DE69818377T2

DE69818377T2 - Immunoassay-Verfahren und Immunoassay-Testsatz

Info

Publication number: DE69818377T2
Application number: DE69818377T
Authority: DE
Inventors: Keisaku Ibaraki-shi Okada; Kenjiro Ibaraki-shi Mori; Shuji Ibaraki-shi Senda
Original assignee: Nitto Denko Corp
Current assignee: Nitto Denko Corp
Priority date: 1997-08-07
Filing date: 1998-07-22
Publication date: 2004-06-24
Anticipated expiration: 2018-07-23
Also published as: DE69818377D1; EP0896223A1; EP0896223B1; US20020086339A1; JP3609240B2; JPH1151939A; US6391652B2; US20010009765A1

Description

Fachgebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Immunassayverfahren, eine Immunassayvorrichtung und einen Immunassay-Kit, die einen leichten, schnellen und hochgradig genauen Nachweis von wenigstens zwei Arten von Testsubstanzen aus Verotoxin-erzeugendem Escherichia coli, Verotoxin und Human-Hämoglobin in einer Testprobe gleichzeitig auf demselben Grundmaterial.
Hintergrund der Erfindung
O157, ein Verotoxin-erzeugendes Escherichia coli, das in den letzten Jahren ernste Probleme verursacht hat, tritt mit der Nahrung, die die Hauptinfektionsquelle ist, in den Körper ein und verursacht das Einsetzen einer Krankheit nach etwa 4 bis 9 Tagen Inkubationszeit. Blutiger Stuhl ist ein Symptom, das schon in den frühen Stadien der Infektion auftritt, und in manchen Fällen folgen hämolytische Anämie, Nierenversagen und Thrombocytopenie aufgrund der Wirkung des von O157 erzeugten Verotoxins. Die Krankheit kann letztlich soweit fortschreiten, dass sie ein hämolytisches urämisches Syndrom (HUS) verursacht.
Der Vorgang des Nachweises von Verotoxin-erzeugendem Escherichia coli in Nahrung und Patienten ist äußerst kompliziert und erfordert viele Tage, bevor Ergebnisse erhalten werden. Ein immunologisches Assayverfahren hat jedoch vor kurzem einen vergleichsweise leichten Nachweis der ursächlichen Quelle ermöglicht.
Ein spezifisches Nachweisverfahren umfasst ein Verfahren (Warenzeichen EHEC-TEC ELISA TEST SYSTEM, hergestellt von Organon Teknika Corp.) zum Nachweis von O157-Antigen, das das Kultivieren eines Nahrungsmittels unter Verwendung von mTSB-Medium (modifizierte Tripticase-Soja-Brühe) und das Anwenden eines ELISA-Verfahrens (enzyme-linked immunosorbent assay) umfasst. Zum Nachweis der Verotoxinerzeugung durch Escherichia coli, das aus Nahrungsmitteln abgetrennt wurde, umfasst ein Verfahren (Warenzeichen Verotox-F "Seiken", hergestellt von Denka Seiken Co., Ltd.) seine Kultur in einem CA-YE-Medium und den Nachweis von Verotoxin 1 und Verotoxin 2 durch einen Latexagglutinierungstest unter Verwendung des Überstands als Testprobe.
Ein Verfahren zum Nachweis von O157 in einer Testprobe von einem Patienten umfasst die Verwendung eines Latexagglutinierungstests (Warenzeichen Escherichia coli O157 Detection Kit "UNI", hergestellt von Unipath Ltd.).
Die oben genannten Verfahren weisen O157 und Verotoxin als einziges Testobjekt nach, was bedeutet, dass sie nicht gleichzeitig nachgewiesen werden können. Außerdem erfordern diese Verfahren eine Anreicherung vor dem Nachweis. Sie sind also zeitraubend und erfordern eine komplizierte Manipulation.
Andererseits hat vor kurzem ein Immunitätschromatographie-Verfahren als Verfahren, das einen schnellen und leichten Immunassay ermöglicht, Aufsehen erregt. Bei diesem Verfahren werden die folgenden Schritte vorgenommen. Eine immobilisierte Phase, auf der eine Immunitätssubstanz, die an eine Assaytargetsubstanz in einer Testprobe binden kann, auf einem wasserabsorbierenden Grundmaterial immobilisiert ist, und eine Markierungsphase, die eine markierte Immunitätssubstanz, welche an die Assaytargetsubstanz binden kann, in einer solchen Weise umfasst, dass die markierte Immunitätssubstanz bei Kontakt mit Wasser aus dem Grundmaterial freigesetzt werden kann, werden in speziellen Abständen angeordnet, so dass man einen Teststreifen erhält, und eine Testprobe wird von einem Ende auf der Markierungsphasenseite des Streifens her absorbiert. Dann wird eine markierte Immunitätssubstanz aus der Markierungsphase freigesetzt, an die Assaytargetsubstanz gebunden, so dass ein Komplex aus markierter Immunitätssubstanz und Assaytargetsubstanz entsteht, und dieser Komplex wird an eine immobilisierte Immunitätssubstanz an der oben genannten immobilisierten Phase gebunden. Durch Bestimmen der markierten Immunitätssubstanz, die an der immobilisierten Phase gebunden ist, kann die Assaytargetsubstanz in der Testprobe bestimmt werden.
Beispiele für den Marken, der verwendet werden soll, um die markierte Immunitätssubstanz zu erhalten, sind kolloidales Metallteilchen, Enzym, fluoreszentes Material, phosphoreszentes Material, Farbmaterial und wasserdispergierbare Polymerteilchen, die an Enzym, fluoreszentes Material, phosphoreszentes Material, Farbmaterial und dergleichen gebunden sind oder ein solches enthalten. Insbesondere eine markierte Immunitätssubstanz, bei der wasserdispergierbare Polymerteilchen, die mit einem fluorophosphoreszenten Material, Farbmaterial (z. B. Farbstoff und Pigment) und dergleichen gefärbt sind, durch physikalische Adsorption an eine Immunitätssubstanz gebunden sind, und eine markierte Immunitätssubstanz, die durch Bindung von kolloidalen Goldteilchen an eine Immunitätssubstanz erhalten wird, werden aufgrund einer hohen Bestimmungsempfindlichkeit und leichten Verwendbarkeit verbreitet verwendet.
In der vorliegenden Erfindung wird ein Immunitätschromatographie-Verfahren verwendet, um durch O157 repräsentiertes Verotoxin-erzeugendes Escherichia coli, das heutzutage große Besorgnis erregt, Verotoxin und mit Darmblutung assoziiertes Humanhämoglobin nachzuweisen, und es wird ein Immunassayverfahren bereitgestellt, das einen leichten, schnellen, hochgradig genauen und gleichzeitigen Nachweis dieser Assaytargetsubstanzen erlaubt.
Kurzbeschreibung der Erfindung
Gemäß der vorliegenden Erfindung hat sich gezeigt, dass bei einem herkömmlichen Immunitätschromatographie-Verfahren die Verwendung eines markierten Antikörpers, wobei ein zweiter Antikörper, der an die Assaytargetsubstanzen binden kann, mit farbigen Teilchen markiert wurde, und einer immobilisierten Phase, die wenigstens zwei erste Antikörper umfasst, die zur spezifischen Bindung mit wenigstens zwei Arten von Assaytargetsubstanzen befähigt sind, welche aus in einer Testprobe enthaltenem Verotoxin-erzeugendem Escherichia coli, Verotoxin und Human-Hämoglobin ausgewählt sind, wobei die ersten Antikörper an verschiedenen Stellen auf einem wasserabsorbierenden Grundmaterial immobilisiert sind, den gleichzeitigen Nachweis von mehreren Assaytargetsubstanzen in einer Testprobe ermöglicht.
Die vorliegende Erfindung stellt also folgendes bereit.

(1) Ein Immunassayverfahren, das folgendes umfasst: das In-Kontakt-Bringen einer immobilisierten Phase, die an verschiedenen Stellen auf einem wasserabsorbierenden Grundmaterial wenigstens zwei erste Antikörper umfasst, die zur spezifischen Bindung mit wenigstens zwei Arten von Assaytargetsubstanzen befähigt sind, welche aus in einer Testprobe enthaltenem Verotoxinerzeugendem Escherichia coli, Verotoxin und Human-Hämoglobin ausgewählt sind, mit einer Testprobe und einer markierte Antikörper enthaltenden Flüssigkeit, die jeweils einen zweiten Antikörper umfassen, der mit farbigen Teilchen markiert ist und zur Bindung mit der Assaytargetsubstanz befähigt ist, so dass ein Komplex aus Assaytargetsubstanz und markiertem Antikörper entsteht und der Komplex an die jeweiligen ersten Antikörper an der immobilisierten Phase bindet.
(2) Das Immunassayverfahren gemäß dem obigen Punkt (1), wobei der Kontakt hergestellt wird, indem man ein Gemisch aus der Testprobe und der Flüssigkeit so fließen lässt, dass es von einem Ende des wasserabsorbierenden Grundmaterials her absorbiert wird, wodurch der Komplex an den ersten Antikörper bindet.
(3) Das Immunassayverfahren gemäß dem obigen Punkt (1), wobei der Kontakt hergestellt wird, indem man die Testprobe so fließen lässt, dass sie von einem Ende des wasserabsorbierenden Grundmaterials her absorbiert wird, wodurch die Assaytargetsubstanz an den ersten Antikörper bindet, und dann die Flüssigkeit so fließen lässt, dass sie vom Grundmaterial absorbiert werden kann, wodurch der markierte Antikörper an die Assaytargetsubstanz bindet.
(4) Das Immunassayverfahren gemäß dem obigen Punkt (1), wobei der Kontakt hergestellt wird, indem man die Testprobe bis auf halbem Weg zur immobilisierten Phase absorbieren lässt, wobei man die Flüssigkeit von einem Ende des wasserabsorbierenden Grundmaterials her absorbieren lässt, wodurch ein Komplex aus dem markierten Antikörper und der Assaytargetsubstanz entsteht, und der Komplex an den ersten Antikörper an der immobilisierten Phase bindet.
(5) Das Immunassayverfahren gemäß dem obigen Punkt (1), wobei der Kontakt hergestellt wird, indem man eine Markierungsphase an einer Stelle auf halbem Weg zur immobilisierten Phase bildet, wobei die Markierungsphase den markierten Antikörper in einer solchen Weise umfasst, dass der markierte Antikörper bei Kontakt mit Wasser vom Grundmaterial freigesetzt werden kann, die Testprobe von einem Ende des wasserabsorbierenden Grundmaterials her absorbieren lässt, wodurch ein Komplex aus dem markierten Antikörper und der Assaytargetsubstanz entsteht, und der Komplex an den ersten Antikörper an der immobilisierten Phase bindet.
(6) Eine Immunassayvorrichtung, die folgendes umfasst: eine immobilisierte Phase, welche mehrere erste Antikörper umfasst, die jeweils zur spezifischen Bindung mit einer Assaytargetsubstanz befähigt sind, die auf einem wasserabsorbierenden Grundmaterial immobilisiert ist, und eine Markierungsphase, die einen markierten zweiten Antikörper, der mit farbigen Teilchen markiert ist und zur Bindung mit der Assaytargetsubstanz befähigt ist, in einer solchen Weise umfasst, dass der markierte Antikörper bei Kontakt mit Wasser vom Grundmaterial freigesetzt werden kann, wobei die immobilisierte Phase wenigstens zwei erste Antikörper umfasst, die zur spezifischen Bindung mit wenigstens zwei Arten von Assaytargetsubstanzen befähigt sind, welche aus in einer Testprobe enthaltenem Verotoxin-erzeugendem Escherichia coli, Verotoxin und Human-Hämoglobin ausgewählt sind, wobei die ersten Antikörper an verschiedenen Stellen auf dem Grundmaterial immobilisiert sind.
(7) Ein Immunassay-Kit, der folgendes umfasst: eine immobilisierte Phase, welche auf einem wasserabsorbierenden Grundmaterial mehrere immobilisierte erste Antikörper umfasst, die jeweils zur spezifischen Bindung mit einer Assaytargetsubstanz befähigt sind, und eine markierte Antikörper enthaltende Flüssigkeit, die jeweils einen zweiten Antikörper umfassen, der mit farbigen Teilchen markiert ist und zur Bindung mit der Assaytargetsubstanz befähigt ist, wobei es sich bei der Assaytargetsubstanz um wenigstens zwei Arten von Assaytargetsubstanzen handelt, welche aus Verotoxin-erzeugendem Escherichia coli, Verotoxin und Human-Hämoglobin ausgewählt sind.

Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 ist eine Draufsicht, die schematisch eine Ausführungsform des in Beispiel 1 hergestellten Immunassaystreifens der vorliegenden Erfindung zeigt. In der Figur ist 1 ein wasserabsorbierendes Grundmaterial, 2 ist eine immobilisierte Phase und 3 ist ein Polyestervlies.
2 ist eine Querschnittsansicht entlang der Linie X-X' des Immunassaystreifens von 1. In der Figur ist 1 ein wasserabsorbierendes Grundmaterial, 2 ist eine immobilisierte Phase, 3 ist ein Polyestervlies, und 4 ist eine Polyesterfolie.
3 ist eine Draufsicht, die schematisch eine Ausführungsform des in Beispiel 4 hergestellten Immunassaystreifens der vorliegenden Erfindung zeigt. In der Figur ist 1 ein wasserabsorbierendes Grundmaterial, 2 ist eine immobilisierte Phase, 3 ist ein Polyestervlies und 5 ist eine Markierungsphase.
4 ist eine Querschnittsansicht entlang der Linie X-X' des Immunassaystreifens von 3. In der Figur ist 1 ein wasserabsorbierendes Grundmaterial, 2 ist eine immobilisierte Phase, 3 ist ein Polyestervlies, 4 ist eine Polyesterfolie und 5 ist eine Markierungsphase.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Der erste Antikörper und der zweite Antikörper in der vorliegenden Erfindung sind Antikörper, die spezifisch an Verotoxin-erzeugendes Escherichia coli (im folgenden als VTEC bezeichnet), Verotoxin (im folgenden als VT bezeichnet) oder Human-Hämoglobin (im folgenden als Hb bezeichnet) als Assaytargetsubstanz binden. Der erste Antikörper und der zweite Antikörper binden an dieselbe Assaytargetsubstanz. Gemäß der vorliegenden Erfindung, bei der eine gleichzeitige Bestimmung von zwei oder mehr Assaytargetsubstanzen erreicht werden kann, können mehrere erste Antikörper und zweite Antikörper verwendet werden. Sie binden spezifisch an wenigstens zwei Arten von Assaytargetsubstanzen von den oben genannten Assaytargetsubstanzen. Der Antikörper kann bekannt sein und kann je nach der zu bestimmenden Assaytargetsubstanz derjenige sein, der im Sandwichassayverfahren verwendet wird. Der erste Antikörper, der unter Bildung einer immobilisierten Phase immobilisiert werden soll, und der zweite Antikörper, der als markierter Antikörper verwendet werden soll, können dieselben sein, oder zwei Arten von Antikörpern, die verschiedene Epitope erkennen, können verwendet werden, obwohl sie je nach der Art des zu verwendenden Antikörpers und der Assaytargets variiert werden können. Als Antikörper kann ein monoklonaler Antikörper und ein polyklonaler Antikörper verwendet werden. Wenn einer der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist, ist der andere Antikörper einer, der ein anderes Epitop erkennt als das Epitop, das der monoklonale Antikörper erkennt.
In der vorliegenden Erfindung kann das nachzuweisende VTEC überdies zu verschiedenen Serumgruppen gehören, und Beispiele dafür sind VTECs der Serumgruppen O157, 026, O111, O18, O114, O115, O128 und O145. Einschließlich des H-Antigens in der Proteinstruktureinheit der Geißeln werden sie als O157:H7, O157:H-, 026:H11, O26:H-, 0111:H-, 018:H-, O114:H-, 0115:H19, 0128:H2 und 0145:H- bezeichnet. Von diesen sind die Serumgruppen von VTEC, die in der vorliegenden Erfindung effektiv verwendet werden, O157, O26 und O111, insbesondere O157:H7, O157:H-, O26:H11, O26:H- und O111:H-. VT umfasst im Falle des Menschen VT-1 und VT-2 mit verschiedenen physikalisch-chemischen Eigenschaften und immunologischen Eigenschaften. In der vorliegenden Erfindung können diese zwei Arten von Verotoxinen gleichzeitig nachgewiesen werden.
Das in der vorliegenden Erfindung zu verwendende wasserabsorbierende Grundmaterial kann eine Testprobe absorbieren, die eine Assaytargetsubstanz enthält, wie eine Lösung, die aus Nahrungsmitteln extrahiert wurde, und Kulturüberstand sowie eine Kotsuspension (gelöst). Alternativ dazu können auch ein Grundmaterial, das mit einem Puffer verdünnte Lösungen der oben genannten absorbieren kann, und eine Flüssigkeit, die einen markierten Antikörper enthält, verwendet werden. Diese unterliegen keiner Einschränkung, solange sie die oben genannten Testproben absorbieren können. In der vorliegenden Erfindung wird ein wasserabsorbierendes Grundmaterial verwendet, um Zeit für eine ausreichende Reaktion zwischen der Assaytargetsubstanz in einer Testprobe und dem markierten Antikörper oder dem ersten Antikörper auf der immobilisierten Phase zu sichern. Wenn das wasserabsorbierende Grundmaterial eine schlechtere Wasserabsorption zeigt, wird die Zeit, die eine Assaytargetsubstanz benötigt, um eine immobilisierte Phase zu erreichen, oder wenn eine Markierungsphase eingesetzt wird, um diese Markierungsphase zu erreichen, länger, und ein schneller Assay ist nicht erreichbar.
Wenn das wasserabsorbierende Grundmaterial andererseits eine zu hohe Wasserabsorption zeigt, kann die notwendige Zeit für eine ausreichende Reaktion einer Assaytargetsubstanz in einer Testprobe mit einem markierten Antikörper oder einem ersten Antikörper auf der immobilisierten Phase nicht gewährleistet werden, so dass ein genauer Assay unerreichbar wird. Zu den bevorzugten Beispielen für das Grundmaterial gehören Vlies, Filterpapier, Glasfasergewebe, Glasfilter, Nitrocellulosefilter und poröses Material. Diese Grundmaterialien haben eine geeignete Wasserabsorptionsgeschwindigkeit und erlauben eine leichte visuelle Bestätigung, wenn farbige Teilchen binden und somit eine Farbe entwickeln.
Im Hinblick darauf wird die Wasserabsorption des wasserabsorbierenden Grundmaterials in der vorliegenden Erfindung vorzugsweise durch 0,5–5 cm der Länge des Teils der Wasserabsorption demonstriert, wenn man ein Ende eines 5 mm breiten rechteckigen wasserabsorbierenden Grundmaterials in Wasser eintaucht und den Streifen eine Minute lang dort belässt.
Zur Einstellung der Wasserabsorption eines Grundmaterials kann die Oberfläche des Grundmaterials mit einem hydrophilen Polymer oder Tensid bedeckt oder darin eingetaucht werden. Außerdem kann das wasserabsorbierende Grundmaterial aus einem einzigen Material hergestellt werden, oder ein kontinuierliches Grundmaterial, das man erhält, indem man heterogene Materialien mit einem wahlfreien Klebemittel miteinander verbindet, kann verwendet werden.
In der vorliegenden Erfindung unterliegt die Form des wasserabsorbierenden Grundmaterials keiner besonderen Einschränkung, solange eine Assaytargetsubstanz entwickelt werden kann. Zum Beispiel kann vorzugsweise eine rechteckige Platte (Streifen) oder ein stäbchenförmiges Grundmaterial verwendet werden.
In der vorliegenden Erfindung bedeutet "immobilisierte Phase" den Bereich, wo ein erster Antikörper, der eine Assaytargetsubstanz binden kann, auf einem wasserabsorbierenden Grundmaterial immobilisiert ist. Das Verfahren zum Immobilisieren des ersten Antikörpers (Herstellungsverfahren der immobilisierten Phase) auf einem wasserabsorbierenden Grundmaterial unterliegt keiner besonderen Einschränkung. Ein herkömmlicherweise bekanntes physikalisches Verfahren und ein Verfahren der kovalenten Bindung sind geeignet. Insbesondere ist das Verfahren der kovalenten Bindung zu bevorzugen, wobei der Antikörper kaum von dem Grundmaterial freigesetzt wird. Wenn das wasserabsorbierende Grundmaterial keine funktionelle Gruppe für das oben genannte Verfahren der kovalenten Bindung aufweist, wird ein Grundmaterial unter Verwendung eines Polymers mit einer geeigneten funktionellen Gruppe hergestellt und in einem Ausmaß an dem wasserabsorbierenden Grundmaterial befestigt, dass die Wasserabsorptionseigenschaft nicht beeinträchtigt wird. Alternativ dazu wird eine Lösung, die einen ersten Antikörper und ein hydrophiles Polymer enthält, auf ein wasserabsorbierendes Grundmaterial aufgetragen, und dieses wird dann in ein Koagulanslösungsmittel eingetaucht, um das oben genannte hydrophile Polymer zu koagulieren, wodurch eine immobilisierte Phase hergestellt werden kann. Beispiele für das hydrophile Polymer sind Hydroxypropylmethylcellulose, Polyvinylalkohol und Hydroxyethylcellulose. Beispiele für das Koagulanslösungsmittel sind Aceton, Ethanol, Methanol und Ether.
Die zu immobilisierende Menge der ersten Immunitätssubstanz variiert je nach der Art und Eigenschaft der zu verwendenden Immunitätssubstanz. Allgemein gesagt, ein Antikörper gegen VTEC wird in einer Menge von 0,001–0,5 mg/cm² aufgetragen, ein Antikörper gegen VT wird in einer Menge von 0,01–1 mg/cm² aufgetragen, und ein Antikörper gegen Hb wird in einer Menge von 0,01– 1 mg/cm² aufgetragen.
Die immobilisierte Phase in der vorliegenden Erfindung umfasst wenigstens zwei erste Antikörper, die an verschiedenen Stellen auf dem wasserabsorbierenden Grundmaterial immobilisiert sind. Um die zweiten Antikörper, die mit farbigen Teilchen markiert sind (markierten Antikörper) und die durch die später zu erwähnende Flüssigabsorption gewandert sind, auf der immobilisierten Phase einzufangen und um die Farbentwicklung jeder Assaytargetsubstanz zu ermöglichen, werden die ersten Antikörper vorzugsweise in einem Abstand von nicht weniger als 1 mm, vorzugsweise 5 mm, auf dem wasserabsorbierenden Grundmaterial immobilisiert, so dass die entwickelten Farben sich nicht mit der benachbarten Farbe vermischen.
Der markierte Antikörper in der vorliegenden Endung umfasst farbige Teilchen, die einen zweiten Antikörper markieren, der eine Assaytargetsubstanz binden kann. Die farbigen Teilchen können beliebige sein, solange sie visuell wahrnehmbar sind. Beispiele dafür sind kolloidale Teilchen von Metallen, wie Gold, Silber und Kupfer, Pigmente, wie etwa Sudanblau, Sudanrot IV, Sudan III, Ölorange und Chinizaringrün, sowie farbiger Latex, wobei der Latex mit Farbstoff gefärbt wurde. Unter dem Aspekt der visuellen Beobachtung werden vorzugsweise Goldkolloid und farbiger Latex in Blau und Rot, Grün oder Orange verwendet, wobei farbigem Latex, der aus blau oder rot gefärbten wasserdispergierbaren Polymerteilchen hergestellt wird, im Hinblick auf die Wasserdispergierbarkeit, Dispersionsstabilität und leichte Einstellung der Nachweisempfindlichkeit für die Assaytargetsubstanz besonderer Vorzug gegeben wird.
Die Größe der oben genannten farbigen Teilchen wird im Hinblick auf die Lagerstabilität und leichte Herstellung so eingestellt, dass sie in den Bereich von 0,01–3 μm, vorzugsweise 0,05–0,5 μm, fällt. Wenn die Teilchengröße zu gering ist, ist der Grad der Färbung pro Teilchen ebenfalls gering, so dass die visuelle Beobachtung aufgrund der geringen Farbentwicklung bei der Bindung mit der immobilisierten Phase schwierig wird. Wenn die Größe zu groß ist, kann eine geringfügige Agglomeration von farbigen Teilchen eine Verstopfung des wasserabsorbierenden Grundmaterials verursachen, was wiederum zu einer verschlechterten Wasserabsorption und einer unspezifischen Farbentwicklung führen kann.
Die farbigen Teilchen können nach einem herkömmlicherweise bekannten Verfahren, wie einem Verfahren der kovalenten Bindung, physikalischen Adsorptionsverfahren und Verfahren der ionischen Bindung an den zweiten Antikörper gebunden werden. Im Hinblick auf die fehlende Freisetzung von Immunitätssubstanz nach der Bindung und die überlegene Stabilität wird vorzugsweise ein Verfahren der kovalenten Bindung eingesetzt. Für den Nachweis von mehreren Assaytargetsubstanzen in einer Testprobe werden die entsprechenden mehreren Antikörper in der vorliegenden Erfindung an verschiedene Arten von farbigen Teilchen gebunden. Die zu diesem Zweck verwendeten farbigen Teilchen können dieselbe Farbe oder verschiedene Farben haben.
In der vorliegenden Erfindung wird der markierte Antikörper in einem Puffer dispergiert, was eine Flüssigkeit ergibt, die von einem Ende des wasserabsorbierenden Grundmaterials, das eine immobilisierte Phase aufweist, her absorbiert wird. Alternativ dazu kann er auch in dem wasserabsorbierenden Grundmaterial enthalten sein, so dass bei Kontakt mit Wasser ein markierter Antikörper aus dem wasserabsorbierenden Grundmaterial freigesetzt werden kann, wenn der markierte Antikörper mit der Testprobe in Kontakt tritt. In der vorliegenden Erfindung bezieht sich "Markierungsphase" auf einen Bereich, wo der markierte Antikörper in einer solchen Weise enthalten ist, dass seine Freisetzung vom Grundmaterial bei Kontakt mit Wasser ermöglicht wird.
Der Puffer, in dem der markierte Antikörper dispergiert ist, hat einen pH-Wert und eine Salzkonzentration, die die Antigen-Antikörper-Reaktion nicht hemmen. Die Konzentration des markierten Antikörpers während des Nachweises beträgt 0,005–5%, vorzugsweise 0,01–0,5%. Wenn die Konzentration zu gering ist, nehmen die an die immobilisierte Phase gebundenen Teilchen zahlenmäßig ab, was somit zu einer schlechten Farbentwicklung führt. Wenn sie zu groß ist, tritt nicht nur ein ökonomisches Problem, sondern auch eine obskure Farbentwicklung der immobilisierten Phase auf, die dadurch verursacht wird, dass überschüssige farbige Teilchen in einem anderen Bereich als der immobilisierten Phase verbleiben. Im folgenden wird die Flüssigkeit, die einen markierten Antikörper enthält, auch als markierte Antikörperflüssigkeit bezeichnet.
Der markierte Antikörper wird zum Beispiel dadurch in das wasserabsorbierende Grundmaterial eingebracht (Herstellung einer Markierungsphase), dass man eine Lösung, die einen markierten Antikörper enthält, auf ein wasserabsorbierendes Grundmaterial aufträgt und unter geeigneten Bedingungen trocknet. Die Lösung kann durch Lyophilisierung getrocknet werden. Ein anderes Verfahren umfasst das Dispergieren eines markierten Antikörpers in einem wasserlöslichen Polymer oder einer Saccharoselösung, das Auftragen dieser Dispersionsflüssigkeit auf ein wasserabsorbierendes Grundmaterial und Trocknen. Dieses Verfahren ist für die Herstellung des Immunassaystreifens der vorliegenden Erfindung vorteilhaft. Mit einer Testprobe in Kontakt gebracht, löst sich ein wasserlösliches Polymer oder Saccharose leicht in Wasser auf, und der markierte Antikörper wird schnell von dem Grundmaterial freigesetzt und reagiert mit der Assaytargetsubstanz. Durch Einstellen der Konzentration des wasserlöslichen Polymers oder der Saccharose kann eine Lösung mit einer geeigneten Viskosität erhalten werden, so dass ein markierter Antikörper in einem speziellen Bereich des wasserabsorbierenden Grundmaterials enthalten sein kann und der markierte Antikörper frei von Koagulation oder Verformung beim Trocknen ist. Nach dem Trocknen wird der markierte Antikörper überdies kaum aus dem wasserabsorbierenden Grundmaterial freigesetzt.
Beispiele für das in der oben genannten Weise zu verwendende wasserlösliche Polymer sind Polyvinylpyrrolidon, Polyvinylalkohol, Polyethylenglycol, Celluloseether (z. B. Methylcellulose, Ethylcellulose, Carboxymethylcellulose, Carboxyethylcellulose, Oxyethylcellulose, Cyanethylcellulose), Gelatine.
In der vorliegenden Erfindung beträgt der Abstand zwischen der oben genannten immobilisierten Phase und dem Teil, wo die Absorption der Testprobe und/oder der Flüssigkeit, die markierten Antikörper enthält, eingeleitet wird (im folgenden als Flüssigkeitsabsorptionsteil bezeichnet), oder wenn ein Immunassaystreifen mit einer Markierungsphase verwendet wird, der Abstand zwischen der immobilisierten Phase und der Markierungsphase 1–6 cm, vorzugsweise 3–4 cm. Wenn der Abstand zu groß ist, erreicht die Assaytargetsubstanz möglicherweise nicht die immobilisierte Phase, oder die Farbentwicklung wird zu intensiv, oder der Assay dauert zu lang. Wenn der Abstand umgekehrt zu kurz ist, wird die Farbentwicklung an der immobilisierten Phase unbeständig oder zu gering.
Die Menge des markierten Antikörpers, der in der Markierungsphase aufgetragen werden soll, unterliegt keiner besonderen Einschränkung, solange sie ausreichend ist, um die Konzentration des markierten Antikörpers während des Nachweises zu erreichen. Die Menge beträgt 0,005–5 mg/cm² im Gewicht eines Latexfestkörpers.
Der Flüssigkeitsabsorptionsteil unterliegt keiner besonderen Einschränkung, solange er die Übertragung der Testprobe oder einer Flüssigkeit, die einen markierten Antikörper enthält, zum wasserabsorbierenden Grundmaterial nicht verhindert. Es kann sich um dasselbe Grundmaterial oder um ein Laminat aus Vliesstoff und Gewebe, die an dem wasserabsorbierenden Grundmaterial befestigt sind, handeln.
In der vorliegenden Erfindung werden außerdem eine immobilisierte Phase, auf der der erste Antikörper immobilisiert ist, und ein wasserabsorbierendes Grundmaterial, das einen Flüssigkeitsabsorptionsteil aufweist, als Immunassayvorrichtung der vorliegenden Erfindung bezeichnet. Die Form der Immunassayvorrich tung der vorliegenden Erfindung unterliegt keiner Einschränkung und kann zum Beispiel eine Platte, ein Streifen oder ein Stäbchen sein. Diese Immunassayvorrichtung kann eine immobilisierte Phase, einen Flüssigkeitsabsorptionsteil und eine Markierungsphase enthalten.
Das erfindungsgemäße Immunassayverfahren umfasst die folgenden Verfahren. In einem ersten Verfahren werden eine Testprobe, die einem Assay unterzogen werden soll, und eine markierte Antikörperflüssigkeit miteinander gemischt. Zu diesem Zeitpunkt werden mehrere Assaytargetsubstanzen (VTEC, VT, Hb) in der Testprobe jeweils an den markierten Antikörper gebunden, so dass jeweils ein Komplex aus markiertem Antikörper und Assaytargetsubstanz entsteht [markierter Antikörper (farbiges Teilchen – zweiter Antikörper) – Assaytargetsubstanz]. Dann wird ein Gemisch aus der Testprobe und der markierten Antikörperflüssigkeit von einem Ende des wasserabsorbierenden Grundmaterials, das eine immobilisierte Phase aufweist, her absorbiert. Der in dem Gemisch gebildete Komplex bewegt sich zusammen mit der Bewegung der Flüssigkeit durch das wasserabsorbierende Grundmaterial, um die immobilisierte Phase zu erreichen. An der immobilisierten Phase wird der Komplex an den ersten Antikörper gebunden, der an der immobilisierten Phase immobilisiert ist, so dass erneut ein markierter Immunkomplex entsteht, der [markierten Antikörper (farbiges Teilchen – zweiter Antikörper) – Assaytargetsubstanz – ersten Antikörper] umfasst, wodurch der Komplex auf der immobilisierten Phase immobilisiert und an diese gebunden wird.
In einem zweiten Verfahren wird eine Testprobe allein von einem Ende des wasserabsorbierenden Grundmaterials, das eine immobilisierte Phase aufweist, her absorbiert. Jede Assaytargetsubstanz in der Testprobe wird an den ersten Antikörper auf der immobilisierten Phase gebunden (Assaytargetsubstanz – erster Antikörper). Gemäß diesem Verfahren ist die Testprobe flüssig, und wenn sie fest ist, wird sie in einem geeigneten Puffer gelöst und einer Behandlung wie Suspendieren unterzogen, so dass sie vom wasserabsorbierenden Grundmaterial absorbiert werden kann. Dann wird die markierte Antikörperflüssigkeit absorbiert, wodurch jeder markierte Antikörper einen Komplex mit der Assaytarget substanz bildet, die an die immobilisierte Phase bindet, so dass ein markierter Immunkomplex entsteht, der [markierten Antikörper (farbiges Teilchen – zweiter Antikörper) – Assaytargetsubstanz – ersten Antikörper] umfasst, wodurch der Komplex auf der immobilisierten Phase immobilisiert und an diese gebunden wird.
Gemäß einem dritten Verfahren wird eine markierte Antikörperflüssigkeit von einem Ende des wasserabsorbierenden Grundmaterials, das eine immobilisierte Phase aufweist, her absorbiert. Eine flüssige oder feste Testprobe wird auf halbem Weg zur immobilisierten Phase absorbiert oder aufgetragen. Die mehreren Assaytargetsubstanzen in der Testprobe bilden jeweils einen Komplex mit dem markierten Antikörper. Der so gebildete Komplex bewegt sich zusammen mit der Bewegung der Flüssigkeit durch das wasserabsorbierende Grundmaterial, um die immobilisierte Phase zu erreichen. An der immobilisierten Phase bindet der Komplex an den ersten Antikörper, der an der immobilisierten Phase immobilisiert ist, so dass erneut ein markierter Immunkomplex entsteht, der [markierten Antikörper (farbiges Teilchen – zweiter Antikörper) – Assaytargetsubstanz – ersten Antikörper] umfasst, wodurch der Komplex auf der immobilisierten Phase immobilisiert und an diese gebunden wird.
Wenn ein erfindungsgemäßer Immunassaystreifen, auf dem zuvor eine Markierungsphase gebildet wurde, verwendet werden soll, wird das folgende Verfahren eingesetzt. Zuerst wird eine Testprobe, die einem Assay unterzogen werden soll, von einem Ende des wasserabsorbierenden Grundmaterials, das eine immobilisierte Phase aufweist, her absorbiert. Bei diesem Verfahren ist die Testprobe ebenfalls flüssig, und wenn sie fest ist, wird sie in einem geeigneten Puffer gelöst und einer Behandlung wie Suspendieren unterzogen, so dass sie vom wasserabsorbierenden Grundmaterial absorbiert werden kann. Die Testprobe bewegt sich durch das wasserabsorbierende Grundmaterial, um die Markierungsphase zu erreichen, und setzt den markierten Antikörper aus dem Grundmaterial frei. Die in der Testprobe enthaltenen mehreren Assaytargetsubstanzen (VTEC, VT, Hb) binden an die jeweiligen markierten Antikörper, so dass jeweils ein Komplex aus dem markierten Antikörper und der Assaytargetsubstanz entsteht [markierter Antikörper (farbiges Teilchen – zweiter Antikörper) – Assaytargetsubstanz]. Dann bewegt sich der so gebildete Komplex zusammen mit der Bewegung der Flüssigkeit durch das wasserabsorbierende Grundmaterial, um die immobilisierte Phase zu erreichen. An der immobilisierten Phase bindet der Komplex an den ersten Antikörper, der an der immobilisierten Phase immobilisiert ist, so dass erneut ein markierter Immunkomplex entsteht, der [markierten Antikörper (farbiges Teilchen – zweiter Antikörper) – Assaytargetsubstanz – ersten Antikörper] umfasst, wodurch der Komplex auf der immobilisierten Phase immobilisiert und an diese gebunden wird.
Die farbigen Teilchen, die den markierten Antikörper bilden, sammeln sich aufgrund der Immobilisierung an einem Teil, wo sie kollektiv eine klare Farbentwicklung erzeugen, die eine visuelle Bestätigung der Existenz der Assaytargetsubstanz ermöglicht. Soweit die immobilisierte Phase in der vorliegenden Erfindung erste Antikörper, die mehreren Assaytargetsubstanzen entsprechen, an verschiedenen Stellen umfasst, kann die Anwesenheit von wenigstens zwei Arten von Assaytargetsubstanzen aus VTEC, VT und Hb nachgewiesen werden.
Daher ermöglicht die vorliegende Erfindung den gleichzeitigen Nachweis von VTEC und VT, die in Nahrungsmitteln vorhanden sind, oder von Hb, das mit in Kot vorhandenem VTEC und/oder VT coexistiert.
Das Immunassayverfahren der vorliegenden Erfindung wird vorteilhafterweise durch den erfindungsgemäßen Immunassaykit oder die erfindungsgemäße Immunassayvorrichtung verkörpert. Das wasserabsorbierende Grundmaterial mit einer immobilisierten Phase, auf der ein erster Antikörper, der eine Assaytargetsubstanz zu binden vermag, immobilisiert ist, und einer Flüssigkeit, die einen markierten Antikörper enthält, der an einen zweiten Antikörper gebunden ist, der mit farbigen Teilchen markiert ist und an die Assaytargetsubstanz zu binden vermag, oder der Markierungsphase, die den markierten Antikörper umfasst, die den Kit bilden, sind dieselben, wie sie oben erwähnt sind.
Wenn ein Assay unter Verwendung des erfindungsgemäßen Immunassayverfahrens, der Immunassayvorrichtung oder des Assaykits durchgeführt wird, kann vorzugsweise eine Testprobe in einer Flüssigkeit von 1–500 μl, eine Assaytargetsubstanz mit VTEC in 10²-10⁹ cfu, VT in 0,01–100 000 ng und Hb in 0,5– 500000 ng bestimmt werden, obwohl dies auch je nach der Art und Größe des zu verwendenden wasserabsorbierenden Grundmaterials und den Eigenschaften der zu verwendenden Immunitätssubstanz geändert werden kann.
Die vorliegende Erfindung wird ausführlicher anhand der folgenden Beispiele beschrieben.
Beispiel 1: Nachweis der Assaytargetsubstanz (1)
1) Herstellung von markierter Immunitätssubstanzflüssigkeit
Zu einer Dispersion (3 ml), die blau gefärbte carboxylierte Polystyrollatexteilchen enthält (Feststoffkonzentration 5 Gew.-%, mittlere Teilchengröße 0,1 μm, 0,01 M Boratpuffer, pH 8), wurden wasserlösliches Carbodiimid (1 ml, 1 mg/ml, 0,01 M Boratpuffer, pH 8) und Anti-Escherichia-coli-O157:H7-Antikörper (1 ml, Ziegen-IgG (hergestellt von Kirkegaard & Perry Laboratories Inc.); 1 mg/ml, 0,01 M Boratpuffer, pH 8) gegeben, und das Gemisch wurde 3 h lang bei 10°C umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Zentrifugation gewaschen, wobei man 0,01 M Boratpuffer (pH 8) als Waschlösung verwendete, was einen Komplex aus blau gefärbten Latexteilchen und markiertem Anti-Escherichia-coli-O157:H7-Antikörper ergab (Feststoffkonzentration 2 Gew.-%).
In derselben Weise wie oben wurden Anti-Verotoxin-1-Antikörper (Maus-IgG, 1 mg/ml) und Anti-Verotoxin-2-Antikörper (Maus-IgG, 1 mg/ml) unabhängig voneinander an eine getrennte Dispersion von grün gefärbten carboxylierten Polystyrollatexteilchen (mittlere Teilchengröße 0,1 μm) gebunden.
In derselben Weise wie oben wurde Anti-Human-Hämoglobin-Antikörper (Kaninchen-IgG (hergestellt von Nippon Bio-Test Laboratories Inc.), 5 mg/ml) an rot gefärbte carboxylierte Polystyrollatexteilchen (mittlere Teilchengröße 0,1 μm) gebunden.
Dann wurde jeder mit Latexteilchen markierte Antikörper in 0,01 M Boratpuffer (pH 8, jeweils Feststoffkonzentration 2 Gew.-%) suspendiert.
2) Herstellung einer immobilisierten Phase
Auf einer Nitrocellulosemembran (Porengröße 8 μm, 6 mm × 60 mm, entspricht 1 in den Figuren) wurde in einem Abstand von 30 mm von einem Ende (2-4 in den Figuren) Anti-Escherichia-coli-O157:H7-Antikörper (Ziegen-IgG, 1 mg/ml, 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,4) aufgetragen, im Abstand von 25 mm (2-3 in den Figuren) wurde Anti-Verotoxin-1-Antikörper (Kaninchen-IgG, 2 mg/ml) aufgetragen, im Abstand von 20 mm (2-2 in den Figuren) wurde Anti-Verotoxin-2-Antikörper (Kaninchen-IgG, 2 mg/ml) aufgetragen, und im Abstand von 15 mm (2-1 in den Figuren) wurde Anti-Human-Hämoglobin-Antikörper (Kaninchen-IgG, 1 mg/ml) aufgetragen, in einer Menge von jeweils 1,5 μl zum Ziehen einer Linie mit einer Ausgabevorrichtung.
Diese Membran wurde 10 Minuten lang in eine wässrige Lösung von Rinderserumalbumin (1 Gew.-%) und Polyoxyethylen(10)octylphenylether (Wako Pure Chemical, 0,1 Gew.-%) eingetaucht und 2 h lang bei 40°C getrocknet.
Dann wurde eine Polyesterfolie (90 μm dick, entspricht 4 in den Figuren) mit einem Sprühleim auf die Rückseite dieser Membran (Seite gegenüber der Oberfläche, auf die Antikörper aufgetragen wurde) geklebt.
In einem Abstand von 0–8 mm vom gegenüberliegenden Ende bezüglich der Auftragung der Antikörper wurde ein Polyestervlies (6 mm × 8 mm, Dicke 2,5 mm, entspricht 3 in den Figuren) aufgeklebt, was den erfindungsgemäßen Immunassaystreifen ergab.
3) Assay
Eine Testprobe wurde hergestellt, die 0,1 M Phosphatpuffer (der NaCl (0,9 Gew.-%) enthielt, pH 7,4) und Escherichia coli O157:H7, Verotoxin Typ 1, Verotoxin Typ 2 und Human-Hämoglobin umfasste, die in den Konzentrationen, die in den Tabellen 1–3 gezeigt sind, darin dispergiert waren.
Diese Testprobe wurde mit den oben in 1) hergestellten Suspensionen von mit farbigem Latex markiertem Antikörper (markierte Immunitätssubstanz) bis zu einer Feststoffkonzentration von jeweils 0,02 Gew.-% gemischt. Nach dem Mischen und Rühren wurde die gemischte Lösung (60 μl) tropfenweise zu dem oben in 2) hergestellten Teststreifen aus Polyestervlies gegeben, und die Anwesenheit oder Abwesenheit einer Farbentwicklung in 20 Minuten wurde visuell beobachtet.
Die Tabellen 1–3 zeigen die Assayergebnisse, wenn jede Assaytargetsubstanz allein oder in Kombination in der Testprobe verwendet wurde. Das verwendete Escherichia coli O157:H7 erzeugte kein Verotoxin, so dass die Assayergebnisse einer gemischten Testprobe nicht beeinflusst wurden. In jeder Tabelle waren die Bewertungskriterien wie folgt.

+: linienartige Farbentwicklung auf der immobilisierten Phase gefunden
–: keine linienartige Farbentwicklung auf der immobilisierten Phase gefunden

Tabelle 1
Tabelle 2
Tabelle 3
Beispiel 2: Nachweis der Assaytargetsubstanz (2)
In derselben Weise wie in Beispiel 1 wurden die Testproben (60 μl), die so hergestellt wurden, dass sie die in den Tabellen 4–6 gezeigten Konzentrationen haben, tropfenweise zu dem Polyestervliesteil des in Beispiel 1, 2) hergestellten Teststreifens gegeben und zur immobilisierten Phase entwickelt. Dann wurde 0,1 M Phosphatpuffer (der NaCl (0,9 Gew.-%) enthielt, pH 7,4) hinzugefügt, um die feste Komponente jeder markierten Immunitätssubstanz auf eine Konzentration von 0,02 Gew.-% zu verdünnen. Die erhaltene markierte Immunitätssubstanzflüssigkeit (60 μl) wurde tropfenweise zu dem Polyestervliesteil der oben genannten Teststreifen gegeben, und die Anwesenheit oder Abwesenheit der Farbentwicklung an der immobilisierten Phase wurde 20 Minuten später visuell beobachtet.
Die Tabellen 4–6 zeigen die Assayergebnisse, als jede Assaytargetsubstanz allein oder in Kombination in der Testprobe verwendet wurde.
Tabelle 4
Tabelle 5
Tabelle 6
Beispiel 3: Nachweis der Assaytargetsubstanz (3)
In derselben Weise wie in Beispiel 1 wurden die Testproben (2 μl), die so hergestellt wurden, dass sie die in den Tabellen 7–9 gezeigten Konzentrationen haben, auf der Oberflächenseite des in Beispiel 1, 2) hergestellten Immunassaystreifens in einem Abstand von 12–20 mm von dem Ende, das dem Teil, wo der Antikörper aufgetragen wurde, entgegengesetzt war, absorbiert (immobilisierte Phase). Dann wurde 0,1 M Phosphatpuffer (der NaCl (0,9 Gew.-%) enthielt, pH 7,4) hinzugefügt, um die feste Komponente jeder markierten Immunitätssubstanz auf eine Konzentration von 0,02 Gew.-% zu verdünnen. Die beim Mischen erhaltene markierte Immunitätssubstanzflüssigkeit (60 μl) wurde tropfenweise zu dem Polyestervliesteil der oben genannten Teststreifen gegeben, und die Anwesenheit oder Abwesenheit der Farbentwicklung an der immobilisierten Phase wurde 20 Minuten später visuell beobachtet.
Die Tabellen 7–9 zeigen die Assayergebnisse, als jede Assaytargetsubstanz allein oder in Kombination in der Testprobe verwendet wurde.
Tabelle 7
Tabelle 8
Tabelle 9
Beispiel 4: Nachweis der Assaytargetsubstanz (4)
1) Herstellung eines Immunassaystreifens
Die in Beispiel 1, 1) hergestellte Dispersion des mit blau gefärbten Latexteilchen markierten Anti-Escherichia-coli-O157:H7-Antikörpers (1 ml, Feststoffkonzentration 2 Gew.-%), eine Dispersion des mit grün gefärbten Latexteilchen markierten Anti-Verotoxin-1-Antikörpers (1 ml, Feststoffkonzentration 2 Gew.-%), eine Dispersion des mit grün gefärbten Latexteilchen markierten Anti-Verotoxin-2-Antikörpers (1 ml, Feststoffkonzentration 2 Gew.-%), eine Dispersion des mit rot gefärbten Latexteilchen markierten Anti-Human-Hämoglobin-Antikörpers (1 ml, Feststoffkonzentration 2 Gew.-%) und eine wässrige Lösung von Saccharose (6 ml, 20 Gew.-%) wurden miteinander gemischt, und ein Rayonvlies (6 mm × 8 mm) wurde mit diesem Gemisch (10 μl) imprägniert und 2 h lang bei 40°C getrocknet.
Diese vlieshaltigen, mit farbigen Latexteilchen markierten Antikörper wurden auf die Vorderfläche der in Beispiel 1, 2) hergestellten Membran mit der immobilisierten Phase geklebt, wobei eine Polyesterfolie (90 μm dick) wie in Beispiel 1 in einem Abstand von 12–20 mm von dem der immobilisierten Phase entgegenge setzten Ende auf die Rückseite geklebt wurde (die der Seite des Auftragens der Antikörper entgegengesetzte Seite). Außerdem wurde ein Polyestervlies (6 mm × 8 mm, Dicke 2,5 mm, entspricht 3 in den Figuren) in einem Abstand von 0– 8 mm daraufgeklebt, was den Immunassaystreifen der vorliegenden Erfindung ergab.
2) Assay
Escherichia coli O157:H7, Verotoxin Typ 1, Verotoxin Typ 2 und Human-Hämoglobin wurden in 0,1 M Phosphatpuffer (der NaCl (0,9 Gew.-%) enthielt, pH 7,4) auf die in den Tabellen 10–14 gezeigten Konzentrationen dispergiert, was Testproben ergab.
Die erhaltene Testprobe (60 μl) wurde tropfenweise zu dem Polyestervliesteil der oben genannten Teststreifen gegeben, und die Anwesenheit oder Abwesenheit einer Farbentwicklung auf der immobilisierten Phase wurde 20 Minuten später visuell beobachtet.
Die Tabellen 10–13 zeigen die Assayergebnisse, als jede Assaytargetsubstanz allein oder in Kombination in der Testprobe verwendet wurde. Tabelle 14 zeigt die Assayergebnisse, als jede Testprobe gemischt und dem Assay unterzogen wurde.
Das verwendete Escherichia coli O157:H7 erzeugte kein Verotoxin, so dass die Assayergebnisse einer gemischten Testprobe nicht beeinflusst wurden. In jeder Tabelle waren die Bewertungskriterien wie in Beispiel 1.
Tabelle 10 Testprobe mit E. coli O157:H7 allein
Tabelle 11 Testprobe mit Verotoxin 1 allein
Tabelle 12 Testprobe mit Verotoxin 2 allein
Tabelle 13 Testprobe mit Human-Hämoglobin allein
Tabelle 14 Testprobengemisch der Assaytargetsubstanz
Wie aus den obigen Ergebnissen hervorgeht, ermöglichen das Immunassayverfahren, die Immunassayvorrichtung und der Immunassaykit der vorliegenden Erfindung eine leichte und gleichzeitige Analyse von O157 (VTEC), VT und Hb in einer Testprobe, und sie ermöglichen den Nachweis mit Präzision auf demselben Niveau wie die individuelle Analyse. Sofern die Analyse von einer Farbentwicklung abhängt, ergibt die visuelle Beobachtung eine qualitative oder halbqualitative Analyse. Bei Verwendung einer optischen Vorrichtung wird eine quantitative Analyse möglich.
Diese Anmeldung beruht auf der in Japan eingereichten Anmeldung Nr. 213177/1997.

Claims

Immunassayverfahren, umfassend das In-Kontakt-Bringen einer immobilisierten Phase, die an verschiedenen Stellen auf einem wasserabsorbierenden Grundmaterial wenigstens zwei erste Antikörper umfasst, die zur spezifischen Bindung mit wenigstens zwei Arten von Assaytargetsubstanzen befähigt sind, welche aus in einer Testprobe enthaltenem Verotoxin-erzeugendem Escherichia coli, Verotoxin und Human-Hämoglobin ausgewählt sind; mit einer Testprobe und einer markierte Antikörper enthaltenden Flüssigkeit, die jeweils einen zweiten Antikörper umfassen, der mit farbigen Teilchen markiert ist und zur Bindung mit der Assaytargetsubstanz befähigt ist; so dass ein Komplex aus Assaytargetsubstanz und markiertem Antikörper entsteht und der Komplex an die jeweiligen ersten Antikörper an der immobilisierten Phase bindet.
Immunassayverfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Kontakt hergestellt wird, indem man ein Gemisch aus der Testprobe und der Flüssigkeit so fließen lässt, dass es von einem Ende des wasserabsorbierenden Grundmaterials her absorbiert wird, wodurch der Komplex an den ersten Antikörper bindet.
Immunassayverfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Kontakt hergestellt wird, indem man die Testprobe so fließen lässt, dass sie von einem Ende des wasserabsorbierenden Grundmaterials her absorbiert wird, wodurch die Assaytargetsubstanz an den ersten Antikörper bindet, und dann die Flüssigkeit so fließen lässt, dass sie vom Grundmaterial absorbiert werden kann, wodurch der markierte Antikörper an die Assaytargetsubstanz bindet.
Immunassayverfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Kontakt hergestellt wird, indem man die Testprobe bis auf halbem Weg zur immobilisierten Phase absorbieren lässt, wobei man die Flüssigkeit von einem Ende des wasserabsorbierenden Grundmaterials her absorbieren lässt, wodurch ein Komplex aus dem markierten Antikörper und der Assaytargetsubstanz entsteht, und der Komplex an den ersten Antikörper an der immobilisierten Phase bindet.
Immunassayverfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Kontakt hergestellt wird, indem man eine Markierungsphase an einer Stelle auf halbem Weg zur immobilisierten Phase bildet, wobei die Markierungsphase den markierten Antikörper in einer solchen Weise umfasst, dass der markierte Antikörper bei Kontakt mit Wasser vom Grundmaterial freigesetzt werden kann, die Testprobe von einem Ende des wasserabsorbierenden Grundmaterials her absorbieren lässt, wodurch ein Komplex aus dem markierten Antikörper und der Assaytargetsubstanz entsteht, und der Komplex an den ersten Antikörper an der immobilisierten Phase bindet.
Immunassayvorrichtung, umfassend eine immobilisierte Phase, welche mehrere erste Antikörper umfasst, die jeweils zur spezifischen Bindung mit einer Assaytargetsubstanz befähigt sind, die auf einem wasserabsorbierenden Grundmaterial immobilisiert ist, und eine Markierungsphase, die einen markierten zweiten Antikörper, der mit farbigen Teilchen markiert ist und zur Bindung mit der Assaytargetsubstanz befähigt ist, in einer solchen Weise umfasst, dass der markierte Antikörper bei Kontakt mit Was ser vom Grundmaterial freigesetzt werden kann, wobei die immobilisierte Phase wenigstens zwei erste Antikörper umfasst, die zur spezifischen Bindung mit wenigstens zwei Arten von Assaytargetsubstanzen befähigt sind, welche aus in einer Testprobe enthaltenem Verotoxin-erzeugendem Escherichia coli, Verotoxin und Human-Hämoglobin ausgewählt sind, wobei die ersten Antikörper an verschiedenen Stellen auf dem Grundmaterial immobilisiert sind.
Immunassay-Kit, umfassend eine immobilisierte Phase, welche auf einem wasserabsorbierenden Grundmaterial mehrere immobilisierte erste Antikörper umfasst, die jeweils zur spezifischen Bindung mit einer Assaytargetsubstanz befähigt sind, und eine markierte Antikörper enthaltende Flüssigkeit, die jeweils einen zweiten Antikörper umfassen, der mit farbigen Teilchen markiert ist und zur Bindung mit der Assaytargetsubstanz befähigt ist, wobei es sich bei der Assaytargetsubstanz um wenigstens zwei Arten von Assaytargetsubstanzen handelt, welche aus Verotoxinerzeugendem Escherichia coli, Verotoxin und Human-Hämoglobin ausgewählt sind.