DE69932428T2

DE69932428T2 - Mittels liposomen verbesserte testvorrichtung sowie verfahren

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Publication number: DE69932428T2
Application number: DE69932428T
Authority: DE
Inventors: Allen Richard Romulus DURST; A. Richard Grand Island MONTAGNA; J. Antje Romulus BÄUMER; Ti Sui Geneva SIEBERT; S. Geoffrey Aurora RULE
Original assignee: Cornell Research Foundation Inc; Innovative Biotechnologies International Inc
Current assignee: Cornell Research Foundation Inc; Innovative Biotechnologies International Inc
Priority date: 1998-05-21
Filing date: 1999-05-21
Publication date: 2007-02-08
Anticipated expiration: 2019-05-22
Also published as: EP1078260A1; WO1999060399A1; EP1078260B1; ATE333646T1; DE69932428D1; EP1078260A4

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Detektion oder quantitativen Bestimmung eines Analyts und eine bei dem Verfahren verwendete Testvorrichtung. Insbesondere betrifft die Erfindung eine Biosensortestvorrichtung und ein Verfahren unter Verwendung von markerbeladenen Liposomen und elektrochemischer Detektion zur Signalverstärkung und quantitativen Bestimmung.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Es existiert eine Vielzahl von Techniken, die zur Detektion und/oder Ermittlung der Konzentration eines Analyts in einer Testprobe verwendbar sind. Derartige Techniken umfassen Immunoassays gemäß der Beschreibung in US-Patent 5 789 154, 5 756 362 und 5 753 519, die hier jeweils als Bezug aufgenommen sind.
Immunoassays unter Verwendung elektrochemischer Detektion sind in US-Patent 4 822 566 von Newman und O. Niwa, Y. Xu, H. B. Halsall und W. R. Heineman, Anal. Chem. 1993, 65, 1559-1563 ("Niwa") beschrieben. Newman beschreibt eine mehrlagige Immunoassayvorrichtung, die auf der Bewegung biologischer Spezies in eine oder aus einer Schicht mit biologischer Bindung im Laufe biospezifischer Bindungsreaktionen beruht. Diese Bewegung ändert die Dielektrizitätskonstante des den Analyt enthaltenden Fluidmediums, was zu von einem Sensor detektierten Kapazitätsänderungen führt. Ein Kondensator, der aus einer Gruppierungsanordnung ineinandergreifender Kupfer- und Goldfinger (2 Mil breit, 0,5 Mil hoch, durch 3-Mil-Zwischenräme getrennt) besteht, der durch photolithographische Ätztechniken gebildet wurde, ist offenbart. Niwa beschreibt einen elektrochemischen Enzymimmunosassay, der eine Mikroelektrodenzelle mit ineinandergreifender Gruppierungsanordnung zur Detektion von 4-Aminophenol (PAP), das während eines Enzymimmunoassays von Maus-IgG produziert wurde, verwendet. Die ineinandergreifende Gruppierungsanordnung aus Gold bestand aus 50 Paaren von 3 oder 5 μm breiten Mikrobanden, die 2 μm voneinander beabstandet waren. Silberplattierte und unplattierte quadratische Goldelektroden wurden als Bezugs- bzw. Hilfselektroden verwendet. Der Assay wurde in Mikrovertiefungen durchgeführt.
Die Vorrichtungen und Techniken bei Newman und Niwa sind jedoch relativ komplex. Beispielsweise wird der bei Niwa beschriebene Enzymimmunoassay über mehrere Stufen bis zur vollständigen Durchführung auf einer Immunovertiefungenvorrichtung durchgeführt und die Reaktionslösung dann in eine getrennte elektrochemische Detektionsvorrichtung überführt.
Nucleinsäuredetektionsverfahren sind zur Detektion und Ermittlung des Vorhandenseins von Organismen, wie Pathogenen in Nahrungsmittel- und Wasserversorgungseinrichtungen, besonders verwendbar. Southern-, Northern-, Dot-Blotting, Reverse-Dot-Blotting und Elektrophorese sind die herkömmlichen Verfahren zur Isolierung und Sichtbarmachung spezieller Nucleinsäuresequenzen. Jedes weist Vorteile und Nachteile auf. Beispielsweise ist Gelelektrophorese, die häufig unter Verwendung von Ethidiumbromidanfärbung durchgeführt wird, ein relativ einfaches Verfahren zur Gewinnung von Fragmentlängeninformation für DNA-Doppelhelices. Diese Technik liefert jedoch keine Information über die Nucleotidsequenz der Fragmente und Ethidiumbromid wird als sehr toxisch betrachtet, obwohl in letzter Zeit sicherere Anfär bungen entwickelt wurden.
Wenn zusätzlich zur Längeninformation ein Wunsch zur Bestimmung des Vorhandenseins spezieller Nucleotidsequenzen besteht, kann entweder Southern-Blotting für DNA oder Northern-Blotting für RNA gewählt werden. Diese Verfahren trennen die Nucleinsäuren zunächst auf einem Gel auf und übertragen sie anschließend auf ein Membranfilter, wo sie entweder durch Brennen oder UV-Strahlung fixiert werden. Die Membran wird typischerweise mit einer Vorhybridisierungslösung zur Verringerung von spezifischer Bindung behandelt, bevor sie zur Lösung einer Reportersonde übertragen wird. Eine Hybridisierung findet dann zwischen der Sonde und allen Sequenzen, zu denen sie komplementär ist, statt. Die anfängliche Hybridisierung wird typischerweise unter Bedingungen einer relativ geringen Stringenz oder Selektivität durchgeführt, worauf Waschvorgänge zunehmender Stringenz zur Beseitigung von nichtspezifisch gebundener Sonde und Verbesserung des Signal/Rauschen-Verhältnisses folgen.
Ursprünglich wurden Sonden häufig mit ³²P markiert, das durch Einwirken der Membran auf einen photographischen Film detektiert wurde. Heute verwenden jedoch viele Forscher Nichtisotopen-Reportersonden. Diese Blottingverfahren erfordern mehr Zeit und Arbeit als einfache Gelelektrophorese, insbesondere wenn geringe Mengen Nucleinsäure vorhanden sind.
Dot- oder Slot-Blotting sind im wesentlichen äquivalente Verfahren, die nur Sequenzhomologieinformation liefern. Keine Trennung von Nucleinsäuresequenzen wird vor einer Hybridisierung durchgeführt, wodurch beträchtlich Zeit eingespart wird. Typischerweise wird die gesamte DNA oder RNA, die Zusammensetzung der zu beurteilenden Probe an eine Ny lon- oder Nitrocellulosemembran gebunden, wobei ein kleiner "Punkt" des Nucleinsäuregemischs gebildet wird. Die Membran wird dann in einer der für Southern- und Northern-Blotting beschriebenen ähnlchen Weise sondiert. Die Technik ist einfacher als Southern- und Northern-Blotting, kann jedoch zu nichtspezifischer Bindung der Sonde führen, wodurch die Empfindlichkeit verringert wird. Sonden können mit ³²P, Biotin, verschiedenen Haptenen oder Enzymen, wie Meerrettichperoxidase und alkalische Phosphatase, markiert werden, wobei ein farbiger Fleck auf der Membran in Gegenwart eines geeigneten Substrats produziert wird.
Bei der Reverse-Dot-Blot-Technik wird eine Oligonucleotideinfangsonde auf einer Membran immobilisiert, während die Zieleinheit in Lösung gehalten wird. Bei diesem Schema muss die Zieleinheit auch die Reportereinheit, üblicherweise durch indirekte Registrierung, tragen. Ein Vorteil dieser Strategie besteht darin, dass mehrere Einfangsonden auf der gleichen Membran immobilisiert werden können, so dass mehrere Zielsequenzen gleichzeitig bestimmt werden können.
Es gibt eine breite Vielzahl von DNA- und RNA-Detektionsschemata in der Literatur, von denen viele als kommerzielle Kits erhältlich sind. Nucleinsäuredetektionsschemata unterliegen den gleichen Trends im Hinblick auf die Assaygestaltung wie Immunoassays, wobei Anstrengungen auf einfacherere, schnellere und automatisierbare Detektionsschemata gerichtet sind.
Es ist günstig, Assays auf der Basis der Art und Weise, in der das Signal produziert und detektiert wird, zu kategorisieren. Vener et al. (1991) Anal. Biochem. 198, 308-11, klassifizierten die Verwendung von Hybridisierungssonden in zwei Kategorien: direkte Registrierung und indirekte Registrierung. Direkte Registrierung, die nicht mit direkter Hybridisierung zu verwechseln ist, wird als die Verwendung einer Reportersonde, die selbst zur Produktion eines detektierbaren Signals fähig ist, definiert. Dies kann durch Markierung mit einem Radioisotop, fluoreszierenden Tag, Enzym oder Solteilchen erfolgen. Der größte Teil der ersten Arbeiten, die mit Nucleinsäurehybridisierung durchgeführt wurden, verwendeten direkte Registrierung mit ³²P-markierten Sonden.
Ein Beispiel für diese Art eines Assays ist die von Pollard-Knight et al. (1990) Anal. Biochem. 185, 84-9, angegebene. Diese Forscher verwendeten direkt mit Meerrettichperoxidase markierte Sonden in einem Detektionsschema verstärkter Chemilumineszenz. Einzelkopiesequenzen von humaner genomischer DNA wurden durch Southern Blotting auf Nitrocellulosemembranen immobilisiert und sie bildeten das Ziel für enzymmarkierte Sonden einer Länge zwischen 50 und 3571 Basen. Ein Enzym existierte für alle 50-100 Basen der Sonde, so dass eine bessere Empfindlichkeit mit längeren Sondenlängen erhalten wurde. Die Verwendung eines speziellen blauempfindlichen Films zusammen mit kommerziellem Enzymsubstrat ermöglichte die Detektion von einem amol mehrerer verschiedener Zielsequenzen.
Bei indirekter Registrierung trägt die Sonde nicht selbst die signalproduzierende oder Reportereinheit, sondern sie trägt statt dessen einen Liganden, wie Biotin, Fluorescein, Digoxygenin oder in einigen Fällen eine nichtkomplementäre Nucleotidsequenz, die dann durch ein getrenntes Biomolekül oder einen Rezeptor spezifisch erkannt wird. Letzteres erzeugt dann entweder die signalproduzierenden Moleküle oder es trägt diese. Diese Art eines Assays wird sehr häufig als Nichtisotopersatz für ³²P-Markierung verwendet und ist als kommerzielle Kits, die von Amersham International (Arlington Heights, IL) und Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN) produziert werden, erhältlich.
Das durch Wasser übertragene Pathogen Cryptosporidium parvum erläutert die Notwendigkeit für effiziente und kostengünstige Nucleinsäuredetektionsverfahren. Cryptosporidium parvum wird in Wasserversorgungseinrichtungen und Nahrung gefunden. Dessen Lebenszyklus umfasst Oozysten, die durch Trinkwasserbehandlungsverfahren, wie chemische Desinfektion und Filtration, schwierig bekämpft werden können. Die Aufnahme von Oozysten kann schwere Krankheit hervorrufen. Die Tabelle 1 zeigt eine Zahl dokumentierter, durch Wasser übertragener Ausbrüche von Cryptosporidiosis in der jüngsten Geschichte. TABELLE 1
Diese Ausbrüche und die Schwierigkeit der Eliminierung von Cryptosporidium-Oozysten aus Wasserversorgungseinrichtungen durch herkömmliche Wasserbehandlungsverfahren zeigen die Notwendigkeit für effiziente und kostengünstige Organismendetektionsverfahren. Verfahren zur Detektion von Oozysten wurden vorgeschlagen, doch plagen sie sich mit schlechten Rückgewinnungseffizienzen herum und sie ergeben selten Informationen im Hinblick auf die Lebensfähigkeit der Oozys ten, die in den Proben gefunden werden. Sie teilen auch die Mängel bestimmter Verfahren zur Detektion von Organismen allgemein, wie Zellkultur-, Agaragarplattentest-, Gewebekultur- und herkömmliche Immunoassayverfahren, die arbeitsaufwändig, zeitaufwändig und kostenaufwändig sind.
Im Hinblick auf die Mängel und Komplexität früherer Verfahren zur Verwendung als rasche, zuverlässige und einfache Assays besteht weiterhin Bedarf an einer Technologie, die Analyte, wie Umwelt- und Nahrungsmittelkontamiationsstoffe einschließlich pathogener Organismen, genau detektiert und bestimmt.
Roberts et al. (1995), Anal. Chem. 67: 482-491 (D1) offenbart einen Immunkompetitionsassay auf Liposombasis zur Detektion polychlorierter Biphenyle.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Durch die vorliegende Erfindung erfolgt die Bereitstellung eines Verfahrens zur Detektion oder quantitativen Bestimmung eines Analyts in einer Testprobe unter Verwendung eines elektrochemischen Signalerzeugungs- und Verstärkungssystems. Die bei dem Verfahren der Erfindung verwendete Testvorrichtung umfasst ein erstes absorbierendes Material mit einem Kontaktbereich zur Aufnahme der Testprobe und anderer Assaykomponenten. Sie umfasst ferner einen Einfangbereich entweder auf dem ersten absorbierenden Material oder auf einem zweiten absorbierenden Material in Fluidfließkontakt mit dem ersten absorbierenden Material. Der Einfangbereich weist ein an den Einfangbereich gebundenes erstes Bindungsmaterial auf.
Die Testvorrichtung umfasst ferner eine Elektrodenanordnung mit einem ersten Leiter und einem zweiten Leiter. Jeder Leiter umfasst eine Mehrzahl von Fingern und die Finger des ersten Leiters greifen mit den Fingern des zweiten Leiters ineinander. Die Elektrodenanordnung ist so positioniert, dass der Ablauf eines Redoxzyklus eines in dem Einfangbereich freigesetzten elektroaktiven Markers induziert wird.
Die hier verwendete "Testvorrichtung der Erfindung" bedeutet, dass die Testvorrichtung in dem Verfahren der Erfindung verwendet wird. Bei dem Verfahren wird die Testprobe auf den Kontaktbereich appliziert. Entweder vor oder nach der Applikation der Testprobe wird sie mit einem Konjugat von einen elektroaktiven Marker einkapselnden Liposomen und einem zweiten Bindungsmaterial in Kontakt gebracht. Das zweite Bindungsmaterial ist so ausgewählt, dass es mit einem Bereich des Analyts eine Bindung eingeht. Das erste Bindungsmaterial ist so ausgewählt, dass es mit einem anderen Bereich des Analyts als dem Bereich, der für das zweite Bindungsmaterial ausgewählt ist, eine Bindung eingeht. Die Testprobe und das Konjugat werden während eines Zeitraums, der zum Ermöglichen einer Reaktion zwischen einem in der Probe vorhandenen Analyt und dem zweiten Bindungsmaterial ausreichend ist, inkubiert.
Die Testprobe wird von dem Kontaktbereich zu dem Einfangbereich und dann in diesen wandern gelassen. Eine Spannung, die zur Induktion des Ablaufens eines Redoxzyklus des in den Liposomen enthaltenen elektroaktiven Markers ausreichend ist, wird an die Leiter angelegt. Nach der Inkubation der Testprobe und des Konjugats werden in dem Einfangbereich gebundene Liposomen lysiert, wobei der Marker freigesetzt wird, der infolge der an die Leiter angelegten Spannung einen Redoxzyklus durchläuft, was das Fließen eines Stroms zwischen dem ersten und zweiten Leiter verursacht. Das Vorhandensein der Menge des erhaltenen Stroms wird detektiert und mit dem Vorhandensein bzw. der Menge des Ana lyts in der Testprobe korreliert. In dieser Ausführungsform ist die Größe des von in dem Einfangbereich gebundenen Liposomen freigesetzten Stroms direkt proportional der Menge eines Analyts in der Testprobe.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die Elektrodenanordnung so positioniert, dass das Ablaufen eines Redoxzyklus eines elektroaktiven Markers, der von Liposomen freigesetzt wurde, die aus dem Einfangbereich wandern, induziert wird. Daher wird das Vorhandensein oder die Menge des durch Liposomen, die nicht im Einfangbereich gebunden sind, erzeugten Stroms detektiert oder gemessen. In dieser Ausführungsform ist die Größe des erzeugten Stroms umgekehrt proportional zur Menge eines Analyts in der Probe.
Die Vorrichtung und das Verfahren der Erfindung können direkt an Ort und Stelle verwendet werden. Die Vorrichtung wird nur einmal verwendet und sie ist daher frei von anderen verbliebenen Umgebungskontaminationsstoffen als denjenigen, die in der zu messenden Probe vorhanden sein können. Proben können innerhalb von Minuten nach der Gewinnung getestet werden, wobei die Ergebnisse unmittelbar an Ort und Stelle verfügbar sind. Ferner sind die Vorrichtung und das Verfahren der Erfindung weniger komplex als viele der früheren Materialien und Verfahren. Die Fähigkeit, quantitative Ergebnisse ohne zusätzliche Stufen zur spektrophotometrischen oder fluorimetrischen Analyse zu liefern, ist ein Vorteil der vorliegenden elektrochemischen Vorrichtung und des vorliegenden Verfahrens gegenüber Vorrichtungen und Verfahren, die Farbstoffe und fluoreszierende Materialien als Marker verwenden.
Zusätzlich ergeben mit elektroaktivem Marker beladene Liposome, die bei der Vorrichtung und dem Verfahren der Erfin dung verwendet werden, ein hochempfindliches rasches oder sogar unmittelbares Signalerzeugungs/verstärkungssystem. Ferner ist die Markermenge, die in dem elektrochemischen Messbereich des absorbierenden Materials der Testvorrichtung ermittelt wird, direkt proportional zur Analytkonzentration in der Probe. Dieses Merkmal der Erfindung ergibt einen speziellen Vorteil gegenüber früheren Testvorrichtungen, Nucleinsäuredetektionsassays und Immunoassays, die eine intuitive Korrelation zwischen Signalintensität und Analytkonzentration ergeben. Eine elektrochemische Detektion bietet größere Empfindlichkeit als eine kolorimetrische Bestimmung und sie ist Fluorimetrie oder Chemilumineszenz vergleichbar. Ferner liefert die vorliegende Erfindung quantitative Ergebnisse, die direkt von dem Elektroanalysator oder anderen Detektionsinstrumenten, an die die Testvorrichtung angeschlossen ist, erhalten werden können, ohne dass die Übertragung der Vorrichtung zu einer getrennten optischen Messvorrichtung notwendig ist. Ferner ermöglicht eine elektrochemische Detektion Tests in Lösungen oder Gemischen, die stark gefärbt sind oder teilchenförmiges Material umfassen und die daher eine optische Detektion stören würden.
Ineinandergreifende Elektrodenanordnungen sind für eine Teststreifenanalyse aufgrund von deren planarer Konfiguration und inhärenten Empfindlichkeit für elektrochemische Messungen besonders geeignet. Mikroelektroden, die in einer ineinandergreifenden Anordnung gefertigt sind, weisen inhärente Vorteile im Hinblick auf die Signaldetektion gegenüber herkömmlicheren Elektrodenkonfigurationen auf. Diese Vorteile können nur mit Elektroden sehr kleiner Abmessungen aufgrund der theoretischen Beziehungen zwischen Elektrodengeometrie und Ionendiffusion realisiert werden. Eine Maßstabsverkleinerung der Größe einer individuellen Elektrode hat den Vorteil der Erhöhung der Massentransportrate, der Erhöhung des Signal/Rauschen (Faradayscher/Ladestrom)-Verhältnisses und der Verringerung ohmscher Signalverluste gemäß der Beschreibung bei M. Fleischmann, S. Pons, D. R. Rolison, P. P. Schmidt, Hrsg., Ultramicroelectrodes (Datatech Systems, Inc., Morganton, NC 1987). Vorteile von Mikroelektroden sind ebenfalls bei J. O. Howell, Voltammetric Microelectroces, Bioanalytical Systems, Inc., West Lafayette IN 47906, beschrieben.
Die Vorteile der Fertigung kleiner Elektroden bei ineinandergreifenden Anordnungen gehen noch weiter dadurch, dass sie das Hin- und Hergehen des Redoxzyklus von Ionen zwischen Anode(n) und Kathode(n) ermöglichen. Siehe O. Niwa, Y. Xu, B. H. Halsall, W. R. Heineman, Anal. Chem. 65, 1559-1563 (1993) und O. Niwa, H. Tabei, Anal. Chem. 66, 285-289 (1994). Dies erzeugt viel größere Ströme zur Detektion und ermöglicht die Verwendung extrem kleiner Probenvolumina. Durch Verwendung eines dualen Potentiostats und eines Vierelektrodensystems mit einer ineinandergreifenden Anordnung ist es möglich, Ladestrom fast vollständig zu eliminieren. Dies führt zu einem größeren Signal/Rauschen-Verhältnis und ermöglicht die Verwendung extrem hoher Scanraten. Siehe O. Niwa, M. Morita, H. Tabei, Anal. Chem. 62, 447-452 (1990) und C. Chidsay, B. J. Feldman, C. Lundgren, R. W. Murray, Anal. Chem. 58, 601-607 (1986). Ferner ist die hochentwickelte Elektronik, die zur Detektion der mit individuellen Mikroelektrodenfilamenten verbundenen sehr kleinen Ströme notwendig ist, aufgrund der Aufsummierung des Stroms von der großen Mikroelektrodenanordnung nicht notwendig.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist ein Schema einer Testvorrichtung gemäß der Erfindung.
2a ist eine zusammengebaute Darstellung einer in eine Kassette eingeschlossenen Testvorrichtung gemäß der Erfindung.
2b ist eine zerlegte Darstellung der in 2a gezeigten Testvorrichtung.
3a ist ein Schema einer ineinandergreifenden Elektrodenanordnung, die bei der Testvorrichtung und dem Verfahren der Erfindung verwendet wird.
3b ist eine vergrößerte Darstellung eines Bereichs der in 3a gezeigten Elektrodenanordnung.
4 ist eine zerlegte Darstellung einer alternativen, in eine Kassette eingeschlossenen Testvorrichtung gemäß der Erfindung.
5a und 5b sind schematische Darstellungen von ineinandergreifenden Elektrodenanordnungen, die bei der Testvorrichtung und dem Verfahren der Erfindung verwendet werden, mit 250-facher bzw. 1000-facher Vergrößerung.
6 ist eine schematische Darstellung eines derivatisierten markerbeladenen Liposoms, das über die Zielsequenz und Einfangsonde im Einfangbereich der Testvorrichtung der vorliegenden Erfindung eingefangen wurde.
7 ist ein Diagramm von erzeugtem Strom gegen Markerkonzentration für 5 verschiedene ineinandergreifende Elektrodenanordnungskonfigurationen.
8 ist ein Diagramm von erzeugtem Strom gegen Markerkonzentration für 3 getrennte ineinandergreifende Elektrodenanordnungen der gleichen Größe und Zusammensetzung.
9 ist ein Diagramm von durch Liposomen übertragene Reportersonde/Antisense-Reportersonde-Bindungsintensität gegen Reportersondenkonzentration.
10 ist ein Diagramm von erzeugtem Strom gegen Konzentration einer synthetischen Zielsequenz für zwei Vorrichtungskonzentrationen.
11 ist ein Diagramm von erzeugtem Strom gegen Konzentration einer synthetischen Zielsequenz unter Verwendung eines Zwei-Kissen-Teststreifens.
12 ist ein Diagramm von erzeugtem Strom gegen Volumen von dem Assay zugesetztem NASBA-Amplicon.
13 ist ein Diagramm von erzeugtem Strom gegen Konzentration des elektroaktiven Markers für Eisen(II)-cyanid gegenüber einem Gemisch von Eisen(II)-cyanid und Eisen(III)-cyanid.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Das Verfahren der Erfindung verwendet zwei Bindungsmaterialien für den Zielanalyt – eines, das mit markereinkapselnden Lipoosomen konjugiert ist, und ein anderes, das auf einem Bereich eines absorbierenden Materials immobilisiert ist. Die zwei Bindungsmaterialien binden an verschiedene Bereiche des Analyts. Ein Überschuss an sowohl dem Liposomkonjugat als auch dem immobilisierten Bindungsmaterial wird verwendet. Daher werden in dem Ausmaß, in dem der Analyt in der Testprobe vorhanden ist, die markerbeladenen Liposomen an das absorbierende Material über den Analyt gebunden. Daher beruhen die Testvorrichtung und das Verfahren der Erfindung auf dem "Sandwich", das durch das erste Bindungs material (das auf dem absorbierenden Material immobilisiert ist), den Analyt und das zweite Bindungsmaterial (das mit den markerbeladenen Liposomen konjugiert ist) gebildet wird.
Die Erfindung umfasst sowohl direkte als auch indirekte Detektions/Messverfahren. Bei dem ersteren wird das Vorhandensein oder die Menge des Markers, der im Immobilisierungs- oder "Einfang"bereich der Testvorrichtung gebunden ist, detektiert. In dieser Ausführungsform ist die Menge an in dem Einfangbereich gebundenem Marker direkt proportional zur Menge eines Analyts in der Testprobe. Die Ausführungsform mit indirekter Detektion umfasst die Detektion oder Messung des Markers, der von Liposomkonjugat, das über den Einfangbereich hinaus wandert, freigesetzt wird, der indirekt proportional zur Menge eines Analyts in der Testprobe ist.
"Analyt" bedeutet die zu messende oder zu detektierende Verbindung oder Zusammensetzung. Er ist zur Bindung an die ersten und zweiten Bindungsmaterialien fähig. Ein bevorzugter Analyt ist ein Nucleinsäuremolekül.
"Bindungsmaterial" bedeutet ein Biorezeptormolekül, wie ein Immunglobulin oder Derivat oder Fragment desselben, mit einem Bereich auf der Oberfläche oder in einer Höhlung, der spezifisch an eine spezielle räumliche und polare Organisation eines anderen Moleküls – in diesem Fall des Analyts – bindet und dadurch als komplementär zu dieser definiert wird. Alternativ sind, wenn der Zielanalyt ein Nucleinsäuremolekül ist, das erste und zweite Bindungsmaterial Nucleinsäuremoleküle, die so ausgewählt sind, dass sie mit getrennten Bereichen des Zielnucleinsäuremoleküls hybridisieren.
Antikörperbindungsmaterialien können monoklonal oder polyklonal sein und durch einschlägig bekannte Techniken, wie Immunisierung eines Wirts und Gewinnung von Seren oder Hybridzelllinientechnologie, hergestellt werden. Das Bindungsmaterial kann auch eine natürlich vorkommende oder synthetische Verbindung, die spezifisch an den interessierenden Analyt bindet, sein.
Wie im folgenden detaillierter diskutiert ist, verwendet das Verfahren der Erfindung ein Konjugat von markereinkapselnden Liposomen und einem zweiten Bindungsmaterial. Das zweite Bindungsmaterial kann mit der Liposomoberfläche konjugiert sein. Das zweite Bindungsmaterial muss an die Liposomen so gebunden sein, dass ein Bereich des zweiten Bindungsmaterials präsentiert wird, der durch den Analyt erkannt werden kann.
Geeignete Konjugationsverfahren sind in US-Patent 5 789 154, 5 756 362 und 5 753 519 diskutiert. Beispielsweise kann die Liposomoberfläche mit Thiolgruppen aktiviert und an eine Maleimidgruppe an dem zweiten Bindungsmaterial gekoppelt sein. Oder es können umgekehrt maleimidaktivierte Liposomen und durch Thiolgruppen aktiviertes Bindungsmaterial verwendet werden.
Das erste und das zweite Bindungsmaterial wird so gewählt, dass es spezifisch an getrennte Bereiche des Analyts bindet. Beispielsweise ist es, wenn der Analyt eine Nucleinsäuresequenz ist, notwendig, Sonden für getrennte Bereiche der Zielnucleinsäuresequenz zu wählen. Techniken zur Gestaltung derartiger Sonden sind bekannt. Für die praktische Durchführung der vorliegenden Erfindung geeignete Sonden müssen zur Zielanalytsequenz komplementär sein, d.h. zur Hybridisierung mit dem Ziel fähig sein, und für den Zielanalyt hochspezifisch sein. Die Sonden sind vorzugsweise zwischen 17 und 25 Nucleotiden lang, um die erforderliche Spezifität zu liefern, während unpassend lange Hybridisierungszeiten vermieden und das Potential zur Bildung von Sekundärstrukturen unter den Assaybedingungen minimiert werden. Zusätzlich sollten das erste und zweite Bindungsmaterial (Einfang- und Reportersonden) nicht zur Hybridisierung miteinander fähig sein. Techniken zur Identifizierung von Sonden, die zur praktischen Durchführung der Erfindung geeignet sind, sind bei J. Sambrook, E. F. Firtsch und T. Maniatis, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (Gold Spring Harbor Laboratory Press 1989), das hierdurch als Bezug aufgenommen ist, beschrieben. Ein Softwareprogramm, das als "Lasergene" bekannt ist, das von DNASTAR erhältlich ist, kann optional verwendet werden.
Allgemein wird zur Gestaltung eines Assays die Zielnucleinsäure aus einer Probe extrahiert und dann durch eine einer Vielzahl bekannter Amplifikationstechniken amplifiziert. Derartige Amplifikationstechniken umfassen Polymerasekettenreaktion, Ligasekettenreaktion und Nucleic Acid Sequence Based Amplification (NASBA). Siehe T. Kievits et al., "NASBA isothermal enzymatic in vitro nucleic acid amplification optimized for the diagnosis of HIV-1 infection", Journal of Virological Methods, 35 (1991) 273-286. NASBA, vertrieben von Organon-Teknika, ist eine bevorzugte Amplifikationstechnik für Informationen im Hinblick auf das Vorhandensein oder die Konzentration von lebensfähigen Organismen in einer Probe.
Wie weiter unten diskutiert wird, kann die Testprobe, von der bekannt ist oder angenommen wird, dass sie den Analyt enthält, mit dem Konjugat kombiniert werden, wobei ein Gemisch gebildet wird, das eine Lösung, Suspension, Dispersion oder ein anderes Gemisch sein kann. Alternativ können die Testprobe und das Konjugat getrennt auf das erste ab sorbierende Material, beispielsweise durch jeweiliges Auftüpfeln auf das absorbierende Material am gleichen Ort oder getrennten Orten, appliziert werden.
"Absorbierendes Material" bedeutet ein poröses Material mit einer Porengröße von 0,05 μm bis 50 μm, vorzugsweise 0,45 μm bis 5 μm, das zum Durchqueren für ein wässriges Medium aufgrund Kapillarkräften geeignet ist. Derartige Materialien können natürliche Polymermaterialien, insbesondere Cellulosematerialien, wie faserhaltige Papiere, beispielsweise Filterpapier, Chromatographiepapier und dgl.; synthetische oder modifizierte natürlich vorkommende Polymere, wie Nitrocellulose, Celluloseacetat, Poly(vinylchlorid), Polyacrylamid, vernetztes Dextran, Agarose, Polyacrylat, Nylon, aktiviertes Nylon, eine modifizierte Polysulfonbasis und dgl. sein, die entweder als solche oder in Verbindung mit einem Träger gemäß der im folgenden angegebenen Beschreibung verwendet werden. Nitrocellulose ist ein bevorzugtes absorbierendes Material für das (die) absorbierende(n) Kissen, die die Kontakt- und Einfangbereiche der Testvorrichtung umfassen.
Die absorbierenden Materialien können polyfunktional sein oder zur Polyfunktionalisierung fähig sein, um eine Immobilisierung des zweiten Bindungsmaterials zu ermöglichen.
Die bei der Testvorrichtung und dem Verfahren der Erfindung verwendeten absorbierenden Materialien sind allgemein ein Celluloseester, wobei Nitrocellulose, ausnehmend gute Ergebnisse ergibt. Der Ausdruck "Nitrocellulose" soll so verstanden werden, dass er Salpetersäureester von Cellulose bezeichnet, die Nitrocellulose allein oder ein gemischter Ester von Salpetersäure und anderen Säuren und insbesondere aliphatischen Carbonsäuren mit einem bis sieben Kohlenstoffatomen sein können, wobei Essigsäure bevorzugt ist.
Derartige Materialien, die aus Cellulose, die mit Salpetersäure allein oder einem Gemisch aus Salpetersäure und einer anderen Säure, wie Essigsäure, verestert ist, gebildet sind, werden häufig als Nitrocellulosepapier bezeichnet.
Obwohl Nitrocellulose ein bevorzugtes Material zur Herstellung der Testvorrichtung ist, soll dies so verstanden werden, dass andere Materialien mit einer Oberfläche, die zur Trägerung der darauf in einer wie im folgenden beschriebenen Konzentration zu immobilisierenden Mittel ausreichend ist, ebenfalls zur Herstellung derartiger Testvorrichtungen verwendet werden können.
Wie hier beschrieben umfasst die Testvorrichtung ein oder mehrere absorbierende Materialien. Ungeachtet der Zahl der verwendeten absorbierenden Kissen oder Materialien ist es wichtig, dass mindestens ein Bereich des Teststreifens, der die Konjugatapplikation und Einfangbereiche umfasst und zwischen diesen liegt, aus einem Liposomen nicht lysierenden Material besteht. Das Material, auf dem das erste Bindungsmaterial immobilisiert wird, muss die Immobilisierung unterstützen können und das Material bzw. die Materialien müssen die Flüssigkeitswanderung (Lateralfluss) ermöglichen.
Absorbierende Materialien mit hohen Oberflächen (wie Nitrocellulose) sind für einige Anwendungen insofern besonders bevorzugt, als das erste Bindungsmaterial und, falls gewünscht, das Liposomkonjugat auf derartigen Materialien in hohen Konzentrationen getragen werden können. Es ist jedoch klar, dass die Konzentrationen von Bindungsmaterial und Liposomkonjugat, die tatsächlich verwendet werden, teilweise von der Bindungsaffinität des ersten und zweiten Bindungsmaterials abhängen. Entsprechend ist der Umfang der Erfindung nicht auf eine spezielle Konzentration eines Bin dungsmaterials auf dem absorbierenden Material beschränkt.
Die Applikation des Bindungsmaterials und, falls gewünscht, des Liposomkonjugats auf das absorbierende Material kann durch bekannte Techniken, beispielsweise durch Aufsprühen oder Auftüpfeln von Lösungen dieser Komponenten auf das absorbierende Material, durchgeführt werden.
Das erste Bindungsmaterial und/oder Liposomkonjugat können an das absorbierende Material durch kovalente Bindung gebunden werden. Beispielsweise kann das zu bindende Material direkt auf das absorbierende Material appliziert und dann durch Ultraviolettstrahlung gebunden werden. Alternativ können Materialien an dem absorbierenden Material absorbiert werden, sofern die Bindung des ersten Bindungsmaterials an das absorbierende Material nicht-diffusiv ist. Dies umfasst das Inkontaktbringen des absorbierenden Materials mit einer Lösung, die das zu bindende Material enthält, mit dem Material und das Trocknenlassen des Materials. Allgemein ist dieses Verfahren nur verwendbar, wenn das absorbierende Material relativ hydrophob ist oder eine hohe Oberflächenladung aufweist, und eine anschließende Behandlung mit Proteinen, Detergentien, Polysacchariden oder anderen Materialien, die zur Blockierung nichtspezifischer Bindungsstellen fähig sind, ist erforderlich.
Das erste Bindungsmaterial wird vorzugsweise indirekt an das absorbierende Material in dem Einfangbereich der Vorrichtung gebunden. Beispielsweise wird das erste Bindungsmaterial vorzugsweise mit einem Tag, beispielsweise Biotin, markiert und ein Ligand, der das Tag spezifisch bindet, beispielsweise Streptavidin oder Anti-Biotin-Antikörper, auf das absorbierende Material in dem Einfangbereich appliziert. Andere Mittel, die zur Immobilisierung des ersten Bindungsmaterials in dem Einfangbereich geeignet sind, um fassen Avidin, Anti-Fluorescein, Anti-Digoxin, Anti-Dinitrophenyl (DNP).
Vor oder nach der Applikation des Bindungsmaterials und optional des Liposomkonjugats auf den entsprechenden Bereich bzw. die entsprechenden Bereiche auf bzw. an dem absorbierenden Material bzw. den absorbierenden Materialien kann die verbliebene nichtspezifische Bindungskapazität des absorbierenden Materials bzw. der absorbierenden Materialien mit einer oder mehreren Arten von Proteinen oder anderen Verbindungen, wie Polyvinylpyrrolidon, Polyvinylalkohol, andere geeignete Polymerblockierungsmittel und dgl., die nicht spezifisch an die in dem Assay zu verwendenden Materialien binden, gesättigt oder blockiert werden und vorzugsweise wird dies durchgeführt. Eine Blockierung wird allgemein durchgeführt, nachdem das Bindungsmaterial und Liposomkonjugat auf den Streifen appliziert wurden, doch kann es in Abhängigkeit von dem Applikationsverfahren, dem speziellen Blockierungsmittel und dem verwendeten absorbierenden Material möglich sein, den Streifen zu blockieren, bevor diese Komponenten appliziert werden. Daher kann beispielsweise die verbliebene Bindungskapazität des Substrats durch die Verwendung von Rinderserumalbumin zur Verhinderung einer nichtspezifischen Bindung blockiert werden, was bei Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 76 (1979) 4350, beschrieben ist. Die Techniken zur Verhinderung einer nichtspezifischen Bindung sind allgemein einschlägig bekannt und derartige Techniken sind auch allgemein zur Verhinderung einer nichtspezifischen Bindung in dem Assay der vorliegenden Erfindung verwendbar. Beispiele für besonders geeignete Techniken zur Blockierung mit Polyvinylpyrrolidon und Polyvinylalkohol sind beispielsweise bei Bartles et al., Anal. Biochem., 140 (1984) 784, und in der britischen Patentbeschreibung GB 2204398 A beschrieben. Alternativ können ein oder mehrere Blockierungsmittel in die Pufferlö sung eingearbeitet werden, die zum Waschen oder Tragen von Testkomponenten längs des absorbierenden Materials bzw. der absorbierenden Materialien verwendet wird.
In Verbindung mit einem Blockierungsmittel oder Blockierungsmitteln kann ein grenzflächenaktives Mittel auf das absorbierende Material in einer Konzentration, die zur Förderung eines homogenen Flusses der Testlösung über die Testvorrichtung ausreichend ist, zur Erleichterung der Wanderung des Liposomkonjugats ohne Lyse der Liposome appliziert werden. Geeignete grenzflächenaktive Mittel umfassen Brij^TM (Polyoxyethylenether), Tween 20^TM (Polyoxyethylensorbitanmonolaurat), Triton X-100^TM (tert-Octylphenoxypolyethoxyethanol), Natriumdodecylsulfat, n-Octyl-D-glucopyranosid, Span 20^TM, Nonindet P-40, Chapso^TM, Turgitol^TM und Natriumdioxycholat. Die Konzentration des grenzflächenaktiven Mittels bzw. der grenzflächenaktiven Mittel, die in einer Blockierungslösung verwendet wird, hängt teilweise von der Liposomzusammensetzung ab. Allgemein können grenzflächenaktive Mittel in einer Konzentration von etwa 0 bis etwa 0,01 Volumenprozent der Blockierungslösung, vorzugsweise von etwa 0,001 bis etwa 0,005 Volumenprozent der Blockierungslösung eingearbeitet werden. Es ist wichtig, dass die Konzentration eines auf das absorbierende Material applizierten grenzflächenaktiven Mittels kontrolliert wird, da eine vorzeitige Lyse der Liposome erfolgen kann, wenn die Konzentration des grenzflächenaktiven Mittels zu hoch ist. Tween 20^TM ist ein bevorzugtes grenzflächenaktives Mittel zur Verwendung in einer Blockierungslösung.
Die Blockierungsmittel blockieren nichtspezifische Bindungsstellen an dem absorbierenden Material. Die Blockierungsmittel sind aus der Gruppe von proteinartigen Blockierungsreagentien, die zur Hemmung der Bindung von Molekülen mit einem Molekulargewicht von größer als etwa 1000 mit dem absorbierenden Material fähig sind, und von Polymerblockierungsreagentien, die zur Hemmung der Bindung von Molekülen mit einem Molekulargewicht von weniger als etwa 1000 mit dem absorbierenden Material fähig sind, ausgewählt. Die proteinartigen Blockierungsreagentien können aus der Gruppe von Gelatine, fettfreier Trockenmilch, Rinderserumalbumin, Schlüssellochnapfschneckenhämocyanin und Casein ausgewählt werden. Das Polymerblockierungsreagens kann aus der Gruppe von Polyvinylpyrrolidon und Polyvinylalkohol ausgewählt werden und das grenzflächenaktive Mittel kann aus der Gruppe von Polyoxyethylenethern, Polyoxyethylensorbitanmonolaurat, tert-Octylphenoxypolyethoxyethanol und Natriumdodecylsulfat, Octylglucopyranosid und Natriumdioxycholat ausgewählt werden.
Die Testvorrichtung umfasst vorzugsweise zwei oder drei absorbierende Kissen, die Ende an Ende gelegt sind, wie im folgenden vollständiger diskutiert wird. In der Ausführungsform mit zwei Kissen umfasst das erste Kissen sowohl den Kontaktbereich als auch den Einfangbereich, der vorzugsweise in oder jenseits etwa der Hälfte der Länge des Streifens beginnt, um ausreichend Raum auf dem Kissen vor der Einfangzone zur Reaktion oder Hybridisierung der Zielsubstanz mit dem auf den Liposomen getragenen zweiten Bindungsmaterial zu lassen. Ein zweites Kissen kann als Dochtkissen verwendet werden, was im folgenden vollständiger diskutiert wird, um überschüssige Reagentien aus dem ersten Absorptionskissen zu ziehen. Wenn drei Kissen verwendet werden, ist der Einfangbereich vorzugsweise auf dem zentralen Kissen, noch besser in der oder nahe der Mitte des Kissens lokalisiert. In dieser Ausführungsform ist das Dochtkissen das dritte Kissen, doch können ein weiteres Kissen oder weitere Kissen als Dochtkissen jenseits eines dritten Kissens verwendet werden.
Die Testvorrichtung und das Verfahren der Erfindung können alternativ nur ein Kissen, beispielsweise wenn das Probenvolumen klein ist, umfassen. In diesem Fall ist es nötig, dass das absorbierende Material ausreichend Fläche jenseits des Einfangbereichs aufweist, um ein ausreichendes Volumen von Testreagentien zu absorbieren, um eine vollständige Durchführung der Reaktionen oder Hybridisierungen, auf denen der Assay beruht, zu ermöglichen, was im folgenden vollständiger diskutiert wird, und im Falle der hier offenbarten Ausführungsform mit indirekter Messung Raum für eine ausreichende Trennung zwischen dem Einfangbereich und dem Bereich, in dem der freigesetzte elektroaktive Marker gemessen oder detektiert wird, aufweist.
Das absorbierende Material kann eine Einzelstruktur, beispielsweise eine in Streifen geschnittene Lage sein. Die absorbierenden Materialien können auf einem Trägermaterial montiert sein, was im folgenden vollständiger beschrieben ist. Andererseits können die absorbierenden Materialien ihren eigenen Träger liefern. In einer Ausführungsform umfasst die Testvorrichtung einen Streifen eines teilchenförmigen Materials, das an einen Träger oder eine feste Oberfläche gebunden ist, was beispielsweise bei Dünnschichtchromatographie gefunden wird. Das absorbierende Material kann eine Lage mit darauf befindlichen Bahnen sein oder eine gleichförmige Lage mit der Fähigkeit zur Aufteilung in getrennte Bahnen durch physikalische Entfernung des absorbierenden Materials von dem Träger zur Induktion einer Bahnbildung sein, wobei ein getrennter Assay in jeder Bahn durchgeführt werden kann. Die absorbierenden Materialien können eine Vielzahl von Formen aufweisen, die rechteckige, kreisrunde, ovale, trigonale Formen oder dgl. umfassen, wobei mindestens eine Durchquerungsrichtung eines Testgemischs durch Kapillarwanderung besteht. Andere Durchquerungsrichtungen können beispielsweise in einem ovalen oder kreisförmigen Teil auftreten, das in der Mitte mit dem Testgemisch in Kontakt gebracht wird. Jedoch besteht die Hauptüberlegung darin, dass eine Fließrichtung vom Kontaktbereich über den Einfangbereich besteht. In dieser Diskussion werden Streifen eines absorbierenden Materials als Erläuterung und nicht Beschränkung beschrieben.
Das Konjugat kann in die Vorrichtung und das Verfahren auf eine Vielzahl von Wegen eingeführt werden. Es wird vorzugsweise mit der Testprobe kombiniert und es kann über einen Zeitraum inkubiert werden, der es ermöglicht, dass eine Reaktion oder Hybridisierung zwischen einem in der Probe vorhandenen Analyt und dem zweiten Bindungsmaterial an dem Konjugat erfolgt. Wenn der Analyt ein Nucleinsäuremolekül ist, wird das Gemisch vorzugsweise bei erhöhter Temperatur, d.h. von etwa 30°C bis 50°C, vorzugsweise von etwa 40°C bis 44°C, während etwa 3 bis 30 min inkubiert.
Alternativ kann das Liposom/zweites Bindungsmaterial-Konjugat an dem absorbierenden Material in dem Kontaktbereich am gleichen Ort wie die Testprobe oder an einem getrennten Ort eingeführt werden. Eine dritte Alternative umfasst die Einführung des Liposomkonjugats unmittelbar vor oder direkt am Einfangbereich der Testvorrichtung.
Die Wanderung der Testprobe und des Liposomkonjugats, wenn diese außerhalb des Einfangbereichs eingeführt wurden, wird vorzugsweise durch die Einführung eines Dochtwirkungsreagens, vorzugsweise einer Pufferlösung, auf den Streifen zum Tragen der Testkomponenten längs des Streifens unterstützt. Alternativ ist es, wenn das Probenvolumen ausreichend groß ist, nicht notwendig, eine getrennte Pufferlösung zu verwenden. Wenn das Liposomkonjugat direkt auf den Einfangbereich appliziert wird, wird die Pufferlösung vorzugsweise auf den Streifen nach einer Inkubationsperiode, um eine Reaktion oder Hybridisierung eines in der Testprobe vorhandenen Analyts mit dem Konjugat zu ermöglichen, eingeführt.
Bei der Konstruktion der Testvorrichtungen gemäß der Erfindung ist es günstig, den Einfangbereich relativ nahe am Kontaktbereich zu positionieren, um die Zeit, die notwendig ist, damit das Testgemisch den Einfangbereich erreicht und diesen durchquert, zu minimieren. Wenn jedoch die Testprobe mit dem Liposomkonjugat vor Einführung auf der Testvorrichtung nicht inkubiert wurde, ist es wichtig, dass der Einfangbereich und der Kontaktbereich ausreichend getrennt sind, um ausreichend Gelegenheit zu bieten, dass ein in der Testprobe vorhandener Analyt und das mit den Liposomen konjugierte zweite Bindungsmaterial aneinander binden, so dass das Konjugat, das mit der Analytmenge in der Testprobe korreliert, letztendlich im Einfangbereich über den Analyt und das erste Bindungsmaterial gebunden wird.
1 zeigt eine 3-Kissen-Testvorrichtung gemäß der Ausführungsform der Erfindung mit direkter Messung. Sie umfasst erste, zweite und dritte absorbierende Materialien 104, 106 bzw. 108, die auf dem Träger 102 ruhen. Jedes dieser absorbierenden Materialien, die hier auch funktional als Probenkissen, Reaktionskissen bzw. Dochtwirkungskissen identifiziert werden, steht in Fluidfließkontakt mit dem angrenzenden absorbierenden Kissen. Das Probenkissen 104 umfasst den Kontaktbereich, wo die Lösung oder das Gemisch, die die Testprobe und das Liposomkonjugat enthalten, appliziert werden. Das Reaktionskissen umfasst den Einfangbereich 110, an den das erste bindende Material nicht-diffusiv gebunden ist.
Wenn die Testprobe und das Konjugatgemisch durch die Vorrichtung vom Probenkissen 104 in das Reaktionskissen 106 wandern, bindet ein in der Testprobe vorhandener Analyt mit dem mit den Liposomen konjugierten zweiten Bindungsmaterial. Da das zweite Bindungsmaterial so gewählt ist, dass es nur einen Bereich des Analyts bindet, bleibt der Analyt auch zur Bindung mit dem ersten Bindungsmaterial verfügbar, wenn die Testkomponenten in den Einfangbereich 110 wandern. Auf diese Weise wird eine Menge markerbeladener Liposomen, die der Konzentration des Analyts in der Testprobe proportional ist, im Einfangbereich der Testvorrichtung gebunden.
In 1 ist die ineinandergreifende Elektrodenanordnung 112, die in den 3a und 3b detaillierter gezeigt ist, von deren Position unter dem Einfangbereich 110 entfernt gezeigt. Wenn die Elektrodenanordnung 112 an ihrem Ort unter dem Einfangbereich 110 ist, ist sie so positioniert, dass der Ablauf eines Redoxzyklus des elektroaktiven Markers, der aus den über den Analyt im Einfangbereich 110 gebundenen Liposomen bei Lyse der Liposomen und Laufen der den freigesetzten Marker enthaltenden Testlösung durch das absorbierende Material 106 freigesetzt wurde, induziert wird.
Die Bindung zwischen dem Liposomkonjugat, dem Analyt und dem ersten Bindungsmaterial ist in 6 dargestellt, die insbesondere die bevorzugte Ausführungsform, wobei der Analyt eine Zielnucleinsäuresequenz ist, darstellen soll. In dieser Ausführungsform ist das erste Bindungsmaterial eine Einfangsonde 514, die derart gewählt ist, dass sie mit einem Bereich der Zielnucleinsäuresequenz 516 hybridisiert und dies tut. Die Einfangsonde 514 ist im Einfangbereich des absorbierenden Materials 510 immobilisiert. Ein zweites Bindungsmaterial 520, das hier als Reportersonde für die Ausführungsform der Nucleinsäuredetektion/messung bezeichnet wird, ist derart gewählt, dass es mit einem anderen Bereich der Zielnucleinsäuresequenz 516 als dem Bereich der Zielsubstanz, mit dem die Einfangsonde 514 hybridisiert, hybridisiert und dies tut. Das zweite Bindungsmaterial 520 ist mit dem markereinkapselnden Liposom 518 konjugiert und es bindet das markereinkapselnde Liposom über die Zielnucleinsäuresequenz 516 und die Einfangsonde 514 an das absorbierende Material 510 im Einfangbereich. Die ineinandergreifende Elektrodenanordnung 512 ist so positioniert, dass das Ablaufen eines Redoxzyklus des aus dem Lipsom 518 bei Lyse freigesetzten Markers induziert wird.
Ein getrenntes absorbierendes Kissen kann als Dochtwirkungskissen verwendet werden, ungeachtet dessen, wie viele andere absorbierende Kissen verwendet werden. Das Dochtwirkungskissen dient sowohl zum Ziehen der flüssigen Probe und des Liposomkonjugats längs des durch die absorbierenden Kissen gebildeten Teststreifens als auch zum Ziehen von ungebundenem Konjugat aus dem Einfangbereich zur Verstärkung der Assaygenauigkeit. Das Dochtwirkungsmaterial und die Kissenlänge sind vorzugsweise mit den anderen Komponenten der Vorrichtung und den speziellen verwendeten Testkomponenten abgestimmt, um einen ausreichenden Fluidfließkontakt längs des Teststreifens bereitzustellen. Ein bevorzugtes Dochtwirkungsmaterial ist Whatman-Filterpapier.
Wenn mehr als ein absorbierendes Kissen verwendet wird, werden die Kissen Ende an Ende gelegt und sie überlappen vorzugsweise leicht, um einen guten Fluidfließkontakt sicherzustellen. Die Kissen sind vorzugsweise zusammenlaminiert, wo sie miteinander in Kontakt stehen, beispielsweise mit Kunststoff und Klebstoff. Alternativ wird der Kontakt zwischen den überlappenden Bereichen aufgrund von Druck, der auf die Teststreifen durch eine Kassette, in der der Teststreifen gehalten wird, ausgeübt wird, gehalten, wie hier beschrieben ist.
3a zeigt eine ineinandergreifende Elektrodenanord nung, die in der Testvorrichtung und dem Verfahren der Erfindung verwendet wird. Sie umfasst die Anodenkontaktfläche 302 und die Kathodenkontaktfläche 304 und die Elektrodenfinger 306. 3b ist eine vergrößerte Darstellung eines Bereichs der in 3a gezeigten Elektrodenanordnung. Sie zeigt die Anodenelektrodenfinger 306a, die mit den Kathodenelektrodenfingern 306b ineinandergreifen. 5a und 5b sind schematische Darstellungen von in der Testvorrichtung und dem Verfahren der Erfindung verwendeten ineinandergreifenden Elektrodenanordnungen bei 250-facher bzw. 1000-facher Vergrößerung.
2a und 2b zeigen zusammengebaute und zerlegte Darstellungen einer in eine Kassette eingeschlossenen Testvorrichtung gemäß der Erfindung. Die Kassette hat die Funktion, den Teststreifen in passender Position zu halten und die ineinandergreifende Elektrodenanordnung sowie etwaige Schutzbarrieren oder -schirme, die die Elektrodenfinger vor einer Schädigung schützen, die ansonsten aufgrund eines direkten Kontakts mit dem absorbierenden Material der Testvorrichtung erhalten würde, zu positionieren und zu unterstützen. Die Vorrichtung umfasst das obere Gehäuse 202 und das untere Gehäuse 222, die günstigerweise aus Kunststoff, beispielsweise durch Spritzgusstechniken, gefertigt werden können. Testprobe und Liposomkonjugat können in das absorbierende Material 232 über die Pufferlösungsöffnung 204 bzw. die Testgemischöffnung 206 eingeführt werden. Das Fortschreiten der Wanderung der Testkomponenten kann über die Öffnung 216 festgestellt werden.
Die Testgenauigkeit kann durch Isolieren des Einfangbereichs vom Rest des Teststreifens, sobald das Reaktionsgemisch in den Einfangbereich gewandert ist und das ungebundene Konjugat aus dem Einfangbereich in beispielsweise ein getrenntes Dochtwirkungskissen weggeflossen ist, verstärkt werden. Für diesen Zweck umfasst die in 2a und 2b gezeigte Vorrichtung ferner die Schneidevorrichtung 212 und den Schneidevorrichtungsempfänger 218. Bei Beendigung der Reaktion zwischen dem Analyt/Liposom-Konjugat und dem zweiten Bindungsmaterial im Einfangbereich des absorbierenden Materials kann die Schneidevorrichtung 212 zum Schneiden rings um den Umfang des Einfangbereichs durch das absorbierende Material zur physikalischen Isolierung des Einfangbereichs von dem angrenzenden Bereich des absorbierenden Materials verwendet werden, um sicherzustellen, dass nur Marker, der von den über den Analyt im Einfangbereich gebundenen Liposomen freigesetzt wurde, über die ineinandergreifende Elektrodenanordnung 224 gemessen wird. Wenn die Schneidevorrichtung 212 in den Schneidevorrichtungsempfänger 218 gestoßen wird, fällt der Einfangbereich des absorbierenden Materials auf die Dichtung 220, die einen Verschluss bildet, der ein Austreten der mit dem Einfangbereich übertragenen Flüssigkeit verhindert.
Es ist wichtig zu erkennen, dass die Schneidevorrichtung zwar in 2 als kreisförmige Klinge gezeigt ist, die Form der Schneidevorrichtung jedoch nicht entscheidend ist. Beispielsweise kann sie alternativ quadratisch sein oder zwei parallele Klingen umfassen.
Eine Spannung wird über die Leitungen 226 und 228 an die Elektrodenanordnung 224 angelegt, die das Ablaufen von Redoxzyklen des elektroaktiven Markers, der infolge der Lyse der an den Einfangbereich gebundenen Liposomen freigesetzt wurde, induziert. Eine Liposomlyse kann durch Einführen eines Liposomenlysiermittels über die Öffnung in die Schneidevorrichtung 212, vorzugsweise nachdem der Einfangbereich von dem angrenzenden absorbierenden Material isoliert wurde, erreicht werden. Als Alternative zur Applikation der Liposomlösung oder -suspension an einem Zeitpunkt, an dem der Test durchgeführt wird, kann das Liposomkonjugat direkt in den Teststreifen, beispielsweise in dehydratisiertem Zustand oder getrocknet auf der Oberfläche der ineinandergreifenden Elektrodenanordnung eingearbeitet werden. In diesen Ausführungsformen liefert das Testgemisch oder der Testpuffer die Flüssigkeit zur Solubilisierung des Lysiermittels, was dessen Kontakt mit den Liposomen ermöglicht. Die Verwendung eines Liposomlysiermittels in trockener Form vermeidet die Zugabe eines zusätzlichen Testreagens während des Tests.
4 zeigt eine alternative, in eine Kassette eingeschlossene Testvorrichtung gemäß der Erfindung, die die Puffer- und Testgemischöffnungen 404 bzw. 406, die Schneidevorrichtung 412, den Schneidevorrichtungsempfänger 414 und Belüftungslöcher 432 im oberen Gehäuse 402 umfasst. Das untere Gehäuse 422 umfasst ein optionales Sieb 436, das die ineinandergreifende Anordnung 424 vor einem direkten Kontakt mit dem Einfangbereich des absorbierenden Materials 434 physikalisch schützt, wenn der Einfangbereich freigeschnitten wird. Die Elektrodenanordnung 424, die über die Leitungen 426 und 428 mit einer Spannungsquelle, wie einer Batterie und einem Widerstand, verbunden ist, wird durch die Basis 438 in Position gehalten. Die Dichtung 420 verhindert ein Austreten von Flüssigkeit um die Elektrodenanordnung 424.
Obwohl die ineinandergreifende Elektrodenanordnung in den 1, 2 und 4 unter dem Einfangbereich der Testvorrichtung als Beispiel positioniert ist, ist anzumerken, dass es nur notwendig ist, dass die Elektrodenanordnung so positioniert ist, dass sie den Ablauf eines Redoxzyklus des elektroaktiven Markers, der in dem oder durch den Einfangbereich fließend freigesetzt wurde, induziert. Daher kann die Elektrodenanordnung beispielsweise alternativ auf der oberen Oberfläche des absorbierenden Materials im Einfangbereich befindlich sein.
Die in 1, 2 und 4 gezeigte Testvorrichtung kann so modifiziert werden, dass sie einen weiteren Kanal oder Kanäle zur Bereitstellung einer linearen Interpolation und Verifizierung einer Reaktion umfasst. Beispielsweise kann eine Dreikanalvorrichtung zur gleichzeitigen Messung des Analyts in einer Testprobe und von Kontrollkompositionen hoher Konzentration und niedriger Konzentration konstruiert werden. Es sollte auch anerkannt werden, dass Einkanalvorrichtungen innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung sind.
Obwohl die Erfindung so beschrieben wurde, dass sie eine Zweielektrodenanordnung verwendet, können kompliziertere Formate ebenfalls verwendet werden. Beispielsweise wird in einem Dreielektrodenformat das Potential von entweder dem ersten oder dem zweiten Leiter gegenüber der Bezugselektrode gesteuert und das Potential des anderen von dem ersten oder zweiten Leiter "floatet", um den gleichen Strom über beide Elektroden beizubehalten. Die Größe des zwischen dem ersten und zweiten Leiter fließenden Stroms wird ermittelt und mit der Analytmenge korreliert, da der gemessene Strom zur Markerionenkonzentration proportional ist.
Wie oben beschrieben wurde, können Vorrichtungen gemäß der Erfindung in Abhängigkeit von der gewünschten Anwendung in Ein- oder Mehrkanalformaten konstruiert werden.
Der Träger für das absorbierende Material, wenn ein Träger gewünscht oder notwendig ist, ist normalerweise hydrophob, wasserunlöslich, nichtporös und starr und üblicherweise von der gleichen Länge und Breite wie der absorbierende Streifen, doch er kann größer oder kleiner sein. Eine breite Vielzahl organischer und anorganischer Materialien, sowohl natürliche als auch synthetische, und Kombinationen derselben können verwendet werden, nur mit der Maßgabe, dass der Träger die Erzeugung eines Signals durch den Marker nicht stört. Beispiele für Polymere umfassen Polyethylen, Polypropylen, Poly(4-methylbuten), Polystyrol, Polymethacrylat, Poly(ethylenterephthalat), Nylon, Poly(vinylchlorid), Poly(vinylbutyrat), Glas, Keramiken, Metalle und dgl.
Die Größe der Stücke von absorbierendem Material ist von mehreren Überlegungen abhängig. Die im folgenden angegebene Diskussion konzentriert sich primär auf Streifen von absorbierendem Material zum Zwecke der Erläuterung und nicht der Beschränkung. Wie oben angegeben fallen andere Formen, beispielsweise kreisförmig, oval, trigonal und dgl., in gleicher Weise unter den Umfang dieser Erfindung. Die Abmessungen derselben und andere Parameter können durch den Fachmann unter Bezug auf die hier angegebene Offenbarung bestimmt werden.
Wenn die Kapillarströmung überwiegend aufwärts erfolgt, steuern die Länge und Dicke des Streifens die Menge eines Gemischs, das durch den Einfangbereich laufen kann. Wenn der Transport eines großen Volumens eines Testgemischs gewünscht wird, muss die Fluidkapazität des Streifens jenseits des Einfangbereichs ausreichend sein, um das gewünschte Volumen aufzunehmen. Alternativ kann zusätzliches absorbierendes Material, ein absorbierendes Kissen oder Schwamm, die hier als Dochtwirkungskissen bezeichnet werden, zum Kontaktieren des Endes des absorbierenden Materials jenseits des Einfangbereichs verwendet werden. Ein Dochtwirkungskissen kann auf diese Weise in Situationen verwendet werden, wenn es günstig ist, ein größeres Volumen des Testgemischs über die Testvorrichtung zu ziehen.
Um die Konservierung von Reagentien und die Bereitstellung für Proben beschränkter Größe zu ermöglichen, ist die Breite des Streifens allgemein relativ eng, üblicherweise geringer als 20 mm, vorzugsweise geringer als 10 mm. Allgemein beträgt die Breite des Streifens nicht weniger als etwa 2 mm und sie liegt üblicherweise im Bereich von etwa 2 mm bis 10 mm, vorzugsweise von etwa 3 mm bis 6 mm.
Wie im folgenden detailliert beschrieben ist, kann die Testvorrichtung gemäß der Erfindung zur gleichzeitigen Mehrfachanalytdetektion oder -bestimmung modifiziert werden. Die Länge des Streifens hängt von der Konzentration des Analyts und praktischen Überlegungen, wie problemlose Handhabung und Zahl der Messbereiche auf dem Streifen, ab und sie beträgt etwa 4 cm bis 20 cm, üblicherweise etwa 5 cm bis 15 cm, vorzugsweise etwa 6 bis 13 cm, kann jedoch von jeder praktischen Länge sein. Die Struktur des Streifens kann in breitem Umfang variiert werden und umfasst fein, mittelfein, mittel, mittelgrob und grob. Die Auswahl der Porosität des Materials kann auf der Bindungsrate der Komponenten für einen gegebenen Test beruhen.
Die Position der Kontakt- und Einfangbereiche sollte durch das in der vorliegenden Erfindung bestehende Grundprinzip bestimmt werden. Beispielsweise wird, ungeachtet dessen, ob die Testprobe und Konjugat am gleichen oder getrennten Orten im Kontaktbereich der Testvorrichtung appliziert werden, gewünscht, dass ausreichend Gelegenheit zum Auftreten einer Bindung zwischen dem mit den Liposomen konjugierten zweiten Bindungsmaterial und einem in der Testprobe vorhandenen Analyt bereitgestellt wird, so dass die Konzentration des in dem Einfangbereich gebundenen Konjugats genau die Konzentration des Analyts in der Testprobe widerspiegelt. Allgemein gesprochen sollte, wenn Nitrocellulose mit einer Porengröße von 8 μm für das erste oder das erste und das zweite absorbierende Material verwendet wird, der Abstand zwischen dem Kontaktbereich und dem Einfangbereich im Bereich von etwa 5 mm bis etwa 20 μm liegen. Wenn mehrere Einfangbereiche für Mehrfachanalytbestimmungen verwendet werden, können die Einfangbereiche nahe beieinander oder voneinander beabstandet gruppiert werden, sie dürfen jedoch nicht so nahe sein, dass die Auflösung der Signale beeinträchtigt wird. Infolgedessen sollten derartige Messbereiche üblicherweise nicht weniger als 0,5 mm, vorzugsweise mindestens 1 mm, voneinander beabstandet sein.
Die Testprobe kann von einer breiten Vielzahl von Quellen, wie physiologische Flüssigkeiten, beispielsweise Speichel, Schweiß, Serum, Plasma, Urin, Tränenflüssigkeit, Rückenmarkflüssigkeit und dgl., chemischen Behandlungsströmen, Nahrungsmitteln, Abwasser, natürlichen Wässern, Erdextrakten und dgl. stammen. Bei Durchführung des Verfahrens der Erfindung kann die Probe, von der angenommen wird, dass sie den Analyt enthält, mit dem Konjugat in einem wässrigen Elektrolytmedium zur Bildung eines wässrigen Testgemischs oder einer Lösung kombiniert werden. Verschiedene Zusatzstoffe können zur Einstellung der Eigenschaften des Testgemischs oder einer als Dochtwirkungsreagens verwendeten Trägerlösung in Abhängigkeit von den Eigenschaften der anderen Komponenten der Vorrichtung sowie denen der Liposome oder des Analytanalogon/Lipsom-Konjugats oder des Analyts selbst zugesetzt werden. Beispiele für Lösungszusatzstoffe, die in Test-, Kontroll- oder Trägerlösungen oder -gemische gemäß der Erfindung eingearbeitet werden können, umfassen Puffer, beispielsweise pH-Puffer und Ionenstärkepuffer, Proben- oder Analytsolubilisierungsmittel, beispielsweise apolare Lösemittel, und Polymere mit hohem Molekulargewicht, wie Ficoll^®, ein nichtionisches synthetisches Saccharosepolymer, erhältlich von Pharmacia, und Dextran.
Der Kontaktbereich des ersten absorbierenden Materials wird mit Testgemisch, beispielsweise durch Eintauchen des Kontaktbereichs in das Testgemisch, in Kontakt gebracht. Alternativ kann das Testgemisch mit dem absorbierenden Material durch Auftüpfeln des Testgemischs (vorzugsweise nach Inkubation, um eine Reaktion oder Hybridisierung zu ermöglichen) auf das absorbierende Material in dem Einfangbereich in Kontakt gebracht werden. Alternativ können die Testprobe und das Konjugat, vorzugsweise in Pufferlösung, getrennt auf den Kontaktbereich entweder am gleichen Ort oder an getrennten Orten appliziert werden, sofern die beiden in Kontakt miteinander kommen, wenn sie über das absorbierende Material bzw. die absorbierenden Materialien wandern.
Wenn quantitative Ergebnisse gewünscht werden, kann das Benetzen des ersten absorbierenden Materials und des zweiten absorbierenden Materials, wenn es vorhanden ist, durch Kapillarwirkung fortgesetzt werden, bis ein ausreichendes Volumen des Testgemischs und/oder der Pufferlösung den Einfangbereich durchlaufen hat, um sicherzustellen, dass ein in dem Test vorhandener Analyt den Einfangbereich erreicht hat. Wenn nur eine Detektion gewünscht wird, muss weniger darauf geachtet werden, sicherzustellen, dass der gesamte Analyt den Einfangbereich erreicht hat. Es ist möglich, Laufzeiten und Puffervolumina unter Verwendung von Vorversuchen unter Verwendung elektrochemischer Detektion und Messung, die hier beschrieben sind, oder kolorimetrischer Detektion, die beispielsweise bei Rule et al. (1996) Clin. Chem. 42, 1206-1209, beschrieben ist, zu "eichen".
Größtenteils sind relativ kurze Zeiten beteiligt, wenn das Testgemisch den Streifen durchquert. Üblicherweise benötigt eine Durchquerung des Testgemischs über den Streifen mindestens 30 s und nicht mehr als 45 min bis 1 h, noch besser etwa 1 min bis 10 min. Gemäß dem Verfahren der Erfindung ist das Signal rasch, sogar unmittelbar detektierbar.
Das Konjugat des zweiten Bindungsmaterials und der markereinkapselnden Liposome kann durch allgemein einschlägig bekannte Verfahren hergestellt werden, wobei das in einem gegebenen Fall verwendete spezielle Verfahren von den Liposomkomponenten und dem Bindungsmaterial, die verwendet werden, abhängt. Derartige Techniken umfassen kovalente Kopplung, Derivatisierung oder Aktivierung und dgl. Die Liposome können aus einer Komponente, die mit dem zweiten Bindungsmaterial derivatisiert wurde, produziert werden, wodurch die Liposome, wenn sie produziert werden, mit dem zweiten Bindungsmaterial konjugiert werden. Bei einem anderen Verfahren können die Liposome, die den Marker umfassen, am Anfang gebildet werden, worauf die Konjugation der Liposome mit dem zweiten Bindungsmaterial durch einschlägig bekannte Verfahren folgt.
Liposome können aus einer breiten Vielzahl von Lipiden, die Phospholipide, Glykolipide, Steroide, relativ langkettige Alkylester, beispielsweise Alkylphosphate, Fettsäureester, beispielsweise Lecithin, Fettamine und dgl. umfassen, hergestellt werden. Ein Gemisch von Fettmaterialien kann verwendet werden, beispielsweise eine Kombination von einem neutralen Steroid, einem Ladungsamphiphil und einem Phospholipid. Erläuterungsbeispiele für Phospholipide umfassen Lecithin, Sphingomyelin und Dipalmitoylphosphatidylcholin und dgl. Repräsentative Steroide umfassen Cholesterin, Cholestanol, Lanosterol und dgl. Repräsentative ladungsamphiphile Verbindungen enthalten allgemein 12 bis 30 Kohlenstoffatome. Mono- oder Dialkylphosphatester oder Alkylamine, beispielsweise Dicetylphosphat, Stearylamin, Hexadecylamin, Dilaurylphosphat und dgl., sind repräsentativ.
Die Liposomsäckchen werden in wässriger Lösung, die den Marker enthält, hergestellt, wodurch die Säckchen den elektroaktiven Marker in ihrem Innern umfassen. Die Liposomsäckchen können durch kräftiges Rühren in der Lösung und anschließende Entfernung des nicht-verkapselten Markers hergestellt werden. Weitere Einzelheiten im Hinblick auf die Herstellung von Liposomen sind in US-Patent 4 342 826 und der internationalen PCT-Anmeldung WO 80/01515 angegeben.
Wie hier im vorhergehenden angegeben, umfasst das Signalerzeugungssystem einen elektroaktiven Marker, der im Inneren der konjugierten Liposome eingeschlossen ist. Geeignete Marker sind diejenigen, die elektrochemisch aktiv sind, jedoch die Liposome nicht abbauen oder in anderer Weise aus den Liposomen austreten. Sie umfassen Metallionen, organische Verbindungen, wie Chinone, Phenole und NADH, und organometallische Verbindungen, wie derivatisierte Ferrocene. Ein reversibles Ferrocyanid/Ferricyanid-Paar ist der am stärksten bevorzugte elektroaktive Marker gemäß der Erfindung. Ein gleiches Gemisch aus Ferrocyanid und Ferricyanid ist besonders bevorzugt.
Die Verwendung von Liposomen gemäß der Beschreibung in der vorliegenden Anmeldung ergibt mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen Signalerzeugungssystemen unter Verwendung von beispielsweise Enzymen. Diese Vorteile umfassen eine erhöhte Signalintensität, Lagerungsstabilität und die sofortige Freisetzung von signalerzeugenden Markern gemäß der Beschreibung bei T. A. Siebert, S. G. Reeves, R. A. Durst, Analytica Chimica Acta 282, 297-305 (1993); W. T. Yap, L. Locascio-Brown, A. L. Plant, S. J. Choquette, Analytical Chemistry 63, 2007 (1991); A. L. Plant, M. V. Brizgys, L. Locasio-Brown, R. A. Durst, Analytical Boichemistry 176, 420-426 (1989); L. Locascio-Brown, A. L. Plant, V. Horvath, R. A. Durst, Analytical Chemistry 62, 2587-2593 (1990); und R. A. Durst, L. Locascio-Brown, A. L. Plant, R. D. Schmid, Hrsg., Flow Injection Analysis based on enzymes or antibodies, Band 14 (VCH, Weinheim, 1990). Beispielsweise zeigen erste Berechnungen, dass das Brechen eines einzelnen Liposoms in einem typischen Kapillarelektrophoreseprobenvolumen zu einer Konzentration von 5 μM K₄Fe(CN)₆ an dem Detektor mit ineinandergreifender Elektrodenanordnung führt. Daher sollte aufgrund der großen Empfindlichkeit der ineinandergreifenden Elektrodenanordnungen die Detektion einzelner Liposomereignisse mit dem vorliegenden System theoretisch möglich sein.
Wie oben beschrieben ist, kann die Lyse der Liposome in dem Einfangbereich durch Applikation eines Liposomenlysiermittels auf den Einfangbereich des absorbierenden Materials, nachdem das Konjugat darin gebunden wurde, erreicht werden. Geeignete Liposomlysiermaterialien umfassen grenzflächenaktive Mittel, wie Octylglucopyranosid, Natriumdioxycholat, Natriumdodecylsulfat, Polyoxyethylensorbitanmonolaurat, das von Sigma unter der Marke Tween-20 vertrieben wird, und ein nichtionisches grenzflächenaktives Mittel, das von Sigma unter der Marke Triton X-100 vertrieben wird, das tert-Octylphenoxypolyethoxyethanol ist. Octylglucopyranosid ist ein bevorzugtes Lysemittel für viele Assays, da es Liposome rasch lysiert und die Signalmessung nicht zu stören scheint. Alternativ kann eine Komplementelyse von Liposomen verwendet werden oder die Liposomen können mit elektrischen, optischen, thermischen oder anderen physikalischen Mitteln aufgebrochen werden.
Die Bewegung der Testkomponenten längs des absorbierenden Materials bzw. der absorbierenden Materialien beruht auf Kapillarwirkung. Diese Kapillarbewegung längs des absorbierenden Materials bewirkt, dass das Testgemisch zu dem und durch den Einfangbereich geführt wird, wo die Messung des aus den Liposomen freigesetzten Markers stattfindet.
Eine elektroaktive Spezies, beispielsweise Ferrocyanid, ist in den Liposomen eingekapselt. Die ineinandergreifende Elektrodenanordnung ist so positioniert, dass sie das Ablaufen eines Redoxzyklus eines in dem Einfangbereich freigesetzten elektroaktiven Markers induziert.
Die Bezugselektrode ist, wenn sie verwendet wird, üblicherweise eine Silberelektrode, obwohl Blei alternativ für die Bezugselektrode verwendet werden kann. Die die ineinandergreifende Anordnung bildenden Elektroden können aus beliebigen geeigneten Materialien, wie den Edelmetallen, anderen Metallen, wie Kupfer und Zink, oder Kohleelektrodenmaterialien in verschiedenen Formen, die Graphit-, glasartige und netzartige Kohlematerialien umfassen, oder geeigneten Gemischen dieser Materialien hergestellt werden. Der erste Leiter kann aus dem gleichen oder einem unterschiedlichen Material gegenüber dem zweiten Leiter bestehen.
Das elektrochemische Detektionssystem der vorliegenden Erfindung umfasst einen ineinandergreifenden Satz von Mikroelektroden und optional eine Bezugselektrode. In einer anderen optionalen Ausführungsform kann ein "Vierelektroden"system verwendet werden, das die ineinandergreifende Anordnung, eine Bezugselektrode und eine Hilfselektrode verwendet. Ein Vierelektrodensystem ist bei O. Niwa, M. Morita, H. Tabei, Anal. Chem. 62, 447-452 (1990) beschrieben. Platin ist ein geeignetes Material für die Hilfselektrode.
Der ineinandergreifende Elektrodensatz kann auf einem Träger, beispielsweise einem thermisch oxidierten Siliciumwafer, durch Photolithographie und die Abhebetechnik gemäß der Beschreibung in A. Aoki, T. Matsue, I. Uchida, Analytical Chemistry 1990, 62, 2206-10, gefertigt werden. Wir ermittelten, dass bessere Ergebnisse durch Einarbeiten von Siliciumnitrid (Si₃N₄) oben auf dem oxidierten Siliciumträger erhalten werden können. Insbesondere scheint das Siliciumnitrid eine bessere Isolierung zu ergeben, die wegen der bei dem vorliegenden Verfahren und der vorliegenden Vorrichtung verwendeten Ionenlösungsumgebung wichtig ist. Siehe auch K. Aoki, M. Morita, O. Niwa, H. Tabei, Journal of Electroanalytical Chemistry 256, 259 (1988) und A. M. Aoki, Tomokazu, Uchida, Isamu, Analytical Chemistry 1990, 62, 2206-10. Ineinandergreifende Platinelektroden werden vorzugsweise durch Aufdampfen und die Abhebetechnik gemäß der Beschreibung bei Aoki gebildet. Silberleitungsmuster und eine Platinelektrode und Silberbezugselektrode werden, wenn sie verwendet werden, vorzugsweise durch Photolithographie und die Abhebetechnik gebildet. Wenn möglich, sollten alle Leitungsdrähte, die vorzugsweise aus Silber bestehen, entfernt von der Oberfläche der ineinandergreifenden Anordnung lokalisiert sein.
Elektroden, die hier beschrieben sind, werden von der Cornell Nanofabrication Facility (Ithaca, NY) gefertigt. Getrennte Photomasken werden für Silber- und Platinmaterialien gezogen. Jedoch ist nur eine einzige Maske für die Fertigung einer Zweielektrodenanordnung erforderlich.
Der auf dem Siliciumwafer gebildete Elektrodensatz kann dann direkt auf die Oberfläche des absorbierenden Materials appliziert werden. Borosilicatglas- und Quarzsubstrate können alternativ verwendet werden. Derartige Elektroden mit Substratrücken können nach der Beendigung des Tests von dem Streifen entfernt und, falls gewünscht, zur Wiederverwendung präpariert werden. Wenn Elektroden wiederverwendet werden sollen, ist es häufig günstig, sie mit einer Schutz polymerschicht zu überziehen. Agarose kann beispielsweise zur Verhinderung einer Passivierung von Elektroden verwendet werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist jeder Elektrodensatz eine Gesamtgröße von 9 × 4 mm auf und er ist etwa 350 μm dick. Die tatsächliche Fläche des Ineinandergreifens beträgt 6 mm × 2 mm und sie ist so gestaltet, dass sie üblicherweise über 5 mm breite Immunmigrationsstreifen passt. Dieser Aufbau macht es möglich, dass die Anordnung das absorbierende Material vollständig deckt, was die Wechselwirkung eines elektroaktiven Markers mit den Elektroden und daher die Testempfindlichkeit maximiert. Eine bevorzugte ineinandergreifende Anordnung besteht aus 200 Paaren von 3 μm breiten Mikroelektrodenfingern, die durch einen Zwischenraum von 1-5 μm getrennt sind. Bevorzugte Bezugs- und Hilfselektroden betragen 7 × 1 mm.
Obwohl die bevorzugte Konfiguration oben beschrieben wurde, können der erste Leiter und der zweite Leiter 2 bis 1000 Finger umfassen und die Finger des ersten und zweiten Leiters können im Bereich einer Größe von etwa 1 μm bis etwa 20 μm breit reichen. Die Elektrodenfinger können etwa 0,5 μm bis etwa 10 μm voneinander beabstandet sein.
Jede der Elektroden kann alternativ durch Siebdruck der Elektrodenmaterialien auf dem absorbierenden Material hergestellt werden, obwohl mit Siebdruck der Zwischenelektrodenabstand von der Größenordnung 50 μm bis 0,1 mm sein kann. Wie bekannt ist, umfasst Siebdruck die Herstellung einer organischen oder wässrigen Aufschlämmung des Elektrodenmaterials, typischerweise eines feinen Pulvers von Kohle, Gold und dgl., und die anschließende Applikation der Aufschlämmung über und durch ein Seidensieb auf das absorbierende Material der Testvorrichtung. Diese Aufschlämmung kann optional ein polymeres Bindemittel umfassen, das die Aggregation der feinen Metallteilchen zusammen auf der Oberfläche des absorbierenden Materials unterstützt. Die Elektrodenmaterialaufschlämmung kann auf der Oberfläche des absorbierenden Materials durch Erhitzen fixiert werden, doch werden die aufgedruckten Elektrodenbereiche vorzugsweise auf der Oberfläche des absorbierenden Materials lufttrocknen gelassen.
Die Testkomponenten und etwaige Kontrollgemische sind Elektrolytlösungen, wie Kochsalzlösungen, des Analyts und Konjugats.
Bei dem Verfahren der Erfindung wird eine feste Spannung an die Leiter angelegt, um das Ablaufen eines Redoxzyklus des von den im Einfangbereich eingefangenen Liposomen freigesetzten elektroaktiven Markers zu induzieren. Eine einfache Batterie kann zum Anlegen der Spannung verwendet werden. Andere Vorrichtungen, die als Potentiostate gemäß der Erfindung verwendet werden können, umfassen den Cypress (Lawrence, Ks) System Electrochemical Analyzer (CSS-1090) und BAS (West Lafayette, Ind.) Amperometric Detector (LC-4C, LC-3C, LC-3D).
Das Lösemittel für die Testprobe ist normalerweise ein wässriges Medium, das bis zu 40 Gew.-% aus anderen polaren Lösemitteln, insbesondere Lösemitteln mit 1 bis 6, noch besser 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, die Alkohole, Formamid, Dimethylformamid und Dimethylsulfoxid, Dioxan und dgl. umfassen, bestehen kann. Üblicherweise sind die Co-Lösemittel in weniger als etwa 30-40 Gew.-% vorhanden. In einigen Fällen kann in Abhängigkeit von der Natur der Probe ein Teil oder das gesamte wässrige Medium durch die Probe selbst bereitgestellt werden.
Der pH-Wert für das Medium liegt üblicherweise im Bereich von 4-10, üblicherweise 5-9 und vorzugsweise im Bereich von etwa 6-8. Der pH-Wert wird so gewählt, dass eine signifikante Höhe der Bindungsaffinität der Bindungsmitglieder und eine optimale Erzeugung eines Signals durch das Signalerzeugungssystem beibehalten werden. Verschiedene Puffer können zum Erreichen des gewünschten pH-Werts und Beibehalten des pH-Werts während des Tests verwendet werden. Beispiele für Puffer umfassen Borat, Phosphat, Carbonat, Tris, Barbital und dgl. Der speziell verwendete Puffer ist üblicherweise unkritisch, wenn der Analyt von einer Nucleinsäure verschieden ist, doch bei individuellen Tests kann ein Puffer gegenüber einem anderen bevorzugt sein. Für Nucleinsäureanalyte ist es notwendig, geeignete Puffer zu wählen. Derartige Puffer umfassen SSC, einen Natriumchlorid/Natriumcitrat-Puffer und SSPE (Natriumchlorid, Natriumphosphat, EDTA).
Die Konzentration von Elektrolyten in dem Medium wird üblicherweise so eingestellt, dass Isotonizität oder Äquiosmolalität mit der Lösung im Inneren der Liposomen erreicht wird, um deren Furchung oder Quellung zu verhindern.
Mit einer etwas erhöhten Komplexität der von dem Elektroanalysator angelegten Anregungswellenform kann eine elektrochemische Messung gemäß der Erfindung auch unter Verwendung von Abstreifvoltametrie unter Verwendung von beispielsweise liposomverkapselten Metallionen zur Detektion und Messung durchgeführt werden.
Mäßige und günstigerweise im wesentlichen konstante Temperaturen werden normalerweise zur Durchführung des Tests verwendet. Die Temperatur für den Assay bzw. Test und die Erzeugung eines detektierbaren Signals liegen allgemein im Bereich von etwa 4-65°C, noch günstiger im Bereich von etwa 20-38°C und häufig betragen sie etwa 15-45°C.
Die Konzentration eines Analyts, der getestet werden kann, in der flüssigen Probe variiert allgemein von etwa 10^–3 bis etwa 10^–20 M, noch besser von etwa 10^–5 bis 10^–15 M. Überlegungen, beispielsweise die Konzentration des interessierenden Analyts, und das Protokoll bestimmen normalerweise die Konzentration der anderen Reagentien.
Mit der Testvorrichtung und dem Verfahren der Erfindung kann auch eine Testprobe auf eine Mehrzahl von Analyten, wie toxische Chemikalien oder Pathogene, getestet oder auf einen oder mehrere einer Vielzahl von Analyten durchmustert werden. In einer Ausführungsform umfasst die Testvorrichtung mehrere Einfangbereiche und entsprechende Sätze von ineinandergreifenden Elektrodenanordnungen. Durch entsprechende Kontrolle bzw. Steuerung der Potentiale an den Elektroden können verschiedene Markerionen gemessen und auf getrennte Analytkonzentrationen zurückgeführt werden. In einer anderen Ausführungsform wird ein einziger Elektrodensatz, vorzugsweise in einer Dreielektrodenkonfiguration, die oben beschrieben ist, verwendet. Das Potential wird beispielsweise durch lineares Scannen mit der Zeit variiert, wobei zu den verschiedenen Ionenkonzentrationen proportionale Ströme bei singulären Potentialen (Zeiten) erzeugt werden.
Aus Bequemlichkeitsgründen kann die vorliegende Vorrichtung in einem Kit in einer abgepackten Kombination mit vorgegebenen Mengen von Reagentien zur Verwendung zum Test auf einen Analyt oder eine Mehrzahl von Analyten bereitgestellt werden. Neben der absorbierenden Testvorrichtung und dem Liposomkonjugat können andere Additive, wie Hilfsreagentien, beispielsweise Stabilisierungsmittel, Puffer und dgl., enthalten sein. Die relativen Mengen der verschiede nen Reagentien können in weitem Umfang variiert werden, um eine Konzentration der Reagentien in Lösung zu erhalten, die die Empfindlichkeit des Tests wesentlich optimiert. Die Reagentien können als trockene Pulver, üblicherweise lyophilisisert, die Streckmittel umfassen, die bei Auflösen eine Reagenzlösung mit den passenden Konzentrationen zur Durchführung des Tests ergeben, bereitgestellt werden. Das Kit oder die Packung kann andere Komponenten, beispielsweise Standards des Analyts oder der Analyte (Analytproben mit bekannten Konzentrationen des Analyts) umfassen.
Die vorliegende Erfindung ist für Verfahren und Produkte zur Bestimmung einer breiten Vielzahl von Analyten verwendbar. Als repräsentative Beispiele für Arten von Analyten können genannt werden: Umwelt- und Nahrungskontaminationsstoffe, die Pestizide und toxische Industriechemikalien umfassen; Arzneimittel, die therapeutische Arzneimittel und Missbrauchsdrogen umfassen; Hormone, Vitamine, Proteine, die Antikörper aller Klassen umfassen; Prionen; Peptide; Steroide; Bakterien; Pilze; Viren; Parasiten; Komponenten oder Produkte von Bakterien, Pilzen, Viren oder Parasiten; Aptamere; Allergene aller Arten; Produkte oder Komponenten normaler oder maligner Zellen; und dgl. Als spezielle Beispiele können T₄; T₃; Digoxin; hCG; Insulin; Theophyllin; luteinisierende Hormone und Organismen, die verschiedene Krankheitszustände verursachen oder mit diesen verbunden sind, wie Streptococcus pyrogenes (Gruppe A), Herpes simplex I und II, Cytomegalovirus, Chlamydien und dgl., genannt werden. Die Erfindung kann auch zur Bestimmung relativer Antikörperaffinitäten und für relative Nucleinsäurehybridisierungsexperimente, einen Restriktionsenzymassay mit Nucleinsäuren und die Bindung von Proteinen und anderem Material an Nucleinsäuren verwendet werden.
Wie hier im vorhergehenden angegeben wurde, kann der Test qualitativ (Vorhandensein oder Nichtvorhandensein einer bestimmten Konzentration eines Analyts) oder quantitativ oder halbquantitativ sein. Es wird angenommen, dass die Herstellung geeigneter Standards und/oder von Standardkurven aus den hier angegebenen Lehren einem Fachmann geläufig ist.
Das Verfahren der Erfindung und die Herstellung und Verwendung der Testvorrichtung gemäß der Erfindung werden durch die folgenden Beispiele erläutert.
BEISPIELE
Materialien für Beispiel 1
Verwendete Materialien:

Qiagen RNeasy Kit for RNA purification (Qiagen Company, Deutschland)
Boom technology (Organon Teknika, Niederlande)

Beispiel 1 – Nucleinsäureextraktion
a. Hitzeschockoptimierung
Oozysten wurden bis zu 20 min 41°C–47°C in einem Wasserbad oder Heizblock unterzogen.
b. Oozystendisruption zur Bildung von Oozystenlysaten
Die folgenden Disruptionsverfahren wurden untersucht: Einfrieren/Auftauen-Zyklus (flüssiges N₂/65°C), Bläschenschlagen mit anschließendem Gefrieren/Auftauen-Zyklus, Inkubation bei 95°C, Inkubation bei 55°C und Inkubation bei 60°C. Die folgenden Versuchsarbeiten wurden unter Verwendung von durch den Einfrieren/Auftauen-Zyklus hergestellten Proben durchgeführt.
c. Nucleinsäurereinigung
Für die Nucleinsäureextraktion aus den Oozystenlysaten wurden zwei kommerziell erhältliche Verfahren verwendet. Das Qiagen-Verfahren, das in dem RN-easy Mini Handbook, März 1997 (Qiagen Inc. 28159 Avenue Stanford, Valencia, CA 91355), das hierdurch als Bezug aufgenommen ist, beschrieben ist, wurde variiert, um optimale Bedingungen zu finden. Speziell wurden eine zusätzliche Ethanolwaschstufe und eine längere Trocknungszeit verwendet. Die Boom-Technik, die in R. Boom et al., "Rapid and Simple Method for Purification of Nucleic Acids", J. Clin. Microbiol., März 1990, 495-503, das hierdurch als Bezug aufgenommen ist, beschrieben ist, wurde gemäß dem Protokoll verwendet.
Beispiel 2 – NASBA-Amplifikation
Die Sequenz von C. parvum ist in N. V. Khramtsov et al., "Cloning and analysis of a Cryptosporidium parvum Gene Encoding a Protein with Homology to Cytoplasmic Form Hsp 70", J. Euk. Microbiol., 42 (4), 1995, 416-422, das hierdurch als Bezug aufgenommen ist, offenbart. Die Nucleinsäure wurde unter Verwendung von OT NASBA-Amplifikationskits amplifiziert. Ein für C. parvum spezifischer Primer wurde gestaltet und in dem Amplifikationskit verwendet. Die Standardbedingungen wurden in Bezug auf die KCl-Konzentration und die Inkubationszeit variiert, um optimale Bedingungen zu finden. Amplifikationen wurden 60-90 min durchgeführt.
Beispiel 3 – Herstellung der ineinandergreifenden Ultramikroelektrodenanordnung (IDUA oder IDA)
a. IDUA-Herstellung
IDUAs wurden unter Verwendung der folgenden Techniken: Photolithographie und Abhebetechnik hergestellt. IDUAs wurden auf 3'-Siliciumwafern hergestellt. Die Herstellung erfolgte gemäß der Beschreibung in der gleichzeitig anhängigen US-Patentanmeldung des Aktenzeichens 08/722901, wobei jedoch die Siliciumwafer nicht nur mit einer Siliciumoxidschicht, sondern zusätzlich mit einer Siliciumnitridschicht beschichtet wurden, um die Isolierung des Siliciums zu verbessern.
Oben auf dieser Siliciumnitridschicht wurde die IDUA-Struktur aufgebaut. Die IDUAs wurden aus Gold oder Platin (einschließlich einer ersten Schicht einer Titanschicht von 5 nm, die einen guten Kontakt der Metalle mit dem Siliciumnitrid sicherstellt) hergestellt. IDUAs wurden mit einem Sauerstoffplasma nach der Abhebetechnik behandelt. Dieses Plasma wird zur Reinigung der Metalloberflächen von übrig gebliebenen Photoresists verwendet. Es hatte jedoch eine negative Wirkung auf die Plattenoberfläche, da sie oxidiert wurde und für elektrochemische Experimente weniger aktiv war. Nicht-plasmabehandelte Platinelektroden waren elektrochemisch die besten und sie wurden für die meisten Experimente verwendet.
Modelle wurden mit und ohne zusätzliche Elektroden zur Verwendung als Bezugs- und Hilfselektroden in elektrochemischen Experimenten hergestellt. Es wurde ermittelt, dass die zusätzlichen Elektroden nicht erforderlich waren und die letzten IDUA-Iterationen wurden mit nur IDUA hergestellt.
b. Elektrochemische Charakterisierung der IDUAs
Die IDUAs wurden unter Verwendung von Amperometrie und cyclischer Voltametrie unter Analyse des reversibel oxidierbaren Rexodpaars Ferrohexacyanid/Ferrihexacyanid elektrochemisch charakterisiert. Das angelegte Potential wurde variiert.
Standardkurven von Ferrohexacyanid gegen das gleiche Volumen eines 1:1-Gemischs von Ferrohexacyanid und Ferrihexacyanid wurden verglichen. Es wurde ermittelt, dass das Gemisch bei den gleichen Konzentrationen signifikant höhere Ströme aufgrund einer erhöhten Zyklusdurchführung der Analyte an der IDUA-Oberfläche ergab, was in 13 gezeigt ist. In späteren Experimenten wurde ein gleiches Gemisch von Ferrihexacyanid und Ferrohexacyanid verwendet.
Die in Tabelle 2 angegebenen verschiedenen IDUA-Iterationen wurden durch Detektieren verschiedener Konzentrationen eines Gemischs von Ferrohexacyanid/Ferrihexacyanid bei einem Potential von 400 mV verglichen.
TABELLE 2
Die Ergebnisse dieser Experimente sind in 7 angegeben (die in 7 angegebenen Daten wurden unter Verwendung einer Goldschicht von 150 nm in Iteration 2 hergestellt). IDUAs der Iteration 4, die aus Platin hergestellt wurden, wurden zur Verwendung als Wandler in dem Biosensor gewählt.
Die Reproduzierbarkeit der IDUAs wurde durch Detektieren verschiedener Konzentrationen eines Gemischs von Ferrohexacyanid/Ferrihexacyanid bei einem Potential von 400 mV getestet, was in 8 angegeben ist. Drei IDUAs der 3. Iteration, die in Tabelle 2 angegeben ist, die aus Gold bestanden, wurden für dieses Experiment verwendet.
Wie in Tabelle 3 angegeben ist, wurde ermittelt, dass die IDUAs mindestens 20-fach empfindlicher als herkömmliche (nicht-ineinandergreifende) Mikroelektroden mit der gleichen Oberfläche sind und ein mindestens 8-fach höheres Signal für die gleiche gemessene Konzentration ergeben.
Tabelle 3
Die Wirkung verschiedener Detergentien und Pufferkonzentrationen wurde mit den IDUAs untersucht. Es wurde ermittelt, dass die Detektion von Ferrohexacyanid/Ferrihexacyanid durch die Ionenstärke des Puffers beeinflusst war. Ein 0,25 M Phosphatpuffer wurde als optimal gewählt. Verschiedene Detergentien, die untersucht wurden, ergaben bei 400 mV ein hohes Hintergrundsignal. Schließlich wurde ein reines b-Octylglucopyranosid (OG) als das optimale Detergens gewählt, da das Hintergrundsignal minimal, ähnlich einer reinen Pufferlösung war.
Beispiel 3 – Liposomzubereitung
Liposome wurden nach den Verfahren gemäß der Beschreibung in US-Patent 5 789 154, 5 756 362 und 5 753 519 und der US-Patentanmeldung des Aktenzeichens 08/722901, deren Offenbarungen hier als Bezug aufgenommen sind, hergestellt. Oligonucleotide, die für die Zielsequenz spezifisch waren, wurden kovalent an die Außenseite der Liposommembran gekoppelt.
Beispiel 4 – Membranstreifenherstellung, Testdurchführung, Detektion
Die Membranstreifen wurden gemäß der Beschreibung in US-Patent 5 789 154, 5 756 362, 5 753 519 und der gleichzeitig anhängigen US-Patentanmeldung des Aktenzeichens 08/722901 hergestellt, wobei jedoch eine zweiteilige Baugruppe (Nitrocellulose und Whatman-Filterpapier) und eine dreiteilige Baugruppe (DuPont Sontara^TM, Nitrocellulose und Whatman-Filterpapier) sowie eine einteilige Baugruppe (Nitrocellulose) verwendet wurden.
Daher war das absorbierende Material der einteiligen Baugruppe das gleiche wie das erste, für die 2-teilige Baugruppe verwendete Material und das mittlere Teil der 3-teiligen Baugruppe. Das als das zweite Material in der 2-teiligen Baugruppe verwendete Dochtwirkungsmaterial war das gleiche, das als das dritte Material in der 3-teiligen Baugruppe verwendet wurde. Die Dimensionen der verschiedenen Teile variierten.
Das absorbierende Material wurde für die Immobilisierung der Oligonucleotide verwendet. Es wurde anschließend an das Immobilisierungsverfahren mit einer Blockierungslösung überzogen. Das Material der 3-teiligen Baugruppe, das als erstes Teil verwendet wurde, wurde ebenfalls mit einer Blockierungslösung überzogen. Das Dochtwirkungsmaterial wurde unbehandelt verwendet.
Die Oligonucleotide wurden direkt auf dem absorbierenden Material oder als biotinylierte Oligonucleotide über Streptavidin-Bindung in dem Einfangbereich immobilisiert.
Die Streifen wurden für die Experimente in vertikaler oder horizontaler Weise verwendet. Sie wurden in die Probenlösung getaucht oder Probenlösung wurde auf das erste Teil der Baugruppen – vor dem Einfangbereich oder direkt auf diesen – appliziert. Ein Probenpuffer wurde anschließend auf den Beginn des ersten Teils des Streifens (direkt oder nach mehreren Minuten Inkubationsdauer) appliziert, um das Auftreten einer Wanderung auf dem Streifen und das Laufen der Probe durch den Einfangbereich zu ermöglichen.
Anschließend wurden, sobald der gesamte Probenpuffer längs des Streifens wanderte, die Einfangbereiche zur Detektion verwendet. In einem Versuch wurde der Einfangbereich ausgeschnitten und oben auf eine IDUA gelegt, ein Detergens zugegeben und das Signal nach einigen Minuten detektiert. In einem alternativen Versuch wurde der Einfangbereich ausgeschnitten und oben auf eine IDUA gelegt, die auf deren Oberfläche getrocknetes Detergens aufwies, und das Signal nach einigen Minuten detektiert. Wenn Sulforhodamin B (SRB) einkapselnde Liposomen verwendet wurden, wurde das Signal unter Verwendung eines Scanners detektiert.
Verschiedene Konzentrationen einer synthetischen Zielsequenz wurden unter Verwendung einer 2-Kissen-Baugruppe mit Einführung von Liposomen direkt auf den Einfangbereich detektiert. Die Ergebnisse sind in 11 gezeigt.
Verschiedene Mengen eines NASBA-Amplicon, das von der Amplifikation von C. parvum-Oozysten-mRNA stammte, wurden unter Verwendung einer 3-Kissen-Baugruppe detektiert, was in 12 angegeben ist. Hintergrundsignale (die von NASBA-Amplicons von H₂O stammten) wurden subtrahiert.
10 zeigt die Ergebnisse von Versuchen, die zur Gestaltung der Testvorrichtung verwendet wurden. Sie zeigt den Strom, der ausgehend von zwei Konzentrationen (null und 300 fmol) einer synthetischen Targetsequenz unter Verwendung von 2-Kissen- und 3-Kissen-Baugruppen erzeugt wurde. Unter Verwendung der 2-Kissen-Baugruppe wurden zwei verschiedene Inkubationszeiten (2 min und 4 min) nach direkter Einführung der Konjugatsuspension in den Einfangbereich (und vor der Einführung von Pufferlösung zum Auswaschen von überschüssigem Konjugat aus dem Einfangbereich) untersucht.
9 zeigt die Ergebnisse einer Untersuchung der Bindungsintensität für ein Reportersonde/Antisense-Reporter-Sondenpaar bei verschiedenen Konzentrationen einer Reportersonde an der Liposomoberfläche. Die Antisense-Reportersonde war auf dem Einfangbereich eines absorbierenden Kissens immobilisiert. Die Optimierung der Konzentration des zweiten Bindungsmaterial an den Liposomen erfordert die Berücksichtigung einer Vielzahl von Faktoren. Beispielsweise muss eine ausreichende Konzentration eines Bindungsmaterials verwendet werden, um gute Bindungsintensität ohne Opferung von Testempfindlichkeit zu erreichen. Ferner muss die Konzentration des zweiten Bindungsmaterials an den Liposomen ausreichend sein, um die Konzentration des Analyts in der Testprobe aufzunehmen, um beispielsweise die "Lockmittelwirkung", die sich sonst aufgrund einer hohen Analytkonzentration ergeben würde, zu vermeiden.
Eine "Damm"-Konstruktion kann alternativ zur Signaldetektion verwendet werden. In dieser Ausführungsform wird der Einfangbereich nicht aus dem Streifen zur elektrochemischen Detektion ausgeschnitten; stattdessen wird der Einfangbereich des Teststreifens oben auf die IDUA ohne Isolieren desselben vom Rest des Streifens gelegt. Jedoch wird jedes Fließen durch Blockieren eines Fließens jenseits des Einfangbereichs unter Verwendung eines Damms gestoppt. Detergens wird zugegeben (unmittelbar vor dem Einfangbereich) und das Signal wird detektiert.
Zur Validierung der Wahlmöglichkeiten von Primer und Sonde wurden verschiedene Konzentrationen der C. parvum hsp70-mRNA in einer NASBA-Reaktion verwendet und die Amplicons unter Verwendung von Elektrochemilumineszenz(ECL)technologie detektiert. Die erhaltenen Daten sind in Tabelle 4 angegeben.
TABELLE 4 Detektion von hsp70-mRNA
Eine Reihenverdünnung von C. parvum-Oozysten wurde in Pufferlösung durchgeführt. Nucleinsäure wurde aus den verschiedenen Proben (über Boom) extrahiert, anschließend mit NASBA amplifiziert und unter Verwendung von Elektrochemilumineszenz(ECL)technologie detektiert. Die erhaltenen Daten sind in Tabelle 5 angegeben. TABELLE 5

Zahl der Oozysten pro Probe ECL-Signal

(Duplikate)

1 000 000 positiv

100 000 positiv

10 000 positiv

1 000 positiv

100 positiv

10 positiv

0 negativ
Die Zuverlässigkeit der in Tabelle 5 angegebenen Daten wurde unter Verwendung von 10 Replikaten von zwei Proben verifiziert, was in Tabelle 6 angegeben ist.
TABELLE 6
Die Offenbarungen der Provisional US Application des Aktenzeichens 60/086190, eingereicht am 21. Mai 1998, und der Provisional US des Aktenzeichens 60/106122, eingereicht am 29. Oktober 1998, werden hierdurch als Bezug aufgenommen.
Obwohl die Erfindung detailliert zum Zwecke der Erläuterung beschrieben wurde, ist klar, dass diese Einzelheiten nur diesem Zweck dienen und Variationen hierbei durch den Fachmann ohne Abweichen von der Idee und dem Umfang der Erfindung, die durch die folgenden Ansprüche definiert ist, gemacht werden können.

Claims

Verfahren zur Detektion oder quantitativen Bestimmung eines Analyts in einer flüssigen Testprobe, das umfasst Bereitstellen einer Testvorrichtung, die umfasst: einen Kontaktbereich auf einem ersten absorbierenden Material, einen Einfangbereich entweder auf dem ersten absorbierenden Material oder auf einem zweiten absorbierenden Material in Fluidfließkontakt mit dem ersten absorbierenden Material, wobei der Einfangbereich ein erstes Bindungsmaterial, das an den Einfangbereich gebunden ist, aufweist, und eine Elektrodenanordnung, die einen ersten Leiter mit einer Mehrzahl von Fingern und einen zweiten Leiter mit einer Mehrzahl von Fingern umfasst, wobei die Finger des ersten Leiters und die Finger des zweiten Leiters ineinandergreifen, wobei der erste und der zweite Leiter über eine Spannungsquelle und eine Auslesevorrichtung elektrisch miteinander verbunden sind und die Anordnung so positioniert ist, dass der Ablauf eines Redoxzyklus eines in dem Einfangbereich freigesetzten elektroaktiven Markers induziert wird; Applizieren der Testprobe auf den Kontaktbereich; Anlegen einer Spannung zwischen den Leitern, wobei das Potential zur Induktion des Ablaufens eines Redoxzyklus des Markers ausreichend ist; Ermöglichen einer Wanderung der Testprobe von dem Kontaktbereich in den Einfangbereich; Inkontaktbringen der Testprobe mit einem Konjugat von Liposomen und einem zweiten Bindungsmaterial, wobei die Liposomen einen elektroaktiven Marker einkapseln, wobei das zweite Bindungsmaterial mit einem Bereich des Analyts eine Bindung eingeht, und wobei das erste Bindungsmaterial mit einem anderen Bereich des Analyts als dem Bereich des Analyts, für den das zweite Bindungsmaterial ausgewählt ist, eine Bindung eingeht; Inkubieren der Testprobe mit dem Konjugat während eines Zeitraums, der zum Ermöglichen einer Reaktion zwischen einem beliebigen, in der Testprobe vorhandenen Analyt und dem zweiten Bindungsmaterial ausreichend ist; nach dem Inkubieren und Ermöglichen das Lysieren von etwaigen in dem Einfangbereich vorhandenen Liposomen unter Freisetzung des Markers, wodurch der Marker einen durch die Leiter induzierten Redoxzyklus durchläuft, was das Fließen eines Stroms zwischen dem ersten und dem zweiten Leiter verursacht; Detektieren des Vorhandenseins oder der Menge des Stroms und Korrelieren des Vorhandenseins oder der Menge des Stroms mit dem Vorhandensein bzw. der Menge des Analyts in der Testprobe.
Verfahren zur Detektion oder quantitativen Bestimmung eines Analyts in einer flüssigen Testprobe, das um fasst: Bereitstellen einer Testvorrichtung, die umfasst: einen Kontaktbereich auf einem ersten absorbierenden Material, einen Einfangbereich entweder auf dem ersten absorbierenden Material oder auf einem zweiten absorbierenden Material in Fluidfließkontakt mit dem ersten absorbierenden Material, wobei der Einfangbereich ein erstes Bindungsmaterial, das an den Einfangbereich gebunden ist, aufweist, und eine Elektrodenanordnung, die einen ersten Leiter mit einer Mehrzahl von Fingern und einen zweiten Leiter mit einer Mehrzahl von Fingern umfasst, wobei die Finger des ersten Leiters und die Finger des zweiten Leiters ineinandergreifen, wobei der erste und der zweite Leiter über eine Spannungsquelle und eine Auslesevorrichtung elektrisch miteinander verbunden sind und die Anordnung so positioniert ist, dass der Ablauf eines Redoxzyklus eines elektroaktiven Markers, der aus Liposomen freigesetzt wird, die über den Einfangbereich hinaus wandern, induziert wird; Applizieren der Testprobe auf den Kontaktbereich; Anlegen einer Spannung zwischen den Leitern, wobei das Potential zur Induktion des Ablaufens eines Redoxzyklus des Markers ausreichend ist; Ermöglichen einer Wanderung der Testprobe von dem Kontaktbereich durch den Einfangbereich; Inkontaktbringen der Testprobe mit einem Konjugat von Liposomen und einem zweiten Bindungsmaterial, wobei die Liposomen einen elektroaktiven Marker einkapseln, wobei das zweite Bindungsmaterial mit einem Bereich des Analyts eine Bindung eingeht, und wobei das erste Bindungsmaterial mit einem anderen Bereich des Analyts als dem Bereich des Analyts, für den das zweite Bindungsmaterial ausgewählt ist, eine Bindung eingeht; Inkubieren der Testprobe mit dem Konjugat während eines Zeitraums, der zum Ermöglichen einer Reaktion zwischen einem beliebigen, in der Testprobe vorhandenen Analyt und dem zweiten Bindungsmaterial ausreichend ist; nach dem Inkubieren und Ermöglichen das Lysieren etwaiger Liposome, die über den Einfangbereich hinaus wandern, unter Freisetzung des Markers, wodurch der Marker einen durch die Leiter induzierten Redoxzyklus durchläuft, was das Fließen eines Stroms zwischen dem ersten und dem zweiten Leiter verursacht; Detektieren des Vorhandenseins oder der Menge des Stroms und Korrelieren des Vorhandenseins oder der Menge des Stroms mit dem Vorhandensein bzw. der Menge des Analyts in der Testprobe.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Inkontaktbringen vor dem Applizieren der Testprobe durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Inkontaktbringen und das Inkubieren vor dem Applizieren der Testprobe durchgeführt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Lysieren durch Einführen eines Liposomlysiermittels auf den Einfang bereich nach dem Ermöglichen und dem Inkubieren durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Analyt ein Ziel-Nucleinsäuremolekül ist, das erste Bindungsmaterial eine Einfangsonde ist, die derart gewählt ist, dass sie zumindest partiell mit einem Teil des Ziel-Nucleinsäuremoleküls hybridisiert, und das zweite Bindungsmaterial ein Reporter-Nucleinsäuremolekül ist, das derart gewählt ist, dass es zumindest partiell mit einem anderen Bereich des Ziel-Nucleinsäuremoleküls als dem Bereich des Ziel-Nucleinsäuremoleküls, für den die Einfangsonde gewählt ist, hybridisiert.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Ziel-Nucleinsäuremolekül in einem Organismus gefunden wird, der aus der Gruppe von Bakterien, Pilzen, Viren, Protozoen und Parasiten ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei der Organismus Cryptosporidium parvum ist.
Verfahren nach Anspruch 1, das ferner das Einführen eines Dochtwirkungsreagens in das erste absorbierende Material nach dem Applizieren der Testprobe zur Übertragung der Testprobe in den Einfangbereich umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Inkontaktbringen durch Applizieren der Testprobe und des Konjugats auf das absorbierende Material und Ermöglichen einer Wanderung der Testprobe oder des Konjugats zum Kontakt miteinander durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Inkontaktbringen durch Immobilisieren des Konjugats auf dem absorbie renden Material zwischen dem Kontaktbereich und dem Einfangbereich und Ermöglichen einer Wanderung der Testprobe durch das immobilisierte Konjugat in Richtung auf den Einfangbereich durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Korrelieren durch Vergleichen der Menge des zwischen dem ersten und zweiten Leiter fließenden Stroms mit einem oder mehreren Bezugsstandards mit bekannten Konzentrationen des Analyts für spezielle Strommengen zur Bestimmung der Analytkonzentration in der Testprobe, bezogen auf die bekannten Konzentrationen, durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Liposomen aus einem oder mehreren Phospholipiden, Glykolipiden, Steroiden, Alkylphosphaten oder Fettsäureestern hergestellt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Finger des ersten Leiters und des zweiten Leiters jeweils etwa 1 μm bis etwa 20 μm breit sind und etwa 0,5 μm bis etwa 10 μm voneinander beabstandet sind.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Marker aus der Gruppe von Ferrocyanid, Ferricyanid und Gemischen von Ferrocyanid und Ferricyanid ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Testvorrichtung ferner ein drittes absorbierendes Material in Fluidfließkontakt mit dem zweiten absorbierenden Material umfasst, wobei das dritte absorbierende Material so positioniert ist, dass es Fluid von dem zweiten absorbierenden Material dochtmäßig abzieht.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei mindestens eines der ersten und zweiten absorbierenden Materialien mit einem oder mehreren Blockierungsmitteln, grenzflächenaktiven Mitteln oder Gemischen derselben behandelt wurde.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Blockierungsmittel aus der Gruppe von Gelatine, fettfreier Trockenmilch, Rinderserumalbumin, Schlüssellochnapfschneckenhämocyanin und Casein ausgewählt sind.
Verfahren nach Anspruch 1, das ferner das Isolieren des Einfangbereichs von dem ersten oder zweiten absorbierenden Material nach dem Ermöglichen und vor dem Detektieren umfasst.