信号が得られる。基準信号を発生さ
せる比較センサ２６は免疫反応マトリックスの制作時に
前処理したニトロセルロースマトリックス部１５の信号
発生支点１４のみに電極活性物質が捕獲されたリポソー
ムを固定させる。従って、試料中にリポソーム破壊因子
が存在する場合やリポソームが免疫反応と関係なく割れ
る場合でも、正確な測定が可能になる。試料測定時には
図９に示すように、測定回路接続部２７を測定器に接続
させ、試料を多成分測定用免疫バイオセンサとしての試
料接触部位２８と反応させればよい。
【００６４】
【発明の効果】以上説明したように、本発明による電気
化学式免疫バイオセンサは、標識物質である電極活性物
質が過量含めるリポソームの長所と他のどんな方法より
もその測定システムが単純な電気化学の原理を一緒に利
用して、抗原-抗体反応の結果を直ちに電気化学的に測
定し得る電気化学式免疫バイオセンサであるため、本発
明による免疫バイオセンサを利用すると、ただ試料をセ
ンサの特定部位に載せる課程だけで短い時間内にすべて
の分析が行われるので、いろんな臨床的な分野に迅速で
簡便に応用できる優秀な免疫分析手段になる。
【００６５】尚、本発明によるストリップ状の使い捨て
の免疫バイオセンサは、乾燥された形態で包装、供給す
ることができるため、製品に対する使用者の便宜を高め
ることができるという長所がある。このように本発明に
よるストリップ状の使い捨ての免疫バイオセンサを活用
すると、総合病院ばかりではなく個人病院内の医者診療
室でも患者の健康状態を直接その場で診断し得る方法を
提供することができ、さらに速い処方を下すことができ
るので国民健康福祉の向上にも大きく寄与することがで
きる。したがって、本発明による免疫バイオセンサは普
通数日がかかる既存の分析システムともはっきりとした
製品の差別性をもつ。
【００６６】尚、本発明で使用した免疫反応を起こすク
ロマトグラフィマトリックス上には測定物質−リポソー
ム破壊因子接合体、測定物質と選択的に結合する抗体
（または抗原）、電気化学的活性物質を込めているリポ
ソームがそれぞれ特定部位に吸着または固定している構
造を有するマトリックスであることを特徴とするため、
本発明を適用すると、既存の抗原−抗体反応のようにリ
ガンドレセプター、免疫グロブリンＧ−蛋白質Ａ、ホル
モン−ホルモンレセプター、ＤＮＡ−ＤＮＡレセプタ
ー、ＲＮＡ−ＲＮＡレセプター、薬物−薬物レセプター
などに応用することができるという長所がある。したが
って、本発明を利用すると、ウイルス、病原性微生物、
蛋白質、リポタンパク質、ホルモン、抗生剤、薬物など
を測定し得る免疫バイオセンサ及び多成分を同時に測定
し得る複合免疫バイオセンサが制作できるという長所が
ある。
【００６７】一方、本発明を適用すると、リポソーム測
定物質複合体を有する免疫バイオセンサを制作すること
もできて発明の波及効果も非常に大きい。即ち、上述し
たリポソーム破壊因子−測定物質複合体の代わりにリポ
ソーム測定物質複合体を作り、これを測定試料とともに
マトリックス上で移動させ免疫反応結果、競争支点を通
過したリポソーム測定物質複合体が電極付近に固定して
いるリポソーム破壊因子によって割れて信号を発生させ
る形態になる。
【００６８】上述ように、本発明によれば免疫バイオセ
ンサを実用化することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明による免疫バイオセンサの３電極系から
なる電極システムの斜視図である。
【図２】本発明による免疫バイオセンサの３電極系から
なる電極システムの平面図である。
【図３】本発明による免疫バイオセンサの２電極系から
なる電極システムの斜視図である。
【図４】本発明による免疫バイオセンサの２電極系から
なる電極システムの平面図である。
【図５】本発明による免疫バイオセンサのマトリックス
部の構造図である。
【図６】本発明による免疫バイオセンサの斜視図であ
る。
【図７】（Ａ）乃至（Ｆ）は本発明による免疫バイオセ
ンサの信号発生原理を示す図面である。
【図８】本発明の一実施例によるＢ型肝炎ウイルスの表
面抗体及び表面抗原同時測定用免疫バイオセンサの斜視
図である。
【図９】本発明の他の実施例による多成分測定用免疫バ
イオセンサの斜視図である。
【符号の説明】
１ 絶縁基板 ２、３、４ 指示電伝導性経路及び接続経路 ５ 指示電極 ６ 対電極 ７ 絶縁層 ８ 基準電極 ９ 電極システム １０ 電極部位 １２ 分析開始点 １３ 競争支点 １４ 信号発生支点 １５ マトリックス部 １８ 試料投与部位 １９〜２５ バイオセンサ

Claims (14)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 絶縁性基板上に多数の電極が設けられ、
    前記電極部位に絶縁層が選択的に形成されて電極部位の
    一部のみを露出させた電極部と、 測定物質−リポソーム破壊因子接合体(analyte-cytolyt
    ic agent conjugates)が吸着した部位、測定物質に結合
    するレセプターが共有結合された部位及び電極活性物質
    が捕獲されたリポソーム(electroactive species-conta
    ining liposome)が固定された部位を有し、免疫クロマ
    トグラフィ機能を行うマトリックス部とから構成し、前
    記電極部の露出した電極部位と前記マトリックス部のリ
    ポソーム固定部位が互いに一致するように接合させたこ
    とを特徴とする電気化学式免疫バイオセンサ。
  2. 【請求項２】 前記マトリックス部はセルロース、ニト
    ロセルロースの濾過紙、ポリスチレン、ポリビニール、
    活性化されたナイロン膜のうちいずれか一つを材質とし
    て構成されたことを特徴とする請求項１記載の電気化学
    式免疫バイオセンサ。
  3. 【請求項３】 前記電極活性物質が捕獲されたリポソー
    ムは、ＤＰＰＣ(dipalmitoylphosphatidycholine)、Ｄ
    ＰＰＧ(dipalmitoylphosphatidylglycerol)、ＤＭＰＣ
    (dimyristoylphosphatidylcholine)、コレステロール(c
    holesterol)などの燐脂質を成分として製造されたこと
    を特徴とする請求項１記載の電気化学式免疫バイオセン
    サ。
  4. 【請求項４】 前記リポソーム内の捕獲された電気活性
    物質は、フェロセン(ferrocene)、ジメチルフェロセン
    (dimethylferrocene)のようなフェロセン誘導体、フェ
    ロシアン化カリウム(potassium ferrocyanide)、ＤＣＰ
    ＩＰ(2,6-dichlorophenolindophenol)、パラ−アミノフ
    ェノール(p-aminophenol)、ＴＴＦ(tetrathiafulvalen
    e)、ＴＣＮＱ(tetracyanoquino-dimethane)、ＰＭＳ(ph
    enazine methosulphate)、メルドラブルー(meldola's b
    lue,7-dimethylamino-1,2-benzophenoxazine)、ＢＰＯ
    (1,2-benzophenoxazine-7-one)、シオニン(thionin)の
    うちいずれか一つであることを特徴とする請求項３記載
    の電気化学式免疫バイオセンサ。
  5. 【請求項５】 前記マトリックス部の測定物質−リポソ
    ーム破壊因子接合体が吸着した部位と、測定物質に結合
    するレセプターが共有結合された部位で測定物質と測定
    物質に結合するレセプターは、それぞれ抗原−抗体、ビ
    オチン-アビジン(biotine-avidin)、免疫グロブリンＧ
    −蛋白質Ａ(immunoglobulin G-protein A)、ホルモン−
    ホルモンレセプター(hormone-hormone receptor)、ＤＮ
    Ａ−ＤＮＡレセプター(DNA-DNA receptor)、ＲＮＡ−Ｒ
    ＮＡレセプター(RNA-RNA receptor)、薬物−薬物レセプ
    ター(drug-drug receptor)などの生理活性物質対で構成
    されたことを特徴とする請求項１記載の電気化学式免疫
    バイオセンサ。
  6. 【請求項６】 前記測定物質−リポソーム破壊因子接合
    体のリポソーム破壊因子は、メリチン(melittin)、ホル
    ホリパーゼＣなどの生理活性物質であることを特徴とす
    る請求項１記載の電気化学式免疫バイオセンサ。
  7. 【請求項７】 絶縁性基板上に多数の電極が設けられ、
    前記電極部位に絶縁層が選択的に形成されて電極部位の
    一部のみを露出させた電極部と、測定物質−リポソーム
    破壊因子接合体が吸着した部位、測定物質に結合するレ
    セプターが共有結合された部位及び電極活性物質が捕獲
    されたリポソームが固定された部位を有するマトリック
    ス部とから構成し、前記電極部の露出した電極部位と前
    記マトリックス部のリポソーム固定部位が互いに一致す
    るように接合させて制作された多数個の電気化学式免疫
    バイオセンサを、基準信号を発生させる比較センサと重
    畳させて、免疫関連多成分の生理活性物質を同時に測定
    可能にすることを特徴とする電気化学式多成分測定免疫
    バイオセンサ。
  8. 【請求項８】 前記マトリックス部はセルロース、ニト
    ロセルロースなどの濾過紙、ポリスチレン、ポリビニー
    ル、活性化されたナイロン膜のうちいずれか一つを材質
    として構成されたことを特徴とする請求項７記載の電気
    化学式免疫バイオセンサ。
  9. 【請求項９】 前記電極活性物質が捕獲されたリポソー
    ムは、ＤＰＰＣ(dipalmitoylphosphatidycholine)、Ｄ
    ＰＰＧ(dipalmitoylphosphatidylglycerol)、ＤＭＰＣ
    (dimyristoylphosphatidylcholine)、コレステロール(c
    holesterol)などの燐脂質を成分として製造されたこと
    を特徴とする請求項７記載の電気化学式免疫バイオセン
    サ。
  10. 【請求項１０】 前記リポソーム内の捕獲された電気活
    性物質は、フェロセン(ferrocene)、ジメチルフェロセ
    ン(dimethylferrocene)のようなフェロセン誘導体、フ
    ェロシアン化カリウム(potassium ferrocyanide)、ＤＣ
    ＰＩＰ(2,6-dichlorophenolindophenol)、パラ−アミノ
    フェノール(p-aminophenol)、ＴＴＦ(tetrathiafulvale
    ne)、ＴＣＮＱ(tetracyanoquino-dimethane)、ＰＭＳ(p
    henazinemethosulphate)、メルドラブル−(meldola's b
    lue,7-dimethylamino-1,2-benzophenoxazine)、ＢＰＯ
    (1,2-benzophenoxazine-7-one)、シオニン(thionin)の
    うちいずれか一つであることを特徴とする請求項９記載
    の電気化学式免疫バイオセンサ。
  11. 【請求項１１】 前記マトリックス部の測定物質−リポ
    ソーム破壊因子接合体が吸着した部位と、測定物質に結
    合するレセプターが共有結合された部位で測定物質と測
    定物質に結合するレセプターは、それぞれ抗原−抗体、
    ビオチン-アビジン(biotine-avidin)、免疫グロブリン
    Ｇ−蛋白質Ａ(immunoglobulin G-protein A)、ホルモン
    −ホルモンレセプター(hormone-hormone receptor)、Ｄ
    ＮＡ−ＤＮＡレセプター(DNA-DNA receptor)、ＲＮＡ−
    ＲＮＡレセプター(RNA-RNA receptor)、薬物−薬物レセ
    プター(drug-drug receptor)などの生理活性物質対で構
    成されたことを特徴とする請求項７記載の電気化学式免
    疫バイオセンサ。
  12. 【請求項１２】 前記測定物質−リポソーム破壊因子接
    合体のリポソーム破壊因子は、メリチン(melittin)、ホ
    スホリパーゼＣなどの生理活性物質であることを特徴と
    する請求項７記載の電気化学式免疫バイオセンサ。
  13. 【請求項１３】 前記それぞれの免疫バイオセンサは同
    じ電極活性物質が捕獲されたリポソームをそれぞれのマ
    トリックス部に固定することを特徴とする請求項７記載
    の電気化学式多成分測定用免疫バイオセンサ。
  14. 【請求項１４】 前記比較センサは電極活性物質が捕獲
    されたリポソームが固定されたマトリックス部を含むこ
    とを特徴とする請求項７記載の電気化学式多成分測定用
    免疫バイオセンサ。
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