DE3237046C2

DE3237046C2 -

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Publication number: DE3237046C2
Application number: DE3237046A
Authority: DE
Inventors: Lance A. Bethesda Md. Us Liotta
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1981-10-13
Filing date: 1982-10-06
Publication date: 1988-08-04
Also published as: FR2514511B1; BE894662A; GR76996B; DK159407C; SE8205751D0; US4446232A; GB2111676A; NL192138C; LU84402A1; DK451982A; CA1200483A; NL192138B; IE53533B1; NL8203946A; GB2111676B; SE462606B; DK159407B; SE8205751L; DE3237046A1; IT8249171A0

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Bestimmung der Anwesenheit von Antigenen bzw. Antikörpern in biologischen Testflüssigkeiten, gemäß dem Oberbegriff der Patentansprüche 1 bzw. 2, deren Verwendung, sowie ein Verfahren unter Verwendung der Vorrichtung.

Immunologische Diagnosetests oder Immunoassays werden zur Erkennung von Antigenen, Hormonen, Infektionserregern und Serum-Antikörpern in Körperflüssigkeiten angewandt. Die Immunoassays lassen sich generell den folgenden beiden Kategorien zuordnen:
erstens, den Antikörper-Antigen-Fällungstests, wie die radiale Immunodiffusion, die Hämagglutination und die Agglutination von überzogenen Latexteilchen; zweitens, den Tests mit markierten Reagenzien, wie der Radioimmunoassay und der Immunoassay mit gebundenen Enzymen.

Die Fällungstests haben den Vorteil, daß sie von Hand ausgeführt und in Einweg-Kits angewandt werden können, visuell ablesbar sind und keinerlei Instrument erfordern. Das Ableseergebnis bei einem Immunoassay vom Fällungstyp wird üblicherweise als Auftreten oder Ausbleiben einer Agglutinierungsreaktion ausgedrückt, die mit einer Serie von bekannten Verdünnungen der Testprobe oder des konkurrierenden Antigens durchgeführt werden. Die Nachteile der Tests vom Fällungstyp sind, daß diese Tests sehr viel weniger empfindlich sind als die Immunoassays mit markierten Reagenzien, daß sie zeitaufwendige Inkubationsstufen erfordern und daß ein subjektiver Irrtum bei der visuellen Bewertung einer Fällungsreaktion sehr leicht möglich ist.

Immunoassays mit markierten Reagenzien sind quantitative Tests und außerdem hochempfindlich, weisen jedoch trotzdem einige Nachteile auf. Bei Radioimmunoassays werden radioaktive Tracer zur Markierung verwendet, weshalb derartige Tests ein Instrument zum Nachweis der Gammastrahlung erfordern. Die radioaktiven Tracer haben kurze Lagerzeiten, bedeuten für die ausführenden Techniker ein Gesundheitsrisiko und sind einer restriktiven Gesetzgebung unterworfen. Assays mit enzym-verknüpften Immunoabsorbentien (ELISA - Enzyme-linked immunoabsorbant assays) verwenden Reagenzien, die mit einem Enzym markiert sind. Das Enzym wird anhand seiner Reaktion mit einem Substrat nachgewiesen, bei der ein Produkt erhalten wird, das leicht gemessen werden kann (beispielsweise durch die Bildung einer Farbe). Der ELISA-Test erfordert keinerlei radioaktive Materialien und verwendet Reagenzien mit einer langen Lagerzeit.

Der ELISA-Assay beginnt damit, daß ein Referenz-Reagens an eine feste Trägerphase gebunden wird, beispielsweise an den Boden einer Plastikschale. Eine Testflüssigkeit, die mit dem enzym-markierten Reagens gemischt ist, wird mit dem gebundenen Referenz-Reagens umgesetzt. In einer Vielzahl von Verdünnungs-, Inkubations- und Waschstufen (bis zu vierzehn) werden die gebundenen und freien Reagenzien getrennt, und es wird eine Farbreaktion eingeleitet. Die Intensität der mit verschiedenen serienmäßigen Verdünnungen gebildeten Farbe gestattet die quantitative Messung. Zur Durchführung des Standard- ELISA-Assays sind zwischen vier und zwölf Stunden erforderlich. Folglich liegt der Hauptnachteil des ELISA in der großen Anzahl der Verdünnungs-, Inkubations- und Waschstufen, die zeitaufwendig sind und bei denen Irrtümer vorkommen können.

Aus der EP-0 013 156 ist eine Vorrichtung zur Bestimmung von Antigenen in biologischen Testflüssigkeiten bekannt (Fig. 13), die sich aus einer Schicht mit an Enzyme gebundenen Antigenen, einer Schicht mit immobilisierten Antikörpern und einer Schicht, wo letztere mit den Enzymen durch Farbbildung reagieren, zusammensetzt. Da das enzym-markierte Antigen, gemäß dieser Vorrichtung, kompetitiv an der Bindung an einen immobilisierten Antikörper gehindert wird, ist die Wirkungsweise der Vorrichtung sehr stark von dem Konzentrationsverhältnis zwischen enzym-markiertem Antigen und immobilisiertem Antikörper abhängig. Nachteilig dabei ist insbesondere, daß bereits ein geringer Überschuß an markiertem Antigen einen hohen Hintergrund bei der Messung erzeugt und ein Überschuß an Antikörper die Empfindlichkeit stark herabsetzt.

Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Vorrichtung gemäß den Oberbegriffen der Ansprüche 1 oder 2 zu schaffen, mit der die Schwierigkeiten überwunden werden können, wie sie oben beschrieben wurden. Somit soll auch bei einem verbesserten ELISA-Assay, d. h. einem verbesserten Verfahren, die Stufe der Verdünnungs- und Waschschritte entfallen und der Test innerhalb einer einzigen kurzen Inkubationsperiode durchgeführt werden können. Zugleich soll eine sehr hohe Empfindlichkeit bzw. ein Meßhintergrund von Null bei der Antigen- bzw. Antikörperbestimmung erreicht werden.

Diese Aufgabe wird durch die in den Ansprüchen 1 und 2 gekennzeichneten Vorrichtungen erreicht. Vorteilhafte Ausgestaltungen der Vorrichtungen sind in den Unteransprüchen angegeben. Sie wird auch durch die Verfahren gelöst, wie sie in den Patentansprüchen 10 und 11 gekennzeichnet sind.

Die Erfindung betrifft somit eine Vorrichtung zur Bestimmung der Anwesenheit von Antigenen (Antikörpern) in einer Probe mit einer ersten Zone, die Antigene und Antikörper, die mit diesen Antigenen immunologisch reagieren können sowie gebundene Enzyme enthält; sowie einer zweiten Zone, die ein Material enthält, das in der Lage ist, mit den Enzymen in einer Farbreaktion zu reagieren, das sich dadurch auszeichnet, daß die Antigene (Antikörper) in der Matrix immobilisiert vorliegen und die Enzyme an die Antikörper (Antigene) gebunden sind.

Die Erfindung betrifft ferner auch ein Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit von Antigenen (Antikörpern) in einer Testflüssigkeit unter Verwendung der o.g. Vorrichtung, das sich dadurch auszeichnet, daß die Antigene (Antikörper) der Testflüssigkeit in einer ersten Stufe mit enzym-verknüpften Antikörpern (Antigenen) reagieren gelassen werden, die gebildeten Antigen-Antikörper Komplexe zu einem Material diffundieren gelassen werden, das mit dem Enzym in einer Farbreaktion reagiert und die diffundierenden nicht in der ersten Stufe mit Antigen (Antikörper) umgesetzten enzym-verknüpften Antikörper (Antigene) in einer zweiten Stufe mit immobilisiertem Antigen (Antikörper) umgesetzt und dadurch an einer Weiterdiffusion zum Eingehen einer Farbreaktion gehindert werden.

Der Einfachheit halber wird im folgenden nur auf die Bestimmung von Antigenen Bezug genommen.

Der Assay liegt in der Form eines trockenen, geschichteten Teststreifens vor, der eine Farbreaktion zeigt, wenn er direkt dem Testfluid ausgesetzt wird. Der Streifen führt die für die Quantitation erforderlichen Verdünnungsstufen automatisch aus und trennt den gebundenen Antikörper von freien Antikörpern. Die Farbreaktion kann visuell oder mit einem Instrument wie beispielsweise einem Spektrophotometer ausgewertet werden. Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann außerdem in Streifenform hergestellt werden und als Tauchstäbchen zur Schnellentdeckung eines Antigens wie beispielsweise einer Droge oder eines Hormons in Urin verwendet werden. Ein Beispiel für eine besondere Anwendung ist die Schnellfeststellung einer Überdosis einer Droge in der Notaufnahme oder die Verwendung der Vorrichtung als zu Hause durchführbarer Schwangerschaftstest.

Nachfolgend wird die Erfindung unter Bezugnahme auf die Figuren noch näher erläutert. Es zeigt

Fig. 1 eine schematische Darstellung der erfindungsgemäßen Vorrichtung,

Fig. 2 eine schematische Darstellung des unter Verwendung der Vorrichtung gemäß Fig. 1 durchgeführten Verfahrens,

Fig. 3 zeigt in schematischer Form was passiert, wenn bei dem erfindungsgemäßen Verfahren unter Verwendung der Vorrichtung von Fig. 1 in dem Testfluid kein Antigen vorliegt;

Fig. 4 zeigt eine alternative Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung;

Fig. 5 zeigt das mit der Vorrichtung von Fig. 4 durchgeführte Verfahren, wenn im Testfluid Antigene vorhanden sind;

Fig. 6 zeigt das mit der Vorrichtung gemäß Fig. 4 durchgeführte Verfahren, wenn in dem Testfluid keine Antigene enthalten sind.

Bezugnehmend auf Fig. 1 besteht die erfindungsgemäße Vorrichtung 10 in einer Ausführungsform aus drei unterscheidbaren Schichten 12, 14 und 16. Die Schichten 12 und 14 bilden die erste Zone 18. Die Schicht 16 bildet die zweite Zone 20. Die Vorrichtung 10 ist in der Darstellung auf einem Trägerteil 22 angeordnet. Die Schicht 12 ist aus einem porösen Material zugeschnitten, das dispergierte lösliche enzym-gebundene Antikörper 24 enthält. Die Schicht 14 ist ebenfalls aus einem porösen Material hergestellt und enthält an dieses Material gebundene Antigene 26. Die Schicht 16 ist in ähnlicher Weise aus einem porösen Material hergestellt und enthält ein gebundenes farbbildendes Reagens 17, d. h. ein Material, das mit einem Enzym eine Farbreaktion ergibt.

Fig. 2 zeigt, wie mit der Vorrichtung gemäß Fig. 1 Antigene in einem Fluid festgestellt werden. Und zwar wird ein Fluid, das allgemein mit dem Bezugszeichen 28 bezeichnet ist, auf die Oberfläche 30 der Schicht 12 aufgebracht. Wenn das Fluid durch die Matrix diffundiert, kommt das freie Antigen mit enzym-gebundenen Antikörpern 24 in Kontakt und kombiniert mit diesen. Nach einer kurzen Inkubationszeit diffundieren die mit Enzymen verknüpften Antikörper mit antigengesättigten spezifischen Erkennungsstellen frei durch die erste Zone 18 und in die zweite Zone 20 (oder Schicht 16), wo das Enzym mit dem farbbildenden Reagens reagiert und eine bestimmte Farbe erzeugt, die die Anwesenheit eines Antigens in dem aufgebrachten Fluid anzeigt.

Fig. 3 zeigt, was passiert, wenn in dem Testfluid keine Antigene enthalten sind. Das Fluid, das allgemein mit dem Bezugszeichen 34 bezeichnet ist, wird auf die Oberfläche 30 der Schicht 12 aufgebracht. Wenn das Fluid durch die Schicht 12 der Matrix diffundiert, werden die enzym-gebundenen Antikörper 24 gelöst und wandern in die Schicht 14, wo sie mit den gebundenen Antigenen 26 in Berührung kommen und von diesen gebunden werden. Demzufolge gelangen keinerlei enzym-gebundene Antikörper zu dem farbbildenden Reagens 17 in der Schicht 16 (zweite Zone 20), und es wird keine Farbveränderung beobachtet. Das zeigt dann natürlich, daß in dem Fluid 34 keine Antigene vorhanden waren.

Fig. 4 zeigt eine etwas andere Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung, bei der die Vorrichtung oder Matrix 11 aus zwei unterschiedlichen Schichten 36 und 38 aufgebaut ist. In diesem Falle bildet die Schicht 36 die erste Zone 40, die ein gebundenes Referenz- Antigen 44 enthält, das mit einem enzym-verknüpften Antikörper 46 kombiniert ist. Die Schicht 38 bildet die zweite Zone 42 und enthält das farbbildende Reagens 17.

Wie in Fig. 5 gezeigt ist, kommt es dann, wenn das Testfluid 48 eine ausreichende Menge an freiem Antigen 50 enthält, dazu, daß das freie Antigen 50 mit dem gebundenen Antigen 44 konkurriert, wobei die enzym-verknüpften Antikörper an bewegliche Antigene 50 gebunden werden und in die Zone 42 hinabdiffundieren, wo sie eine Farbreaktion 52 ergeben.

Wenn dagegen, wie in Fig. 6 gezeigt, das Testfluid 54 keine Antigene enthält, kommt es zu keinerlei Konkurrenzreaktion, und folglich diffundieren auch keinerlei enzym-gebundene Antikörper in die zweite Zone 42, wo folglich auch keine Farbe erzeugt wird.

Die vorliegende Erfindung beruht auf dem Prinzip der Konkurrenz zwischen gebundenen und freien Antigenen bezüglich einer feststehenden Anzahl von Bindungsstellen an einem enzym-gebundenen Antikörper. Damit betrifft die vorliegende Erfindung ein verbessertes Verfahren zur Durchführung eines Tests vom ELISA-Typ. Die Reagenzien des Assays sind auf einen Mehrzonen-Teststreifen aufimprägniert. Man läßt die zu untersuchende flüssige Probe dann passiv in den Teststreifen eindiffundieren. Während dieser Diffusion werden gebundene und freie Antigene automatisch getrennt. Diese Trennung wird dadurch bewirkt, daß das Festphasen-Referenz-Antigen immobilisiert in einer ersten Zone enthalten ist, die von einer zweiten Zone getrennt ist, die das Substrat enthält, auf das das Enzym einwirkt. Man läßt den löslichen enzym-gebundenen Antikörper, der spezifische Bindungsstellen aufweist, sich mit der Testprobe mischen und durch die Schichten diffundieren. Die löslichen Antigene in der Testphase konkurrieren mit dem immobilisierten Referenz-Antigen im Hinblick auf die Kombination mit dem enzym-verknüpften Antikörper. Daher hängt die Menge an enzym-gebundenem Antikörper, der schließlich die zweite Zone mit dem Substrat erreicht, von der Konzentration des gesuchten Antigens in der Probe ab. Das Substrat in dem Teststreifen reagiert mit dem Enzym unter Bildung einer Farbe.

Um eine Quantitation zu erreichen, ist der Teststreifen aus mehreren getrennten Bereichen aufgebaut, von denen jeder eine andere Menge an immobilisiertem Referenz- Antigen enthält. Daher hängt der Ort der Farbveränderung auf dem Teststreifen von der Konzentration des Antigens in der Testprobe ab.

Wie bereits weiter oben ausgeführt wurde, umfaßt die erfindungsgemäße Vorrichtung eine erste Zone, die gebundenes Antigen und einen spezifischen enzym-gebundenen Antikörper enthält, sowie eine zweite Zone, die ein Farbbildungsreagens oder -substrat enthält. Die enzym-verknüpften Antikörper sind in der ersten Zone derart angeordnet, daß sie sich aus dieser ersten Zone wegbewegen können, wenn sie mit einem freien Antigen reagieren, das in diese Zone gelangt oder durch diese Zone hindurchströmt, daß sie jedoch aus dieser ersten Zone nicht entfernt werden, wenn derartige Antigene nicht vorhanden sind.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Immuno-Assay-Vorrichtung ein Schichtenverband von drei übereinander sandwichartig angeordneten porösen Matrixschichten (vgl. Fig. 1). Die erste poröse Schicht ist mit einem spezifischen Antikörper imprägniert, der an ein Enzym gebunden ist. Die zweite poröse Schicht enthält ein immobilisiertes (gebundenes) Referenz- Antigen. Das Antigen ist von dem Typ, der spezifisch von dem Antikörper in der ersten porösen Schicht erkannt wird. Die dritte Schicht enthält ein farbbildendes Substrat, das mit dem Enzym reagiert, das an den Antikörper gebunden ist. Die Vorrichtung funktioniert wie folgt:

Die zu untersuchende Fluidprobe, die das zu untersuchende Antigen enthält, wird mit der ersten Schicht in Kontakt gebracht. Das freie Antigen in der Testprobe diffundiert in die zweite Schicht und dann in die dritte Schicht. Das freie Antigen in der Testprobe konkurriert dabei mit dem immobilisierten gebundenen Referenz-Antigen in der zweiten Schicht im Hinblick auf die Bindung des enzym- gebundenen Antikörpers. Wenn der enzym-gebundene Antikörper mit dem freien Antigen kombiniert, diffundiert die erhaltene Kombination frei in die dritte Schicht und erzeugt dort eine Farbe. Wenn die Fluidprobe kein Antigen enthält, weisen alle enzym-gebundenen Antikörper freie Bindungsstellen auf und kombinieren mit dem immobilisierten Antigen in der zweiten Schicht. Enzym-gebundene Antikörper, die mit dem immobilisierten Antigen in der zweiten Schicht kombinieren, diffundieren jedoch nicht in die dritte Schicht, und es kommt zu keiner Farbreaktion. Der Unterschied im Hinblick auf die Menge des abgebauten Substrats, und damit die Intensität der erzeugten Farbe, ist der Menge an Antigen in der Testprobe proportional. Für eine gegebene Menge eines enzym-markierten Antikörpers in der ersten Schicht ist die Empfindlichkeit der Vorrichtung durch die Menge des Referenz-Antigens in der zweiten Schicht bestimmt. Typischerweise weist daher eine Testvorrichtung eine Serie von sandwichartigen Schichtverbindungen auf, die jeweils eine unterschiedliche Menge an Referenz-Antigen enthalten. Die Serie von Referenz-Antigen-Konzentrationen ist dabei vorher so bestimmt, daß ein Empfindlichkeitsbereich erfaßt wird, der für die zu messende Testlösung geeignet ist. Es sollte noch einmal darauf hingewiesen werden, daß der erfindungsgemäße ELISA-Teststreifen so angelegt ist, daß eine positive Farbreaktion die Anwesenheit des gesuchten Antigens anzeigt.

Die zur Herstellung der erfindungsgemäßen Vorrichtung verwendeten Materialien sind gut bekannt. Es wurde dabei jedoch festgestellt, daß es aus praktischen Gründen wünschenswert ist, die Zonen oder Schichten einer bevorzugten Ausführungsform aus verwobenen Fasern wie aus Nitrocellulose- oder Diazobenzyloxymethyl(DBM)-Papier herzustellen. Nitrocellulosepapier bindet direkt Proteine, und es konnte bereits gezeigt werden, daß es vorteilhaft zum Immobilisieren von Antigenen verwendet werden kann. Eine DBM-Matrix bindet DNA, RNA und Proteine kovalent über die Diazoniumgruppe. Zusätzlich kann auch ein poröses Gel als Polyacrylamid, Agarose oder Collagen verwendet werden. Das Antigen kann dann in den Poren des Gels eingeschlossen werden, oder es kann über Aminogruppen des Liganden und Carboxylgruppen an der Matrix mit dem Gel verknüpft werden. Ferner können auch Teilchen oder Perlen, die den gebundenen Liganden innerhalb einer Cellulose- oder Kunststoff-Faser-Matrix eingeschlossen enthalten, verwendet werden. Ein befriedigendes Ergebnisse lieferndes Beispiel sind Polyacrylamidperlen mit einem Durchmesser von 5-10 µm, bei denen das Antigen über eine Peptidbindung mit der Oberfläche verbunden ist. Diese Perlen sind in einer Cellulosefilter-Matrix mit einer Porengröße von 1-2 µm eingeschlossen.

Geeignete Substrate oder Farbbildungs-Reagenzien sind dem Fachmann gut bekannt. In diesem Zusammenhang werden eine Anzahl von verschiedenen Typen von gereinigten Enzymen üblicherweise als Markierungs-Reagens zur Verwendung in Immuno-Assays wie ELISA verwendet. Zu diesen gehören Meerrettich-Peroxydase, alkalische Phosphatase und Beta-Galactosidase. Die vorliegende Erfindung ist jedoch nicht auf die Verwendung dieser Enzyme als Label für den Antikörper oder ein Antigen beschränkt. Das Enzym, das zur Markierung des Antikörpers verwendet wird, kann in der zweiten Zone der Testvorrichtung eine Farbe erzeugen, indem es direkt oder indirekt mit dem farbbildenden Mittel reagiert. Beispielsweise reagieren gut bekannte Substrate wie Diaminobenzidin oder p-Nitrophenylphosphat mit Meerrettich-Peroxydase in Gegenwart von Wasserstoffperoxid unter Bildung einer braunen bis schwarzen Farbe. Bei einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird Wasserstoffperoxid von außen während der Verwendung der Vorrichtung zugeführt. Alternativ dazu kann die lyophilisierte Farbbildungszone gebundene Glucoseoxydase enthalten, und die erste Zone kann Glucose enthalten. Bei der Verwendung der Vorrichtung diffundiert die Glucose in der ersten Zone in die zweite Zone und erzeugt Wasserstoffperoxid, indem sie mit der Glucoseoxydase reagiert.

Das an den Antikörper gebundene Enzym kann in der zweiten Zone auch auf indirekte Weise eine Farbe erzeugen, beispielsweise durch Beeinflussung der Durchlässigkeit dieser Zone. Ein Beispiel für dieses Verfahren, das für die vorliegende Erfindung geeignet ist, ist die Verwendung von hochgereinigter Collagenase als an den Antikörper gebundenes Enzym. Dieses Enzym baut Collagen zu kleinen Peptiden ab. Zum Nachweis des Collagenase- Labels werden zwei Reagenzien, die unter Bildung einer Farbe reagieren können, durch eine Barriere aus einer Collagenmatrix getrennt. Ein mit der Collagenase markierter Antikörper wird dadurch festgestellt, daß die Collagenase die Collagenbarriere zersetzt und damit eine Vermischung der getrennten Reagenzien unter Bildung einer Farbe ermöglicht. Eine geeignete Collagenase ist die, die aus Clostridium histolyticum erhalten wird, und die nach dem Fachmann gut bekannten Verfahren gereinigt wurde. Eine geeignete Collagenmatrix ist beispielsweise eine, die aus Rindercollagen vom Typ I in der Form einer Dreifachhelix (natives Collagen) oder in der denaturierten (Gelatine) Form gebildet wird.

Nachfolgend wird die Erfindung anhand von konkreten Ausführungsbeispielen noch weiter erläutert.

Beispiel 1 Test: Dreischichtige Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung als Schwangerschaftstest Verwendete Materialien

a) Antigen: menschliches Chorion-Gonadotropin (hCG),
b) Antikörper: Kaninchen-Antisera gegenüber menschlichem hCG,
c) An den Antikörper gebundenes Enzym: Meerrettich- Peroxydase,
d) Substrat für die Farbbildung mit dem Enzym: Diaminobenzidin,
e) Matrixmaterial zur Bildung der porösen Schichten: Nitrocellulose.

Verfahrensweise Stufe 1 Herstellung einer Schicht, die das farberzeugende Reagens enthält

Nitrocellulosematrix-Blätter einer Dicke von 0,2 mm wurden in 2 cm breite und 10 cm lange Streifen geschnitten. Die Blätter wurden 30 Minuten in einer Lösung von 0,1 mg/ml Diaminobenziden in destilliertem Wasser eingeweicht. Die Blätter wurden dann gefroren, indem sie mit Trockeneiskörnern bedeckt wurden. Die gefrorenen Blätter wurden in einem üblichen Gefriertrockner lyophilisiert.

Stufe 2 Herstellung einer antigenhaltigen Schicht

Das Antigen wurde in einer phosphat-gepufferten Salzlösung bei einer Konzentration von 5,0 IE/ml gelöst, und aus der Lösung wurde eine Serie von Verdünnungen hergestellt: 1 : 1, 1 : 2, 1 : 4, 1 : 8, 1 : 16, 1 : 32, 1 : 64 und 1 : 100.

Acht Gruppen von Nitrocellulose-Blättern wurden jeweils in einer Antigenlösung mit unterschiedlicher Verdünnung 30 Minuten bei 4°C eingeweicht. Alle Blätter wurden dann in einer Lösung von 1% Rinderserumalbumin in einer phosphat-gepufferten Salzlösung zwei Stunden bei 4°C eingeweicht, um alle freien proteinbildenden Stellen der Nitrocellulose abzusättigen (Tobin et al., Proc. Natl. Acad. of Sci., 76, 4350 bis 4354, 1979). Die Blätter wurden dann wie oben lyophilisiert.

Stufe 3 Herstellung einer enzym-gebundenen Antikörper enthaltenden Schicht

Das Peroxidase-Enzym wurde nach dem Standardperiodat-Verfahren von Wilson und Nakane [1978, in W. Knapp et al. (Herausgeber), Immunofluorescence and Related Techniques, Elsevier Co., Amsterdam, Seite 215-225] mit dem Antikörper konjugiert. Nach der Reinigung der Konjugate nach Standardverfahren wurde es in einer phosphat-gepufferten Salzlösung bei einer Konzentration von 1 mg/ml aufbereitet. Die Konzentration des enzym-gebundenen Antikörpers, die auf die Schicht aufimprägniert werden sollte, wurde dadurch bestimmt, daß man die enzym-gebundene Antikörperlösung soweit verdünnte, bis ein 20 µl Tröpfchen, das auf die Oberfläche des Nitrocellulose-Blattes, das das immobilisierte Antigen in einer Verdünnung von 1 : 32 enthielt, aufgebracht wurde, eine vollständige Bindung des gesamten Antikörpers an das immobilisierte Antigen ergab (Herstellung einer Standardverdünnungs-Kurve). Diese Konzentration des enzym-gebundenen Antikörpers wurde in Streifen aus Celluolse-Löschpapiermaterial aufgesaugt und wie für Stufe 1 weiter oben beschrieben lyophilisiert.

Stufe 4 Herstellung einer sandwichartigen dreischichtigen Struktur

Quadrate mit 1 cm Kantenlänge aus jeder lyophilisierten Schicht wurden aus den Streifen ausgeschnitten. Der feste Träger war ein Streifen aus einem transparenten Polycarbonatkunststoff mit den Abmessungen 10 cm×1 cm×0,1 mm (Dicke). Acht Quadrate Nitrocellulose, die das farbbildende Substrat enthielten, wurden mit einem Kleber auf Latexbasis an den Kunststoffträger geklebt. Oben auf diese Quadrate wurden unter Verwendung von Latexkleber die antigenhaltigen Blätter an ihren Umfangslinien aufgeklebt. Dabei wurden die acht unterschiedlichen Antigen-Konzentrationen verwendet. Abschließend wurden oben auf die Antigenschichten die Schichten mit dem enzym-gebundenen Antikörper aufgeklebt.

Stufe 5

Zur Durchführung des Assays wurden 50 µl der Testlösung auf die Oberfläche der Deckschicht aufgebracht. Die Testlösung bestand aus einem Standardantigen in phosphat-gepufferter Salzlösung vom pH 7,4 mit einem Anteil von 0,1% Wasserstoffperoxid. Die Empfindlichkeit des Assays betrug 0,3 IE hCG, die eine Farbreaktion bei einer Verdünnung von 1 : 32 an immobilisiertem Antigen lieferte.

Ergebnisse

Die wie oben beschrieben hergestellten ELISA-Teststreifen wurden im Hinblick auf ihre Empfindlichkeit mit einer Standard-Hämagglutinations-Reaktion verglichen. Die Testprobe war ein gesammelter menschlicher Urin von sechs Patienten, von denen bereits vorher bekannt war, daß sie schwanger waren.

Die Ergebnisse zeigen, daß die Empfindlichkeit des ELISA-Streifens größer ist als die Empfindlichkeit der üblichen Hamagglutinations-Reaktion.

Beispiel 2 Test

a) Bestimmung der Zeit der Farbbildung für verschiedene Konzentrationen von enzym-gebundenem Antikörper, der auf die erste Schicht der dreischichtigen Ausführungsform aufimprägniert wurde.

b) Bestimmung der Eignung zum Nachweis von menschlichem Hepatitis-B-Antigen (HBA).

Verfahrensweise

Der Teststreifen wurde nach identischen Methoden wie im Beispiel 1 aufgebaut. Die erste Schicht enthielt eine lyophilisierte Cellulosematrix, die mit den folgenden Verdünnungen eines Peroxidase-konjugierten Anti-HBA imprägniert war: 1/2, 1/5, 1/50, 1/225, 1/625, 1/3125. Im Falle des Versuchs a) enthielt die zweite Schicht kein Antigen. Im Falle des Versuchs b) enthielt die zweite Schicht gebundenes HBA in einer Konzentration von 500 ng/cm². Die dritte Schicht enthielt wie in Beispiel 1 zum Nachweis von hCG ein DAB-Substrat.

Ergebnisse Versuch a)

Die Testprobe bestand aus einem üblichen menschlichen Serum, das in einer 1/10 phosphat-gepufferten Salzlösung verdünnt wurde, die 0,1% Wasserstoffperoxid enthielt.

Farbreaktion

Schlußfolgerungen

Die optimale Konzentration an enzym-gebundenem Antikörper ist 1/625, wenn die zweite Schicht 500 ng HBA/cm² enthält. Die Eignung zum Nachweis von HBA wird anhand der Konkurrenz von freiem Antigen mit dem gebundenen Referens- Antigen bei 1/625 gezeigt.

Versuch (b)-1

Bestimmung der optimalen maximalen Konzentration des enzym-gebundenen Antikörpers in der ersten Schicht, bei dem dieser vollständig an das Referenz-Antigen in der zweiten Schicht gebunden wird, wenn die Testprobe kein Antigen enthält.

Verdünnung des mit demFarbreaktion Enzym konjugierten Anti-HBAnach einer in der ersten SchichtMinute

1/5BN 1/50hell BN 1/225sehr hell BN 1/625keine Farbe
(vollständige Bindung durch das
Referens-Antigen) 1/3125keine Farbe

Versuch (b)-2

Zum Nachweis von HBA mit 100 ng/ml wurde eine 1/625- Verdünnung gemäß Tabelle (b)-1 des Konjugats gewählt.

Die erfindungsgemäße Technik ist gleichermaßen für den Nachweis von Antikörpern wie auch für den Nachweis von Antigenen geeignet. Die Rollen des Antigens und des Antikörpers werden dabei einfach vertauscht. Zum Nachweis von Antikörpern wird das Antigen mit einem Enzym markiert, und der Referenz-Antikörper wird in der ersten Zone immobilisiert. Das mit dem Enzym markierte Antigen wird in der Abwesenheit eines konkurrierenden Antikörpers in der Testprobe an die immobilisierten Antikörper in der ersten Zone gebunden und diffundieren nicht in die zweite Zone, so daß es dort zu keiner Farbreaktion kommt. Wenn in der Testprobe Antikörper vorhanden sind, konkurrieren diese mit den immobilisierten Referenz- Antikörpern. In diesem Falle zeigt eine positive Farbreaktion die Anwesenheit von Antikörpern in der Testprobe an.

Wenn die vorliegende Erfindung für den Nachweis von Antikörpern ausgelegt wird, wird eine Vorrichtung verwendet, die eine erste Zone aufweist, die enzym-gebundene Antigene sowie Antikörper enthält, die immunologisch mit diesen Antigenen reagieren können, wobei diese Antigene in der ersten Zone derart angeordnet sind, daß sie aus dieser ersten Zone entfernt werden, wenn sie mit Antikörpern reagieren, die in die erste Zone hinein oder durch diese hindurchströmen, daß sie jedoch in der Abwesenheit derartiger Antikörper nicht aus dieser ersten Zone entfernt werden; und die ferner eine zweite Zone aufweist, die ein Material enthält, das entweder direkt oder indirekt mit den enzym-gebundenen Antigenen in einer Farbreaktion reagieren kann, die die Anwesenheit dieser Antigene anzeigt.

Claims

1. Vorrichtung zur Bestimmung der Anwesenheit von Antigenen in einer Probe mit einer ersten Zone mit einer Matrix, die Antigene und Antikörper, die in der Lage sind, mit den Antigenen immunologisch zu reagieren, sowie gebundene Enzyme enthält und einer zweiten Zone, die ein Material enthält, das in der Lage ist, mit den Enzymen in einer Farbreaktion zu reagieren, dadurch gekennzeichnet, daß die Antigene in der Matrix immobilisiert vorliegen und die Enzyme an die Antikörper gebunden sind.

2. Vorrichtung zur Bestimmung der Anwesenheit von Antikörpern in einer Probe mit einer ersten Zone mit einer Matrix, die Antigene und Antikörper, die in der Lage sind, mit den Antigenen immunologisch zu reagieren, sowie gebundene Enzyme enthält und einer zweiten Zone, die ein Material enthält, das in der Lage ist, mit den gebundenen Enzymen in einer Farbreaktion zu reagieren, dadurch gekennzeichnet, daß die Antikörper in der Matrix immobilisiert vorliegen, und die Enzyme an die Antigene gebunden sind.

3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die erste Zone und die zweite Zone so angeordnet sind, daß sie aneinandergrenzen.

4. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die erste Zone mit Enzymen verknüpfte Antikörper enthält, die an die immobilisierten Antigene gebunden sind.

5. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die erste Zone aus mindestens zwei getrennten Schichten besteht, wobei eine dieser Schichten die mit den Enzymen verknüpften Antikörper enthält, und die andere Schicht das immobilisierte Antigen enthält.

6. Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Matrix der ersten Zone und/oder der zweiten Zone aus einer Fasermatrix oder einem porösen Polymergel besteht.

7. Verwendung der Vorrichtung nach Anspruch 1 zur Bestimmung von menschlichem Chorion-Gonadatropin.

8. Verwendung der Vorrichtung nach Anspruch 1 zur Bestimmung von Hepatitis-Antigen.

9. Verwendung der Vorrichtung nach Anspruch 1 zur Bestimmung von Rubellavirus-Protein.

10. Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit von Antigenen in einer Testflüssigkeit unter Verwendung einer Vorrichtung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Antigene der Testflüssigkeit in einer ersten Stufe mit Enzym-verknüpften Antikörpern reagieren gelassen werden, die gebildeten Antigen-Antikörper-Komplexe zu einem Material diffundieren gelassen werden, das mit dem Enzym in einer Farbreaktion reagiert, und die diffundierenden nicht in der ersten Stufe mit Antigen umgesetzten Enzym- verknüpften Antikörper in einer zweiten Stufe mit immobilisiertem Antigen umgesetzt und dadurch an einer Weiterdiffusion zum Eingehen einer Farbreaktion gehindert werden.

11. Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit von Antikörpern in einer Testflüssigkeit unter Verwendung einer Vorrichtung gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Antikörper der Testflüssigkeit in einer ersten Stufe mit Enzym-verknüpften Antigenen reagieren gelassen werden, die gebildeten Antigen-Antikörper- Komplexe bis zu einem Material diffundieren gelassen werden, das mit dem Enzym in einer Farbreaktion reagiert, und die diffundierenden nicht in der ersten Stufe mit Antikörper umgesetzten Enzym-verknüpften Antigene in einer zweiten Stufe mit immobilisiertem Antikörper umgesetzt und dadurch an einer Weiterdiffusion zum Eingehen einer Farbreaktion gehindert werden.